CN118085066B

CN118085066B - 一种抗aav的单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN118085066B
Application number: CN202410509166.XA
Authority: CN
Inventors: 吴飞; 彭伟; 倪卓昱
Original assignee: Longxin Qisheng Suzhou Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Longxin Qisheng Suzhou Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2024-04-26
Filing date: 2024-04-26
Publication date: 2024-06-21
Anticipated expiration: 2044-04-26
Also published as: CN118085066A

Abstract

本申请提供了一种抗AAV的单克隆抗体及其用途。本申请还提供了包含所述抗体的ELISA试剂盒及其检测方法。具体来说，本申请提供了抗AAV RC‑C07V5的抗体、以及包括该抗体的ELISA试剂盒。本申请提供的试剂盒可完成AAV RC‑C07V5的定量检测，线性范围较宽。本申请的抗体还可用作AAV RC‑C07V5病毒中和抗体。

Description

一种抗AAV的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及一种抗AAV的单克隆抗体及其用途。

背景技术

腺相关病毒（Adeno-associated virus, 简称AAV）是治疗多种人类疾病的主要基因传递平台。AAV属于细小病毒科依赖病毒属，无包膜，由直径约为22nm的二十面体蛋白质衣壳和约4.7kb的线性单链DNA基因组组成，蛋白质衣壳包裹着DNA基因组。基因组由两侧的反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITR)和中间的Rep基因和Cap基因组成，Rep基因编码四种复制蛋白，根据它们的分子量命名为：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，Cap基因通过不同起始密码子编码三个衣壳蛋白——VP1、VP2和VP3，这三种结构蛋白具有不同的氨基末端，但共用一个羧基末端，VP1、VP2和VP3这三个衣壳蛋白以1：1：10的比例组装，形成二十面体病毒衣壳。

目前已注册的AAV血清型的种类总数已经超过200种，不同血清型AAV的主要区别在于其衣壳蛋白的不同，这也导致了不同的AAV对不同组织和细胞类型的感染能力差异。上海朗昇生物科技有限公司基于AAV9衣壳通过理性设计得到一系列多项性能明显提升的AAV9衣壳变体（参见CN117247434A），其中AAV RC-C07V5衣壳是将AAV9衣壳VP1的可变区VIII（584-598aa）的15个功能氨基酸（HQSAQAQAQTGWVQN，SEQ ID NO.41）突变替换为25个特定氨基酸（LQRGNLALGDVTRPARQAATADVNT，SEQ ID NO.42），其中LALGDVTRPA（SEQ ID NO.43）是具备视网膜组织的功能性短肽，可变区VIII区域的突变弱化了AAV9衣壳结合细胞表面Glu（半乳糖）的结合能力，让RC-C07V5新衣壳获得了更高效的内界膜穿透能力（通过玻璃体腔给药），可以分布在视网膜全层特别是能抵达外界膜组织的感光细胞，并稳定持续表达外源的增补蛋白，同时又具有和AAV9相同的衣壳生产能力和稳定性。

AAV RC-C07V5在制备后，需要对病毒进行QC，其中对衣壳定量可以测定出产品中病毒的颗粒数，VP/VG的比值是反映病毒实心率的重要指标。体内给药后，也需要对靶向器官和组织中病毒粒子数量进行检测，对非靶向器官和组织中病毒的逃逸情况进行监控。ELISA法是一种高效的AAV衣壳检测方法，然而商品化的ELISA检测试剂盒只能针对AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10等少数野生型AAV，尚没有适用于AAV RC-C07V5的ELISA检测试剂盒和抗体。

为此，本领域有需要开发一种特异识别AAV RC-C07V5衣壳蛋白空间构象表位的单克隆抗体和能利用ELISA法定量检测AAV RC-C07V5实心和/或空衣壳的试剂盒，从而为AAVRC-C07V5检测提供可能和便利。

发明内容

本发明的目的就是提供一种AAV RC-C07V5的检测方法。

本发明提供了一种抗AAV RC-C07V5抗体。

本发明提供了包含抗AAV RC-C07V5抗体的检测试剂盒及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗AAV RC-C07V5的抗体，所述的抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区，所述的轻链包括轻链可变区，其中，所述的抗体包括(a)、(b)、(c)或(d)所示的互补决定区CDR：

(a) 根据Kabat编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的重链CDR3；

(b) 根据IMGT编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如RAN所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的重链CDR3；

(c) 根据Chothia编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的重链CDR3；以及

(d) 根据Contact编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示的重链CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区分别进一步包括骨架区(FR)。

在另一优选例中，所述的轻链或重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由骨架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。

在另一优选例中，所述轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4分别具有如SEQ IDNO.23、24、25、26所示的氨基酸序列；和/或所述重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4分别具有如SEQ ID NO.27、28、29、30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4分别具有如SEQ IDNO.31、32、33、26所示的氨基酸序列；和/或所述重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4分别具有如SEQ ID NO.34、35、36、30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，或与其具有≥85%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%的序列同一性。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，或与其具有≥85%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%的序列同一性。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区具有如序列SEQ IDNo: 39所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区具有如SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗体的轻链和/或重链进一步包括恒定区。

在另一优选例中，所述的恒定区为人源恒定区。

在另一优选例中，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与其具有≥85%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%的序列同一性。

在另一优选例中，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.2或与其具有≥85%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%的序列同一性。

在另一优选例中，所述抗体的重链具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，和/或轻链具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留AAV RC-C07V5结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述的抗体不结合或基本不结合野生型AAV衣壳。

在另一优选例中，所述的野生型AAV选自下组：AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、或其组合。

在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的30%，较佳地为20%，更佳地为10%。

在另一优选例中，所述的抗体为动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单链抗体、双链抗体、或抗原结合片段。

在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：

（1）如本发明第一方面所述的抗体；和

（2）任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述标签包括Fc标签、FLAG标签、6His标签，或其组合。

在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸包含编码所述抗体重链的核苷酸序列SEQ IDNO：21。

在另一优选例中，所述的多核苷酸包含编码所述抗体轻链的核苷酸序列SEQ IDNO：22。

在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移***，或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体、或基因组中整合有外源的如本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：

(a) 抗体部分，所述抗体部分为如本发明第一方面所述的抗体；和

(b) 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。

在另一优选例中，所述抗体部分与所述偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

在另一优选例中，所述可检测标记物选自下组：荧光或发光标记物、生物素、放射性标记物、MRI（磁共振成像）或CT（电子计算机X射线断层扫描技术）造影剂，或能够产生可检测产物的酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、或任何形式的纳米颗粒。

在另一优选例中，所述的可检测标记物为生物素。

在另一优选例中，所述的药物为小分子药物、生物因子、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物为抗病毒药物。

在本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的抗体偶联物在制备检测AAV RC-C07V5的试剂或试剂盒中的用途。

在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第三方面所述的多核苷酸、如本发明第四方面所述的载体、如本发明第五方面所述的宿主细胞或如本发明第六方面所述的抗体偶联物在制备AAV RC-C07V5病毒中和制剂或药物中的用途。

在另一优选例中，所述的中和制剂中和AAV RC-C07V5与靶细胞表面受体结合的衣壳表位。

在本发明的第九方面，提供了一种AAV RC-C07V5检测试剂盒，所述试剂盒包含如本发明第一方面所述的抗体和/或如本发明第六方面所述的抗体偶联物。

在另一优选例中，所述的试剂盒为ELISA试剂盒。

在另一优选例中，所述的ELISA试剂盒包括捕获抗体和检测抗体。

在另一优选例中，所述的捕获抗体和检测抗体为本发明第一方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述的捕获抗体与固体支持物结合。

在另一优选例中，所述的检测抗体带有可检测标记，较佳地所述可检测标记为生物素。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒进一步包括选自下组的组分：标记的（如HRP标记的）链霉亲和素、AAV RC-C07V5标准品、洗液、样品稀释液、显色液、终止液、或其组合。

在本发明的第十方面，提供了一种检测样品中AAV RC-C07V5的方法，使用如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第九方面所述的检测试剂盒进行检测。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：对AAV RC-C07V5标准品进行检测从而获得标准曲线，根据标准曲线计算被测样品中AAV RC-C07V5的含量。

在另一优选例中，所述的待测样品选自下组：细胞培养液、全血、血清、血浆、体液、或其组合。

在本发明的第十一方面，提供了一种制剂或药物组合物，其含有：

(i) 如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第三方面所述的多核苷酸、如本发明第四方面所述的载体、如本发明第五方面所述的宿主细胞、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或其组合；和

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的制剂或药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的制剂或药物组合物用于中和AAV RC-C07V5与靶细胞表面受体结合的衣壳表位。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了抗RC-C07V5重组抗体的特异性检测结果。

图2显示了抗RC-C07V5重组抗体结合AAV RC-C07V5而不结合变性后的AAV RC-C07V5。

图3显示了双抗体夹心法ELISA试剂盒检测范围。

图4显示了通过Western Blot分析发现高浓度的抗RC-C07V5重组抗体可以结合变性的AAV RC-C07V5和AAV RC-C07V5。

图5显示了抗RC-C07V5重组抗体对AAV RC-C07V5的中和能力。

图6显示了抗RC-C07V5重组抗体中和AAV RC-C07V5的IC50值。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种抗AAV的单克隆抗体及其用途。具体地，本发明提供了特异识别新抗原AAV RC-C07V5衣壳蛋白空间构象表位的单克隆抗体和能利用ELISA法定量检测AAV RC-C07V5实心和/或空衣壳的试剂盒，从而为AAV RC-C07V5检测提供可能和便利。在此基础上，完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、***或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85%、90%或95%，优选至少为95%。非限制性实施例包括85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 99%, 100%。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等, NIH Publ. No. 91-3242, 卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为k和l)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为a、d、e、g、和m。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

术语“抗体的抗原结合片段”(或简称“抗体片段”)是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。己显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语“抗体的抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过较链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白，如Fab或(Fab')₂片段；抗体重链；抗体轻链。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14或15个连续或非连续的氨基酸。表位可以是抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或l0^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利 4,816,397, 在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。

在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。

如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。

如本文所用，术语“互补决定区(complementarity determining region, CDR)”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的高变区。所述CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest. NIHPublication 91-3242)提供。此外，IMGT（Lefranc, 2003）、Chothia（Al-Lazikani, 1997）等均提供了CDR定义规则，这些规则是本领域技术人员所熟知的。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源的。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源的。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

抗AAV RC-C07V5抗体

如本文所用，术语“本发明的抗体”、和“本发明的AAV RC-C07V5抗体”可互换使用，均指本发明第一方面中所述的靶向AAV RC-C07V5的抗体。

术语“AAV(Adeno-associated virus)”，即腺相关病毒，属于微小病毒科。直径约20-25nM，基因组为单链DNA，长度大约4.7kb，基因组两端由两个ITR(inverted terminalrepeat)组成。

术语“AAV RC-C07V5”是指CN117247434A中公开的AAV RC-C07V5衣壳。AAV RC-C07V5衣壳是将AAV9衣壳VP1的可变区VIII（584-598aa）的15个功能氨基酸（HQSAQAQAQTGWVQN，SEQ ID NO.41）突变替换为25个特定氨基酸（LQRGNLALGDVTRPARQAATADVNT，SEQ ID NO.42）得到的改造AAV衣壳。

本发明的抗体的功能是由此抗体轻链和重链可变区基因特异性基因序列决定。本发明的抗体可以特异性地结合AAV RC-C07V5，其具有高亲和力和高特异性，不与AAV2、AAV5、AAV6、AAV8结合，与AAV9具有弱结合活性。本发明的AAV RC-C07V5抗体还可以作为中和抗体使用，用于中和AAV RC-C07V5与靶细胞表面受体结合的衣壳表位。

本发明的AAV RC-C07V5抗体可以是完整的免疫球蛋白、其抗原结合片段或抗原结合分子。本发明的抗体可以是任何同种型或类别（例如，IgM、IgD、IgG、IgE和IgA）或任何亚类（例如，IgGl-4、IgAl-2）或任何类型的亚类（例如，IgG2a、IgG2b)，并且可以具有κ或λ轻链。抗体的抗原结合片段包括例如Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scAb)、单结构域抗体(dAb)、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。

多核苷酸

本发明还提供一种多核苷酸，其编码上述的本发明的抗体或含有本发明抗体的融合蛋白。

所述多核苷酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。

本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

载体

本发明还提供一种包含所述多核苷酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的多核苷酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述多核苷酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。

本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的多核苷酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

抗体的制备

本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞；或是低等真核细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等, Anal. Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。

本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。

检测用途和试剂盒

本发明还提供了本发明抗体、融合蛋白和/或抗体偶联物的用途，例如用于制备诊断制剂或制备药物。

本发明的抗体可用于检测应用，例如用于AAV RC-C07V5产品质控。

本发明提供了一种能利用ELISA法定量检测AAV RC-C07V5实心和/或空衣壳的试剂盒，所述试剂盒利用本发明的抗体进行包被和检测。本发明的抗AAV RC-C07V5抗体与AAV9和RC-C07V5的线性表位有弱结合活性，因而也可用于AAV9和RC-C07V5的WB检测。在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

当用于检测应用时，本发明的抗体可以用例如放射性、酶或荧光基团标记。本发明的抗体还可以与其他部分缀合，例如特异性结合对的成员，例如生物素（生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员）。本发明的抗体还可以与固体支持物结合，例如聚苯乙烯板或珠粒等。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或相应的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以用于中和AAV RC-C07V5与靶细胞表面受体结合的衣壳表位。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。药物制剂应与给药方式相匹配。活性成分的给药量是治疗有效量。

本发明中，较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。

本发明中，较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。

本发明的主要优点包括：

1）本发明提供了特异性靶向AAV RC-C07V5的抗体，其具备亲和力和特异性。本发明的抗体用于AAV RC-C07V5的ELISA检测灵敏度好，线性范围较宽，满足使用要求。

2）本发明的抗体能够中和AAV RC-C07V5与靶细胞表面受体结合的衣壳表位，可作为AAV RC-C07V5的中和抗体使用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1 AAV9抗体制备及ELISA试剂盒构建

1. AAV RC-C07V5包装

取rep-cap质粒RC-C07V5、GOI质粒GOI-E04V8（GOI-E04V8为在完整表达框中删除了EGFP基因的GOI质粒，删除EGFP是为了避免免疫小鼠时外源蛋白的影响）和phelper，参照常规三质粒包装方法进行AAV包装。

2. AAV纯化

使用POROS™ CaptureSelect™ AAVX Affinity Resin（thermo, A36741）进行亲和层析，利用100kD超离管（MILLIPORE，UFC910096）将buffer置换为PBS，qPCR和ddPCR进行病毒基因组vg的检测。

3. AAV动物免疫

取约10¹¹vg的RC-C07V5病毒通过肌肉免疫的方式免疫C57BL/6小鼠。随后，每隔2～3周重复免疫，从而对实验鼠进行加强免疫，共3次。当小鼠血清效价达到10⁵以上时，取小鼠脾脏进行后续抗体发现工作。

4. AAV抗体杂交瘤细胞株的获得以及单克隆抗体的制备

分别制备小鼠脾脏单细胞悬液和骨髓瘤细胞(SP2/0)单细胞悬液，使用电融合将脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合制备杂交瘤细胞。7天的孵育之后，使用间接ELISA法来测试抗RC-C07V5抗体的存在情况。使用有限稀释法进行亚克隆，挑选单克隆细胞，同时对上清液进行上述ELISA结合，结果显示单克隆抗体LX-mAb01只与RC-C07V5反应，而不与AAV9反应，表明该单克隆抗体具有良好的特异性。

间接ELISA具体方法：在微孔板分别包被100ul 7E+08 vg/ml的AAV9和 RC-C07V5，4℃下包被过夜，弃去包被液，用PBST (含0.05％吐温20的PBS)洗涤板，拍干后向每个孔加入150ul含2％BSA的PBST在37℃封闭1小时。弃去封闭液，拍干后将板用PBST洗涤一次，拍干后向每个孔加入100ul杂交瘤细胞培养上清液，然后在37℃孵育1小时。弃去上清液，将板用PBST洗涤三次，拍干后每个孔加入100ul用PBS 1：1000稀释的HRP（辣根过氧化物酶）标记的山羊抗小鼠（碧云天，A0216）37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤五次，拍干后然后加入50ulTMB显色液并在室温下在黑暗中孵育10分钟。最后加入50ul的1M HCl终止液(国药，10011018)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板，选择OD值最高的阳性孔进行后续实验。

5. 单克隆抗体的可变区测序和单克隆抗体生产

将上述LX-mAb01细胞培养扩增之后，使用TRIzol(Life Technology，15596-026)从约1×10⁶个杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物(PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA，随后通过RACEPCR (GenScript)扩增鼠免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将所得的PCR片段亚克隆至pEASY®-Blunt Cloning Kit载体***(全式金，CB101-02)中，并使用载体特异性引物对***片段进行测序。最终获取了独特V-区域蛋白氨基酸序列：KC225重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.39)和KC224轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.40)。将该序列加上信号肽基因，合成抗体重链及轻链可变区及恒定区的基因序列，构建至哺乳细胞表达载体。用重组质粒转染Expi293哺乳细胞，分泌表达抗体。细胞表达上清经protein A亲和纯化得到RC-C07V5特异性重组抗体。

6. 单克隆抗体的ELISA检测

在微孔板分别包被100ul 7E+08 vg/ml的AAV2/AAV5/AAV6/AAV8/AAV9/ RC-C07V5，使用上述间接ELISA法再次测试抗RC-C07V5抗体的特异性。结果如图1所示。可以看出，抗RC-C07V5抗体只特异性结合RC-C07V5，而不与AAV2/AAV5/AAV6/AAV8/AAV9反应。

结果如图1显示，抗RC-C07V5抗体对RC-C07V5具有很好的特异性。

为了测试抗RC-C07V5抗体能否结合变性后的RC-C07V5，将100ul 7E+08 vg/ml的RC-C07V5 95℃变性5min后自然冷却至室温，也使用上述间接ELISA法测试抗RC-C07V5抗体的特异性，对照为未变性的RC-C07V5。结果如图2显示，抗RC-C07V5抗体只结合RC-C07V5，而不结合变性后的RC-C07V5。

从以上结果可知，抗RC-C07V5抗体只特异性结合具有完整空间构象表位的RC-C07V5。

7. 制备双抗体夹心ELISA试剂盒

7.1 原理：将捕获抗体预包被于96孔反应板中，并进行包装处理，保证其活性。加入不同稀释浓度的标准品或待测样本后，标准品或样本中的衣壳由于其特殊空间构象表位会特异性结合到反应板的捕获抗体上，再分步加入检测抗体和HRP标记物，最终形成抗体-抗原-检测抗体-HRP标记物的复合物，通过洗涤操作，将多余的检测抗体及HRP标记物除去。加入显色液后，HRP催化其显色，显色强度与样品中RC-C07V5的衣壳滴度成正比。用终止液终止反应后，在酶标仪上读取450 nm波长处的吸收值，用标准品衣壳浓度及其对应的OD450值制作标准曲线，通过标准曲线即可计算出待测样品中的RC-C07V5衣壳滴度。

ELISA试剂盒各组分的配置：

标准品：通过AUC测得AAV RC-C07V5的实心率，然后得到病毒总颗粒数vp=vg/实心率；

捕获抗体：抗RC-C07V5抗体，PBST稀释至5ug/ml；

检测抗体：Biotin（生物素）标记的抗RC-C07V5抗体，PBST稀释至0.1ug-0.3ug/ml；

HRP标记物：HRP标记的streptavidin（链霉亲和素），PBST稀释至0.1ug/ml；

显色液：TMB；

终止液：1M HCl。

7.2 检测范围和灵敏度分析：

在微孔板分别包被100ul 5ug/ml捕获抗体，4℃包被过夜，弃包被液，用300ulPBST洗涤板，拍干后向每个孔加入150ul含2％BSA的PBST在37℃封闭1小时。弃去封闭液，用300ul PBST洗涤3次，拍干后加入100ul 从1E+11 vp/ml开始按3倍梯度稀释的标准品病毒，然后在37℃孵育1小时。弃去上清液，将板用300ul PBST洗涤3次，拍干后每个孔加入100ul检测抗体，37℃孵育1小时。弃去上清液，将板用300ul PBST洗涤3次，拍干后每个孔加入100ul HRP标记物37℃孵育1小时。将板用300ul PBST洗涤4次，拍干后然后加入50ul TMB显色液并在室温下在黑暗中孵育10分钟。最后加入50ul的1M HCl终止液(国药，10011018)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。结果如图3所示。从图3的结果可以看出，该试剂盒在4.3E+07vp/ml至2.75E+09vp/ml呈现出良好的线性检测范围。

实施例2 抗RC-C07V5抗体WB检测AAV RC-C07V5

取15μL 2E+09vg AAV9和RC-C07V5病毒放置于1.5mL EP管中，加入5μL 4x样品缓冲液(Thermo，NP0007)，在95℃金属浴中加热10min。12000rpm，离心10min，取10ul上清进行SDS-PAGE，转膜，转膜结束后，使用5％milk-PBST室温封闭60min。倒去封闭液，加入用5％milk-PBST稀释的一抗，4℃过夜孵育。倒去抗体，PBST洗涤三次，倒去洗液，加入10mL用5％milk-PBST稀释的二抗，室温孵育60min。倒去二抗，PBST洗涤三次后进行显色和拍照。

结果如图4所示。从图4的结果可以看出，抗RC-C07V5抗体在8μg/mL的浓度下，与AAV9和RC-C07V5均可以结合，但与RC-C07V5的结合远强于AAV9。

实施例3 抗RC-C07V5抗体中和活性测定

1. 铺板：96孔板HEK-293T细胞铺板，通过细胞计数仪进行计数，每孔铺5E3个细胞，待细胞汇合度达到30%-40%，进行病毒感染。

2. 病毒稀释：感染前对单孔细胞计数，根据公式V（μl）=MOI*细胞数/病毒滴度*1000，计算每个孔所需病毒体积，以DMEM完全培养基作为稀释液对病毒进行稀释；抗RC-C07V5抗体稀释：通过4倍梯度稀释法以DMEM完全培养基作为稀释液进行抗体稀释，获得稀释度为1（抗体原液）、1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024、1：4096和0（DMEM完全培养基）的抗体液；阳性对照抗体（静注人免疫球蛋白PH4，山东泰邦，浓度5%）稀释：同样以4倍梯度稀释法以DMEM完全培养基作为稀释液进行抗体稀释，获得稀释度为1（抗体原液）、1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024、1：4096和0（DMEM完全培养基）的抗体液。

3. 病毒和抗体共孵育：将抗体和病毒以体积比1：1进行混匀，置于37度培养箱过夜孵育。

4. 病毒感染：感染前进行单孔细胞计数，计算并记录实际MOI，每个孔加入100μl病毒和抗体混合液，每种样品每个梯度2个重复孔，感染后将孔板置于37度二氧化碳培养箱培养。

5. 流式检测（LSRFortessa™ X-20，BD）：感染后72h，去除细胞上清，用PBS洗细胞一次，胰酶充分消化后加入含10% FBS的DMEM终止反应，随后进行流式检测，输出结果通过FlowJo软件分析荧光细胞百分比。

6. 结果如图5和图6所示，抗RC-C07V5抗体可以有效中和RC-C07V5病毒，IC50=16427，强于人免疫球蛋白对RC-C07V5的中和作用。抗RC-C07V5抗体不能中和AAV9。

抗体重链（SEQ ID NO.1）：

MGWSWIFLFFLSGTAGVLSEVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYSFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWDSRYDGSMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

抗体轻链（SEQ ID NO.2）：

MRTPAQFLGILLLGFPGIKCDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGGGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

根据Kabat编号***定义的CDR和FR氨基酸序列：

CDR-L1: KASQDINSYLS (SEQ ID NO.3)

CDR-L2: RANRLVD (SEQ ID NO.4)

CDR-L3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO.5)

CDR-H1: DYNMD (SEQ ID NO.6)

CDR-H2: DINPNNGDTFYNQKFKG (SEQ ID NO.7)

CDR-H3: WDSRYDGSMDY (SEQ ID NO.8)

FR-L1: DIKMTQSPSSMYASLGERVTITC (SEQ ID NO.23)

FR-L2: WFQQKPGKSPKTLIY (SEQ ID NO.24)

FR-L3: GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC (SEQ ID NO.25)

FR-L4: FGGGTKLELK (SEQ ID NO.26)

FR-H1: EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYSFT (SEQ ID NO.27)

FR-H2: WVKQSHGKSLEWIG (SEQ ID NO.28)

FR-H3: KATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO.29)

FR-H4: WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO.30)

根据IMGT编号***定义的CDR和FR氨基酸序列：

CDR-L1: QDINSY (SEQ ID NO.9)

CDR-L2: RAN

CDR-L3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO.5)

CDR-H1: GYSFTDYN (SEQ ID NO.10)

CDR-H2: INPNNGDT (SEQ ID NO.11)

CDR-H3: ARWDSRYDGSMDY (SEQ ID NO.12)

FR-L1: DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKAS (SEQ ID NO.31)

FR-L2: LSWFQQKPGKSPKTLIY (SEQ ID NO.32)

FR-L3: RLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC (SEQ ID NO.33)

FR-L4: FGGGTKLELK (SEQ ID NO.26)

FR-H1: EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKAS (SEQ ID NO.34)

FR-H2: MDWVKQSHGKSLEWIGD (SEQ ID NO.35)

FR-H3: FYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYC (SEQ ID NO.36)

FR-H4: WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO.30)

根据Chothia编号***定义的CDR氨基酸序列：

CDR-L1: KASQDINSYLS (SEQ ID NO.3)

CDR-L2: RANRLVD (SEQ ID NO.4)

CDR-L3: LQYDEFPLT (SEQ ID NO.5)

CDR-H1: GYSFTDY (SEQ ID NO.13)

CDR-H2: NPNNGD (SEQ ID NO.14)

CDR-H3: WDSRYDGSMDY (SEQ ID NO.8)

根据Contact编号***定义的CDR氨基酸序列

CDR-L1: NSYLSWF (SEQ ID NO.15)

CDR-L2: TLIYRANRLV (SEQ ID NO.16)

CDR-L3: LQYDEFPL (SEQ ID NO.17)

CDR-H1: TDYNMD (SEQ ID NO.18)

CDR-H2: WIGDINPNNGDTF (SEQ ID NO.19)

CDR-H3: ARWDSRYDGSMD (SEQ ID NO.20)

抗AAV单克隆抗体重链核苷酸序列（SEQ ID NO.21）

ATGGGGTGGTCTTGGATATTTTTGTTTTTCCTTAGTGGCACAGCGGGTGTTCTTTCTGAAGTGCTCTTGCAACAGTCAGGTCCAGAACTTGTGAAACCAGGAGCCAGCGTTAAAATCCCTTGTAAGGCCAGCGGGTACTCATTCACCGACTATAACATGGACTGGGTCAAACAAAGCCACGGTAAATCACTGGAGTGGATTGGCGACATCAATCCGAACAACGGCGACACTTTTTACAACCAGAAATTCAAGGGGAAAGCTACACTGACCGTGGACAAGTCTTCAAGTACTGCGTACATGGAGCTGCGCAGTCTCACAAGCGAGGACACAGCCGTGTATTATTGTGCAAGATGGGACTCCCGATACGACGGCTCCATGGATTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTGACCGTTAGCTCAGCAAAGACAACCGCTCCGAGTGTCTACCCATTGGCACCTGTTTGTGGTGACACAACTGGCAGCAGCGTAACACTCGGTTGTTTGGTGAAAGGCTACTTCCCGGAGCCAGTGACCCTTACCTGGAACAGCGGAAGCCTGTCAAGTGGAGTCCACACCTTCCCAGCAGTTCTCCAATCTGACCTTTACACTCTTTCCAGCTCTGTGACCGTAACTAGCAGCACATGGCCATCCCAATCCATCACATGTAATGTTGCTCATCCGGCTTCTTCTACCAAGGTGGACAAGAAGATAGAACCCCGCGGGCCTACTATTAAGCCTTGTCCACCGTGCAAGTGCCCCGCACCTAACCTCTTGGGTGGCCCCTCCGTGTTCATCTTTCCTCCCAAGATCAAGGATGTGCTGATGATCAGCCTTAGCCCTATCGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCGAGGACGACCCCGACGTGCAGATTTCTTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACCGCTCAGACCCAGACCCACAGGGAGGACTACAACTCTACACTGCGGGTGGTGTCCGCCCTGCCTATTCAGCACCAGGACTGGATGTCCGGAAAGGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACAAAGACCTGCCCGCACCAATAGAGAGAACCATCAGCAAACCCAAAGGCTCTGTCAGGGCTCCTCAGGTGTATGTCTTGCCACCACCAGAGGAAGAAATGACAAAAAAACAGGTCACTCTTACATGTATGGTGACAGATTTCATGCCCGAGGATATATACGTGGAGTGGACCAATAACGGGAAGACTGAACTCAACTACAAAAATACTGAGCCAGTTCTGGATAGTGATGGCTCCTACTTTATGTACAGTAAGTTGCGAGTGGAGAAAAAGAACTGGGTTGAACGCAACAGCTACAGTTGCAGTGTCGTGCATGAAGGACTGCACAATCACCATACAACCAAGAGTTTTTCACGAACGCCAGGTAAAtaa

抗AAV单克隆抗体轻链核苷酸序列（SEQ ID NO.22）

ATGCGAACCCCTGCTCAGTTCCTTGGTATCCTTCTTCTCGGATTTCCAGGGATCAAGTGTGACATTAAGATGACCCAGTCCCCCAGCTCTATGTATGCTAGCCTTGGCGAGAGGGTCACAATTACCTGTAAAGCCTCCCAGGATATTAACTCCTATCTGAGCTGGTTTCAACAGAAACCTGGCAAATCCCCTAAGACGTTGATCTACAGGGCTAACAGACTCGTTGACGGAGTTCCTAGCAGGTTTTCTGGGAGTGGAAGTGGCCAAGATTACAGTCTTACAATCTCCTCCTTGGAATATGAAGACATGGGCATCTATTACTGCTTGCAGTATGATGAATTTCCACTGACATTCGGTGGGGGAACCAAATTGGAATTGAAAAGGGCCGATGCCGCTCCTACAGTGAGCATCTTTCCTCCTTCCTCCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTATCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACTCCTGGACCGACCAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCATGTCCTCCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTACGAGAGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACACACAAGACCTCCACCAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAATAGAAACGAGTGCtaa

轻链信号肽序列：MRTPAQFLGILLLGFPGIKC（SEQ ID NO.37）

重链信号肽序列：MGWSWIFLFFLSGTAGVLS（SEQ ID NO.38）

抗体重链可变区（SEQ ID NO.39）：

EVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYSFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARWDSRYDGSMDYWGQGTSVTVSS

抗体轻链可变区（SEQ ID NO.40）：

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLT。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种抗AAV RC-C07V5的抗体，其特征在于，所述的抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区，所述的轻链包括轻链可变区，其中，所述的抗体包括(a)、(b)、(c)或(d)所示的互补决定区CDR：

(a) 根据Kabat编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的重链CDR3；

(b) 根据IMGT编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如RAN所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的重链CDR3；

(c) 根据Chothia编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的重链CDR3；以及

(d) 根据Contact编号***定义的：

氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的轻链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的轻链CDR2，

氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的轻链CDR3，

氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的重链CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的重链CDR2，和

氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示的重链CDR3。

2. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.39所示，和

所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示。

3. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，和

所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：

（1）如权利要求1所述的抗体；和

（2）协助表达和/或纯化的标签序列。

5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的抗体或如权利要求4所述的融合蛋白。

6.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的载体、或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸。

8.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物含有：

(a) 抗体部分，所述抗体部分为如权利要求1所述的抗体；和

9. 如权利要求1所述的抗体、如权利要求5所述的多核苷酸、如权利要求6所述的载体、如权利要求7所述的宿主细胞或如权利要求8所述的抗体偶联物在制备AAV RC-C07V5病毒中和制剂或药物中的用途。

10. 一种AAV RC-C07V5检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的抗体和/或如权利要求8所述的抗体偶联物。

11. 一种非诊断目的的检测样品中AAV RC-C07V5的方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求1所述的抗体、如权利要求8所述的抗体偶联物或如权利要求10所述的检测试剂盒进行检测。

12. 一种制剂或药物组合物，其特征在于，所述制剂或药物组合物含有：

(i) 如权利要求1所述的抗体、如权利要求5所述的多核苷酸、如权利要求6所述的载体、如权利要求7所述的宿主细胞、如权利要求8所述的抗体偶联物、或其组合；和

(ii)药学上可接受的载体。