CN110305968A - 一种基于ngs分型用于法医学个体识别的snp-dip微单倍型域的复合扩增体系 - Google Patents
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Abstract
本发明属于法医学新技术创新研究应用领域，具体涉及公开一种用于法医学个体识别的SNP‑DIP分子遗传标记组成的微单倍型域的复合扩增检测体系。本发明基于既往报道的SNP或DIP位点，采用微单倍型域的研究策略，通过dbSNP库查阅这些位点的侧翼序列（上下各100bp）是否存在其他SNP或DIP遗传变异，根据每个区域内遗传变异的组合类型差异，形成类似于微单倍型域的分子遗传标记。本发明采用二代测序的方法对这些区域进行深度测序，可实现多个样本的同步分型检测，且可获得每个区域内所有SNP或DIP位点碱基序列变异信息。本发明提供的18个微单倍型域在东亚群体中具有较高的累积个体识别率，可用于法医学个体识别的应用研究。
Description
技术领域
本发明属于法医学新技术研究开发领域，具体涉及公开一种单核苷酸多态性和缺失/***多态性分子遗传标记组成的微单倍型域的复合扩增体系及其基于二代测序的分析检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是基因组中单个核苷酸变异所形成的序列多态性分子遗传标记；缺失/***多态性（Deletion/InsertionPolymorphism, DIP）是基因组中***或缺失不同长度的DNA片段所形成的长度多态性分子遗传标记；这两种遗传标记具有基因组中分布广泛、突变率低、且易获得较短扩增子的优势。SNP和DIP遗传标记主要表现为二等位基因的遗传变异，相比STR基因座，这两种遗传标记的遗传多态性相对偏低。因此在法医学应用中，需要更多的SNP和DIP位点才能达到现有的STR基因座所获得的法医学效能，实现法医学个体识别和亲权鉴定的目的。
微单倍型域作为一种新型分子遗传标记，它是由基因组中一段特定的区域内（小于200bp）的多个SNP和/或DIP位点所组成的遗传标记，这些SNP和/或DIP的组合方式构成微单倍型的多样性。因此微单倍型域遗传标记相比SNP或DIP遗传标记，具有更高的多态性，同时兼备SNP或DIP遗传标记的其他优势，在法医学研究中具有巨大的应用潜力。
二代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS），又称大规模平行测序，相比一代测序技术，其不受荧光物质种类和数量的限制，不仅可以同时检测多个样本，而且可实现大量遗传标记的同步分析检测；在分析长度多态性的同时可进行序列多态性分析，所以NGS技术对于分析微单倍型域遗传标记具有一定的优势。
本发明采用微单倍型域的研究策略，基于既往报道的SNP或DIP遗传标记，通过dbSNP库查询其上下游（各100bp内）是否存在其他遗传变异（SNP或DIP），筛选出那些侧翼序列存在其他变异的SNP或DIP遗传标记，然后采用二代平台测序分析这些遗传标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种SNP-DIP组成的微单倍型域的复合扩增体系及其基于NGS分型检测方法。为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
1、侧翼序列存在变异的SNP/DIP遗传标记的筛选。
首先，我们以既往研究报道过的SNP或DIP位点为基础，通过dbSNP库查找这些位点上下游各100bp的区域内是否存在其他变异，位点的筛选原则如下：（1）每个区域内存在的SNP/DIP位点的最小等位基因频率大于0.01；（2）每个区域内的SNP/DIP位点不处于强连锁不平衡状态；（3）不同区域的物理距离大于10Mb或在不同染色体上；（4）每个区域与现有常用的STR遗传标记的物理距离大于10Mb或在不同染色体上；（5）每个区域内的SNP/DIP位点所构成的单倍型在东亚群体中符合哈迪温伯格平衡。
基于以上原则，本研究共选择出18个区域，每个区域所包含位点的rs编号，所在的染色体以及具体的位置如表1所示。每个区域内位点的命名基于既往报道的原则进行命名，以MH01ZBF002为例，MH表示微单倍型（Microhaplotype）的英文缩写，01表示1号染色体，ZBF表示发现这个位点的实验室，002用于进一步区分同一条染色体上发现的不同微单倍型域位点。
表1. 筛选的每个区域内的SNP/DIP位点及其基本信息
2、筛选的位点复合扩增体系的构建。本发明采用Primer 3在线工具对初步筛选的每个区域进行引物设计，然后采用Oligo软件初步评估设计的引物效能，并对每对引物进行单一的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测进一步评估引物的效能。在确定每个区域的引物序列后，本发明通过调整不同区域内引物浓度的比例，实现18个区域的同步扩增分析。18个区域的多重PCR的反应条件如下：首先对18个区域进行第一轮PCR，PCR体系为10µL，具体包括3.1µLddH2O、1µL 10×PCR buffer、2µL 50nM Primer Mix、0.8µL 2.5mM dNTP、0.1µL 5U/µL HotStart DNA 聚合酶、1µL 100mM Mg2+和2µL 样本DNA。PCR反应条件为：95℃变性15min；94℃变性30s，60℃退火10min，72℃延伸30s，共4个循环；然后，94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸30s，共15个循环。
然后再进行第二轮PCR。在进行PCR之前，需要对第一轮PCR产物加入100µL ddH2O进行稀释。取10µL稀释后的PCR产物加入到包含有3.5µL ddH2O、1µL 10×PCR buffer、3.6µL 2µM barcode、0.8µL 2.5mM dNTP、0.1µL 5U/µL Hot Start DNA 聚合酶和1µL 100mMMg2+的混合溶液中。PCR反应条件如下：95℃变性15min；94℃变性30s，60℃退火4min，72℃延伸30s，共5个循环；然后94℃变性30s，65℃退火1min，72℃延伸30s，共10个循环，4℃保存备用。
3、文库的纯化和定量。取第二轮PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后对目的片段进行切胶回收，采用天根DP214试剂盒对目的片段进行纯化处理。然后采用Agilent 2100生物分析仪对文库进行定量。
4、文库上机测序及数据分析。将步骤3构建好的文库放置于illumina X-10测序平台上，进行测序分析。对于获得的测序数据，首先采用Cutadapt软件去除接头序列，然后采用BWA软件将去除接头后的序列比对到人类参考基因组上（GRCh38.p12），通过GATK软件确定研究位点的基因分型。
本发明提供一种可同时检测SNP/DIP位点以及其侧翼序列的分型检测体系，具体包括18个区域的位点信息，二步PCR的体系组分、反应条件，文库定量，上机测序以及后续数据分析等操作步骤。本发明基于微单倍型域的研究思路，采用既往报道的SNP/DIP位点，通过dbSNP库查阅这些位点的上下游是否存在其他遗传变异，根据其侧翼序列的遗传变异组成类似于微单倍型域的遗传标记，可进一步提高单一的SNP/DIP位点的遗传多态性和法医学应用效能；本发明采用二代测序的方法对这些区域进行检测分析，可实现多个样本的同步检测分析，且可获得每个区域内的所有遗传变异信息；本发明筛选的每个区域内的扩增子在300bp以下，可用于降解检材的分析检测。
具体实施方式
下面以一个样本为例，进一步详细说明本发明的操作流程。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明中所用的试剂：ddH2O、10×PCR buffer、50nM Primer Mix、2.5mM dNTP、5U/µL Hot Start DNA 聚合酶、100mM Mg2+和2µM barcode试剂。
检测方法。
（1）取一个个体样本的DNA 2µL，采用本发明给出的PCR反应体系，如下。
| 组分 | 体积 |
| ddH<sub>2</sub>O | 3.1µL |
| 10×PCR buffer | 1µL |
| 50nM Primer Mix | 2µL |
| 2.5mM dNTP | 0.8µL |
| 5U/µL Hot Start DNA 聚合酶 | 0.1µL |
| 100mM Mg<sup>2+</sup> | 1µL |
| 样本DNA | 2µL |
PCR条件如下。
在完成第一轮PCR反应后，对PCR产物进行稀释处理。取100µL ddH2O加入到第一轮的PCR试剂中，震荡混匀后，取10µL的样本按以下体系进行第二轮PCR。
| 组分 | 体积 |
| ddH<sub>2</sub>O | 3.5µL |
| 10×PCR buffer | 1µL |
| 2µM barcode | 3.6µL |
| 2.5mM dNTP | 0.8µL |
| 5U/µL Hot Start DNA 聚合酶 | 0.1µL |
| 100mM Mg<sup>2+</sup> | 1µL |
| 稀释后的PCR产物 | 10µL |
PCR条件如下。
（2）文库的纯化和定量：在完成两步PCR后，取第二轮PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后选取目的片段进行切胶回收，采用天根DP214试剂盒对目的片段进行纯化处理。最后采用Agilent 2100生物分析仪确定文库的浓度。
（3）上机测序及数据分析：采用illumina X-10测序仪对构建好的文库进行测序分析。获得的数据首先采用Cutadapt软件去除接头序列，然后采用BWA软件将去除接头后的序列和人类参考基因组（GRCh38.p12）进行比对，通过GATK软件确定研究位点的基因分型。
Claims (4)
1.一种用于法医学个体识别的SNP-DIP组成的微单倍型域的复合扩增检测体系，其特征在于18个SNP/DIP微单倍型区域的位点信息；18个区域两步PCR的体系配比和反应条件。
2.根据权利要求书1所述，所述体系中包含的18个区域的位点信息如下所示。
3.根据权利要求书1所述，研发的试剂中所包含的组分有ddH2O、10×PCR buffer、50nMPrimer Mix、2.5mM dNTP、5U/µL Hot Start DNA聚合酶、100mM Mg2+和2µM barcode试剂。
4.根据权利要求1所述，研发的体系的操作步骤如下所示：（1）取待测样品，采用磁珠DNA提取试剂盒，提取样本DNA；（2）首先进行第一轮PCR：PCR体系为10µL，具体包括：3.1µLddH2O、1µL 10×PCR buffer、2µL 50nM Primer Mix、0.8µL 2.5mM dNTP、0.1µL 5U/µL HotStart DNA 聚合酶、1µL 100mM Mg2+和2µL 样本DNA；PCR反应条件为：95℃变性15min；94℃变性30s，60℃退火10min，72℃延伸30s，共4个循环；然后94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸30s，共15个循环；（3）然后再进行第二轮PCR：在进行PCR之前，需要对第一轮的PCR产物加入100µL ddH2O进行稀释；取10µL稀释后的PCR产物加入到包含有3.5µL ddH2O、1µL 10×PCR buffer、3.6µL 2µM barcode、0.8µL 2.5mM dNTP、0.1µL 5U/µL Hot Start DNA 聚合酶和1µL 100mM Mg2+的混合溶液中；PCR反应条件如下：95℃变性15min；94℃变性30s，60℃退火4min，72℃延伸30s，共5个循环；然后94℃变性30s，65℃退火1min，72℃延伸30s，共10个循环；（3）文库的纯化和定量：取第二轮PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后对目的片段进行切胶回收，采用天根DP214试剂盒对目的片段进行纯化处理；然后采用Agilent2100生物分析仪对文库进行定量；（4）上机测序及数据分析：将构建好的文库放置于illumina X-10测序平台上进行测序分析；对于获得的测序数据，首先采用Cutadapt软件去除接头序列，然后采用BWA软件将去除接头后的序列和人类参考基因组（GRCh38.p12）进行比对，通过GATK软件确定研究位点的基因分型。
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