CN118222469A - 一种戊二酸生产菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
一种戊二酸生产菌株及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种合成戊二酸的工程菌，其特征在于：具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体。其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与戊二酸代谢途径相关的基因；其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与赖氨酸代谢途径相关的基因；其染色体DNA上整合或敲除一个或多个与戊二酸生产转运相关的基因。因此，利用上述工程菌生产戊二酸具有传代稳定、成本低廉、转化率高等优点，有利于工业化生产，降低成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更确切的说，本发明涉及一种戊二酸生产菌株的构建方法和应用。
背景技术
戊二酸(1,5-pentanedioic acid,Glutarate)是一种脂肪族二元羧酸，分子式是C5H8O4，分子量132.11，结构式：易溶于水、乙醇、***等，在水中溶解度可达430g·L-1。在所有二元羧酸中，戊二酸的熔点最低，为95-98℃，这一良好的特性使其更适合用于尼龙-4,5和尼龙-5,5等重要聚合物的C5二羧酸结构单元。同时其也是1,5-戊二醇的前体，1,5-戊二醇是用作助焊剂活化剂和药物中间体的常用增塑剂。所以戊二酸在药物和化工合成领域具有重要的应用价值。
目前国内外生产戊二酸主要有以下几种方法：
(1)化学法：该方法通过丁内酯与氯化钾开环，随后水解生成；也可有1,3-二溴丙烷与***/***反应制得二氢衍生物，随后水解生成。该方法不仅成本高，而且需要使用、生成氰化物，对环境不友好。
(2)生物法：该方法可以通过四条代谢途径实现：α-酮戊二酸还原途径、α-酮戊二酸碳链延伸和脱羧途径、反向β氧化途径和赖氨酸分解代谢途径。该方法具有成本低、条件温和、环境污染少等诸多优点。但目前戊二酸发酵生产依赖于以质粒为载体的基因过表达体系，其劣势是菌株传代稳定性差。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种稳定的戊二酸生产菌株。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建戊二酸生产菌株的基因工程方法。
因此，本发明提供了一种合成戊二酸的工程菌，其特征在于：其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与戊二酸代谢途径相关的基因；其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与赖氨酸代谢途径相关的基因；其染色体DNA上整合或敲除一个或多个与戊二酸生产转运相关的基因。
优选地，所述所述与戊二酸代谢途径相关的基因为cadA、patA、patD、gabT、gabD中的一个或多个；所述与赖氨酸代谢途径相关的基因为lysA、lysC、dapA、dapB、ddh中的一个或多个；所述与戊二酸生产转运相关的基因为gabP、ptsG、ynfM中的一个或多个。
优选地，所述戊二酸生产菌株属于大肠杆菌种属。
进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型BW25113。
本发明还提供所述的戊二酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中一步或多步：
A、构建菌株中一个或多个与戊二酸代谢途径相关的基因以多拷贝的形式整合到染色体DNA上过表达；
B、构建菌株中一个或多个与赖氨酸代谢途径相关的基因以多拷贝的形式整合到染色体DNA上过表达；
C、构建菌株中一个或多个与戊二酸生产转运相关的基因被敲除或整合到染色体DNA上过表达。
优选地，所述步骤A中与戊二酸代谢途径相关的基因为cadA、patA、patD、gabT、gabD中的一个或多个；
所述步骤B中赖氨酸代谢途径相关的基因为lysA、lysC、dapA、dapB、ddh中的一个或多个。
所述步骤C中与戊二酸生产转运相关的基因为gabP、ptsG、ynfM中的一个或多个。
优选地，上述步骤中所述的构建菌株属于大肠杆菌种属。
进一步优选地，所述菌株为大肠杆菌K-12野生型BW25113。
本发明还提供所述戊二酸生产菌株在生产戊二酸中的应用。
本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明通过对戊二酸代谢途径相关的特定基因进行多拷贝整合表达，可实现稳定高产的目的。相对之前报道的通过质粒载体过表达的方式，本发明的菌株传代稳定性更高，发酵结果稳定，且产量较之前高。
(2)本发明所构建的戊二酸生产菌株在发酵过程中，相对质粒载体表达的菌种副产物少，糖转化率高。
(3)本发明的戊二酸生产菌株，发酵全程无需使用抗生素，避免了抗生素对环境的污染以及潜在的抗性基因流入环境的可能。
附图说明
图1是戊二酸生物合成途径。
图2是戊二酸标品的HPLC检测图。
图3是发酵产品的HPLC检测图。
图4是本发明实施例1-9中戊二酸生产菌株摇瓶发酵结果图。
图5是本发明实施例9中戊二酸生产菌株发酵罐发酵结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
实施案例中均采用大肠杆菌BW25113构建戊二酸生产菌株，对所属大肠杆菌基因组中的基因进行敲除和编辑主要是基于CRISPR/Cas9技术。可参照文献“Multiple-stepchromosomal integration of divided segments from a large DNA fragment viaCRISPR/Cas9 in Escherichia coli.J Ind Microbiol Biotechnol.2019Jan；46(1):81-90.”。
实施案例中采用的温敏性质粒具有文献J Ind Microbiol Biotechnol.2019Jan；46(1):81-90中的温敏性质粒所示的DNA序列结构；所述大肠杆菌BW25113菌株为常用大肠杆菌，可市售获得。实施案例中，所述***糖诱导条件具体为：在含20mM***糖的LB培养基中，30℃诱导培养。
实施例1
在染色体DNA上单拷贝表达cadA的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上整合表达cadA的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA)，其构建方法可参考Microb Cell Fact.2016Dec 1；15(1):205，具体包括如下步骤：
(1)构建三合一片段和pTarget质粒：以菌株BW25113染色体DNA为模板，以cadB-U-F、cadB-U-R、cadA-D-F、cadA-D-R为引物，通过PCR进行扩增得到cadB的上下游同源臂。再以cadB-U-F、cadA-D-R为引物，以上一步pcr扩增得到的片段和Ptrc启动子做模板，通过重叠延伸PCR法进行扩增，构成整合供体DNA；以cadB-pTarget-F、pTarget-R为引物，以线性pTarget原质粒为模板，通过pcr扩增得到cadB位点的pTarget线性质粒，通过Basic-mix同源重组酶，将所得线性pTarget质粒通过同源重组环化，得到cadB位点的pTarget质粒。所述pTarget质粒表达sgRNA。
所述引物cadB-U-F具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述引物所述引物cadB-U-R具有如SEQ ID No.2所示的序列，所述引物cadA-D-F具有如SEQ ID No.3所示的序列，所述引物cadA-D-R具有如SEQ ID No.4所示的序列，所述引物cadB-pTarget-F具有如SEQ IDNo.5所示的序列，所述引物pTarget-R具有如SEQ ID No.6所示的序列。
SEQ ID No.1：5’-GTGGAAAGATAAGATACAGCGGTAA-3’
SEQ ID No.2：5’-ATGATTAATTGTCAAGCGATGTAAACAATAC-3’
SEQ ID No.3：5’-AGGAAACAGACCATGAACGTTATTGCAATA-3’SEQ ID No.4：5’-GTGCTTTAGTCAGCGGAGGC-3’
SEQ ID No.5：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTATCACTCTGATGAACTCTGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
SEQ ID No.6：5’-CTAGTATTATACCTAGGACTGAGCT-3’
(2)CRISPR基因编辑技术：将pREDCas9质粒电转化进宿主菌BW25113，将转化混合物涂布于固体LB氨苄抗性平板上，30℃培养20h，挑取单菌落接种至LB氨苄抗性培养基试管中，于200rpm恒温摇床中30℃恒温培养10h，按体积分数1％～10％接种量转接至含50mL LB氨苄抗性培养基的三角瓶中，于200rpm恒温摇床中30℃恒温培养1h，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，继续培养1h，将菌液离心，制备感受态，电转化步骤(1)中供体DNA和pTarget质粒，将转化混合物涂布于固体LB氨苄抗性和壮观霉素抗性平板上，30℃培养20h。挑取单菌落并利用引物cadB-U-F、cadA-D-R进行验证。
(3)将步骤(2)中验证正确的菌株置于***糖诱导条件下培养，消除pTarget质粒，同时消除质粒所带的氨苄青霉素抗性。然后将消除pTarget质粒的菌株继续在42℃下培养消除Cas9质粒，同时消除质粒所带的壮观霉素抗性，即得到所述菌株BW25113(ΔcadB::cadA)。
实施例2
在染色体DNA上单拷贝表达patAD的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上整合表达patAD的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例1产物菌株为操作对象，整合位置为ilvG，整合的基因为patAD。具体为将实施案例1中所述步骤(1)中采用的引物由cadB-U-F、cadB-U-R、cadA-D-F、cadA-D-R、cadB-pTarget-F，替换为ilvG-U-F、ilvG-U-R、ilvG-patAD-F、ilvG-patAD-R、ilvG-D-F、ilvG-D-R、ilvG-pTarget-F。
其中所述引物ilvG-U-F具有如SEQ ID No.7所示的序列、所述引物ilvG-U-R具有如SEQ ID No.8所示的序列、所述引物ilvG-patAD-F具有如SEQ ID No.9所示的序列、所述引物ilvG-patAD-R具有如SEQ ID No.10所示的序列、所述引物ilvG-D-F具有如SEQ IDNo.11所示的序列、所述引物ilvG-D-R具有如SEQ ID No.12所示的序列、所述引物ilvG-pTarget-F具有如SEQ ID No.13所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.7：5’-TGCAAGTGAAGTTGAGTTGTTCTGGC-3’
SEQ ID No.8：5’-TCAAGATTCAGGACGGGGAACTAACTTTGACAATTAATCATCCGGCTC-3’
SEQ ID No.9：5’-GCGCTCGAAGGTAACCTGTTCATGGTCTGTCTCCTGTGTGAAATTGT-3’
SEQ ID No.10：5’-GCCACGTCATGGTTAAACATTAATGCAACATCAGGT-3’
SEQ ID No.11：5’-GCCGATACATTGACCTGATGTTGCATTAATGTTTAAC-3’
SEQ ID No.12：5’-CTATCGCTTCCCGGTTTCGCA-3’
SEQ ID No.13：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTGGAAGAGTTGCCGCGCATCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例3
在染色体DNA上两拷贝表达patAD的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上二拷贝整合表达patAD的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例2产物菌株为操作对象，整合位置为mbhA，整合的基因为patAD。具体为将实施案例2中采用的引物由ilvG-U-F、ilvG-U-R、ilvG-patAD-F、ilvG-patAD-R、ilvG-D-F、ilvG-D-R、ilvG-pTarget-F，替换为mbhA-U-F、mbhA-U-R、mbhA-patAD-F、mbhA-patAD-R、mbhA-D-F、mbhA-D-R、mbhA-pTarget-F。
其中所述引物mbhA-U-F具有如SEQ ID No.14所示的序列、所述引物mbhA-U-R具有如SEQ ID No.15所示的序列、所述引物mbhA-patAD-F具有如SEQ ID No.16所示的序列、所述引物mbhA-patAD-R具有如SEQ ID No.17所示的序列、所述引物mbhA-D-F具有如SEQ IDNo.18所示的序列、所述引物mbhA-D-R具有如SEQ ID No.19所示的序列、所述引物mbhA-pTarget-F具有如SEQ ID No.20所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.14：5’-GATCCCTTCCCTGCTGCTCT-3’
SEQ ID No.15：5’-GAGCCGGATGATTAATTGTCAACTGATTTTATTTAACGGCGACAG-3’
SEQ ID No.16：5’-ACAATTTCACACAGGAGACAGACCATGAACAGGTTACCTTCGAGCGC-3’
SEQ ID No.17：5’-CTGCATCACTTTAATGTTTAACCATGATGGC-3’
SEQ ID No.18：5’-GTTAAACATTAAAGTGATGCGTAGCGCAAT-3’
SEQ ID No.19：5’-CAAGGTGAGATGTGGGCATAAT-3’
SEQ ID No.20：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTTACCGTTCATACCGATGCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例4
在染色体DNA上三拷贝表达patAD的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上三拷贝整合表达patAD的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例3产物菌株为操作对象，整合位置为mbhA，整合的基因为patAD。具体为将实施案例2中采用的引物由ilvG-U-F、ilvG-U-R、ilvG-patAD-F、ilvG-patAD-R、ilvG-D-F、ilvG-D-R、ilvG-pTarget-F，替换为ygaY-U-F、ygaY-U-R、ygaY-patAD-F、ygaY-patAD-R、ygaY-D-F、ygaY-D-R、ygaY-pTarget-F。
其中所述引物ygaY-U-F具有如SEQ ID No.21所示的序列、所述引物ygaY-U-R具有如SEQ ID No.22所示的序列、所述引物ygaY-patAD-F具有如SEQ ID No.23所示的序列、所述引物ygaY-patAD-R具有如SEQ ID No.24所示的序列、所述引物ygaY-D-F具有如SEQ IDNo.25所示的序列、所述引物ygaY-D-R具有如SEQ ID No.26所示的序列、所述引物ygaY-pTarget-F具有如SEQ ID No.27所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.21：5’-CCTACAAACCACATCGCACATT-3’
SEQ ID No.22：5’-GAGCCGGATGATTAATTGTCAAACACCGAAGCAACCCAAAAG-3’
SEQ ID No.23：5’-ACAATTTCACACAGGAGACAGACCATGAACAGGTTACCTTCGAGCGC-3’
SEQ ID No.24：5’-GTTAAACATTAATTGCTTGCCGCTCCAC-3’
SEQ ID No.25：5’-CGGCAAGCAATTAATGTTTAACCATGACGTGGC-3’
SEQ ID No.26：5’-GGAGTAGGGCTTTCCATAGAGTGT-3’
SEQ ID No.27：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTCTCAACTACCCACAGTTGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例5
在染色体DNA上整合表达gabTDP的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上整合表达gabTDP的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例4产物菌株为操作对象，整合位置为lhgD，整合的基因为gabTDP。具体为将实施案例1所述步骤(1)中采用的引物由cadB-U-F、cadB-U-R、cadA-D-F、cadA-D-R、cadB-pTarget-F，替换为lhgD-U-F、lhgD-U-R、lhgD-D-F、lhgD-D-R、lhgD-pTarget-F。
其中所述引物lhgD-U-F具有如SEQ ID No.28所示的序列、所述引物lhgD-U-R具有如SEQ ID No.29所示的序列、所述引物lhgD-D-F具有如SEQ ID No.30所示的序列、所述引物lhgD-D-R具有如SEQ ID No.31所示的序列、所述引物lhgD-pTarget-F具有如SEQ IDNo.32所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.28：5’-CAGCGGCATTGTCAGCTACC-3’
SEQ ID No.29：5’-GAGCCGGATGATTAATTGTCAAGCCCAGTCCTGAGCGTAGAT-3’
SEQ ID No.30：5’-ACAATTTCACACAGGAGACAGACCATGAAACTTAACGACAGTAACTTATTCCGC-3’
SEQ ID No.31：5’-ACCGGCTTTGCGGGTAATCA-3’
SEQ ID No.32：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTCCCCGGACGCACGCTGCGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例6
在染色体DNA上整合表达lysC和dapA的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-lysA-dapA)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上整合表达lysC和dapA的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-lysA-dapA)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例5产物菌株为操作对象，整合位置为yciQ，整合的基因为lysC、lysA和dapA。具体为将实施案例2采用的引物由ilvG-U-F、ilvG-U-R、ilvG-patAD-F、ilvG-patAD-R、ilvG-D-F、ilvG-D-R、ilvG-pTarget-F，替换为yciQ-U-F、yciQ-U-R、yciQ-lysC-F、yciQ-dapA-R、yciQ-D-F、yciQ-D-R、yciQ-pTarget-F。
其中所述引物yciQ-U-F具有如SEQ ID No.33所示的序列、所述引物yciQ-U-R具有如SEQ ID No.34所示的序列、所述引物yciQ-lysC-F具有如SEQ ID No.35所示的序列、所述引物yciQ-dapA-R具有如SEQ ID No.36所示的序列、所述引物yciQ-D-F具有如SEQ IDNo.37所示的序列、所述引物yciQ-D-R具有如SEQ ID No.38所示的序列、所述引物yciQ-pTarget-F具有如SEQ ID No.39所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.33：5’-TTACTTGAAGCATTGGGCGAAC-3’
SEQ ID No.34：5’-GAACCCTGGCATCTTGACTGGTTGACAATTAATCATCCGGCTC-3’
SEQ ID No.35：5’-ATGTCTGAAATTGTTGTCTCCAATTGGCGG-3’
SEQ ID No.36：5’-GGTTCTTGTCAGACTTACAGCAAACCGGCATGCTTAAG-3’
SEQ ID No.37：5’-GGTTTGCTGTAAGTCTGACAAGAACCAGCAAATCCT-3’
SEQ ID No.38：5’-GTTATGCCCACGGTGAAGCTAT-3’
SEQ ID No.39：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTAAACAACGGGGCTTGCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例7
在染色体DNA上整合表达ddh的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-lysA-dapA，ΔgapC::ddh)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上整合表达ddh的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-dapA，ΔgapC::ddh)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例6产物菌株为操作对象，整合位置为gapC，整合的基因为ddh。具体为将实施案例2采用的引物由ilvG-U-F、ilvG-U-R、ilvG-patAD-F、ilvG-patAD-R、ilvG-D-F、ilvG-D-R、ilvG-pTarget-F，替换为gapC-U-F、gapC-U-R、gapC-ddh-F、gapC-ddh-R、gapC-D-F、gapC-D-R、gapC-pTarget-F。
其中所述引物gapC-U-F具有如SEQ ID No.40所示的序列、所述引物gapC-U-R具有如SEQ ID No.41所示的序列、所述引物gapC-ddh-F具有如SEQ ID No.42所示的序列、所述引物gapC-ddh-R具有如SEQ ID No.43所示的序列、所述引物gapC-D-F具有如SEQ ID No.44所示的序列、所述引物gapC-D-R具有如SEQ ID No.45所示的序列、所述引物gapC-pTarget-F具有如SEQ ID No.46所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.40：5’-TGGGAAGAAACCACGAAACTCCA-3’
SEQ ID No.41：5’-TCTCGCCTACCTGCTGAAACATTGACAATTAATCATCCGGC-3’
SEQ ID No.42：5’-ACAATTTCACACAGGAGACAGACCATGACCAACATCCGCGTAGCTA-3’
SEQ ID No.43：5’-CCAGGCGTCGACTTAGACGTCGCGTG-3’
SEQ ID No.44：5’-GTCTAAGTCGACGCCTGGTACGATAACGAATATGGC-3’
SEQ ID No.45：5’-GCAGCAATGTCGGCGGATAA-3’
SEQ ID No.46：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTACAGAATATTCGCGAAAAAACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例8
在染色体DNA上敲除ptsG的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-dapA，ΔgapC::ddh，ΔptsG)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上敲除ptsG的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-dapA，ΔgapC::ddh，ΔptsG)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例7产物菌株为操作对象，敲除的基因为ptsG。具体为将实施案例1所述步骤(1)中采用的引物由cadB-U-F、cadB-U-R、cadA-D-F、cadA-D-R、cadB-pTarget-F，替换为ptsG-U-F、ptsG-U-R、ptsG-D-F、ptsG-D-R、ptsG-pTarget-F。
其中所述引物ptsG-U-F具有如SEQ ID No.47所示的序列、所述引物ptsG-U-R具有如SEQ ID No.48所示的序列、所述引物ptsG-D-F具有如SEQ ID No.49所示的序列、所述引物ptsG-D-R具有如SEQ ID No.50所示的序列、所述引物ptsG-pTarget-F具有如SEQ IDNo.51所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.47：5’-CTAACTGACGGAGCGTGACT-3’
SEQ ID No.48：5’-AATATCCAACTCTGTTTTATTTTTCCATCAGATAGCGC-3’
SEQ ID No.49：5’-GCGCTATCTGATGGAGTTGGATATTCCGAATTAAGTATCT-3’
SEQ ID No.50：5’-ATATTGGTCAGGATCTGCTTAACCTG-3’
SEQ ID No.51：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTAAAACCATACCACAGCAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例9
在染色体DNA上整合ynfM的基因工程菌株BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-dapA，ΔgapC::ddh，ΔptsG，ΔycgH::ynfM)的构建。
本实施案例构建的戊二酸生产菌株为染色体DNA上敲除PTSG的基因工程菌BW25113(ΔcadB::cadA，ΔilvG::patAD，ΔmbhA::patAD，ΔygaY::patAD，ΔlhgD::gabTDP，ΔyciQ::lysC-dapA，ΔgapC::ddh，ΔptsG，ΔycgH::ynfM)的构建，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现菌株构建。构建方法与实施案例1的方法基本相似，区别仅在于：以实施案例7产物菌株为操作对象，整合位置为ycgH，整合的基因为ynfM。具体为将实施案例2采用的引物由ilvG-U-F、ilvG-U-R、ilvG-patAD-F、ilvG-patAD-R、ilvG-D-F、ilvG-D-R、ilvG-pTarget-F，替换为ycgH-U-F、ycgH-U-R、ycgH-ynfM-F、ycgH-ynfM-R、ycgH-D-F、ycgH-D-R、ycgH-pTarget-F。
其中所述引物ycgH-U-F具有如SEQ ID No.52所示的序列、所述引物ycgH-U-R具有如SEQ ID No.53所示的序列、所述引物ycgH-ynfM-F具有如SEQ ID No.54所示的序列、所述引物ycgH-ynfM-R具有如SEQ ID No.55所示的序列、所述引物ycgH-D-F具有如SEQ IDNo.56所示的序列、所述引物ycgH-D-R具有如SEQ ID No.57所示的序列、所述引物ycgH-pTarget-F具有如SEQ ID No.58所示的序列，具体如下：
SEQ ID No.52：5’-CTTATTGCAAAACCCAGTACCGGGC-3’
SEQ ID No.53：5’-TACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGAGCTCAGATTACCAAAACGGAGGG-3’
SEQ ID No.54：5’-ACAATTTCACACAGGAGACAGACCATGTTCACGGGAAGTATTGTCGCG-3’
SEQ ID No.55：5’-GTCGATGAATACGTTACAGCAAACCGGCATGCTTAAGC-3’
SEQ ID No.56：5’-CGGTTTGCTGTAACGTATTCATCGACGCGGTACATATG-3’
SEQ ID No.57：5’-GTTGGTGCTGTCACTGGCGTTCTGA-3’
SEQ ID No.58：5’-TCCTAGGTATAATACTAGTGCGTAGTCGAAATTCTCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’
实施例10戊二酸生产菌株摇瓶发酵生产戊二酸
本实施案例采用实施案例1中制备得到的菌株进行戊二酸的发酵生产，其生产方法具体如下：
取实施案例1中最终制备得到的菌株，将其接种到4mL无抗液体LB培养基中，37℃培养10h，取1ml接种到50mL发酵培养基中，在37℃、转速220rpm条件下进行发酵培养，分别在之后分别在12h、24h、36h、48h取样并用高效液相色谱测定戊二酸浓度。实验案例1-9戊二酸发酵结果如图3所示。
本发明所采用的发酵培养基为M10培养基，具体配方为：为10-25g/L葡萄糖、1-5g/L酵母膏、8-16g/L(NH4)2SO4、1-5g/L KH2PO4、1-5g/L MgSO4、10-30g/L CaCO3。
戊二酸的HPLC检测条件：使用有机酸柱(Amine HPX-87H Ion Exclusion Column，300mm×7.8mm)，进样量20μL，柱温50℃。5mM H2SO4等度洗脱，流速0.5mL min-1。
作为本实施案例可替换的实施方案，所述事实案例1最终制备得到的菌株还可替换为实施案例2-9中最终制备得到的菌株。
实施例11戊二酸生产菌株发酵放大
本实施案例采用实施案例9中制备得到的菌株进行戊二酸的发酵放大生产，其生产方法具体如下：
取实施案例9中最终制备得到的菌株，将其接种到4mL无抗液体LB培养基中，37℃培养10h，再将其转移至种子培养基，在37℃、转速220rpm条件下培养10h，之后按8％的接种量接种到装有1L发酵培养基的3L发酵罐中进行发酵，发酵即得戊二酸。之后分别在12h、24h、36h、48h取样并用高效液相色谱测定戊二酸浓度。具体发酵结果如图4所示。
作为本实施案例优选地实施方式，在所属发酵罐进行发酵时，维持温度在37℃、溶氧10％-20％，并用NH3·H2O调节PH在7.0；在所述发酵罐中发酵时，在线监测所述发酵罐中葡萄糖含量，当其下降到3g/L时，流加补料溶液，维持葡萄糖含量在1-5g/L。本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，不影响本发明目的的实现。
需要说明的是，本发明所述种子培养基为LB培养基，具体配方为：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。所述发酵培养基具体成分为：15g/L葡萄糖，8g/L(NH4)2SO4，6g/LKH2PO4，10g/L酵母膏，2g/L Mg2SO4，0.8g/L柠檬酸，30mg/L VB1,30m g/L VB6,5mL微量元素溶液，其余为水。
实施例12戊二酸生产菌株发酵结果统计
本实施案例对实施案例1-9中所构建菌株进行戊二酸的发酵生产，具体发酵发酵结果如图3、图4所示。其中图3为生产菌株摇瓶发酵产量图，图4为实施案例9中生产菌株发酵罐产量图。
由图可知，本发明菌株发酵生产戊二酸摇瓶产量为8.5g/L，发酵罐产量最高达84g/L。且随着改造进行，戊二酸产量逐步提升，表明本发明对各基因的改造起到了明显效果。
表1本发明实施例中涉及的质粒和菌株列表
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (9)
1.一种合成戊二酸的工程菌，其特征在于：具有单一稳定的染色体，不含质粒形式或其他游离DNA载体；其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与戊二酸代谢途径相关的基因；其染色体DNA上整合拷贝一个或多个与赖氨酸代谢途径相关的基因；其染色体DNA上整合或敲除一个或多个与戊二酸生产转运相关的基因。
2.根据权利要求1所述的合成戊二酸的工程菌，其特征在于：所述与戊二酸代谢途径相关的基因为cadA、patA、patD、gabT、gabD中的一个或多个；所述与赖氨酸代谢途径相关的基因为lysA、lysC、dapA、dapB、ddh中的一个或多个；所述与戊二酸生产转运相关的基因为gabP、ptsG、ynfM中的一个或多个。
3.根据权利要求1所述的合成戊二酸的工程菌，其特征在于：所述戊二酸生产菌株由大肠杆菌种属构建。
4.根据权利要求3所述的合成戊二酸的工程菌，其特征在于：所述菌株为大肠杆菌野生型BW25113。
5.一种戊二酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤中的一步或多步：
A、构建菌株中一个或多个与戊二酸代谢途径相关的基因以多拷贝的形式整合到染色体DNA上过表达；
B、构建菌株中一个或多个与赖氨酸代谢途径相关的基因通过替换启动子的方式整合到染色体DNA上过表达；
C、构建菌株中一个或多个与戊二酸生产转运相关的基因被敲除或过表达。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述步骤A中与戊二酸代谢途径相关的基因为cadA、patA、patD、gabT、gabD中的一个或多个；所述步骤B中与赖氨酸代谢途径相关的基因为lysA、lysC、dapA、dapB、ddh中的一个或多个；所述步骤C中与戊二酸生产转运相关的基因为gabP、ptsG、ynfM中的一个或多个。
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述构建的菌株属于大肠杆菌种属。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述菌株为大肠杆菌K-12野生型BW25113。
9.如权利要求1-4所述的戊二酸生产菌株在生产戊二酸中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410280398.2A CN118222469A (zh) | 2024-03-12 | 2024-03-12 | 一种戊二酸生产菌株及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410280398.2A CN118222469A (zh) | 2024-03-12 | 2024-03-12 | 一种戊二酸生产菌株及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118222469A true CN118222469A (zh) | 2024-06-21 |
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Family Applications (1)
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| CN202410280398.2A Pending CN118222469A (zh) | 2024-03-12 | 2024-03-12 | 一种戊二酸生产菌株及其构建方法和应用 |
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2024
- 2024-03-12 CN CN202410280398.2A patent/CN118222469A/zh active Pending
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