CN118225718A - 一种检测凝血酶抑制剂的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测凝血酶抑制剂的试剂盒，该试剂盒包括第一试剂、第二试剂和抗凝血酶校准品；第一试剂包括凝血酶试剂和稀释试剂；第二试剂包括凝血酶发色底物；抗凝血酶校准品包括已知浓度的凝血酶抑制剂；第一试剂的制备方法为：由稀释试剂对凝血酶试剂进行稀释得到，凝血酶试剂的pH为6‑6.5，稀释试剂的pH为8.0‑9.0，稀释得到的第一试剂的pH为7.5；其中，凝血酶试剂中含有凝血酶、葡萄糖、聚乙烯醇和基础试剂，且葡萄糖和聚乙烯醇的浓度比为(14.8‑15.2):(0.8‑1.2)，稀释试剂中含有聚乙烯醇。本发明试剂盒的优点在于试剂盒中凝血酶稀释后的稳定性和活性最佳，因此能精确测定凝血酶抑制剂的含量，且试剂盒测试方法简单准确，组成简单，易于制备。

Description

一种检测凝血酶抑制剂的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是指一种检测凝血酶抑制剂的试剂盒。

背景技术

凝血酶在凝血因子中定义为因子Ⅱa，凝血酶在凝血过程中主要是激活纤维蛋白原形成不容的纤维蛋白，从而达到止血的效果。在体内凝血与抗凝血双方是相互达到平衡的，当一方发生因疾病等因素引起因子等失衡时，另外一方就会表现出相应症状，例如血栓的形成是由于抗凝因子的缺乏或者凝血亢进，当在临床中发生血栓后或发现易栓症状就会用到抗凝药物，凝血酶作为血栓形成的关键首先会降低其活性或者灭活。具有凝血酶的抑制功能的药物有达比加群、阿加曲班、水蛭素和比伐卢定等，这些凝血酶抑制剂在高剂量应用时不可避免的会出现出血现象，因此检验这些凝血酶抑制剂的含量在抗凝治疗过程中极为重要。

现有技术中常用发色底物法检测凝血酶抑制剂的含量，发色底物法检测凝血酶抑制剂的工作原理为通过向待测血浆中添加含过量的凝血酶，在病人血浆中残存的凝血酶抑制剂成比例地抑制已加入的凝血酶的活性，从而影响凝血酶与发色底物的结合，而剩余的凝血酶作用于凝血酶发色底物，裂解出显色基团(释放出的pNA在一定范围内检测)，显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中凝血酶抑制剂含量呈负相关，进而实现快速检测凝血酶抑制剂的含量。在这一过程中，凝血酶的活性和稳定性至关重要。凝血酶一般在酸性条件下保存，但使凝血酶活性维持在最佳状态下的pH为中性偏碱。现有技术中的凝血酶抑制剂检测试剂盒采用明胶作为试剂盒的稳定剂，但明胶作为稳定剂对凝血酶的稳定性效果不佳，因此亟需一种凝血酶抑制剂试剂盒使凝血酶的稳定性和活性最佳，以便精确检测凝血酶抑制剂的含量。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明构建了一种检测凝血酶抑制剂的试剂盒及制备方法，其中试剂盒中凝血酶的稳定性和活性最佳，提高了凝血酶抑制剂检测的准确性，解决了目前试剂盒普遍存在的凝血酶稳定性和活性不高的问题。

本发明的第一个目的是提供一种检测凝血酶抑制剂的试剂盒，试剂盒包括第一试剂、第二试剂和抗凝血酶校准品：

所述第一试剂包括凝血酶试剂和稀释试剂；

所述第二试剂包括凝血酶发色底物和辅料；

所述抗凝血酶校准品包括已知浓度的凝血酶抑制剂；

所述第一试剂的制备方法为：由所述稀释试剂对凝血酶试剂进行稀释得到，所述凝血酶试剂的pH为6-6.5，所述稀释试剂的pH为8.0-9.0，稀释得到的第一试剂的pH为7.5；其中，所述凝血酶试剂中含有凝血酶、葡萄糖、聚乙烯醇和基础试剂，且葡萄糖和聚乙烯醇的浓度比为(14.8-15.2):(0.8-1.2)，所述稀释试剂中含有聚乙烯醇；

凝血酶的最适稳定pH值为6.0，而最佳活性pH为7.5，因此稀释试剂的pH为8.0-9.0，优选为8.0。

进一步地，第一试剂中，所述凝血酶试剂包含凝血酶，所述凝血酶选自人凝血酶、牛凝血酶或猪凝血酶，优选为牛凝血酶。

进一步地，所述稀释试剂还包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、聚凝胺、氯化钠和ProClin300。其中聚凝胺为肝素抑制剂，在肝素存在的情况下，抗凝血酶迅速灭活凝血酶，形成假阳性，因此肝素的抑制或灭活是必须的。肝素抑制剂为0.01-0.5g/L的鱼精蛋白、20U-500U/L的肝素酶、0.01-0.3g/L的聚凝胺。鱼精蛋白的水溶性较差；肝素酶价格昂贵；聚凝胺水溶性好，溶液无色透明，价格低廉且灭活效率高，因此本试剂盒优选聚凝胺。

进一步地，所述基础试剂还包含吗啉乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)、牛血清蛋白(BSA)、甘氨酸、甘露醇和ProClin300。

进一步地，第二试剂中，所述发色底物为可用于测定凝血酶抑制剂的发色底物，包括但不限于不限于Bz-Phe-Val-Arg-pNA(S-2160)、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(S-2238)、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(Chomozym TH)、H-D-Phe-Pro-Arg-pNA。

进一步地，所述第二试剂还包括缓冲液、抗氧化剂、表面活性剂和稳定剂、防腐剂的一种或多种。

进一步地，上述各试剂中：

缓冲液可为5-50mM的Tris-HCl缓冲液、2-20mM咪唑缓冲液、10-100mM的HEPES缓冲液、5-25mM的巴比妥缓冲液5-50mM的MES缓冲液或其组合；

稳定剂包括但不限于0.01-2.0g/L的明胶、3-30g/L的甘露醇、10-50g/L的山梨醇、2-15g/L的聚乙二醇、0.01-0.5g/L的壳聚糖、10-50g/L的甘氨酸、10-50g/L的木糖醇、20-100g/L的蔗糖、10-80g/L的海藻糖、5-50g/L的BSA、0.1-5g/L的聚乙烯醇、2-20g/L的葡聚糖、5-50g/L的葡萄糖；

防腐剂可选择任一本领域常用的防腐剂，如叠氮化钠，含量为0.05％-0.2％时，既可以有效杀菌，又不会产生副作用，可延长试剂盒的有效期；还可以是浓度在0.01％-1.0％的庆大霉素、环丙沙星、ProClin系列防腐剂中的任何一种；

抗氧化剂可为1000U-10000U的SOD、0.1-3g/L的BHA、BHT和PG、10茶多酚等；

表面活性剂可为0.5-15.0g/LTriton、1.0-20.0g/LTween、1.0-15.0g/L月桂醚、2.0-10.0g/L聚氧乙烯烷基苯基醚中的一种或多种，优选吐温-80，浓度为2.0-10.0g/L。

进一步地，所述凝血酶抑制剂包括但不限于达比加群、阿加曲班、比伐卢定、水蛭素的一种或多种。

进一步地，上述试剂盒中：

所述凝血酶的工作浓度为0.1-2IU/mL，优选工作浓度为0.5IU/mL，凝血酶的工作浓度决定了试剂盒的灵敏度和线性区间，凝血酶过多使得低剂量的凝血酶抑制剂灵敏度降低，凝血酶过高时则高值线性不足；

所述凝血酶发色底物的工作浓度为0.2-1.7IU/mL，优选工作浓度为0.42IU/mL。在凝血酶发色底物检测凝血酶抑制剂的过程中，作为凝血酶底物，要求具有较高的敏感性和较好的水溶性，才能提高检测效率，且具有较宽的线性范围，保证检测结果的准确性。如果底物溶解度过低，试剂接近饱和状态，检测过程中易产生沉淀而导致测定结果的不准确。

本发明中，除特殊说明外，工作浓度指：采用上述试剂盒检测样本中检测凝血酶抑制剂的过程中，第一试剂中凝血酶试剂与稀释试剂稀释后，与第二试剂和稀释样本混合，所形成的分析混合物中各组分的浓度被定义为其工作浓度。

进一步地，所述试剂盒还包括质控品。

进一步地，所述试剂盒检测样本为血液样本。

本发明的第二个目的是提供一种采用上述试剂盒检测凝血酶抑制剂的方法，包括以下步骤：

S1、将第一试剂和凝血酶抑制剂标准品进行稀释重建：凝血酶试剂以稀释试剂按照体积比为1:4的比例稀释，每瓶标准品用1mL蒸馏水稀释。

S2、将稀释后的抗凝血酶标准品与第一试剂混合、孵育，再加入第二试剂，按特定时间间隔测定吸光度，根据抗凝血酶校准品中凝血酶抑制剂浓度以及吸光度制作校准曲线；

S3、对待测样本重复上述S2操作，将测定待测样本的吸光度代入校准曲线中即可计算出待测样本中凝血酶抑制剂的含量。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明试剂盒中凝血酶稀释后的稳定性和活性经试验证明效果最佳，因此能精确测定凝血酶抑制剂的含量；

(2)本发明试剂盒测试方法简单准确，组成简单，易于制备，且本发明试剂盒检测凝血酶抑制剂含量时，操作简单，适用于多种型号的凝血分析仪，便于在各级医院，医学生物科研单位等推广使用，从而可促进该检测项目的常规开展。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为达比加群时的校准曲线；

图2是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为阿加曲班时的校准曲线；

图3是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为比伐卢定时的校准曲线；

图4是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为水蛭素时的校准曲线；

图5是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为达比加群时的线性范围相关性分析：

图6是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为阿加曲班时的线性范围相关性分析；

图7是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为比伐卢定时的线性范围相关性分析；

图8是本发明试剂盒中当凝血酶抑制剂为水蛭素时的线性范围相关性分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1检测凝血酶抑制剂的试剂盒的制备方法

(1)凝血酶的选择

以抗凝血酶校准品为达比加群为例，以相同空白样本OD值情况下比较各稀释梯度测试的OD差值，结果如下：

表1各稀释梯度下人凝血酶、牛凝血酶和猪凝血酶的OD值

三种凝血酶的曲线相关性均在0.99以上，人凝血酶与牛凝血酶的表现相近，并且都优于猪凝血酶，考虑成本原因，优选地，本试剂盒采用牛凝血酶。

(2)试剂盒的组成和制备方法

检测凝血酶抑制剂的试剂盒包括第一试剂，第二试剂，抗凝血酶校准品，以1mL/瓶分装。第二试剂具体组成如表2所示。

表2第二试剂的配比

抗凝血酶校准品包括已知浓度的达比加群、阿加曲班、比伐卢定、水蛭素等；

检测凝血酶抑制剂的试剂盒还包括质控品，质控品包括达比加群(水平1范围50-150ng/mL，水平2范围250-350ng/mL)、阿加曲班(水平1范围0.2-0.8mg/L，水平2范围1.5-2.5mg/L)、比伐卢定(水平1范围0.5-1.5mg/L，水平2范围5-8mg/L)、水蛭素(水平1范围2-8ATU/mL，水平2范围15-25ATU/mL)等。

第一试剂由凝血酶试剂和稀释试剂以1:4比例稀释得到，在第二试剂的基础上探究凝血酶试剂和稀释试剂的不同配比，以获得使凝血酶稳定性和活性最佳的第一试剂。

稀释试剂的配比如表3所示。

表3稀释试剂的配比方案

凝血酶试剂以MES缓冲液10mM、BSA30g/L、甘氨酸30g/L、甘露醇20g/L、ProClin3001mL/L作为基础试剂，在500IU/mL凝血酶的基础上调整如下成分，以寻求凝血酶试剂的最佳配比。其中表4中所提到的pH为将凝血酶、基础试剂和表4中的方案混合后所得溶液的pH。

表4凝血酶试剂配比方案

①以水平1范围下的达比加群质控品为例，将方案S1-方案S22的凝血酶试剂在37℃下进行加速，分别在第10天和第21天取出，用方案P1稀释后测试质控品，以质控品的靶值计算偏差，比较不同配比方案下凝血酶试剂的稳定性，得到测试值与质控的偏差，测试结果变化越小，凝血酶试剂越稳定。

表5凝血酶试剂稳定性测试

方案S1、S2、S3、S17用以探究不同pH条件下凝血酶的稳定性，试验结果表明，方案S17中凝血酶的稳定性最佳。pH值会影响凝血酶的稳定性，随着pH值的升高，测试值与质控的偏差增大，则凝血酶的稳定性下降。在方案S4-方案S22中，当pH＝6时，不同配比的凝血酶试剂均表现出较好的稳定性，其中方案S5中凝血酶的稳定性最佳。而采用方案S5的凝血酶试剂经方案P1以体积比为1:4稀释后测的pH为7.5(方案P1和方案P2的pH相同，以体积比为1:4稀释凝血酶试剂后所得的pH均为7.5)，而pH为7.5时凝血酶的活性最佳。综上所述，采用方案S5配制凝血酶试剂。

②采用不同配比的稀释试剂对不同配比的凝血酶试剂进行稀释，在4℃、37℃下测定测试值与质控的偏差，以探究在不同配比的稀释试剂下凝血酶试剂的最佳稳定性。

表6方案P1稀释下凝血酶试剂稳定性测试

表7方案P2稀释下凝血酶试剂稳定性测试

试验结果表明，无论是在4℃还是在37℃下，在方案P1的稀释下，方案S4-方案S22中凝血酶的稳定性相比于方案P2更佳，因此方案P1的稀释试剂能够使得凝血酶试剂的稳定性最佳。

综上所述，第一试剂的组成如表8所示。

表8第一试剂的配比

实施例2检测试剂盒的检测方法

(1)将实施例1所得的第一试剂和标准品进行稀释重建：凝血酶试剂和稀释试剂的体积比为1:4，每瓶抗凝血酶标准品用1mL蒸馏水稀释。

(2)以Ci-300血凝仪操作为例，根据仪器说明，设定分析程序：测定波长为405nm。

仪器自动将抗凝血酶校准品(以单点校准品为例)稀释成100％，50％，25％，12.5％，0％的5个标准点，将稀释后的抗凝血酶校准品加入75uL第一试剂在37℃孵育200秒，再加入75uL第二试剂，测定第15秒和第45秒的吸光度(OD)，每管重复测定2次，以吸光度(OD)的均值对数值为纵坐标，对应的含量为横坐标，制作“含量-吸光度(对数值)”校准曲线。不同凝血酶抑制剂的校准曲线见图1-图4。

取5uL待测样本，加入咪唑缓冲液45uL稀释，稀释比例为1:10，在37℃孵育20秒，加入75uL第一试剂在37℃孵育200秒，再加入75uL第二试剂，测定第15秒和第45秒的吸光度(OD)，以对数代入校准曲线，即可计算出待测样本中凝血酶抑制剂的含量。

本试剂盒不仅只适用于Ci-300血凝仪，而且还适用于其他品牌型号的凝血分析仪，如希森美康SYSMEX-CS系列、法国斯塔高STA-RMAX血凝仪，美国贝克曼库尔特ACL TOP血凝仪等，具体参数可以根据仪器不同进行适当调整。

实施例3本发明试剂盒的分析性能评估

(1)抗肝素能力的评估

以质控品达比加群为例，肝素抑制剂选用0.05g/L聚凝胺，使用实施例2所述的检测方法，取不含肝素且达比加群含量不同的两组血浆样本，样本1的达比加群含量在50-150ng/mL范围内，样本2的达比加群含量在150-250ng/mL内，进行梯度肝素测试，重复测定3次，计算各测试平均值与空白肝素结果的偏差，结果如表9所示。

表9试剂盒抗肝素能力评估结果

实验结果表明，无论是在低浓度范围内的达比加群还是在高浓度范围内的达比加群，在0.05g/L聚凝胺下，以肝素为0IU/mL作为对照组，不同梯度下的肝素的吸光度与对照组的肝素的吸光度不会产生较大偏差，则认为0.05g/L聚凝胺能较好地抑制肝素的活性，说明本制备方法中的0.05g/L聚凝胺能够抑制肝素，避免假阳性结果的出现。

(2)最低检测限

使用实施例2所述的检测方法，重复进行20次空白测试，计算空白样本含量均值(X)和标准差(SD)，以空白均值加上两倍标准差，计算最低检测限，其结果如表10所示。

表10最低检测极限分析

实验结果表明，相比于达比加群、比伐卢定和水蛭素，阿加曲班的最低检测限为0.02mg/L，可优先使用本试剂盒检测阿加曲班。

(3)单点定标测试线性

将接近线性范围上限的高值样本，用生理盐水分别按照1:0、0.8:0.2、0.6:0.4、0.4:0.6、0.2:0.8、0:1的比例稀释，并以生理盐水为空白样本，加上稀释前原样本，共得到6份不同含量的样本，使用实施例1所得的本发明试剂盒，实施例2所述检测方法检测各样本，每个样本重复测定2次，在单点定标模式下将测定浓度的平均值(X轴)与理论浓度(Y轴)进行线性回归分析，其结果如图5-图8所示。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种检测凝血酶抑制剂的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括第一试剂、第二试剂和抗凝血酶校准品；

所述第一试剂包括凝血酶试剂和稀释试剂；

所述第二试剂包括凝血酶发色底物；

所述抗凝血酶校准品包括已知浓度的凝血酶抑制剂；

所述第一试剂的制备方法为：由所述稀释试剂对凝血酶试剂进行稀释得到，所述凝血酶试剂的pH为6-6.5，所述稀释试剂的pH为8.0-9.0，稀释得到的第一试剂的pH为7.5；其中，所述凝血酶试剂中含有凝血酶、葡萄糖、聚乙烯醇和基础试剂，且葡萄糖和聚乙烯醇的浓度比为(14.8-15.2):(0.8-1.2)，所述稀释试剂中含有聚乙烯醇。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述稀释试剂还包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、聚凝胺、氯化钠和ProClin300。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述基础试剂还包含吗啉乙磺酸缓冲液、牛血清蛋白、甘氨酸、甘露醇和ProClin300。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述凝血酶为人凝血酶、猪凝血酶和牛凝血酶中的一种。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述凝血酶的工作浓度为0.1-2IU/mL，所述凝血酶发色底物的工作浓度为0.2-1.7umol/mL。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述凝血酶抑制剂包括达比加群、阿加曲班、比伐卢定、水蛭素的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第二试剂还包括缓冲液、抗氧化剂、表面活性剂和稳定剂的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质控品。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒检测样本为血液样本。

10.一种使用如权利要求1-9任一项所述的试剂盒检测凝血酶抑制剂的方法，包括以下步骤：

S1、将第一试剂中的凝血酶试剂采用稀释试剂稀释重建，将不同浓度的抗凝血酶校准品进行稀释重建；

S2、将稀释后的抗凝血酶校准品与第一试剂混合孵育，然后加入第二试剂，按特定间隔测定吸光度，根据抗凝血酶校准品中的凝血酶抑制剂浓度以及吸光度制作校准曲线；

S3、稀释待测样本，将稀释后的待测血浆样本与第一试剂混合孵育，然后加入第二试剂，按特定时间间隔测定吸光度，将测得的待测样本的吸光度代入校准曲线中计算出待测样本中凝血酶抑制剂的含量。