CN113584003A - 一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及耐热性提高的β‑甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用，可有效推动β‑甘露聚糖酶的产业化发展，其解决的技术方案是，本发明通过分子生物学手段，利用易错PCR技术对现有的β‑甘露聚糖酶进行随机突变，并筛选到耐热性提高的突变体H283R；并进一步对H283位点进行定向突变为其他18种常见氨基酸，分别对这18种突变体进行酶活检测后筛选到了耐热性提高的H283K突变体，且这两个突变体在提高β‑甘露聚糖酶耐热性的同时对其比酶活没有显著影响。

Description

一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因改造技术领域，特别是一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

甘露聚糖是自然界中含量仅次于木聚糖的半纤维素，以β-1,4糖苷键链接形成主链，由半乳糖、葡萄糖等参与形成侧链，广泛存在于高等植物及一些藻类的细胞壁中。部分工业原料中甘露聚糖的存在会影响其应用效果或者下游产品的品质，所以需要对其进行去除或降解。由于甘露聚糖结构复杂，所以对其彻底水解需要多种酶的参与，包括β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、脱乙酰酯化酶等，其中β-甘露聚糖酶主要水解β-1,4糖苷键链接形成的主链，所以其作用最为关键。

β-甘露聚糖酶催化植物性食物中甘露聚糖水解产生的甘露寡糖具有良好的生理调节功能，如降低胆固醇、调节血糖、调节肠道、促进双歧杆菌等益生菌的生长等，所以作为食品添加剂或者饲用酶制剂在食品和饲料行业中得到广泛应用，另外在造纸、洗涤剂、石油开采等行业中β-甘露聚糖酶也被普遍的应用，β-甘露聚糖酶作为商用产品，在制备和应用过程中需要经受高温环境，所以开发耐热性好、性质优良的β-甘露聚糖酶是使β-甘露聚糖酶产业化的关键。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用，可有效推动β-甘露聚糖酶的产业化发展。

本发明解决的技术方案是，该耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体为β-甘露聚糖酶突变体H283R或β-甘露聚糖酶突变体H283K。

所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体H283R由氨基酸序列为SEQ ID NO：2的β-甘露聚糖酶ManA的第283位的组氨酸突变为精氨酸获得；

所述的β-甘露聚糖酶突变体H283K，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体H283K由氨基酸序列为SEQ ID NO：2的β-甘露聚糖酶ManA的第283位的组氨酸突变为赖氨酸获得。

所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R的编码基因。

所述的β-甘露聚糖酶突变体H283K的编码基因。

含有所述的H283R的编码基因或含有所述的H283K的编码基因的表达载体。

所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R、β-甘露聚糖酶突变体H283K在制备动物饲料添加剂中的应用。

所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R、β-甘露聚糖酶突变体H283K在制备食品添加剂中的应用。

本发明通过分子生物学手段，利用易错PCR技术对现有的β-甘露聚糖酶进行随机突变，并筛选到耐热性提高的突变体H283R；并进一步对H283位点进行定向突变为其他18种常见氨基酸，分别对这18种突变体进行酶活检测后筛选到了耐热性提高的H283K突变体，且这两个突变体在提高β-甘露聚糖酶耐热性的同时对其比酶活没有显著影响。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

1、以人工合成的黑曲霉(Aspergillus niger)的一个β-甘露聚糖酶基因ManA为目的基因，基因序列为SEQ ID NO：1所示，其相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：2，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对基因ManA和毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将基因ManA连接进载体pGAPZαA中，形成表达质粒pGAPZαA-ManA；SEQ IDNO：1：

TCTTTCGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGACGGTGAGACTGGTTACTTTGCCGGTACTAACTCTTACTGGATTGGATTTTTGACTGACAACGCCGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGCGTGTCTGGGGTTTTAACGATGTTACTTCTCAACCATCTTCTGGCACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAACACCGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCCGAACAACATGATATTAAGTTGATCATCAACTTCGTTAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCTTACGTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGGTGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACCATGCAGTCTGCCTACCAAACTTACATTAAGACTGTCGTTGAACGCTACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTTCTGTTTTGTACAACTGGATTGAGAAGACTTCTAAGTTTATCAAGGGTTTGGACGCTGACAGAATGGTTTGTATTGGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACATTGACTCTGACGGTTCTTACCCATACCAATTTTCTGAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGACACCATCGACTTCGGTACCTTGCACTTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTACTGCTCATGGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCTAACCATTGTTCTGTTGAAGGTTCTTGGCAAAAGACTGCTTTGTCTACTACTGGTGTTGGTGCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTAAGTCTCCAGATGATGGTAACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACCAGTGCTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCTATTGGTTCTGCT

SEQ ID NO：2：

SFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVDLVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTVWYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAEQHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIKGLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEGLNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWGNGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNHCSVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLSTGKSPDDGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIGSA

2、进行易错PCR：

采用引物GAP-mF：5'CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'

GAP-mR：5'GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'

以pGAPZαA-ManA为模板，进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.25mM的4种dNTP，4种dNTP为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再添加0.1mM的MnCl2和0.5mM的dGTP；反应的程序是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物；

3、用PCR产物回收试剂盒回收第2步的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠(pH3.5)和3倍体积的乙醇沉淀回收产物，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清，加入200μl70％乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清，室温晾干，加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物；

4、以常用的酵母电转化方法，将第3步中所得的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上(所述的YPDS培养基平板是：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g和1M山梨醇制成，溶解酵母膏、蛋白胨于900mL蒸馏水中，加入琼脂，加入葡萄糖、1M山梨醇溶解后加蒸馏水定容至1L，115℃灭菌15min，即成)，30℃倒置培养3天筛选阳性克隆；

5、挑取第4步中YPDS平板上的所有克隆，分别接入到2mL的YPD培养基中(所述的YPDS培养基平板是：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，溶解酵母膏、蛋白胨、葡萄糖于900mL蒸馏水中，溶解后加蒸馏水至1L，混匀后，分装2mL到每个试管中，115℃灭菌15min，即成)，30℃，180转/分钟培养3天；

6、取第5步发酵液，12000转/分钟离心2分钟，收集上清，取200μL于75℃加热30分钟后凉水冷却至室温，以DNS法分别测定加热前上清与加热后上清中的β-甘露聚糖酶活性，200μL反应体系包括：20μL稀释上清液(用0.15M NaCl溶液稀释)、80μL pH缓冲液(柠檬酸钠，pH 4)、刺槐豆胶水溶液(0.006g/mL)，混匀后80℃反应10分钟，立即加入250μL DNS溶液，沸水煮5分钟，凉水冷却至室温后加入800μL蒸馏水混匀，测定540nm紫外线吸收值，根据标准曲线计算酶活；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解角豆胶生成1μmol还原糖所需的酶量；

7、以第6步方法进行测定后，计算加热后发酵液与加热前发酵液的酶活比值作为酶活保留值，筛选到比野生型β-甘露聚糖酶的酶活保留值(26.66％)高的克隆(第2号克隆，酶活保留值为76.95％)，提取第二号克隆的基因组DNA，以其为模板，用引物

GAP-F5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5'GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)，获得PCR产物，经测序后获知该克隆中的β-甘露聚糖酶基因有一个碱基发生了突变，848位的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)，即A848G突变(基因序列为SEQ ID NO：3)，相应的蛋白突变为283位的组氨酸(H)突变为精氨酸(R)，即H283R(氨基酸序列为SEQ ID NO：4)；

SEQ ID NO：3：

TCTTTCGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGACGGTGAGACTGGTTACTTTGCCGGTACTAACTCTTACTGGATTGGATTTTTGACTGACAACGCCGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGCGTGTCTGGGGTTTTAACGATGTTACTTCTCAACCATCTTCTGGCACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAACACCGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCCGAACAACATGATATTAAGTTGATCATCAACTTCGTTAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCTTACGTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGGTGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACCATGCAGTCTGCCTACCAAACTTACATTAAGACTGTCGTTGAACGCTACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTTCTGTTTTGTACAACTGGATTGAGAAGACTTCTAAGTTTATCAAGGGTTTGGACGCTGACAGAATGGTTTGTATTGGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACATTGACTCTGACGGTTCTTACCCATACCAATTTTCTGAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGACACCATCGACTTCGGTACCTTGCACTTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTACTGCTCATGGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCTAACCGTTGTTCTGTTGAAGGTTCTTGGCAAAAGACTGCTTTGTCTACTACTGGTGTTGGTGCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTAAGTCTCCAGATGATGGTAACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACCAGTGCTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCTATTGGTTCTGCT

SEQ ID NO：4：

SFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVDLVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTVWYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAEQHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIKGLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEGLNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWGNGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNRCSVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLSTGKSPDDGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIGSA

8、对β-甘露聚糖酶基因进行定向单点突变，以pGAPZαA-ManA为模板，Pfu酶作为聚合酶进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，反应的程序是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸10分钟，循环15次，72℃反应10分钟；将β-甘露聚糖酶283位组氨酸(H)分别突变为丙氨酸A(所用引物为A-F：5'

GGTGTTACTTCTAACGCTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，A-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAAGCGTTAGAAGTAACACC 3')、半胱氨酸C(所用引物为C-F：5'GGTGTTACTTCTAACTGTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，C-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAACAGTTAGAAGTAACACC 3')、天冬氨酸D(所用引物为D-F：5'GGTGTTACTTCTAACGATTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，D-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAATCGTTAGAAGTAACACC 3')、谷氨酸E(所用引物为E-F：5'GGTGTTACTTCTAACGAATGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，E-R：5'

GAACCTTCAACAGAACATTCGTTAGAAGTAACACC 3')、苯丙氨酸F(所用引物为F-F：5'GGTGTTACTTCTAACTTTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，F-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAAAAGTTAGAAGTAACACC 3')、甘氨酸G(所用引物为G-F：5'GGTGTTACTTCTAACGGTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，G-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAACCGTTAGAAGTAACACC 3')、异亮氨酸I(所用引物为I-F：5'GGTGTTACTTCTAACATTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，I-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAAATGTTAGAAGTAACACC 3')、赖氨酸K(所用引物为K-F：5'GGTGTTACTTCTAACAAGTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，K-R：5'

GAACCTTCAACAGAACACTTGTTAGAAGTAACACC 3')、亮氨酸L(所用引物为L-F：5'GGTGTTACTTCTAACCTTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，L-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAAAGGTTAGAAGTAACACC 3')、甲硫氨酸M(所用引物为M-F5'GGTGTTACTTCTAACATGTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，M-R：5'

GAACCTTCAACAGAACACATGTTAGAAGTAACACC 3')、天冬酰胺N(所用引物为N-F：5'GGTGTTACTTCTAACAACTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，N-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAGTTGTTAGAAGTAACACC 3')、脯氨酸P(所用引物为P-F：5'GGTGTTACTTCTAACCCATGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，P-R：5'

GAACCTTCAACAGAACATGGGTTAGAAGTAACACC 3')、谷氨酰胺Q(所用引物为Q-F：5'GGTGTTACTTCTAACCAATGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，Q-R：5'

GAACCTTCAACAGAACATTGGTTAGAAGTAACACC 3')、丝氨酸S(所用引物为S-F：5'GGTGTTACTTCTAACTCTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，S-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAAGAGTTAGAAGTAACACC 3')、苏氨酸T(所用引物为T-F：5'GGTGTTACTTCTAACACTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，T-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAAGTGTTAGAAGTAACACC 3')、缬氨酸V(所用引物为V-F：5'GGTGTTACTTCTAACGTTTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，V-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAAACGTTAGAAGTAACACC 3')、色氨酸W(所用引物为W-F：5'GGTGTTACTTCTAACTGGTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，W-R：5'

GAACCTTCAACAGAACACCAGTTAGAAGTAACACC 3')、酪氨酸Y(所用引物为Y-F：5'GGTGTTACTTCTAACTACTGTTCTGTTGAAGGTTC 3'，Y-R：5'

GAACCTTCAACAGAACAGTAGTTAGAAGTAACACC 3')，PCR结束后在反应体系中加入限制性内切酶DpnⅠ，37℃反应消化原始模板后转化大肠杆菌Top10感受态，涂布在含有30μg/mL的LB培养基平板(所述的LB培养基平板是：酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂20g，溶解酵母膏、蛋白胨、氯化钠于900mL蒸馏水中，加入琼脂后加蒸馏水定容至1L，115℃灭菌15min，即成)上筛选阳性克隆，提取突变体质粒后，基因测序确定突变成功；

9、以常用的酵母电转化方法，将第8步中所得18种突变体质粒分别电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，分别涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上，30℃倒置培养3天筛选阳性克隆；

10、分别挑取第9步18种突变体克隆，分别接入到2mL的YPD培养基中30℃，180转/分钟培养3天；

11、取第10步发酵液，12000转/分钟离心2分钟，收集上清，取200μL于75℃加热30分钟后凉水冷却至室温，以DNS法分别测定加热前上清与加热后上清中的β-甘露聚糖酶活性，计算加热后突变体的酶活保留值，比较发现只有H283K突变体的酶活保留值(83.57％)高于野生型β-甘露聚糖酶的酶活保留值，其他突变体的酶活保留值均较低；H283K突变体的基因序列为SEQ ID NO：5，氨基酸序列为SEQ ID NO：6；

SEQ ID NO：5：

TCTTTCGCTTCTACTTCTGGTTTGCAATTTACTATTGACGGTGAGACTGGTTACTTTGCCGGTACTAACTCTTACTGGATTGGATTTTTGACTGACAACGCCGATGTTGATTTGGTCATGGGTCATTTGAAGTCTTCTGGTTTGAAGATTTTGCGTGTCTGGGGTTTTAACGATGTTACTTCTCAACCATCTTCTGGCACTGTTTGGTACCAATTGCATCAAGATGGTAAGTCTACTATTAACACCGGTGCTGATGGTTTGCAAAGATTGGATTACGTTGTTTCTTCTGCCGAACAACATGATATTAAGTTGATCATCAACTTCGTTAACTACTGGACCGATTACGGTGGTATGTCTGCTTACGTTTCTGCTTACGGTGGTTCTGGTGAAACTGATTTTTACACTTCTGATACCATGCAGTCTGCCTACCAAACTTACATTAAGACTGTCGTTGAACGCTACTCTAACTCTTCTGCTGTTTTTGCTTGGGAATTGGCTAACGAACCAAGATGTCCATCTTGTGATACTTCTGTTTTGTACAACTGGATTGAGAAGACTTCTAAGTTTATCAAGGGTTTGGACGCTGACAGAATGGTTTGTATTGGTGATGAAGGTTTTGGTTTGAACATTGACTCTGACGGTTCTTACCCATACCAATTTTCTGAAGGTTTGAACTTTACTATGAACTTGGGTATTGACACCATCGACTTCGGTACCTTGCACTTGTACCCAGATTCTTGGGGTACTTCTGATGATTGGGGTAACGGTTGGATTACTGCTCATGGTGCTGCTTGTAAGGCTGCTGGTAAGCCATGTTTGTTGGAAGAATACGGTGTTACTTCTAACAAGTGTTCTGTTGAAGGTTCTTGGCAAAAGACTGCTTTGTCTACTACTGGTGTTGGTGCTGATTTGTTTTGGCAATACGGTGATGATTTGTCTACTGGTAAGTCTCCAGATGATGGTAACACTATTTACTACGGTACTTCTGATTACCAGTGCTTGGTTACTGATCATGTTGCTGCTATTGGTTCTGCT

SEQ ID NO：6：

SFASTSGLQFTIDGETGYFAGTNSYWIGFLTDNADVDLVMGHLKSSGLKILRVWGFNDVTSQPSSGTVWYQLHQDGKSTINTGADGLQRLDYVVSSAEQHDIKLIINFVNYWTDYGGMSAYVSAYGGSGETDFYTSDTMQSAYQTYIKTVVERYSNSSAVFAWELANEPRCPSCDTSVLYNWIEKTSKFIKGLDADRMVCIGDEGFGLNIDSDGSYPYQFSEGLNFTMNLGIDTIDFGTLHLYPDSWGTSDDWGNGWITAHGAACKAAGKPCLLEEYGVTSNKCSVEGSWQKTALSTTGVGADLFWQYGDDLSTGKSPDDGNTIYYGTSDYQCLVTDHVAAIGSA

12、分别测定两个突变体H283R、H283K和野生型在70℃、75℃、80℃三个温度下加热30分钟后的酶活保留值，结果如表1所示，70℃下突变体与野生型没有显著差异，在75℃下突变体H283R和H283K的酶活保留值相对于野生型分别提高了50.29和56.91个百分点，在80℃下突变体H283R和H283K的酶活保留值相对于野生型分别提高了11.12和26.83个百分点，说明突变体H283R和H283K与野生型相比在耐热性上有显著的提高，且H283K突变体的耐热性优于H283R突变体；

表1

注：同列肩标无字母标注表示差异不显著(P>0.05)，标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

13、纯化野生型及H283R和H283K突变体蛋白，在80℃，pH4条件下测定比酶活进行比较，结果如表2所示，可见野生型与两个突变体的比酶活没有显著差异，说明这两个突变体在提高β-甘露聚糖酶耐热性的同时对其比酶活没有显著影响。

表2

突变型	比酶活(U/mg)
		野生型	456.55±13.11
H283R	450.60±20.94
		H283K	453.53±18.41

本发明通过分子生物学手段，得到了两种耐热性好、性质优良的β-甘露聚糖酶突变体，突变体H283R和H283K与野生型相比在耐热性上有显著的提高，且这两个突变体在提高β-甘露聚糖酶耐热性的同时对其比酶活没有显著影响，为β-甘露聚糖酶产业化提供了技术支持和有效途径，具有良好的经济和社会效益。

序列表

<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120> 一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用

<130> 2021

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificaial Sequence)

<400> 1

tctttcgctt ctacttctgg tttgcaattt actattgacg gtgagactgg ttactttgcc 60

ggtactaact cttactggat tggatttttg actgacaacg ccgatgttga tttggtcatg 120

ggtcatttga agtcttctgg tttgaagatt ttgcgtgtct ggggttttaa cgatgttact 180

tctcaaccat cttctggcac tgtttggtac caattgcatc aagatggtaa gtctactatt 240

aacaccggtg ctgatggttt gcaaagattg gattacgttg tttcttctgc cgaacaacat 300

gatattaagt tgatcatcaa cttcgttaac tactggaccg attacggtgg tatgtctgct 360

tacgtttctg cttacggtgg ttctggtgaa actgattttt acacttctga taccatgcag 420

tctgcctacc aaacttacat taagactgtc gttgaacgct actctaactc ttctgctgtt 480

tttgcttggg aattggctaa cgaaccaaga tgtccatctt gtgatacttc tgttttgtac 540

aactggattg agaagacttc taagtttatc aagggtttgg acgctgacag aatggtttgt 600

attggtgatg aaggttttgg tttgaacatt gactctgacg gttcttaccc ataccaattt 660

tctgaaggtt tgaactttac tatgaacttg ggtattgaca ccatcgactt cggtaccttg 720

cacttgtacc cagattcttg gggtacttct gatgattggg gtaacggttg gattactgct 780

catggtgctg cttgtaaggc tgctggtaag ccatgtttgt tggaagaata cggtgttact 840

tctaaccatt gttctgttga aggttcttgg caaaagactg ctttgtctac tactggtgtt 900

ggtgctgatt tgttttggca atacggtgat gatttgtcta ctggtaagtc tccagatgat 960

ggtaacacta tttactacgg tacttctgat taccagtgct tggttactga tcatgttgct 1020

gctattggtt ctgct 1035

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificaial Sequence)

<400> 2

Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr

1 5 10 15

Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp

20 25 30

Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu

35 40 45

Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser

50 55 60

Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile

65 70 75 80

Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser

85 90 95

Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp

100 105 110

Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln

130 135 140

Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val

145 150 155 160

Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr

165 170 175

Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly

180 185 190

Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu

195 200 205

Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu

210 215 220

Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu

225 230 235 240

His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly

245 250 255

Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys

260 265 270

Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu Gly

275 280 285

Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu

290 295 300

Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp

305 310 315 320

Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr

325 330 335

Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala

340 345

<210> 3

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificaial Sequence)

<400> 3

tctttcgctt ctacttctgg tttgcaattt actattgacg gtgagactgg ttactttgcc 60

ggtactaact cttactggat tggatttttg actgacaacg ccgatgttga tttggtcatg 120

ggtcatttga agtcttctgg tttgaagatt ttgcgtgtct ggggttttaa cgatgttact 180

tctcaaccat cttctggcac tgtttggtac caattgcatc aagatggtaa gtctactatt 240

aacaccggtg ctgatggttt gcaaagattg gattacgttg tttcttctgc cgaacaacat 300

gatattaagt tgatcatcaa cttcgttaac tactggaccg attacggtgg tatgtctgct 360

tacgtttctg cttacggtgg ttctggtgaa actgattttt acacttctga taccatgcag 420

tctgcctacc aaacttacat taagactgtc gttgaacgct actctaactc ttctgctgtt 480

tttgcttggg aattggctaa cgaaccaaga tgtccatctt gtgatacttc tgttttgtac 540

aactggattg agaagacttc taagtttatc aagggtttgg acgctgacag aatggtttgt 600

attggtgatg aaggttttgg tttgaacatt gactctgacg gttcttaccc ataccaattt 660

tctgaaggtt tgaactttac tatgaacttg ggtattgaca ccatcgactt cggtaccttg 720

cacttgtacc cagattcttg gggtacttct gatgattggg gtaacggttg gattactgct 780

catggtgctg cttgtaaggc tgctggtaag ccatgtttgt tggaagaata cggtgttact 840

tctaaccgtt gttctgttga aggttcttgg caaaagactg ctttgtctac tactggtgtt 900

ggtgctgatt tgttttggca atacggtgat gatttgtcta ctggtaagtc tccagatgat 960

ggtaacacta tttactacgg tacttctgat taccagtgct tggttactga tcatgttgct 1020

gctattggtt ctgct 1035

<210> 4

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificaial Sequence)

<400> 4

Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr

1 5 10 15

Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp

20 25 30

Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu

35 40 45

Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser

50 55 60

Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile

65 70 75 80

Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser

85 90 95

Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp

100 105 110

Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln

130 135 140

Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val

145 150 155 160

Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr

165 170 175

Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly

180 185 190

Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu

195 200 205

Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu

210 215 220

Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu

225 230 235 240

His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly

245 250 255

Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys

260 265 270

Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn Arg Cys Ser Val Glu Gly

275 280 285

Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp Leu

290 295 300

Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp

305 310 315 320

Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr

325 330 335

Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala

340 345

<210> 5

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificaial Sequence)

<400> 5

tctttcgctt ctacttctgg tttgcaattt actattgacg gtgagactgg ttactttgcc 60

ggtactaact cttactggat tggatttttg actgacaacg ccgatgttga tttggtcatg 120

ggtcatttga agtcttctgg tttgaagatt ttgcgtgtct ggggttttaa cgatgttact 180

tctcaaccat cttctggcac tgtttggtac caattgcatc aagatggtaa gtctactatt 240

aacaccggtg ctgatggttt gcaaagattg gattacgttg tttcttctgc cgaacaacat 300

gatattaagt tgatcatcaa cttcgttaac tactggaccg attacggtgg tatgtctgct 360

tacgtttctg cttacggtgg ttctggtgaa actgattttt acacttctga taccatgcag 420

tctgcctacc aaacttacat taagactgtc gttgaacgct actctaactc ttctgctgtt 480

tttgcttggg aattggctaa cgaaccaaga tgtccatctt gtgatacttc tgttttgtac 540

aactggattg agaagacttc taagtttatc aagggtttgg acgctgacag aatggtttgt 600

attggtgatg aaggttttgg tttgaacatt gactctgacg gttcttaccc ataccaattt 660

tctgaaggtt tgaactttac tatgaacttg ggtattgaca ccatcgactt cggtaccttg 720

cacttgtacc cagattcttg gggtacttct gatgattggg gtaacggttg gattactgct 780

catggtgctg cttgtaaggc tgctggtaag ccatgtttgt tggaagaata cggtgttact 840

tctaacaagt gttctgttga aggttcttgg caaaagactg ctttgtctac tactggtgtt 900

ggtgctgatt tgttttggca atacggtgat gatttgtcta ctggtaagtc tccagatgat 960

ggtaacacta tttactacgg tacttctgat taccagtgct tggttactga tcatgttgct 1020

gctattggtt ctgct 1035

<210> 6

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificaial Sequence)

<400> 6

Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu Thr

1 5 10 15

Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr Asp

20 25 30

Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly Leu

35 40 45

Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro Ser

50 55 60

Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr Ile

65 70 75 80

Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu Asp Tyr Val Val Ser Ser

85 90 95

Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr Trp

100 105 110

Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr Met Gln Ser Ala Tyr Gln

130 135 140

Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr Ser Asn Ser Ser Ala Val

145 150 155 160

Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Pro Ser Cys Asp Thr

165 170 175

Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr Ser Lys Phe Ile Lys Gly

180 185 190

Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly Asp Glu Gly Phe Gly Leu

195 200 205

Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Gln Phe Ser Glu Gly Leu

210 215 220

Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr Leu

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His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn Gly

245 250 255

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260 265 270

Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn Lys Cys Ser Val Glu Gly

275 280 285

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290 295 300

Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp Asp

305 310 315 320

Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Gln Cys Leu Val Thr

325 330 335

Asp His Val Ala Ala Ile Gly Ser Ala

340 345

Claims (7)

1.一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体H283R，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体H283R由氨基酸序列为SEQ IDNO：2的β-甘露聚糖酶ManA的第 283位的组氨酸突变为精氨酸获得。

2.权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R的编码基因。

3.一种耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体H283K，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶突变体H283K的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体H283K由氨基酸序列为SEQ IDNO：2的β-甘露聚糖酶ManA的第283位的组氨酸突变为赖氨酸获得。

4.权利要求3所述的β-甘露聚糖酶突变体H283K的编码基因。

5.含有权利要求2所述的H283R的编码基因或含有权利要求4所述的H283K的编码基因的表达载体。

6.权利要求1或3所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R、β-甘露聚糖酶突变体H283K在制备动物饲料添加剂中的应用。

7.权利要求1或3所述的β-甘露聚糖酶突变体H283R、β-甘露聚糖酶突变体H283K在制备食品添加剂中的应用。