具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
1、以人工合成的黑曲霉(Aspergillus niger)的一个β-甘露聚糖酶基因ManA为目的基因,基因序列为SEQ ID NO:1所示,其相应的氨基酸序列为SEQ ID NO:2,用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因ManA和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切,之后用T4 DNA连接酶将基因ManA连接进载体pGAPZαA中,形成表达质粒pGAPZαA-ManA;SEQ IDNO:1:
TCTTTCGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGACGGTGAGACTGGTTACTTTGCCGGTACTAACTCTTACTGGATTGGATTTTTGACTGACAACGCCGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGCGTGTCTGGGGTTTTAACGATGTTACTTCTCAACCATCTTCTGGCACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAACACCGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCCGAACAACATGATATTAAGTTGATCATCAACTTCGTTAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCTTACGTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGGTGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACCATGCAGTCTGCCTACCAAACTTACATTAAGACTGTCGTTGAACGCTACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTTCTGTTTTGTACAACTGGATTGAGAAGACTTCTAAGTTTATCAAGGGTTTGGACGCTGACAGAATGGTTTGTATTGGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACATTGACTCTGACGGTTCTTACCCATACCAATTTTCTGAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGACACCATCGACTTCGGTACCTTGCACTTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTACTGCTCATGGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCTAACCATTGTTCTGTTGAAGGTTCTTGGCAAAAGACTGCTTTGTCTACTACTGGTGTTGGTGCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTAAGTCTCCAGATGATGGTAACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACCAGTGCTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCTATTGGTTCTGCT
SEQ ID NO:2:
SFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVDLVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTVWYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAEQHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIKGLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEGLNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWGNGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNHCSVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLSTGKSPDDGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIGSA
2、进行易错PCR:
采用引物GAP-mF:5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'
GAP-mR:5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'
以pGAPZαA-ManA为模板,进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR),Taq酶作为聚合酶,在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP,4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP,再添加0.1mM的MnCl2和0.5mM的dGTP;反应的程序是:95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟,循环30次,72℃反应10分钟,得PCR产物;
3、用PCR产物回收试剂盒回收第2步的PCR产物,加入0.1倍体积的饱和醋酸钠(pH3.5)和3倍体积的乙醇沉淀回收产物,12000转/分钟离心10分钟,弃掉上清,加入200μl70%乙醇清洗,12000转/分钟离心10分钟,弃掉上清,室温晾干,加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物;
4、以常用的酵母电转化方法,将第3步中所得的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上(所述的YPDS培养基平板是:酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g和1M山梨醇制成,溶解酵母膏、蛋白胨于900mL蒸馏水中,加入琼脂,加入葡萄糖、1M山梨醇溶解后加蒸馏水定容至1L,115℃灭菌15min,即成),30℃倒置培养3天筛选阳性克隆;
5、挑取第4步中YPDS平板上的所有克隆,分别接入到2mL的YPD培养基中(所述的YPDS培养基平板是:酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g,溶解酵母膏、蛋白胨、葡萄糖于900mL蒸馏水中,溶解后加蒸馏水至1L,混匀后,分装2mL到每个试管中,115℃灭菌15min,即成),30℃,180转/分钟培养3天;
6、取第5步发酵液,12000转/分钟离心2分钟,收集上清,取200μL于75℃加热30分钟后凉水冷却至室温,以DNS法分别测定加热前上清与加热后上清中的β-甘露聚糖酶活性,200μL反应体系包括:20μL稀释上清液(用0.15M NaCl溶液稀释)、80μL pH缓冲液(柠檬酸钠,pH 4)、刺槐豆胶水溶液(0.006g/mL),混匀后80℃反应10分钟,立即加入250μL DNS溶液,沸水煮5分钟,凉水冷却至室温后加入800μL蒸馏水混匀,测定540nm紫外线吸收值,根据标准曲线计算酶活;1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下,每分钟分解角豆胶生成1μmol还原糖所需的酶量;
7、以第6步方法进行测定后,计算加热后发酵液与加热前发酵液的酶活比值作为酶活保留值,筛选到比野生型β-甘露聚糖酶的酶活保留值(26.66%)高的克隆(第2号克隆,酶活保留值为76.95%),提取第二号克隆的基因组DNA,以其为模板,用引物
GAP-F5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5'GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR),获得PCR产物,经测序后获知该克隆中的β-甘露聚糖酶基因有一个碱基发生了突变,848位的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G),即A848G突变(基因序列为SEQ ID NO:3),相应的蛋白突变为283位的组氨酸(H)突变为精氨酸(R),即H283R(氨基酸序列为SEQ ID NO:4);
SEQ ID NO:3:
TCTTTCGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGACGGTGAGACTGGTTACTTTGCCGGTACTAACTCTTACTGGATTGGATTTTTGACTGACAACGCCGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGCGTGTCTGGGGTTTTAACGATGTTACTTCTCAACCATCTTCTGGCACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAACACCGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCCGAACAACATGATATTAAGTTGATCATCAACTTCGTTAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCTTACGTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGGTGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACCATGCAGTCTGCCTACCAAACTTACATTAAGACTGTCGTTGAACGCTACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTTCTGTTTTGTACAACTGGATTGAGAAGACTTCTAAGTTTATCAAGGGTTTGGACGCTGACAGAATGGTTTGTATTGGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACATTGACTCTGACGGTTCTTACCCATACCAATTTTCTGAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGACACCATCGACTTCGGTACCTTGCACTTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTACTGCTCATGGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCTAACCGTTGTTCTGTTGAAGGTTCTTGGCAAAAGACTGCTTTGTCTACTACTGGTGTTGGTGCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTAAGTCTCCAGATGATGGTAACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACCAGTGCTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCTATTGGTTCTGCT
SEQ ID NO:4:
SFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVDLVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTVWYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAEQHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIKGLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEGLNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWGNGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNRCSVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLSTGKSPDDGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIGSA
8、对β-甘露聚糖酶基因进行定向单点突变,以pGAPZαA-ManA为模板,Pfu酶作为聚合酶进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR),反应的程序是:95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸10分钟,循环15次,72℃反应10分钟;将β-甘露聚糖酶283位组氨酸(H)分别突变为丙氨酸A(所用引物为A-F:5'
GGTGTTACTTCTAACGCTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',A-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAAGCGTTAGAAGTAACACC 3')、半胱氨酸C(所用引物为C-F:5'GGTGTTACTTCTAACTGTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',C-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAACAGTTAGAAGTAACACC 3')、天冬氨酸D(所用引物为D-F:5'GGTGTTACTTCTAACGATTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',D-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAATCGTTAGAAGTAACACC 3')、谷氨酸E(所用引物为E-F:5'GGTGTTACTTCTAACGAATGTTCTGTTGAAGGTTC 3',E-R:5'
GAACCTTCAACAGAACATTCGTTAGAAGTAACACC 3')、苯丙氨酸F(所用引物为F-F:5'GGTGTTACTTCTAACTTTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',F-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAAAAGTTAGAAGTAACACC 3')、甘氨酸G(所用引物为G-F:5'GGTGTTACTTCTAACGGTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',G-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAACCGTTAGAAGTAACACC 3')、异亮氨酸I(所用引物为I-F:5'GGTGTTACTTCTAACATTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',I-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAAATGTTAGAAGTAACACC 3')、赖氨酸K(所用引物为K-F:5'GGTGTTACTTCTAACAAGTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',K-R:5'
GAACCTTCAACAGAACACTTGTTAGAAGTAACACC 3')、亮氨酸L(所用引物为L-F:5'GGTGTTACTTCTAACCTTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',L-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAAAGGTTAGAAGTAACACC 3')、甲硫氨酸M(所用引物为M-F5'GGTGTTACTTCTAACATGTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',M-R:5'
GAACCTTCAACAGAACACATGTTAGAAGTAACACC 3')、天冬酰胺N(所用引物为N-F:5'GGTGTTACTTCTAACAACTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',N-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAGTTGTTAGAAGTAACACC 3')、脯氨酸P(所用引物为P-F:5'GGTGTTACTTCTAACCCATGTTCTGTTGAAGGTTC 3',P-R:5'
GAACCTTCAACAGAACATGGGTTAGAAGTAACACC 3')、谷氨酰胺Q(所用引物为Q-F:5'GGTGTTACTTCTAACCAATGTTCTGTTGAAGGTTC 3',Q-R:5'
GAACCTTCAACAGAACATTGGTTAGAAGTAACACC 3')、丝氨酸S(所用引物为S-F:5'GGTGTTACTTCTAACTCTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',S-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAAGAGTTAGAAGTAACACC 3')、苏氨酸T(所用引物为T-F:5'GGTGTTACTTCTAACACTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',T-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAAGTGTTAGAAGTAACACC 3')、缬氨酸V(所用引物为V-F:5'GGTGTTACTTCTAACGTTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',V-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAAACGTTAGAAGTAACACC 3')、色氨酸W(所用引物为W-F:5'GGTGTTACTTCTAACTGGTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',W-R:5'
GAACCTTCAACAGAACACCAGTTAGAAGTAACACC 3')、酪氨酸Y(所用引物为Y-F:5'GGTGTTACTTCTAACTACTGTTCTGTTGAAGGTTC 3',Y-R:5'
GAACCTTCAACAGAACAGTAGTTAGAAGTAACACC 3'),PCR结束后在反应体系中加入限制性内切酶DpnⅠ,37℃反应消化原始模板后转化大肠杆菌Top10感受态,涂布在含有30μg/mL的LB培养基平板(所述的LB培养基平板是:酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g,溶解酵母膏、蛋白胨、氯化钠于900mL蒸馏水中,加入琼脂后加蒸馏水定容至1L,115℃灭菌15min,即成)上筛选阳性克隆,提取突变体质粒后,基因测序确定突变成功;
9、以常用的酵母电转化方法,将第8步中所得18种突变体质粒分别电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中,分别涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上,30℃倒置培养3天筛选阳性克隆;
10、分别挑取第9步18种突变体克隆,分别接入到2mL的YPD培养基中30℃,180转/分钟培养3天;
11、取第10步发酵液,12000转/分钟离心2分钟,收集上清,取200μL于75℃加热30分钟后凉水冷却至室温,以DNS法分别测定加热前上清与加热后上清中的β-甘露聚糖酶活性,计算加热后突变体的酶活保留值,比较发现只有H283K突变体的酶活保留值(83.57%)高于野生型β-甘露聚糖酶的酶活保留值,其他突变体的酶活保留值均较低;H283K突变体的基因序列为SEQ ID NO:5,氨基酸序列为SEQ ID NO:6;
SEQ ID NO:5:
TCTTTCGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGACGGTGAGACTGGTTACTTTGCCGGTACTAACTCTTACTGGATTGGATTTTTGACTGACAACGCCGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGCGTGTCTGGGGTTTTAACGATGTTACTTCTCAACCATCTTCTGGCACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAACACCGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCCGAACAACATGATATTAAGTTGATCATCAACTTCGTTAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCTTACGTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGGTGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACCATGCAGTCTGCCTACCAAACTTACATTAAGACTGTCGTTGAACGCTACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTTCTGTTTTGTACAACTGGATTGAGAAGACTTCTAAGTTTATCAAGGGTTTGGACGCTGACAGAATGGTTTGTATTGGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACATTGACTCTGACGGTTCTTACCCATACCAATTTTCTGAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGACACCATCGACTTCGGTACCTTGCACTTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTACTGCTCATGGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCTAACAAGTGTTCTGTTGAAGGTTCTTGGCAAAAGACTGCTTTGTCTACTACTGGTGTTGGTGCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTAAGTCTCCAGATGATGGTAACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACCAGTGCTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCTATTGGTTCTGCT
SEQ ID NO:6:
SFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVDLVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTVWYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAEQHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIKGLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEGLNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWGNGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNKCSVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLSTGKSPDDGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIGSA
12、分别测定两个突变体H283R、H283K和野生型在70℃、75℃、80℃三个温度下加热30分钟后的酶活保留值,结果如表1所示,70℃下突变体与野生型没有显著差异,在75℃下突变体H283R和H283K的酶活保留值相对于野生型分别提高了50.29和56.91个百分点,在80℃下突变体H283R和H283K的酶活保留值相对于野生型分别提高了11.12和26.83个百分点,说明突变体H283R和H283K与野生型相比在耐热性上有显著的提高,且H283K突变体的耐热性优于H283R突变体;
表1
注:同列肩标无字母标注表示差异不显著(P>0.05),标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
13、纯化野生型及H283R和H283K突变体蛋白,在80℃,pH4条件下测定比酶活进行比较,结果如表2所示,可见野生型与两个突变体的比酶活没有显著差异,说明这两个突变体在提高β-甘露聚糖酶耐热性的同时对其比酶活没有显著影响。
表2
突变型 |
比酶活(U/mg) |
野生型 |
456.55±13.11 |
H283R |
450.60±20.94 |
H283K |
453.53±18.41 |
本发明通过分子生物学手段,得到了两种耐热性好、性质优良的β-甘露聚糖酶突变体,突变体H283R和H283K与野生型相比在耐热性上有显著的提高,且这两个突变体在提高β-甘露聚糖酶耐热性的同时对其比酶活没有显著影响,为β-甘露聚糖酶产业化提供了技术支持和有效途径,具有良好的经济和社会效益。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用
<130> 2021
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 1
tctttcgctt ctacttctgg tttgcaattt actattgacg gtgagactgg ttactttgcc 60
ggtactaact cttactggat tggatttttg actgacaacg ccgatgttga tttggtcatg 120
ggtcatttga agtcttctgg tttgaagatt ttgcgtgtct ggggttttaa cgatgttact 180
tctcaaccat cttctggcac tgtttggtac caattgcatc aagatggtaa gtctactatt 240
aacaccggtg ctgatggttt gcaaagattg gattacgttg tttcttctgc cgaacaacat 300
gatattaagt tgatcatcaa cttcgttaac tactggaccg attacggtgg tatgtctgct 360
tacgtttctg cttacggtgg ttctggtgaa actgattttt acacttctga taccatgcag 420
tctgcctacc aaacttacat taagactgtc gttgaacgct actctaactc ttctgctgtt 480
tttgcttggg aattggctaa cgaaccaaga tgtccatctt gtgatacttc tgttttgtac 540
aactggattg agaagacttc taagtttatc aagggtttgg acgctgacag aatggtttgt 600
attggtgatg aaggttttgg tttgaacatt gactctgacg gttcttaccc ataccaattt 660
tctgaaggtt tgaactttac tatgaacttg ggtattgaca ccatcgactt cggtaccttg 720
cacttgtacc cagattcttg gggtacttct gatgattggg gtaacggttg gattactgct 780
catggtgctg cttgtaaggc tgctggtaag ccatgtttgt tggaagaata cggtgttact 840
tctaaccatt gttctgttga aggttcttgg caaaagactg ctttgtctac tactggtgtt 900
ggtgctgatt tgttttggca atacggtgat gatttgtcta ctggtaagtc tccagatgat 960
ggtaacacta tttactacgg tacttctgat taccagtgct tggttactga tcatgttgct 1020
gctattggtt ctgct 1035
<210> 2
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 2
Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp
20 25 30
Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu
35 40 45
Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile
65 70 75 80
Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser
85 90 95
Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp
100 105 110
Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln
130 135 140
Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val
145 150 155 160
Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr
165 170 175
Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly
180 185 190
Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu
195 200 205
Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu
210 215 220
Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu
225 230 235 240
His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly
245 250 255
Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys
260 265 270
Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu Gly
275 280 285
Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu
290 295 300
Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp
305 310 315 320
Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr
325 330 335
Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala
340 345
<210> 3
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 3
tctttcgctt ctacttctgg tttgcaattt actattgacg gtgagactgg ttactttgcc 60
ggtactaact cttactggat tggatttttg actgacaacg ccgatgttga tttggtcatg 120
ggtcatttga agtcttctgg tttgaagatt ttgcgtgtct ggggttttaa cgatgttact 180
tctcaaccat cttctggcac tgtttggtac caattgcatc aagatggtaa gtctactatt 240
aacaccggtg ctgatggttt gcaaagattg gattacgttg tttcttctgc cgaacaacat 300
gatattaagt tgatcatcaa cttcgttaac tactggaccg attacggtgg tatgtctgct 360
tacgtttctg cttacggtgg ttctggtgaa actgattttt acacttctga taccatgcag 420
tctgcctacc aaacttacat taagactgtc gttgaacgct actctaactc ttctgctgtt 480
tttgcttggg aattggctaa cgaaccaaga tgtccatctt gtgatacttc tgttttgtac 540
aactggattg agaagacttc taagtttatc aagggtttgg acgctgacag aatggtttgt 600
attggtgatg aaggttttgg tttgaacatt gactctgacg gttcttaccc ataccaattt 660
tctgaaggtt tgaactttac tatgaacttg ggtattgaca ccatcgactt cggtaccttg 720
cacttgtacc cagattcttg gggtacttct gatgattggg gtaacggttg gattactgct 780
catggtgctg cttgtaaggc tgctggtaag ccatgtttgt tggaagaata cggtgttact 840
tctaaccgtt gttctgttga aggttcttgg caaaagactg ctttgtctac tactggtgtt 900
ggtgctgatt tgttttggca atacggtgat gatttgtcta ctggtaagtc tccagatgat 960
ggtaacacta tttactacgg tacttctgat taccagtgct tggttactga tcatgttgct 1020
gctattggtt ctgct 1035
<210> 4
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 4
Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp
20 25 30
Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu
35 40 45
Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile
65 70 75 80
Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser
85 90 95
Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp
100 105 110
Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln
130 135 140
Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val
145 150 155 160
Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr
165 170 175
Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly
180 185 190
Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu
195 200 205
Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu
210 215 220
Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu
225 230 235 240
His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly
245 250 255
Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys
260 265 270
Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn Arg Cys Ser Val Glu Gly
275 280 285
Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu
290 295 300
Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp
305 310 315 320
Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr
325 330 335
Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala
340 345
<210> 5
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 5
tctttcgctt ctacttctgg tttgcaattt actattgacg gtgagactgg ttactttgcc 60
ggtactaact cttactggat tggatttttg actgacaacg ccgatgttga tttggtcatg 120
ggtcatttga agtcttctgg tttgaagatt ttgcgtgtct ggggttttaa cgatgttact 180
tctcaaccat cttctggcac tgtttggtac caattgcatc aagatggtaa gtctactatt 240
aacaccggtg ctgatggttt gcaaagattg gattacgttg tttcttctgc cgaacaacat 300
gatattaagt tgatcatcaa cttcgttaac tactggaccg attacggtgg tatgtctgct 360
tacgtttctg cttacggtgg ttctggtgaa actgattttt acacttctga taccatgcag 420
tctgcctacc aaacttacat taagactgtc gttgaacgct actctaactc ttctgctgtt 480
tttgcttggg aattggctaa cgaaccaaga tgtccatctt gtgatacttc tgttttgtac 540
aactggattg agaagacttc taagtttatc aagggtttgg acgctgacag aatggtttgt 600
attggtgatg aaggttttgg tttgaacatt gactctgacg gttcttaccc ataccaattt 660
tctgaaggtt tgaactttac tatgaacttg ggtattgaca ccatcgactt cggtaccttg 720
cacttgtacc cagattcttg gggtacttct gatgattggg gtaacggttg gattactgct 780
catggtgctg cttgtaaggc tgctggtaag ccatgtttgt tggaagaata cggtgttact 840
tctaacaagt gttctgttga aggttcttgg caaaagactg ctttgtctac tactggtgtt 900
ggtgctgatt tgttttggca atacggtgat gatttgtcta ctggtaagtc tccagatgat 960
ggtaacacta tttactacgg tacttctgat taccagtgct tggttactga tcatgttgct 1020
gctattggtt ctgct 1035
<210> 6
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificaial Sequence)
<400> 6
Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp
20 25 30
Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu
35 40 45
Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile
65 70 75 80
Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser
85 90 95
Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp
100 105 110
Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln
130 135 140
Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val
145 150 155 160
Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr
165 170 175
Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly
180 185 190
Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu
195 200 205
Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu
210 215 220
Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu
225 230 235 240
His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly
245 250 255
Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys
260 265 270
Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn Lys Cys Ser Val Glu Gly
275 280 285
Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu
290 295 300
Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp
305 310 315 320
Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr
325 330 335
Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala
340 345