CN111304753B - Dna编码分子库的筛选方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DNA编码分子库的筛选方法，包括：提供第一复合物和目标靶点，第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团以及能够特异性结合目标靶点的配体；将第一复合物与目标靶点孵育，得到第二复合物；提供DNA编码分子库，DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA，第二DNA与第一DNA间存在互补碱基序列；将DNA编码分子库与第二复合物孵育，得到第一混合体系；提供切断试剂，将切断试剂与第一混合体系孵育，分离，获得第二混合体系；将第二混合体系进行变性解离，获得解离产物，分析解离产物中的DNA序列信息，根据DNA序列信息确定目标编码化合物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种DNA编码分子库的筛选方法和试剂盒。
背景技术
当代药物研发中，针对疾病的药物靶点，通过构建大型的候选药物分子库，进行高通量、大规模筛选是新药研发中不可或缺的手段。当今世界上主要的制药公司均拥有大型的分子库和大规模的筛选平台用于新药研发，然而，传统的分子库和筛选平台成本高昂、技术门槛高、管理运行复杂，成为严重制约高通量筛选发展和应用的问题。
近年来，DNA编码分子库技术逐渐发展起来，成为药物研发中的新兴筛选方法。在DNA编码分子库中，每一个化合物与一个特异性的DNA片段相连接，该DNA片段成为了特异于该化合物的条形码，从而实现对化合物的特异性编码。DNA编码分子库能够在极小的体系中，实现千万乃至上千亿级的高通量筛选，筛选结果可以通过PCR扩增和DNA测序进行解码分析，从而推断出相应的化合物结构，来获得苗头化合物以应用于进一步药物研发。DNA编码分子库已得到新药研发领域中的广泛认可和应用，成为新药研发中的一种重要支撑技术。
然而，现有使用DNA编码分子库进行药物筛选的方法存在诸多缺陷，一些方法中，所使用的靶点大部分为纯化后的蛋白质，或为经修饰后的蛋白质靶点固载在磁珠之类的固相载体之上形成的固载蛋白，这限制了DNA编码分子库的应用范围，导致其它与疾病体系更加接近、更加具有生物相关度的药物靶点，例如膜蛋白、蛋白质复合体、活细胞、病理组织等，由于较难或无法纯化和固载，而不能够用于DNA编码分子库的筛选，成为本领域的一个瓶颈问题。而例如膜蛋白、蛋白质复合体、活细胞、病理组织等药物靶点，反而是与疾病体系更加接近，更加具有生物相关度，是更有价值的药物筛选靶点。而以不需要被专门过表达的，更加接近生理状态的活细胞作为药物筛选的靶点一直是本领域尚未解决的一个难点。
一些方法中，先采用设置有交联基团的DNA片段标记目标靶点，然后利用该DNA片段与DNA编码分子库中的DNA分子互补，实现化合物分子的筛选，然而，由于该方法采用共价交联的方式标记目标靶点，且后续需要采用强烈变性条件进行洗脱，对活细胞上的靶点的活性造成较大影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种DNA编码分子库的筛选方法和试剂盒。为实现该发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种DNA编码分子库的筛选方法，包括以下步骤：
提供第一复合物和目标靶点，所述第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团以及能够特异性结合所述目标靶点的配体；将所述第一复合物与所述目标靶点孵育，得到第二复合物；
提供DNA编码分子库，所述DNA编码分子库中的编码化合物含有第二 DNA，所述第二DNA与所述第一DNA间存在互补碱基序列；将所述DNA编码分子库与所述第二复合物孵育，得到第一混合体系；
提供切断试剂，将所述切断试剂与所述第一混合体系孵育，分离，获得第二混合体系；
将所述第二混合体系进行变性解离，获得解离产物，分析所述解离产物中的DNA序列信息，根据所述DNA序列信息确定目标编码化合物。
本发明提供的DNA编码分子库的筛选方法中，第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团和配体，通过将第一复合物与目标靶点孵育，使得配体特异性识别目标靶点，从而使得第一复合物结合到目标靶点上；DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA，第二DNA与第一DNA间存在互补碱基序列，将DNA编码分子库与第二复合物孵育，使得第一DNA与第二DNA结合形成稳定DNA双链，以增加目标靶点周围DNA编码分子库的浓度，提高了DNA编码分子库与目标靶点结合的效率；将切断试剂与第一混合体系孵育，使得体系中第一复合物上的可切断基团断裂，然后通过分离除去未能够识别结合目标靶点的编码化合物，从而筛选获得能够与目标靶点结合的目标编码化合物；之后，通过变性解离，使得目标编码化合物解离目标靶点，由于DNA编码分子库中的化合物均标记有特异性的DNA序列，通过分析解离产物中的DNA序列信息，进而确定所述目标编码化合物。因而，本发明所提供的方法，适用于活细胞上的靶点，有效扩大了靶点筛选范围，而且无需采用共价交联的方法标记靶点，可保证靶点的活性不受到影响。
相应的，一种试剂盒，用于DNA编码分子库对目标靶点的筛选，包括：第一复合物、DNA编码分子库和切断试剂；
所述第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团以及能够特异性结合目标靶点的配体；
所述DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA，所述第二DNA与所述第一DNA间存在互补碱基序列；
其中，所述DNA编码分子库的筛选采用上述筛选方法。
本发明提供的试剂盒，用于DNA编码分子库对目标靶点的筛选，包括：第一复合物、DNA编码分子库和切断试剂，通过采用上述筛选方法可实现对 DNA编码分子库的有效筛选，适用于活细胞上的靶点，且可保证靶点的活性不受到影响。
附图说明
图1为实施例1中形成MDA-MB-435S细胞-整合素-A链-FAM复合物的示意图；
图2为实施例1中MDA-MB-435S细胞-整合素-A链-FAM复合物组、D1 组和D2组在白光通道和FAM通道下的显微图像；
图3为实施例1中B链与A链在MDA-MB-435S细胞上形成DNA双链的示意图；
图4为实施例1中鉴定B链共价捕获的蛋白的质谱分析结果；
图5为实施例2中进行DNA编码分子库对细胞表面整合素的筛选过程示意图；
图6为实施例2的筛选结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
一种DNA编码分子库的筛选方法，包括以下步骤：
S01、提供第一复合物和目标靶点，所述第一复合物包括依次连接的第一 DNA、可切断基团以及能够特异性结合所述目标靶点的配体；将所述第一复合物与所述目标靶点孵育，得到第二复合物；
S02、提供DNA编码分子库，所述DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA，所述第二DNA与所述第一DNA间存在互补碱基序列；将所述DNA 编码分子库与所述第二复合物孵育，得到第一混合体系；
S03、提供切断试剂，将所述切断试剂与所述第一混合体系孵育，分离，获得第二混合体系；
S04、将所述第二混合体系进行变性解离，获得解离产物，分析所述解离产物中的DNA序列信息，根据所述DNA序列信息确定目标编码化合物。
本发明实施例提供的DNA编码分子库的筛选方法中，第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团和配体，通过将第一复合物与目标靶点孵育，使得配体特异性识别目标靶点，从而使得第一复合物结合到目标靶点上；DNA 编码分子库中的编码化合物含有第二DNA，第二DNA与第一DNA间存在互补碱基序列，将DNA编码分子库与第二复合物孵育，使得第一DNA与第二 DNA结合形成稳定DNA双链，以增加目标靶点周围DNA编码分子库的浓度，提高了DNA编码分子库与目标靶点结合的效率；将切断试剂与第一混合体系孵育，使得体系中第一复合物上的可切断基团断裂，然后通过分离除去未能够识别结合目标靶点的编码化合物，从而筛选获得能够与目标靶点结合的目标编码化合物；之后，通过变性解离，使得目标编码化合物解离目标靶点，由于DNA 编码分子库中的化合物均标记有特异性的DNA序列，通过分析解离产物中的 DNA序列信息，进而确定所述目标编码化合物。因而，本发明实施例所提供的方法，适用于活细胞上的靶点，有效扩大了靶点筛选范围，而且无需采用共价交联的方法标记靶点，可保证靶点的活性不受到影响。
具体地，步骤S01中，第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团以及能够特异性结合目标靶点的配体，将第一复合物与目标靶点孵育，使得配体特异性结合目标靶点，从而获得第二复合物。
第一DNA用于和DNA编码分子库中的第二DNA进行碱基互补配对形成稳定的DNA双链，增加目标靶点周围DNA编码化合物的浓度，以提高筛选效率，使得DNA编码化合物库可以应用于正常表达的活细胞膜蛋白的筛选。
作为一种实施方式，所述第二DNA与所述第一DNA互为反义序列，使得形成的DNA双链更加稳定。在一些实施例中，所述第一DNA的长度为6-25个碱基，使得与第二DNA互补配对的碱基个数大于6个，可进一步提高形成的 DNA双链的稳定性。
可切断基团用于连接第一DNA和配体，在切断试剂的作用下可切断基团发生断裂，使得第一DNA与固定在目标靶点上的配体分离。在DNA编码分子库中的编码化合物中的第二DNA与第一DNA形成稳定DNA双链后，通过切断可切断基团然后分离，即可除去与目标靶点没有结合力的DNA编码化合物，无需在强烈变性条件下进行分离，避免靶点的活性受到影响。
作为一种实施方式，所述可切断基团包括化学可切断基团或光可切断基团。在一些实施例中，所述化学可切断基团选自2,2'-二硫代二乙酸、3,3'-二硫代二丙酸、2,2'-二硫代二乙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)和3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)中的至少一种，这些化学可切断基团可被二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)等可切断试剂快速切断。在一些实施例中，光可切断基团选自2,5-二氧代吡咯烷-1-(3-羟基-1-(2-硝基苯基)丙基)碳酸酯，该可切断基团在光的作用下可以快速被切断，例如可在365nm光照条件下被快速切断。
配体能够特异性结合所述目标靶点，通过利用配体能够特异性识别目标靶点的特性，将第一复合物标记到目标靶点上，以实现在复杂的活细胞膜上特异性识别目标靶点。一方面，可防止采用共价偶联标记的方法影响靶点的活性，另一方面，使得该方法适用于筛选活细胞上的靶点，使得更多的靶点可以应用于DNA编码分子库的筛选，且省略了现有方法在筛选前需要纯化蛋白或固载蛋白的步骤，大大简化了操作。
配体可选为小分子化合物，也可选为大分子抗体，使得配体能够特异性结合目标靶点即可，例如，当目标靶点为MDA-MB-435S细胞表面的整合素蛋白时，配体可选为专一性结合整合素的小分子配体RGDfK环肽，也可以选为整合素的其他大分子抗体。
目标靶点可来源于病理组织，可选为天然靶点，例如活细胞上的靶点，包括但不限于膜蛋白等，也可选为经纯化处理的纯化蛋白，或选为经固载处理的固载蛋白，或选为蛋白复合体。
作为一种实施方式，所述目标靶点为活细胞上的靶点。由于本发明实施例提供的方法中，主要通过第一DNA与第二DNA互补形成稳定DNA双链，然后通过切断可切断基团，分离除去与目标靶点没有结合力的编码化合物，无需在强烈变性条件下进行分离，当目标靶点为活细胞上的靶点时，可保证细胞活力不受到影响，且用于筛选的目标靶点无需经过纯化处理和固载处理，也不需要被专门过表达，而完全处于其天然的细胞环境中，使得目标靶点能够很好地反映蛋白的天然结构和功能，由此可筛选出有着更加优良的生物相关性、更有可能成为真正的分子探针或药物候选化合物。
将所述第一复合物与所述目标靶点孵育的步骤可参考本领域的常规操作，使得第一复合物能够通过配体识别目标靶点而结合到目标靶点上即可。作为一种实施方式，将所述第一复合物与所述目标靶点孵育的步骤中，所述孵育的条件为0.5-10小时。在一些实施例中，所述孵育的温度为0-37℃。
步骤S02中，所述DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA，所述第二DNA与所述第一DNA间存在互补碱基序列；将所述DNA编码分子库与所述第二复合物孵育，得到第一混合体系。
DNA编码分子库可选为本领域常规的DNA编码分子库，包含多种编码化合物，至少含有一种能够与所述目标靶点结合的目标编码化合物，以实现筛选目标编码化合物的目的。
作为一种实施方式，所述第二DNA与所述第一DNA互为反义序列。在一些实施例中，所述第二DNA的长度为6-25个碱基。
作为一种实施方式，所述编码化合物包括依次连接的化合物、所述第二 DNA以及特异于所述化合物的编码DNA。
通过将DNA编码分子库与第二复合物孵育，使得第一DNA与第二DNA 结合形成稳定DNA双链，以增加目标靶点周围DNA编码分子库的浓度，提高了DNA编码分子库与目标靶点结合的效率。
将DNA编码分子库与第二复合物孵育的步骤可参考本领域的常规操作，使得第一DNA与第二DNA结合形成稳定DNA双链即可。作为一种实施方式，将DNA编码分子库与第二复合物孵育的步骤中，所述孵育的条件为0.5-10小时。在一些实施例中，所述孵育的温度为0-37℃。
步骤S03中，将切断试剂与第一混合体系孵育，使得可切断基团断裂，然后通过分离去除与目标靶点没有结合力的编码化合物，使得第二混合体系中富集有与目标靶点具有结合力的编码化合物。由于将第一复合物与目标靶点孵育的过程中，第一复合物中的配体主要占据目标靶点的正构位点，使得DNA编码分子库中与目标靶点具有结合力的编码化合物主要结合目标靶点的别构位点，也就是，与目标靶点结合的编码化合物主要以目标靶点的别构抑制剂为主。
切断试剂用于切断可切断基团，使得第一DNA与固定在目标靶点上的配体分离。在DNA编码分子库中的编码化合物中的第二DNA与第一DNA形成稳定DNA双链后，通过切断试剂的作用切断可切断基团，然后分离除去与目标靶点没有结合力的编码化合物，从而筛选富集与目标靶点具有结合力的目标编码化合物。
作为一种实施方式，将所述切断试剂与所述第一混合体系孵育的步骤中，所述孵育的时间为1分钟-2小时，以使得切断试剂与第一混合体系中的可切断基团充分反应。
在一些实施例中，切断试剂选为二硫苏糖醇(DTT)和/或三(2-羧乙基)膦 (TCEP)，将该切断试剂与第一混合体系在室温下孵育1小时。在本申请说明书中，室温指的是室内温度，常规为20-35℃。
在一些实施例中，切断试剂选为光切断试剂，将该切断试剂与第一混合体系在365nm光照15分钟。
由于非目标编码化合物不能与目标靶点结合，通过简单的分离方法即可除去非目标编码化合物。优选地，所述分离包括清洗、离心和超滤中的任一种方法。
作为一种实施方式，所述分离采用清洗的方法。通过调节分离次数或分离强度，可筛选出不同类型的目标编码化合物。
在一些实施例中，所述分离的步骤包括：采用去离子水，在室温下洗脱6 次以下。在该洗脱条件下，洗脱强度较弱，目标靶点上的正构位点被对应的配体占据，由此可优先筛选出该目标靶点的别构抑制剂。
在一些实施例中，所述分离的步骤包括：采用磷酸盐(PBS)缓冲液，在室温下洗脱7次以上，然后孵育0.5-5小时后在室温下以磷酸盐(PBS)缓冲液进行再次洗脱。通过该方法，可筛选出获得与该目标靶点结合力较强的活性编码化合物。
步骤S04中，将所述第二混合体系进行变性解离，使得目标编码化合物解离目标靶点，获得解离产物。由于DNA编码分子库中的化合物均标记有特异性的DNA序列，通过分析解离产物中的DNA序列信息，进而确定所述目标编码化合物。
由于在第二混合体系中，目标编码化合物通过与目标靶点的异构位点或正构位点特异性结合，为了使得目标编码化合物能够与目标靶点解离，采用使目标靶点变性的方法进行解离。
作为一种实施方式，将所述第二混合体系进行变性解离的步骤中，采用加热、破碎中的任一种方法。
分析解离产物中的DNA序列信息，可采用本领域的常规方法，如一些实施例中，将解离产物进行定量和PCR扩增，然后将扩增产物进行DNA测序，根据DNA测序结果确定目标编码化合物。
通过上述方法筛选得到的目标编码化合物，可为目标靶点的别构抑制剂，也可以为目标靶点的正构抑制剂。由于第一复合物中的配体以特异性结合目标靶点的正构位点为主，本发明实施例的目标编码化合物优选为目标靶点的别构抑制剂。
与现有技术相比，本发明提供的筛选方法具有以下优点：
1)利用配体能够特异性识别目标靶点的特性，将第一复合物标记到目标靶点上，一方面，可防止采用共价偶联标记的方法影响靶点的活性，另一方面，该法适用于活细胞上的靶点，扩大了靶点筛选范围，并省略了现有方法在筛选前需要纯化蛋白或固载蛋白的步骤，大大简化了操作；
2)第一复合物中的第一DNA以可切断基团与配体连接，在DNA编码分子库中的编码化合物中的第二DNA与第一DNA形成稳定DNA双链后，通过切断可切断基团然后洗脱，即可除去与目标靶点没有结合力的编码化合物，无需在强烈变性条件下进行分离，避免靶点的活性受到影响。
基于上述技术方案，本发明实施例还提供了一种试剂盒。
相应的，一种试剂盒，用于DNA编码分子库对目标靶点的筛选，包括：第一复合物、DNA编码分子库和切断试剂；
所述第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团以及能够特异性结合所述目标靶点的配体；
所述DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA，所述第二DNA与所述第一DNA间存在互补碱基序列；
其中，所述DNA编码分子库的筛选采用上述筛选方法。
本发明实施例提供的试剂盒，用于DNA编码分子库对目标靶点的筛选，包括：第一复合物、DNA编码分子库和切断试剂，通过采用上述筛选方法可实现DNA编码分子库对活细胞上靶点的有效筛选，且可保证靶点的活性不受到影响。
其中，所述试剂盒中的第一复合物、DNA编码分子库和切断试剂的种类和性质与上文所述的第一复合物、DNA编码分子库和切断试剂，应具有与上文所述相同的作用效果。同时，第一复合物、目标靶点、DNA编码分子库和切断试剂的具体保存形式可参考本领域常规技术，使得试剂盒中的第一复合物、DNA 编码分子库和切断试剂能够正常使用上述筛选方法进行筛选即可，本发明实施例对此不作特殊限定。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例一种DNA编码分子库的筛选方法和试剂盒的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。
实施例1
本实施例对活细胞膜蛋白的特异性蛋白质标记进行了验证，具体过程如下：
(1)制备MDA-MB-435S细胞-整合素-RGDfK环肽-A链-FAM复合物
使用MDA-MB-435S细胞为研究体系，以MDA-MB-435S细胞表面的整合素蛋白为研究目标蛋白；
使用RGDfK环肽为专一性结合整合素的小分子配体，将RGDfK环肽通过可切断基团连接第一DNA，获得RGDfK环肽-A链复合物，标记为A链；
为了能够直观显示A链与目标靶点特异性结合，在A链的第一DNA远离 RGDfK环肽的一端连接了荧光基团荧光素(FAM)，获得A链-FAM复合物。
如图1所示，将A链-FAM复合物与MDA-MB-435S细胞孵育，得到 MDA-MB-435S细胞-整合素-A链-FAM复合物。
(2)验证A链与目标靶点整合素特异性结合
为了验证标记的特异性，进行了一系列的对照试验：(D1)：使用了不表达整合素蛋白的阴性对照细胞；(D2)：A链的配体替换为不能够特异性结合整合素的小分子配体苯甲酸乙酯。
采用显微镜观察MDA-MB-435S细胞-整合素-A链-FAM复合物以及D1、 D2组的混合体系，如图2所示，发现MDA-MB-435S细胞-整合素-A链-FAM 复合物产生有明显的绿色荧光，而D1、D2组均没有观察到绿色荧光，证实了 MDA-MB-435S细胞上成功标记了A链-FAM复合物。
(3)验证A链成功标记在整合素蛋白上
设计了B链，B链包括依次连接的生物素(biotin)、第二DNA和光交联基团苯基叠氮，B链中的第二DNA序列与A链中的第一DNA互为反义序列，第一DNA和第二DNA能够通过碱基互补配对形成稳定的DNA双链。
如图3所示，将A链加入MDA-MB-435S细胞中，孵育一段时间后加入B 链，在A链与B链形成DNA双链之后，以波长为365nm的光源进行光照使得 B链中的光交联基团与其周围的蛋白共价连接，之后，采用磁珠固载的链霉亲和素(streptavidin)与biotin相结合，以分离出B链所共价捕获的蛋白(即常用的affinity pull-down的分离方法)。分离出的蛋白，从磁珠上洗脱之后，通过质谱分析进行蛋白质鉴定。
结果如图4所示，显示被B链所捕获的蛋白质为目标靶点整合素，验证了 A链成功标记在整合素蛋白上，特异性高。
实施例2
本实施例进行了DNA编码分子库对细胞表面整合素的筛选，具体过程如图5所示：
提供DNA编码分子库，该DNA编码分子库容纳有3,000万的编码化合物，每一编码化合物包括依次连接的化合物、可切断基团、第二DNA(标记为n1) 和特异于化合物的编码DNA(标记为n2)，与此同时，DNA编码分子库中还包含有能够特异性识别整合素蛋白的编码RGDfK环肽，作为阳性对照；
将A链与MDA-MB-435S细胞充分混合孵育后，A链中连接的整合素蛋白的小分子配体RGDfK环肽识别结合MDA-MB-435S细胞表面的整合素蛋白，获得包含有MDA-MB-435S细胞-整合素-A链-FAM复合物的混合体系；
在体系中加入DNA编码分子库，编码化合物通过与A链的第一DNA(标记为n1r)碱基互补配对形成稳定的DNA双链而标记在MDA-MB-435S细胞上，获得第一混合体系。
在第一混合体系中加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，在室温下作用1小时，采用磷酸盐(PBS)缓冲液洗脱7次，DNA编码分子库中与整合素蛋白没有结合力的编码化合物的被洗脱掉，与整合素蛋白有结合力编码化合物的留在细胞上，获得第二混合体系；
将第二混合体系进行再次孵育，然后洗脱，接着进行加热解离，收集解离产物，将解离产物利用常规的乙醇沉淀方法进行纯化、浓缩，之后进行定量、 PCR扩增，生成最终的测序样品进行测序，获得DNA测序的结果。
对DNA测序的结果进行数据分析处理，对每一个化合物的DNA编码序列个数进行统计，计算出筛选后每个化合物的含量百分比，并与未有经过任何筛选的原始分子库中的化合物含量百分比进行比较，计算出筛选所获得的分子库化合物的富集倍数(enrichmentfold)，再以富集倍数为纵坐标，筛选后序列个数为横坐标，获得如图6所示的筛选结果图。
图6中，偏向于右上角的数据点代表的是与目标靶点整合素具有较好结合能力的化合物，并且越倾向于右上角，代表与整合素的结合力越强。对图中的筛选结果进行分析之后，我们发现整合素的已知小分子配体RGDfK环肽，明显地处于图的右上角，反映了RGDfK环肽对靶点蛋白整合素较高的结合力(结合平衡常数Kd＝41.7nM)。而对于所筛选出来的分子库化合物，我们选取了一个富集度较高点，标记为化合物A。
根据DNA编码所反映出的化合物结构，重新合成了不带有DNA标签的化合物A，利用表面等离子共振(surface plasma resonance，SPR)对化合物A与整合素蛋白的结合力进行了测量，获得了15uM的结合力；作为对照，我们还随机选取了没有被整合素筛选到的分子库化合物B进行了合成，相应的SPR结果显示化合物B与靶点整合素蛋白的结合力大于800μM，显示出对SPR并没有活性，该数据验证了本筛选方法对靶点的特异性。
其中，化合物A和化合物B的分子结构如下：
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种DNA编码分子库的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供第一复合物和目标靶点，所述第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团以及能够特异性结合所述目标靶点的配体；将所述第一复合物与所述目标靶点孵育，使得所述配体特异性识别所述目标靶点而使得所述第一复合物结合到所述目标靶点上，得到第二复合物；
提供DNA编码分子库，所述DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA和特异于所述编码化合物的DNA序列，所述编码化合物包括依次连接的化合物、所述第二DNA以及特异于所述化合物的编码DNA，所述第二DNA与所述第一DNA间存在互补碱基序列；将所述DNA编码分子库与所述第二复合物孵育，使得所述第一DNA与所述第二DNA结合形成稳定DNA双链，得到第一混合体系；
提供切断试剂，将所述切断试剂与所述第一混合体系孵育，使得所述第一复合物上的所述可切断基团断裂，分离除去未能够识别结合所述目标靶点的编码化合物，获得第二混合体系；
将所述第二混合体系进行变性解离，获得解离产物，分析所述解离产物中的DNA序列信息，所述DNA序列信息为所述特异于所述编码化合物的编码DNA序列，根据所述DNA序列信息确定目标编码化合物。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述第二DNA与所述第一DNA互为反义序列。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述第一DNA的长度为6-25个碱基；和/或
所述第二DNA的长度为6-25个碱基。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述目标靶点为活细胞上的靶点；和/或
所述目标编码化合物为所述目标靶点的别构抑制剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的筛选方法，其特征在于，将所述DNA编码分子库与所述第二复合物孵育的步骤中，所述孵育的时间为0.5-10小时。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述可切断基团包括化学可切断基团或光可切断基团。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的筛选方法，其特征在于，将所述第二混合体系进行变性解离的步骤中，采用加热、破碎中的任一种方法；和/或
所述分离包括清洗、离心和超滤中的任一种方法。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述切断试剂选自二硫苏糖醇和/或三(2-羧乙基)膦。
9.一种试剂盒，其特征在于，用于DNA编码分子库对目标靶点的筛选，包括：第一复合物、DNA编码分子库和切断试剂；
所述第一复合物包括依次连接的第一DNA、可切断基团以及能够特异性结合所述目标靶点的配体；
所述DNA编码分子库中的编码化合物含有第二DNA和特异于所述编码化合物的DNA序列，所述编码化合物包括依次连接的化合物、所述第二DNA以及特异于所述化合物的编码DNA，所述第二DNA与所述第一DNA间存在互补碱基序列；
其中，所述DNA编码分子库对目标靶点的筛选采用权利要求1至8中任一项所述的筛选方法。
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