CN114814245A - 一种基于发色底物法的蛋白c活性测定试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，蛋白C为一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；R1试剂包括蛋白C激活剂、第一缓冲液和第一辅料；R2试剂包括发色底物Pca‑5297、第二缓冲液和第二辅料；稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH为7.2‑7.6；本发明将蛋白C激活剂和发色底物Pca‑5297搭配使用，检测时切割效率高，反应信号强，反应速度快，灵敏度高，线性范围宽，反应时间短，增加了样本的区分度，有利于线性范围建立以及临床样本测试；试剂为液态，使用方便、成本低廉、稳定性好。

Description

一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒。
背景技术
蛋白C(简称PC)是一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，主要在肝脏中合成，它在凝血酶或凝血酶-血栓调节蛋白复合物的作用下被转变成活化蛋白C(简称APC)。APC与其辅因子蛋白S(简称PS)形成复合物，有灭活Va和VIIIa及增加纤溶的活性，因此具有抗凝作用。当PC缺乏时，因子Va和VIIIa灭活减少及血循环纤溶能力降低，因此促使纤维蛋白形成过多，而导致血栓形成，因此，对PC的测定，对于疾病的预防、监控和治疗有重要作用。
目前，对蛋白C进行定量检测的方法可分为三类：免疫法、APTT凝固法和发色底物法。其中，免疫学方法中的抗原-抗体反应虽然能准确检测PC抗原的含量，但它对特异性抗体的筛选需要高度纯化的PC，这一条件十分苛刻；其次是其整个检测过程时间较长，无法满足急诊病人和临床及时诊断的需要。而APTT凝固法用蛇毒激活PC后，加入到待测血浆中，其中PC的含量对应着其血浆凝固时间的延长的比例，该方法能够特异性检测蛋白C含量，但对结果的影响因素较多，检验人员的经验往往直接影响到检测结果的准确性和重复性。发色底物法早期采用凝血酶-凝血酶调节蛋白作为激活剂，但因为血浆中存在PC抑制剂和干扰物质，其不能直接检测血浆中的PC活性，而需要把PC从血浆中分离出来，这不仅会浪费大量人力物力，检测速度也较慢。
国内市售大部分的PC活性测定试剂盒(发色底物法)主要是进口试剂盒，其价格昂贵，采货周期较长，并且多为冻干粉形态，制作工艺繁琐，成本高且试剂的瓶间差也会因冻干被拉大，冻干粉试剂使用前均需要复溶，并且静置一段时间后才能使用，不利于客户的操作；该类PC活性测定试剂盒，盒内不附赠复溶剂，客户自行选用的复溶剂质量无法把控，对测试结果带来了一定的影响；试剂灵敏度差，线性范围窄，特异性差，导致其检测结果的重复性较差，并且抗干扰能力差，结果易受各种因素的影响，无法反应人体内真实的蛋白C活性水平。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、特异性高、线性范围宽。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，所述蛋白C为一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；
所述R1试剂包括蛋白C激活剂、第一缓冲液和第一辅料，所述第一缓冲液的pH为7.2-7.6；
所述R2试剂包括发色底物Pca-5297、第二缓冲液和第二辅料所述第二缓冲液的pH为7.2-7.6；
所述稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，所述第三缓冲液的pH为7.2-7.6。
进一步地，优选所述蛋白C激活剂的浓度为0.1~0.5 IU/mL。
进一步地，优选所述蛋白C激活剂为蛇毒提取物。
进一步地，优选所述发色底物Pca-5297的浓度为0.5~2mg/ml。
进一步地，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。
进一步地，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为浓度50-100mmol/L的Tris缓冲液。
进一步地，优选所述第一辅料包括第一稳定剂，所述第一稳定剂包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、半乳糖、聚乙二醇2000、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。
进一步地，优选第一稳定剂包括组分：氯化钠、甘露醇、蔗糖、聚乙二醇2000、吐温-20，且以上组分在所述R1试剂中的质量百分比为： 1.0~3.0%氯化钠、3%~5%甘露醇、1-3%蔗糖、0.5~1.5%聚乙二醇2000、0.1~0.5%吐温-20。
进一步地，优选所述第二辅料包括第二稳定剂，所述第二稳定剂包括氯化钠、半乳糖、谷氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的至少一种。
进一步地，优选所述第二稳定剂包括组分：甘露醇、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、吐温-20，且以上组分在所述R2试剂中的质量百分比为： 3-5%甘露醇、1-3%半乳糖、0.5~1.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.1~0.5%吐温-20。
进一步地，优选所述第三辅料还包括第三稳定剂，所述第三稳定剂包括氯化钠、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。
进一步地，优选所述第三稳定剂包括氯化钠，其在稀释试剂中的质量百分比为0.5-1.5%。
进一步地，优选所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。
进一步地，优选所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂的防腐剂均为Proclin-300，所述Proclin-300在所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂中的质量百分比均为0.03-0.05%。
进一步地，优选所述R1试剂、所述稀释试剂均包括蛋白酶保护剂，所述蛋白酶保护剂为BSA、HSA、Prionex中的至少一种。
进一步地，优选所述蛋白酶保护剂为Prionex，所述Prionex在所述R1试剂、所述稀释试剂的质量百分比均为0.03~0.05%。
本发明的有益效果：本发明提供的一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，通过使用蛋白C激活剂和发色底物Pca-5297为试剂原料，活化蛋白C特有的发色底物Pca-5297搭配蛋白C激活剂使用时，活化蛋白C切割发色底物Pca-5297的切割效率更高，反应信号更强，试剂灵敏度更高，线性范围更宽，同时发色底物Pca-5297可排除其他非特异性信号的结合，使试剂盒的特异性更强，所需的反应时间更短，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试；本发明的试剂盒试剂为液态，使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好，为国产首创全液态检测蛋白C活性的测定试剂盒，可以实现对进口蛋白C活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求，还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1的试剂盒与参比试剂盒的相关性线性回归图；
图2是本发明实施例2的试剂盒与参比试剂盒的相关性线性回归图；
图3是本发明实施例3的试剂盒与参比试剂盒的相关性线性回归图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。
一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，蛋白C为一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；R1试剂包括蛋白C激活剂、第一缓冲液和第一辅料，第一缓冲液的pH为7.2-7.6；R2试剂包括发色底物Pca-5297、第二缓冲液和第二辅料第二缓冲液的pH为7.2-7.6；稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，第三缓冲液的pH为7.2-7.6。
本发明试剂盒的工作原理：在待测血浆中加入蛋白C激活剂，蛋白C被激活为活化蛋白C(APC)，APC特异性切割发色底物Pca-5297，使发色底物Pca-5297释放出显色基团pNA（pNA为硝基苯胺，405nm处测定pNA的释放量），反应体系的显色程度与受检血浆中蛋白C的含量呈平行关系，最终根据校准曲线计算出待测血浆中的PC活性。
本发明的一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，通过使用蛋白C激活剂和发色底物Pca-5297为试剂原料，活化蛋白C特有的发色底物Pca-5297搭配蛋白C激活剂使用时，活化蛋白C切割发色底物Pca-5297的切割效率更高，反应信号更强，试剂灵敏度更高，线性范围更宽，同时发色底物Pca-5297可排除其他非特异性信号的结合，使试剂盒的特异性更强，所需的反应时间更短，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试；在反应时间上，本发明中含有蛋白C激活剂的R1试剂加待测样本孵育60s，加入含有发色底物Pca-5297的R2试剂后孵育时间约为60-120s，而现有的试剂盒的R1试剂加待测样本孵育时间在240-300s之间，加入现有试剂盒的R2试剂后孵育时间在120-240s之间，相比之下，本发明的反应更快速，单个测试所需时间更短，减少标本的等待时间，更快的拿到检测报告，优化用户体验，并有利于患者的临床治疗。本发明的试剂盒试剂为液态，使用方便、成本低廉、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、稳定性好，为国产首创全液态检测蛋白C活性的测定试剂盒，可以实现对进口的蛋白C活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求，还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担。
进一步地，优选蛋白C激活剂为蛇毒提取物，蛇毒提取物可特异性激活蛋白C，并排除血浆中的一些其他物质会对蛋白C产生干扰，优选蛋白C激活剂的浓度为0.1~0.5 IU/mL，在该浓度下，蛋白C激活剂对蛋白C的激活效率更高，使蛋白C快速激活为活化蛋白C。发色底物Pca-5297为活化蛋白C特异性的高效底物，该底物的氨基酸序列做了特殊调整与修饰，相比于其他普通的发色底物来说，对于活化蛋白C的敏感度更高，被切割的效率更高，反应更迅速；优选发色底物Pca-5297的浓度为0.5~2mg/ml，在该浓度下，发色底物Pca-5297对于活化蛋白C的敏感度更高，被切割的效率更高。
第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液的pH均为7.2-7.6，通过采用以上任意一种缓冲液都能够有效地将R1试剂、R2试剂、稀释试剂维持在预定的范围内，即将R1试剂、R2试剂、稀释试剂的pH稳定在7.2-7.6之间，并且，通过采用以上的第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液不会对待检测样品中的测定蛋白C活性造成不利的影响；进一步地，优选第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为浓度50-100mmol/L 的Tris缓冲液，在该缓冲液下，蛋白C激活剂和发色底物Pca-5297可以发挥最大效率，提高试剂的灵敏度，同时增加了不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。
第一辅料包括第一稳定剂，第一稳定剂包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、半乳糖、聚乙二醇2000、NP-40、明胶、吐温-20（Tween-20）、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。第一稳定剂的加入可提高R1试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，还可有效保护待检测样本中蛋白C的活性，提高R1试剂的稳定性的作用；如添加蔗糖、半乳糖、海藻糖、葡萄糖、明胶等一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致R1试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面明胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇2000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于蛋白C激活剂均匀的悬浮于第一缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用，还可作为防冻剂，有效降低凝固点，从而达到较好的抗冻融效果；氯化钠、氯化钾等无机盐的加入可以用于调节R1试剂的渗透压，从而可以提高蛋白C激活剂在测定蛋白C活性时将蛋白C激活为活化蛋白的效率；添加吐温-20等可起到表面活性剂的作用，进一步提高试剂稳定性；同时第一稳定剂的添加对蛋白酶也能起到一定的保护作用，提高了试剂盒的稳定性。
在一具体的实施例中，第一稳定剂包括组分：氯化钠、甘露醇、蔗糖、PEG-2000（聚乙二醇2000）、吐温-20，且以上组分在R1试剂中的质量百分比为： 1.0~3.0%氯化钠、3%~5%甘露醇、1-3%蔗糖、0.5~1.5%PEG-2000、0.1~0.5%吐温-20。在上述配比下，有利于试剂盒的试剂稳定性，检测蛋白C活性时准确度高。
第二辅料包括第二稳定剂，第二稳定剂包括氯化钠、半乳糖、谷氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的至少一种，可以是以上组分中的一种，也可以是多个组分组合；第二稳定剂的加入可提高R2试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，使得发色底物Pca-5297均匀的分散于第二缓冲液中，还可有效保护待检测样本中蛋白C的活性，提高R2试剂的稳定性的作用；如添加蔗糖、半乳糖、海藻糖、葡萄糖、明胶等一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致R2试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面明胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；氯化钠、氯化钾等无机盐的加入可以用于调节具有发色底物Pca-5297的R2试剂的渗透压，提高发色底物Pca-5297在测定蛋白C活性时被活化蛋白C切割的效率，从而提高蛋白C活性检测效率；添加吐温-20等可起到表面活性剂的作用，进一步提高R2试剂的稳定性；同时第二稳定剂的添加对蛋白酶也能起到一定的保护作用，提高了试剂盒试剂的稳定性。
在一具体的实施例中，第二稳定剂包括组分：甘露醇、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、吐温-20，且以上组分在R2试剂中的质量百分比为： 3-5%甘露醇、1-3%半乳糖、0.5~1.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.1~0.5%吐温-20。在上述配比下，有利于试剂盒的试剂稳定性，检测蛋白C活性时准确度高。
第三辅料还包括第三稳定剂，第三稳定剂包括氯化钠、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。第三稳定剂的加入可提高稀释试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，可对待检样品进行很好的稀释，氯化钠的加入可以用于调节待检样本的渗透压，使得待检样本中蛋白C的活性不易被破坏，使得可有效检测待检样本中蛋白C的活性。
在一具体的实施例中，第三稳定剂包括氯化钠，其在稀释试剂中的质量百分比为0.5-1.5%。在上述配比下，有利于试剂盒的试剂稳定性，提高测定待测样本的蛋白C活性时的准确度。
R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。添加防腐剂可达到防腐效果，防止由于微生物污染而导致试剂盒失效，有利于延长试剂盒的储存有效期。在一具体实施例中，R1试剂、R2试剂、稀释试剂的防腐剂均为Proclin-300，Proclin-300在R1试剂、R2试剂、稀释试剂中的质量百分比均为0.03-0.05%，上述配比下，试剂盒防腐效果好，有利于提高试剂的稳定性。
R1试剂、稀释试剂均包括蛋白酶保护剂，蛋白酶保护剂为BSA、HSA、Prionex中的至少一种。蛋白酶保护剂的加入有利于延长试剂盒中的R1试剂、稀释试剂的稳定性，有利于试剂盒的长期使用和存储，有利于保护蛋白C的活性，防止蛋白C变性，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对蛋白C起保护作用；防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻部分酶的变性，减轻不利环境因素如加热、表面张力及化学因素引起的变性。
在一具体的实施例中，蛋白酶保护剂为Prionex，Prionex在R1试剂、稀释试剂的质量百分比均为0.03~0.05%。上述配比下，有利于提高试剂的稳定性。
以下通过具体实施方式对本发明做进一步解释说明。
实施例1
一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；具体组分见下表：
表1.实施例1的试剂盒的各试剂组分
Figure 513463DEST_PATH_IMAGE001
注：“/”表示不含此成分。
实施例2
一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；具体组分见下表：
表2.实施例2的试剂盒的各试剂组分
Figure 439831DEST_PATH_IMAGE002
注：“/”表示不含此成分。
实施例3
一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；具体组分见下表：
表3.实施例3的试剂盒的各试剂组分
Figure 395149DEST_PATH_IMAGE003
注：“/”表示不含此成分。
对比例1
对比例1中R1试剂中Protein C激活剂（蛇毒提取物）替换为凝血酶-凝血酶调节蛋白，R2试剂中的发色底物Pca-5297替换为发色底物S-2366，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例2
对比例2中R1试剂、R2试剂以及稀释试剂中的Tris缓冲液替换为Hepes缓冲液，其他组分、用量均与实施例1相同。
对比例3
对比例3中R1试剂中含Mg2+（氯化镁），其他组分、用量均与实施例1相同。
对比例4
对比例4中R1试剂、稀释试剂中均不含蛋白酶保护剂Prionex，其他均与实施例1相同。
使用实施例1-3以及对比例1-4的蛋白C活性测定试剂盒进行定标、空白限、准确度、线性范围、重复性、稳定性以及临床相关性测试。
1. 定标及其结果
采用实施例1-3以及对比例2的蛋白C活性测定试剂盒在全自动凝血分析仪上搭配蛋白C校准品，完成蛋白C项目的校准。校准品为单点校准品，仪器自动浓缩/稀释为C0、C1、C2、C3、C4、C5共5个浓度水平（C0-C5浓度依次升高），定标结果如表4-7所示。定标结果应符合要求：定标曲线的线性回归方程r≥0.980。
表4 .实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的定标结果
Figure 483190DEST_PATH_IMAGE004
表5 .实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的定标结果
Figure 281382DEST_PATH_IMAGE005
表6 .实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的定标结果
Figure 621228DEST_PATH_IMAGE006
表7 .对比例2的蛋白C活性测定试剂盒的定标结果
Figure 555686DEST_PATH_IMAGE007
从表4~7的测试结果发现，实施例1~3标曲线性回归方程的r均≥0.980，符合要求，证明实施例1~3能得到较好的定标曲线。对比例2标曲线性回归方程的r均＜0.980，不符合要求，相邻校准品的OD值没有明显差异，影响试剂的灵敏度和定标曲线的绘制。进一步说明了在Tris缓冲液下Protein C激活剂（蛇毒提取物）和发色底物Pca-5297搭配使用时，具有较好的OD值，对不同浓度的样本区分度高，定标时更易拉开，切割效率高，反应信号强，反应速度快，使得试剂灵敏度更高。
2. 空白限测试及其结果
采用实施例1~3的蛋白C测定试剂盒测定空白样本20次，按照以下的公式（1）和公 式（2）计算平均值（
Figure 814629DEST_PATH_IMAGE008
）、标准差（SD）以及空白限（
Figure 834537DEST_PATH_IMAGE008
＋2SD），测试结果如表8~10所示。测试结果 应符合要求：蛋白C空白限应≤6%。
公式（1）：
Figure 712495DEST_PATH_IMAGE009
，公式（2）：
Figure 501459DEST_PATH_IMAGE010
；
式中：
Figure 196883DEST_PATH_IMAGE011
——测试结果的平均值；
Figure 704087DEST_PATH_IMAGE012
——每次的实测值；
n——测试的次数；
i——测试的序号；
B——相对偏差；
SD——标准差。
表8 .实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的空白限测试结果
Figure 120156DEST_PATH_IMAGE013
表9 .实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的空白限测试结果
Figure 29206DEST_PATH_IMAGE014
表10 .实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的空白限测试结果
Figure 629952DEST_PATH_IMAGE015
从表8~10的测试结果发现，实施例1-3均符合所规定的空白限要求。
3. 准确度测试及其结果
采用实施例1~3以及对比例3的蛋白C活性测定试剂盒测定蛋白C正确度控制品，重复测试3次，按照上述公式（1）和（3）计算相对偏差，测试结果如表11~14所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±10.00%范围内。
公式（3）：
Figure 358874DEST_PATH_IMAGE016
；
式中：
T——正确度控制品标示值；
B——相对偏差。
表11.实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的准确度测试结果
Figure 703267DEST_PATH_IMAGE017
表12.实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的准确度测试结果
Figure 604840DEST_PATH_IMAGE018
表13. 实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的准确度测试结果
Figure 642066DEST_PATH_IMAGE019
表14. 对比例3的蛋白C活性测定试剂盒的准确度测试结果
Figure 858284DEST_PATH_IMAGE020
从表11~14的测试结果发现，实施例1-3的相对偏差比较小，证明实施例1-3都具有很好的准确性。对比例3的相对偏差不符合均在±10.0%范围内的要求。由实施例1与对比例3的结果可知，Mg2+的存在的确会抑制蛋白C被激活，从而使得测试结果不能真实反应待检样本里蛋白C的活性，因此，对比例3的准确性不如实施例1~3。
4.线性范围测试及其结果
将接近试剂盒线性范围上限的高值样本分别稀释成5个不同浓度的样本，对每个浓度的样本测试3次，以理论浓度为（xi），实测结果均值为(yi)，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r），测试结果如表15~18所示。测试结果应符合要求：在10%~140%的线性范围内时，线性相关系数r≥0.980
表15.实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的线性范围测试结果
Figure 881734DEST_PATH_IMAGE021
表16.实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的线性范围测试结果
Figure 499798DEST_PATH_IMAGE022
表17.实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的线性范围测试结果
Figure 442346DEST_PATH_IMAGE023
表18.对比例1的蛋白C活性测定试剂盒的线性范围测试结果
Figure 145860DEST_PATH_IMAGE024
从表15~18的测试结果发现，线性相关系数 r≥0.99，试剂盒线性区间可达10%-140%，说明实施例1-3的试剂盒均符合上述线性范围要求，线性范围宽。而对比例1的线性范围r=0.985，试剂盒线性区间为20%-120%，不符合要求。由实施例1与对比例1可知，蛋白C激活剂（蛇毒提取物）和发色底物Pca-5297搭配使用相比于其他蛋白C激活剂和其他发色底物相比，区分度更高，线性范围更宽。
5.重复性测试及其结果
采用实施例1~3的蛋白C活性测定试剂盒，分别测试蛋白C低值质控品和高值质控 品各10次。按照公式（1）和（2）计算测试结果平均值平均值（
Figure 832056DEST_PATH_IMAGE008
）和标准差（SD），按照公式（4） 计算变异系数（CV），测试结果如表19~21所示。测试结果应符合要求：蛋白C高值质控品和低 值质控品变异系数（CV）≤10%。
公式（4）：
Figure 445571DEST_PATH_IMAGE025
，式中：CV为变异系数。
表19. 实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的重复性测试结果
Figure 824600DEST_PATH_IMAGE026
表20.实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的重复性测试结果
Figure 15410DEST_PATH_IMAGE027
表21 .实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的重复性测试结果
Figure 505297DEST_PATH_IMAGE028
从表19~21的测试结果发现，实施例1-3均符合上述重复性要求。
6. 稳定性测试及其结果
1)开瓶稳定性：将实施例1~3的蛋白C活性测定试剂盒中的R1试剂、R2试剂与稀释试剂开瓶后置于2~8℃储存，在第0天、第10天、第20天、第30天、第35天，第40天进行准确度测试，测试结果如表22~24所示。测试结果应符合要求：蛋白C活性测定试剂盒中R1试剂、R2试剂与稀释试剂开瓶后置于2~8℃储存可以稳定40天，即相对偏差应在±10%范围内。
表22.实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 707739DEST_PATH_IMAGE029
表23. 实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 257669DEST_PATH_IMAGE030
表24. 实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 935775DEST_PATH_IMAGE031
从表22~24的测试结果发现，实施例1~3符合上述开瓶稳定性要求，R1试剂、R2试剂及稀释试剂在开瓶状态下置于2~8℃至少可以稳定储存40天。加速稳定性：将实施例1~3以及对比例4的蛋白C活性测定试剂盒中的R1试剂、R2试剂与稀释试剂在未开封状态下置于37℃储存，在第0天、第8天、第12天、第16天进行准确度测试，测试结果如表25~28所示。测试结果应符合要求：蛋白C活性测定试剂盒中R1试剂、R2试剂与稀释试剂在未开封状态下置于37℃储存可以稳定16天，即相对偏差应在±10%范围内。
表25. 实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 229353DEST_PATH_IMAGE032
表26. 实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 551881DEST_PATH_IMAGE033
表27. 实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 7133DEST_PATH_IMAGE034
表28. 对比例4的蛋白C活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 172535DEST_PATH_IMAGE035
从表25~28的测试结果发现，实施例1-3符合上述加速稳定性要求，R1试剂、R2试剂及稀释试剂在未开封状态下置于37℃至少可以稳定储存16天，对比例4的相对偏差在第16天检测时已不符合均在±10%范围内的要求，即R1试剂、R2试剂及稀释试剂在未开封状态下置于37℃无法稳定储存16天，不符合加速稳定性要求，由实施例1与未添加蛋白保护剂Prionex对比例4的结果可知，通过添加适量的酶蛋白保护剂Prionex有利于试剂盒的长期使用和存储，有利于保护酶的活性，防止蛋白C变性，使得试剂盒具有极好的加速稳定性，相比于对比例4，实施例1-3的试剂盒具有更高的加速稳定性。
7.临床相关性测试及其结果
采用参比试剂盒（STAGO 蛋白C活性测定试剂盒（发色底物法），REF00671）和实施例1-3的蛋白C活性测定试剂盒同时测试一组覆盖线性范围的临床样本（40例），以参比试剂盒的实测值为x轴，实施例1-3试剂盒的实测值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表29-31和附图1-3所示。测试结果应符合要求：线性回归分析应符合线性回归方程的斜率k在0.9~1.1之间且相关系数r≥0.975。
表29. 实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的临床相关性测试结果
Figure 4225DEST_PATH_IMAGE036
表30. 实施例2的蛋白C活性测定试剂盒的临床相关性测试结果
Figure 446839DEST_PATH_IMAGE037
表31. 实施例3的蛋白C活性测定试剂盒的临床相关性测试结果
Figure 72992DEST_PATH_IMAGE038
从表29-31以及附图1-3的测试结果发现，实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒测试临床样本的结果做线性回归分析，线性回归方程的斜率k及相关性r均符合要求，证明实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒具有良好的相关性。
以上数据及附图表明，使用本发明的试剂盒进行相关性能测试，所得结果均符合接受标准。通过上述具体实施例来验证本发明的可行性与合理性，该实施例仅为本发明可供选择的个别实施例说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明申请的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本发明的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。

Claims (16)

1.一种基于发色底物法的蛋白C活性测定试剂盒，所述蛋白C为一种维生素K依赖的血浆丝氨酸蛋白酶酶原，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂与稀释试剂；
所述R1试剂包括蛋白C激活剂、第一缓冲液和第一辅料，所述第一缓冲液的pH为7.2-7.6；
所述R2试剂包括发色底物Pca-5297、第二缓冲液和第二辅料，所述第二缓冲液的pH为7.2-7.6；
所述稀释试剂包括第三缓冲液和第三辅料，所述第三缓冲液的pH为7.2-7.6。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白C激活剂的浓度为0.1~0.5 IU/mL。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白C激活剂为蛇毒提取物。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物Pca-5297的浓度为0.5~2mg/ml。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液均为浓度50-100mmol/L 的Tris缓冲液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一辅料包括第一稳定剂，所述第一稳定剂包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、半乳糖、聚乙二醇2000、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，第一稳定剂包括组分：氯化钠、甘露醇、蔗糖、聚乙二醇2000、吐温-20，且以上组分在所述R1试剂中的质量百分比为： 1.0~3.0%氯化钠、3%~5%甘露醇、1-3%蔗糖、0.5~1.5%聚乙二醇2000、0.1~0.5%吐温-20。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二辅料包括第二稳定剂，所述第二稳定剂包括氯化钠、半乳糖、谷氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、NP-40、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述第二稳定剂包括组分：甘露醇、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、吐温-20，且以上组分在所述R2试剂中的质量百分比为： 3-5%甘露醇、1-3%半乳糖、0.5~1.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.1~0.5%吐温-20。
11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第三辅料还包括第三稳定剂，所述第三稳定剂包括氯化钠、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或几种。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述第三稳定剂包括氯化钠，其在稀释试剂中的质量百分比为 0.5-1.5%。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂均包括防腐剂，所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂的防腐剂均为Proclin-300，所述Proclin-300在所述R1试剂、R2试剂、稀释试剂中的质量百分比均为0.03-0.05%。
15.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂、所述稀释试剂均包括蛋白酶保护剂，所述蛋白酶保护剂为BSA、HSA、Prionex中的至少一种。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶保护剂为Prionex，所述Prionex在所述R1试剂、所述稀释试剂的质量百分比均为0.03~0.05%。
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