CN118186064A - 一种基于不同碱基转换方式的dna损伤区分测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，属于DNA损伤测序领域。利用在不同的DNA损伤位点处聚入不同的修饰碱基组合，在损伤位点处产生不同的碱基转换信号，利用二代测序技术，实现对不同损伤位点的区分标记与检测。该检测方法中产生不同的碱基转换信号以标记不同损伤位点的步骤包括：通过损伤酶将损伤位点处理为3’羟基，用切口平移聚入不同的修饰碱基组合，被聚合酶连续聚入的修饰碱基在测序中可产生连续的碱基转换信号，被聚合酶非连续聚入的修饰碱基在测序中可产生非连续的碱基转换信号；基于此，在核酸扩增中损伤位点处产生不同类型的碱基转换信号，实现对不同损伤位点的区分标记与检测。
Description
技术领域
本发明属于DNA损伤测序领域，更具体地涉及一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法。
背景技术
DNA是生物体中存储遗传信息的载体，其完整性与稳定性对于生物体正常发挥功能至关重要。DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。进一步地，DNA损伤具有一系列分子后果，例如基因组不稳定、端粒功能障碍、表观遗传学改变、蛋白质稳态应激和线粒体功能受损等。
二代测序技术的快速发展为全基因组损伤位点序列信息的检测提供了机会，研究者发展了许多针对不同损伤的检测方法，这些方法的步骤中均包括：对DNA损伤的识别与富集，以及对含有损伤位点的核酸片段连接通用接头。基于抗体识别富集或化学试剂识别引入生物素基团富集的方法，分辨率较低，取决于核酸片段的大小。在对损伤位点进行识别富集的基础上，进一步发展出了根据DNA损伤的特定结构在该位点引入核酸链的断裂或聚合酶终止的方法，损伤位点的信号就是特定序列指示的损伤位点信息(特定序列可由损伤位点产生的3’羟基与特定接头的5’磷酸连接产生，也可由在损伤位点产生特定同聚物序列而产生)或者碱基转换指示的损伤位点信息，以此来实现较高分辨率的DNA损伤序列信息的获得。这种方法分辨率较高，一般可以获得较为精准的损伤位点序列信息；然而该方法在测序过程中的信号种类单一，对测序技术应用于同时检测不同种损伤造成了很大的限制。因此，需要一种能同时实现不同种DNA损伤的区分测序方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，用以解决现有方法无法同时实现不同种DNA损伤区分测序的技术问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明的第一个方面，公开了一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，步骤如下：
1)将损伤酶、聚合酶和若干条含有不同种DNA损伤位点的核酸链进行共孵育，以通过聚入修饰碱基组合标记DNA损伤位点；其中，所述损伤酶为与核酸链损伤位点对应的损伤酶；
2)在上一步产物的基础上，继续加入损伤酶和聚合酶进行共孵育；
3)重复步骤2)若干次，直到所有不同种DNA损伤位点均被不同修饰碱基组合区分标记；
4)对步骤3)得到的产物进行核酸文库构建与核酸扩增，通过测序表征不同修饰碱基组合在不同DNA损伤位点处产生不同的碱基转换信号，实现对不同损伤位点的损伤区分测序。
优选地，步骤1)中，所述核酸链的两端均连接有用于PCR扩增的引物结合序列。
优选地，步骤1)和步骤3)中，所述修饰碱基组合为4sdTTP，或者为dPTP与dKTP；相邻两次孵育过程中，聚入不同的修饰碱基组合。
优选地，步骤1)、步骤2)和步骤3)中，聚合酶为具有5’端到3’端外切酶活性的聚合酶。
进一步优选地，所述聚合酶为Bst全长聚合酶、Taq聚合酶或DNA聚合酶I。
优选地，当DNA损伤为AP损伤和dU损伤时，步骤如下：
Ⅰ)将损伤酶APE1、聚合酶、含有AP损伤位点的核酸链和含有dU损伤位点的核酸链共孵育，以通过聚入4sdTTP标记AP损伤位点；再将OsO4与经过4sdTTP标记反应的产物共孵育；
Ⅱ)将损伤酶UDG、损伤酶APE1、聚合酶与步骤Ⅰ)孵育后的产物共孵育，以通过聚入dPTP与dKTP标记dU损伤位点；
Ⅲ)对步骤Ⅱ)得到的产物进行核酸文库构建与核酸扩增，通过测序表征不同修饰碱基组合在两种损伤位点处产生不同的碱基转换信号，实现对不同损伤位点的损伤区分测序。
进一步优选地，步骤Ⅰ)中，OsO4的终浓度为2.5mM。
优选地，步骤Ⅰ)中，聚合酶为Bst全长聚合酶。
优选地，步骤Ⅰ)中，还包括NH4Cl；在孵育时，将OsO4、NH4Cl与经过4sdTTP标记反应的产物共孵育。
优选地，步骤Ⅱ)中，聚合酶为Taq聚合酶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，通过损伤酶将不同种DNA损伤处理为3’端羟基；基于不同碱基转换的方式，通过加入聚合酶聚入不同的修饰碱基组合，从而利用不同修饰碱基组合标记不同种的DNA损伤位点；通过核酸文库构建与核酸扩增，在PCR体系中，被标记的不同的DNA损伤产生不同的碱基转换信号，实现不同种DNA损伤的区分测序检测，可以更全面地对基因组中的损伤位点进行测序文库的构建。该方法操作简便，无需构建不同种损伤的识别探针分别进行测序，而是利用不同种损伤酶对于损伤的识别特异性，将损伤位点处理为可被聚合酶识别的3’羟基，通过对不同的DNA损伤被区分标记，同时实现不同种DNA损伤的区分测序；该方法具有普适性，多种存在损伤酶识别特异性的损伤均可利用本方法进行不同种损伤的区分标记，基于二代测序技术平台，本方法提供的通过连续/非连续碱基转换信号区分检测不同损伤位点的序列信息，为高分辨率地同时检测不同DNA损伤提供了新方法。
进一步地，相邻两次孵育过程中聚入不同的修饰碱基组合，能够保证反应效率最优。
进一步地，对于基因组中常见的含有AP损伤位点和dU损伤位点的DNA损伤的区分测序方法，首先，利用损伤酶APE1处理含有AP损伤位点的核酸链，利用损伤酶UDG和损伤酶APE1处理含有dU损伤位点的核酸链，从而将不同的损伤位点处理为3’羟基；其次，利用聚合酶使修饰碱基能被连续聚入，从而在测序中可产生连续的碱基转换信号，利用切口平移与不同的修饰碱基组合对不同种损伤位点进行标记。再次，将OsO4与含有4sdTTP标记的AP损伤位点共孵育，4sdTTP核苷在化学试剂OsO4作用下会发生碱基结构改变，转化为5mC，碱基转换后的扩增产物可被限制酶识别并酶切；而dPTP与dKTP两简并碱基无需进行化学试剂OsO4诱导，其在核酸扩增测序中可直接产生碱基转换信号。最后，得到的产物通过核酸文库构建与核酸扩增，从而实现对不同损伤位点的损伤区分测序。
附图说明
图1为本方法的流程示意图；
图2为损伤位点聚入修饰碱基组合的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳验证图；
图3为4sdT核苷在化学试剂OsO4作用下发生结构改变的质谱验证图，其中(a)为4sdT核苷的质谱数据图，(b)为4sdT核苷在OsO4作用下发生结构改变形成5mdC核苷的质谱数据图；
图4为含有4sdT位点核酸链在化学试剂OsO4作用下发生碱基转换的琼脂糖凝胶电泳验证图；
图5为两种损伤分别被不同修饰碱基组合标记后，产生不同碱基转换信号的一代测序验证图。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下仅就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
本文中，若无特别说明，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”或类似用语涵盖了“由……组成”和“主要由……组成”的意思，例如“A包含a”涵盖了“A包含a和其他”和“A仅包含a”的意思。
本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
本发明提供了一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，如图1所示，包括以下步骤：
1.分别设计含有AP损伤位点的核酸链和含有dU损伤位点的核酸链，并使用软件模拟验证已设计序列杂交的正确性；
其中，所述核酸链两端均连接有用于PCR扩增的引物结合序列。
2.将损伤酶APE1、聚合酶、含有AP损伤位点的核酸链和含有dU损伤位点的核酸链共孵育，以聚入4sdTTP标记AP损伤位点，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证修饰碱基是否成功聚入损伤位点。然后将2.5mM OsO4与含有4sdTTP标记的AP损伤位点共孵育，并通过质谱验证碱基结构是否改变成功；
其中，所述聚合酶为具有5端到3端外切酶活性的聚合酶，优选Bst全长聚合酶、Taq聚合酶或DNA聚合酶I。
3.将损伤酶UDG、损伤酶APE1、聚合酶与步骤2)孵育后的产物共孵育，以聚入dPTP与dKTP标记dU损伤位点；
其中，所述聚合酶应为具有5端到3端外切酶活性的聚合酶，优选Bst全长聚合酶、Taq聚合酶或DNA聚合酶I。
4.将步骤3聚入dPTP与dKTP标记dU损伤位点的产物置于接头连接体系中进行核酸文库的构建与PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳验证存在酶切条带以及碱基是否转换成功；通过测序表征不同修饰碱基组合在两种损伤位点处产生不同的碱基转换信号，实现对不同损伤位点的损伤区分测序。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中使用本领域常规的仪器设备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中使用各种原料，除非另作说明，都使用常规市售产品，其规格为本领域常规规格。在本发明的说明书以及下述实施例中，如没有特别说明，“％”都表示质量百分比，比例都表示质量比。
1.设计核酸探针分子及模拟：
为实现对AP损伤位点和dU损伤位点的区分标记，设计对应的核酸探针。委托生工生物公司进行含有dU损伤位点的核酸链(序列如表1中SEQ ID NO.1所示)的合成，并通过处理得到含有AP损伤位点的核酸链(序列如表1中SEQ ID NO.2所示)，并对完成设计的核酸探针用NUPACK软件进行模拟，模拟结果显示二级结构较少，说明两条核酸链均可顺利进行后续反应，无二级结构干扰。
表1序列表
2.损伤位点聚入修饰碱基组合：
1)将含有AP损伤位点的核酸链和含有dU损伤位点的核酸链混合，再向其中加入损伤酶APE1，得到由AP位点产生的3’羟基，即，样A。对样A进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，结果如图2所示。
2)对样A进行纯化后，加入Bst全长聚合酶，在37℃反应1小时，以聚入4sdTTP与其余3种正常核苷酸(dATP、dGTP与dCTP)，得到样B。对样B进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，结果如图2所示，表征结果显示修饰碱基成功聚入损伤位点。
3)参见表2，将100ng/μL的样B、终浓度为200mM的NH4Cl、终浓度为2.5mM的OsO4和ddH2O混合，在95℃反应5分钟，之后在60℃反应5小时，得到样C。
同时，将100ng的样B替换为100ng的C-DNA(序列如表1中SEQ IDNO.3所示)，设置阳性对照；将100ng的样B替换为100ng的T-DNA(序列如表1中SEQ ID NO.4所示)作为阴性对照。
表2OsO4反应体系
对样C进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，结果如图2所示，孔B代表聚入含有4sdTTP修饰碱基组合的损伤位点核酸链，孔E代表聚入含有dPTP与dKTP并继续聚入dNTP的损伤位点核酸链，证明修饰碱基组合可聚入损伤位点处。取50μL 50μM的样C送样至LC-MS，通过质谱验证含有AP损伤位点的核酸链在化学试剂OsO4作用下是否发生了碱基转换，结果如图3所示，证明4sdT核苷发生碱基结构改变形成5mdC核苷。
纯化样C，之后进行PCR扩增，取PCR扩增产物进行酶切反应，验证含有4sdTTP位点核酸链在化学试剂OsO4作用下发生碱基转换，结果如图4所示，其中C-DNA组为阳性对照，T-DNA组为阴性对照，红框为实验组，实验组出现与阳性组同位置的核酸条带，证明碱基转换成功发生。
4)向纯化后的样C中加入损伤酶UDG与损伤酶APE1，在37℃反应1小时，得到由dU位点产生的3’羟基，即，样D。对样D进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，结果如图2所示。
5)对样D进行纯化后，加入Taq热稳定聚合酶，以聚入dPTP与dKTP，得样E。对样E进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，结果如图2所示。
6)将样E与表3中的PCR反应体系混合，进行核酸文库构建和PCR扩增，扩增程序为：95℃30s；95℃15s，56℃20s，72℃20s，进行30轮；72℃3min，然后通过测序表征不同修饰碱基组合在两种损伤位点处产生不同的碱基转换信号。
表3 50μL PCR反应体系
结果如图5所示，聚入4sdTTP的损伤位点样品在扩增中产生非连续的碱基转换信号，聚入dPTP dKTP的损伤位点样品产生连续的碱基转换信号。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤如下：
1)将损伤酶、聚合酶和若干条含有不同种DNA损伤位点的核酸链进行共孵育，以通过聚入修饰碱基组合标记DNA损伤位点；其中，所述损伤酶为与核酸链损伤位点对应的损伤酶；
2)在上一步产物的基础上，继续加入损伤酶和聚合酶进行共孵育；
3)重复步骤2)若干次，直到所有不同种DNA损伤位点均被不同修饰碱基组合区分标记；
4)对步骤3)得到的产物进行核酸文库构建与核酸扩增，通过测序表征不同修饰碱基组合在不同DNA损伤位点处产生不同的碱基转换信号，实现对不同损伤位点的损伤区分测序。
2.根据权利要求1所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤1)中，所述核酸链的两端均连接有用于PCR扩增的引物结合序列。
3.根据权利要求1所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)中，所述修饰碱基组合为4sdTTP，或者为dPTP与dKTP；相邻两次孵育过程中，聚入不同的修饰碱基组合。
4.根据权利要求1所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤1)、步骤2)和步骤3)中，聚合酶为具有5’端到3’端外切酶活性的聚合酶。
5.根据权利要求4所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，所述聚合酶为Bst全长聚合酶、Taq聚合酶或DNA聚合酶I。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，当DNA损伤为AP损伤和dU损伤时，步骤如下：
Ⅰ)将损伤酶APE1、聚合酶、含有AP损伤位点的核酸链和含有dU损伤位点的核酸链共孵育，以通过聚入4sdTTP标记AP损伤位点；再将OsO4与经过4sdTTP标记反应的产物共孵育；
Ⅱ)将损伤酶UDG、损伤酶APE1、聚合酶与步骤Ⅰ)孵育后的产物共孵育，以通过聚入dPTP与dKTP标记dU损伤位点；
Ⅲ)对步骤Ⅱ)得到的产物进行核酸文库构建与核酸扩增，通过测序表征不同修饰碱基组合在两种损伤位点处产生不同的碱基转换信号，实现对不同损伤位点的损伤区分测序。
7.根据权利要求6所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤Ⅰ)中，OsO4的终浓度为2.5mM。
8.根据权利要求6所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤Ⅰ)中，聚合酶为Bst全长聚合酶。
9.根据权利要求6所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤Ⅰ)中，还包括NH4Cl；在孵育时，将OsO4、NH4Cl与经过4sdTTP标记反应的产物共孵育。
10.根据权利要求6所述的一种基于不同碱基转换方式的DNA损伤区分测序方法，其特征在于，步骤Ⅱ)中，聚合酶为Taq聚合酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410378603.9A CN118186064A (zh) | 2024-03-29 | 2024-03-29 | 一种基于不同碱基转换方式的dna损伤区分测序方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410378603.9A CN118186064A (zh) | 2024-03-29 | 2024-03-29 | 一种基于不同碱基转换方式的dna损伤区分测序方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118186064A true CN118186064A (zh) | 2024-06-14 |
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ID=91410588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410378603.9A Pending CN118186064A (zh) | 2024-03-29 | 2024-03-29 | 一种基于不同碱基转换方式的dna损伤区分测序方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118186064A (zh) |
-
2024
- 2024-03-29 CN CN202410378603.9A patent/CN118186064A/zh active Pending
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