JP2024522670A - 呼吸器合胞体ウイルスに対する抗体及びその使用 - Google Patents

呼吸器合胞体ウイルスに対する抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。本開示はさらに、ＲＳＶ感染の治療及び／又は予防のための薬剤を製造するための上記抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年６月１１日に中国特許庁に出願された第２０２１１０６５３３９３．６号中国特許出願の優先権を主張する。その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。本開示はさらに、ＲＳＶ感染の治療及び／又は予防における上記抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は急性下気道感染症を引き起こし、世界中の子供の病気や死亡につながる主な病原体である。ＲＳＶ関連疾患で入院する確率は、インフルエンザやパラインフルエンザウイルス関連疾患の場合の３倍となり、高い入院率は５歳未満の乳幼児では多く見られ、最も罹患率が高いのは３歳の乳幼児である。全世界の生後１か月から１歳までの乳幼児死亡の６．７％がＲＳＶによるものである。ＲＳＶは、未就学児、特に乳幼児にとって呼吸器感染症の最も主要な病原体であり、免疫力の低い成人や高齢者も感染しやすい。ＲＳＶは世界中で人間の健康に深刻な脅威をもたらしているが、ＲＳＶ感染を予防及び治療するための手段はほとんどなく、ワクチンの開発も、ホルマリン不活化ワクチンによる症状の悪化があったため、順調に進んでいない。母親体内の抗体は、妊娠最後の数週間に胎盤を通じて赤ちゃんに渡され、防御免疫を提供できるが、この防御は毎月約２倍減衰し、持続性がない。現在、ワクチンや特に有効な治療法はなく、唯一の予防策は１９９８年に承認されたパリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）である。パリビズマブは、乳幼児の入院率や死亡率をある程度減らすことはできるが、免疫活性が弱く、使用頻度が高い。先天性の呼吸器系や循環器系に障害のある未熟児は、全流行期を通じて５回の接種を受ける必要があり、費用が高額で不便であるため、すべての乳児に接種するのは不適当であり、ハイリスク児の予防も限られている。一方、モノクローナル抗体Ｄ２５の改良版であるアストラゼネカ社製ＭＥＤＩ８８９７は、強力な中和活性を持ち、１～２回の免疫接種のみで済み、現在第ＩＩＩ相臨床試験中である。したがって、ＲＳＶ感染を予防・治療するための、次世代の有効性の高いモノクローナル抗体薬が切望されている。
これまで、中和抗体はウイルス性疾患の効果的な治療法であることが証明されている。現在市販されているウイルス感染症の治療・予防薬としては、小児の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防するためのパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）、ＨＩＶ感染を治療するためのイバリズマブ（Ｔｒｏｇａｒｚｏ）、狂犬病ウイルス暴露後予防のためのラビシールドなどがある。さらに、様々なウイルスを標的とする臨床研究中のモノクローナル抗体も多くある（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／）。抗体は主に、中和活性を持つ抗体がウイルスのエンベロープタンパク質に結合し、ウイルスの細胞受容体への結合をブロックすることで、ウイルス感染を阻害するという方法と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介し、マクロファージや補体などの免疫細胞及び免疫分子を動員して、遊離ウイルス及び感染細胞を破壊するという方法とによって機能する。
呼吸器合胞体ウイルスは、パラミクソウイルス科に属し、Ａ型とＢ型の２つの型を持つ一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスであり、これらの型はどちらも流行する。ＲＳＶ表面の吸着タンパク質（Ｇ）及び融合タンパク質（Ｆ）は、中和抗体応答を誘導できる主な抗原である。Ｇタンパク質はウイルスの細胞膜表面への接着を担うタンパク質であるが、抗原の多様性があり、広域スペクトルの防御薬の作製が困難である。Ｆタンパク質は、ウイルスと細胞の融合を担うタンパク質であり、中和抗体の標的となるより多くのエピトープを提示することから、現在開発されているほとんどのワクチン及び免疫療法薬の主な標的となり、臨床でパリビズマブによりＲＳＶ疾患を予防するための標的でもある。Ｆタンパク質は、融合前（ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ）と融合後（ｐｏｓｔ－ｆｕｓｉｏｎ）の２つのコンフォメーションを有する。融合前のＦタンパク質は不安定であり、融合後のＦタンパク質に変わるコンフォメーション変化が発生し得る。現在、強力な中和エピトープのほとんどは融合前コンフォメーションのＦタンパク質に集中していることが分かっており、例えば、モノクローナル抗体Ｄ２５及びその改良型モノクローナル抗体ＭＥＤＩ８８９７はいずれも、融合前Ｆのエピトープφに結合する。２０１３年、Ｐｅｔｅｒ Ｋｗｏｎｇチームは、一連の変異（Ｓ１９０Ｆ、Ｖ２０７、Ｓ１５５Ｃ及びＳ２９０Ｃ）を導入することにより、安定な融合前のＲＳＶ Ｆタンパク質ＤＳ－Ｃａｖ１を取得した。ＤＳ－Ｃａｖ１でマウスを免疫すると、より高い中和抗体の産生が活性化される。
一側面において、本開示は、重鎖可変領域を含む、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は下記の組み合わせから選択されるいずれか１つである。
（１）アミノ酸配列がＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１８）であるＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＩＳＹＤＧＳＮＴ（配列番号１９）であるＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＡＲＤＹＣＳＲＧＴＣＹＨＤＹ（配列番号２０）であるＨＣＤＲ３；
（２）アミノ酸配列がＧＹＴＦＴＴＹＤ（配列番号２４）であるＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＬＮＰＤＮＧＮＴ（配列番号２５）であるＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＴＲＡＰＷＷＷＹＦＤＹ（配列番号２６）であるＨＣＤＲ３；及び
（３）アミノ酸配列がＧＦＳＦＴＮＹＧ（配列番号３０）であるＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＩＳＹＤＤＧＳＤＫ（配列番号３１）であるＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＶＲＤＰＴＧＤＹ（配列番号３２）であるＨＣＤＲ３。
いくつかの実施形態において、上記の抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域をさらに含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は下記の組み合わせから選択されるいずれか１つである。
（１）アミノ酸配列がＱＤＩＲＮＤ（配列番号１５）であるＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＡＡＳ（配列番号１６）であるＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＬＱＤＹＮＹＰＱＴＦＧ（配列番号１７）であるＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列がＧＦＴＦＳＳＹＡ（配列番号１８）であるＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＩＳＹＤＧＳＮＴ（配列番号１９）であるＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＡＲＤＹＣＳＲＧＴＣＹＨＤＹ（配列番号２０）であるＨＣＤＲ３；
（２）アミノ酸配列がＳＧＳＩＡＳＮＹ（配列番号２１）であるＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＥＤＮ（配列番号２２）であるＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＱＳＹＤＴＳＮＡＶＦＧ（配列番号２３）であるＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列がＧＹＴＦＴＴＹＤ（配列番号２４）であるＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＬＮＰＤＮＧＮＴ（配列番号２５）であるＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＴＲＡＰＷＷＷＹＦＤＹ（配列番号２６）であるＨＣＤＲ３；及び
（３）アミノ酸配列がＳＬＮＩＧＳＮＹ（配列番号２７）であるＬＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＫＮＮ（配列番号２８）であるＬＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＡＡＷＤＤＳＬＳＧＶＶＦＧ（配列番号２９）であるＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列がＧＦＳＦＴＮＹＧ（配列番号３０）であるＨＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＩＳＹＤＤＧＳＤＫ（配列番号３１）であるＨＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＶＲＤＰＴＧＤＹ（配列番号３２）であるＨＣＤＲ３。
いくつかの実施形態において、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片における前記重鎖可変領域は、配列番号４、６若しくは８で表される配列、又は、配列番号４、６若しくは８で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片における前記重鎖可変領域は、配列番号４で表される配列、又は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号５で表される配列、又は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、或いは、
前記重鎖可変領域は、配列番号６で表される配列、又は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号７で表される配列、又は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、或いは、
前記重鎖可変領域は、配列番号８で表される配列、又は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号９で表される配列、又は、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片における前記重鎖定常領域は、配列番号１０で表される配列、又は、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖定常領域は、配列番号１１若しくは１２で表される配列、又は、配列番号１１若しくは１２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片における前記抗体はマウス抗体、キメラ抗体、ヒト由来の抗体又は完全ヒト抗体であり、好ましくは、前記抗体はヒト由来の抗体である。
いくつかの実施形態において、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片における前記Ｆタンパク質は融合前コンフォメーションである。
いくつかの実施形態において、前記呼吸器合胞体ウイルスは、Ａ型又はＢ型の呼吸器合胞体ウイルスである。
別の側面において、本開示は、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。具体的には、前記核酸分子は、上記いずれか１項に記載の抗体の軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードする。別の側面において、本開示は上記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
別の側面において、本開示は、上記抗体又はその抗原結合断片を含むか、又は発現させる宿主細胞、或いは、上記核酸分子又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の側面において、本開示は、上記いずれか１項に記載の上記抗体又はその抗原結合断片と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の側面において、本開示は、呼吸器合胞体ウイルスに関連する疾患又は症状の治療及び／又は予防のための薬剤を製造するための、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。別の側面において、本開示は、治療有効量の上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は上記医薬組成物を被験者に投与することを含む、被験者において呼吸器合胞体ウイルスに関連する疾患又は症状の治療及び／又は予防を行う方法を提供する。
さらに、本開示の上記いずれか１項に記載の呼吸器合胞体ウイルスに関連する疾患又は症状は、上気道感染症又は下気道感染症に関連する疾患又は症状である。より好ましくは、前記疾患又は症状は、気管炎、気管支炎及び肺感染症から選択される。最も好ましくは、前記疾患又は症状は気管支炎又は肺炎である。
別の側面において、本開示は、試料を上記抗体又はその抗原結合断片と接触させ、抗原抗体複合体の形成の有無又は形成された抗原抗体複合体の量を検出することを含む、試料中の呼吸器合胞体ウイルスの存在又は含有量を検出するための方法を提供する。
別の側面において、本開示は、上記いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む呼吸器合胞体ウイルス検出キットを提供する。
図１は、発現及び精製されたＲＳＶ－Ｆ（ＤＳ－Ｃａｖ１）タンパク質のクロマトグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果を示すものである。
別段の断りがない限り、本開示で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
「抗体」とは、形質細胞（エフェクターＢ細胞）によって分泌され、外来物質（ポリペプチド、ウイルス、細菌など）を中和するために身体の免疫系によって使用される免疫グロブリンを指す。これに対応して、上記外来物質は、抗原と呼ばれる。「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示すものであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体及び抗体断片（又は抗原結合断片、又は抗原結合部分）を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。典型的又は通常の抗体分子の基本構造は、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖からなる四量体である。アミノ酸配列の保存性の違いによって、重鎖及び軽鎖は、アミノ末端にある可変領域（Ｖ）と、カルボキシ末端にある定常領域（Ｃ）とに分けられる。１本の重鎖及び１本の軽鎖の可変領域の相互作用により、抗原結合部位（Ｆｖ）が形成される。可変領域において、特定の領域は可変領域内の他の領域（フレームワーク領域、ＦＲ）よりもアミノ酸残基の組成及び順序が変化しやすく、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる。超可変領域は実際には、抗体の抗原へ結合に重要な部位である。これらの超可変領域配列は抗原決定基と相補的であるため、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）とも呼ばれる。重鎖及び軽鎖はいずれも、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる３つの相補性決定領域を有する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ領域から構成される。
抗体相補性決定領域の配列が既知である場合、当業者は、ＤＮＡ組換え技術などを用いて、抗体分子の配列の一部（例えば、定常領域又はフレームワーク領域）を他の種の配列と容易に置換し、キメラ抗体を形成することができる。キメラ抗体は、元の抗体の結合特異性を実質的に保持することができる。例えば、異なる種で使用した場合の抗体の免疫原性を弱めるために、又は、ＡＤＣＣ関連活性などの定常領域の特定の機能を利用するために、元の抗体がマウス抗体の場合には、その定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することができ、逆に、元の抗体がヒト抗体の場合には、その定常領域をマウス抗体の定常領域に置換することができる。抗体の免疫原性をさらに低下させるために、又は他の目的のために、元の抗体の結合特異性を実質的に保持しながら、抗体分子内のＣＤＲ配列以外の配列をすべて、別の抗体分子（同じ又は異なる種に由来するもの）の対応する配列（場合によっては、１つ以上のアミノ酸変異を含んでもよい。）で置き換えることができる。一例において、当業者は、マウス抗体をヒト化するためにＣＤＲ移植を使用することが多い。
また、当業者には理解されるように、本開示による具体的な抗体配列を基に、いくつかのアミノ酸の置換、欠失、挿入を行い、得られた生成物の抗原（Ｆタンパク質）結合能力又は生物学的活性の検証又はスクリーニングを行うことにより、本発明による抗Ｆタンパク質抗体分子の変異体を取得することができる。これらの変異体も本発明の範囲に含まれる。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示による抗体分子の重鎖可変領域は、配列番号４で表される配列、又は、配列番号４と少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号５で表される配列、又は、配列番号５と少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示による抗体分子の重鎖可変領域は、配列番号６で表される配列、又は、配列番号６と少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号７で表される配列、又は、配列番号７と少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本開示による抗体分子の重鎖可変領域は、配列番号８で表される配列、又は、配列番号８と少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号９で表される配列、又は、配列番号９と少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
抗体の「抗原結合断片」とは、元の抗体の配列の一部（特にＣＤＲ配列）を含むとともに、元の抗体の結合特異性も有するポリペプチドを指す。当該抗原結合断片は通常、元の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むことで、抗原結合能力を有する。抗原結合断片の形態としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などの様々な形態がある。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がペプチド鎖となるように短いペプチドによって結合されることで形成される。正しいフォールディングにより、重鎖及び軽鎖からの可変領域が非共有結合相互作用を通じてＦｖセグメントを形成するため、ｓｃＦｖは抗原に対する親和性活性を好適に保持することができる。ｓｄＡｂは最初にラクダ科動物から発見された、軽鎖を天然に欠いていても抗原結合能力を有するものである。ｓｄＡｂは、通常の抗体分子に比べて、安定性（ｐＨ、熱、プロテアーゼに対する耐性）に優れるなどの利点があり、通常の抗体分子ではアクセスが難しい抗原分子上の抗原エピトープなどを標的として結合することができる。
抗体が「抗原に特異的に結合する」又は抗体の「抗原結合特異性」とは、他の抗原と比較して、より高い又は比較的高い結合親和性で標的抗原に結合する抗体の能力を指す。標的抗原に対する抗体の結合能力は、例えば、標的抗原に結合する抗体のＫＤ値の測定、他の抗体と競合する標的抗原に結合する能力の測定などの様々な方法により定性的又は定量的に同定することができる。ここで、Ｋｄは平衡解離定数であり、抗体とその抗原との結合親和性の強さを評価するために使用できる。ＫＤ値が小さいほど、親和性が強いと考えられる。抗体が標的抗原に特異的に結合することは、それが他の抗原に結合できないことを意味するわけではない。例えば、免疫交差反応性も当分野で知られている。
本開示において使用される場合、「抗体」は、完全な抗体又はその抗原結合断片を包含し、ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などであり得る。抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＹなどの任意のタイプ、或いは、例えば、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ＩｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＡ１又はｌｇＡ２などの任意のサブタイプであり得る。
抗体を調製する方法は、当分野で知られており、動物を抗原で免疫した後に特定の抗体を発現する細胞を単離する方法（例えば、ハイブリドーマ技術による抗体調製）、ファージ抗体ライブラリを利用する抗体スクリーニング技術、遺伝子工学技術によって細胞を形質転換し、抗体分子を発現させる方法などが挙げられる。一例において、本開示の実施例は、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする組換え発現ベクターを２９３Ｔ細胞に導入することによって抗体分子を調製する方法を提供する。
用語「キメラ」抗体とは、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が別の供給源又は種に由来する抗体を指す。
用語「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体の反応性を保持していながら、ヒトにおける低い免疫原性を有する抗体を意味する。例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持するとともに、抗体の残りの部分をヒト対応物（すなわち、定常領域及び可変領域のフレームワーク部分）で置き換えることによって達成できる。
用語「ヒト抗体」、「ヒト由来の抗体」、「フルヒト抗体」、「完全ヒト抗体」は、交換可能に使用され、可変領域及び定常領域がヒト配列である抗体を意味する。この用語には、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、潜在的免疫原性の低減、親和性の増加、望ましくないフォールディングを引き起こし得るシステイン又はグリコシル化部位の除去などのために改変されている配列を有する抗体も包含される。この用語には、ヒト細胞に典型的でないグリコシル化を与え得る非ヒト細胞で組換えにより産生された抗体も包含される。この用語には、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の一部又はすべてを含むトランスジェニックマウスで産生された抗体も包含される。ヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する意味である。
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団を意味する。すなわち、少量で存在し得る天然の突然変異を除いて、集団に含まれる抗体分子のアミノ酸配列が同一である。一方、ポリクローナル抗体調製物は、通常、可変ドメインに異なるアミノ酸配列を有する複数の異なる抗体を含み、通常、異なるエピトープに特異的である。「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特性を表すものであって、抗体がいずれの特定の方法により製造されることを求めるものとして解釈されるべきではない。いくつかの実施形態において、本開示による抗体はモノクローナル抗体である。
用語「抗原」とは、抗原結合タンパク質（例えば、抗体を含む）などの選択的結合剤によって結合され得、さらに、動物において使用されて該抗原に結合可能な抗体を生成することができる分子又はその部分を意味する。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と相互作用できる１つ又は複数のエピトープを有し得る。
抗体分子に対して、例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、抗体分子コンジュゲート（例えば、ＡＤＣ）の形成、精製用タグの付加、又は他のタンパク質との融合（例えば、二重特異性抗体の形成）などの様々な修飾を施すことができることは当分野で知られている。本開示による抗体分子に修飾を施すことによって得られるこれらの抗体誘導体も本発明の範囲に含まれる。
アミノ酸配列に関して、用語「配列同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（「配列相同性」とも呼ばれる。）とは、２つのアミノ酸配列（例えば、クエリ配列と参照配列）間の同一性の程度を表す量であり、一般にパーセンテージとして表される。通常、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを計算する前に、配列をアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）し、（存在する場合）ギャップ（ｇａｐ）を導入する。特定のアラインメント位置で２つの配列におけるアミノ酸残基が同じである場合、２つの配列はその位置で同一であるか又は一致すると考えられるが、２つの配列におけるアミノ酸残基が異なる場合、その位置で非同一であるか又は一致しないと考えられる。いくつかのアルゴリズムでは、一致する位置の数をアライメントウィンドウ内の位置の総数で割って、配列の同一性を取得する。他のアルゴリズムでは、ギャップの数及び／又はギャップの長さも考慮される。本発明の目的のために、公知のアラインメントソフトウェアＢＬＡＳＴ（ウェブページｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能）を用いて、デフォルト設定により最適な配列アライメントを取得し、２つのアミノ酸配列間の配列同一性を算出することができる。
「発現ベクター」は、「組換え発現ベクター」とも呼ばれ、宿主細胞内で目的のタンパク質（例えば、抗体分子の軽鎖及び／又は重鎖）を発現させるための様々な発現要素を含む核酸分子を指す。真核細胞（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）で目的のタンパク質を発現させるための発現ベクターの場合、これらの発現要素としては一般に、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列などがある。大腸菌での増幅の便宜上、発現ベクターに大腸菌レプリコン配列も含まれることがよくある。発現ベクターはさらに、スクリーニングのための抗生物質耐性遺伝子又は選択マーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）など）及び目的タンパク質コード配列を挿入するためのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含んでもよい。発現ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターであり得る。
本開示による発現ベクターは、様々な宿主細胞内で本開示による抗体分子又はその断片を発現させるのに適し、特に、哺乳動物細胞（例えば、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、サル、オランウータン、又はヒトの細胞）で発現させるのに適する。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＢＨＫ細胞から選択される。
本開示は、ＲＳＶ融合前コンフォメーションのＦタンパク質ＤＳ－Ｃａｖ１を餌として用いて、シングルセルシーケンシングにより、ＲＳＶ感染から回復した小児の末梢血リンパ球（ＰＢＭＣｓ）から、４つのヒトモノクローナル抗体を単離し、それぞれＲＶ７、ＲＶ８、ＲＶ１０及びＲＶ１１と名付けた。これらのうち、ＲＳＶ Ｆタンパク質に結合できるものは３つあり、ＲＶ８及びＲＶ１０は、融合前Ｆタンパク質と融合後Ｆタンパク質の両方に結合するが、ＲＶ１１は融合前Ｆタンパク質のみに結合する。これら３つのモノクローナル抗体は、ＲＳＶの診断及び抗原の定量的測定に使用できる。中でも、ＲＶ８及びＲＶ１１の２つは、ＲＳＶ Ａ型及びＢ型の両方に対する中和活性を有し、ＲＳＶの予防及び治療に使用できる。
本開示による抗体又はその抗原結合断片は、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質（融合前コンフォメーション及び／又は融合後コンフォメーション）に特異的に結合することができ、つまり、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質は当該抗体の標的抗原となる。当該抗体は、呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質に結合すると、中和活性によってＲＳＶの細胞感染力を阻害する。したがって、本開示による抗体又はその抗原結合断片は、ＲＳＶ感染の予防又は治療に使用できる。別の側面において、本開示による抗体の抗原結合特異性により、当該抗体を、被験者からの試料（血液など）におけるＲＳＶウイルスの有無を検出するために使用することができる。したがって、本開示は、本開示による抗体又はその抗原結合断片を含み得るＲＳＶ検出キットを提供する。
医薬組成物に関して使用される「薬学的に許容される担体」とは、安全に投与可能な固体又は液体の希釈剤、増量剤、抗酸化剤、安定剤などの物質を意味する。これらの物質は、過度の有害な副作用を伴わずにヒト及び／又は動物に投与するのに適し、その中に存在する薬物又は活性剤の活性を維持するのに適する。
「被験者」又は「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を包含する。非ヒト動物には、例えば、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類などのすべての脊椎動物（例えば、哺乳類及び非哺乳類）が含まれる。特に明記しない限り、前記用語「患者」又は「被験者」は本開示において交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、対象又は被験者はヒトである。
「投与する」又は「与える」とは、動物、ヒト、実験の被験者、細胞、組織、器官又は生体流体に適用される場合、外因性薬物、治療剤、診断剤又は組成物と動物、ヒト、被験者、細胞、組織、器官又は生体流体との接触を意味する。
ＲＳＶ感染の治療又は予防に関して、「治療有効量」とは、臨床医が望む生物学的又は医学的反応を被験者に引き起こすのに十分な活性化合物（抗体など）の量を指し、また、所望の効果を十分に又は少なくとも部分的に達成できる薬物又は薬剤の投与量を意味することができる。本開示による抗体の投与時の「治療有効量」は、投与経路、被験者の体重、年齢、状態などの要因に基づいて当業者によって決定され得る。例えば、典型的な１日当たりの投与量は、活性成分として体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲であり得る。
本開示で使用される、単数形の「一」、「１つ」及び「当該」は、文脈上特に明記しない限り、複数の表現を含み、またその逆も同様である。
以下に、具体的な実施例により、本発明をさらに説明する。
（実施例１）ＲＳＶウイルスの融合前Ｆタンパク質（ＤＳ－Ｃａｖ１）の発現と精製
Ｃ末端にトロンビン切断部位、６つのヒスチジン配列、１つのＧＳ［グリシン－セリン］リンカーが付加されるＲＳＶ Ａ２型の融合前Ｆタンパク質ＤＳ－Ｃａｖ１をコードする配列を、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグをコードする配列及び終止コドンとともに、哺乳類発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入した（アミノ酸配列は配列番号１を参照）。ライゲーション産物をＤＨ５α大腸菌コンピテントセルに形質転換した。その後、単一クローンを選択して４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、６～８時間培養した後、３００ｍＬのＬＢ培地に移し、１２～１６時間培養して、集菌し、エンドトキシンフリーのプラスミド抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）によりプラスミドを抽出して、ｐＣＡＧＧＳ－ＲＳＶ－Ｆ（ＤＳ－Ｃａｖ１）を得た。
抽出したプラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＲＳＶ－Ｆ（ＤＳ－Ｃａｖ１）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｆタンパク質を発現させた。トランスフェクションの４～５日後、目的タンパク質を含む２９３Ｔ細胞培養上清を遠心分離及びろ過（０．２２μＭ）により細胞破片を除去した後、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ニッケルキレートカラムに結合させ、さらに様々な濃度のイミダゾールでカラムから溶出させた。溶出したタンパク質をそれぞれ回収して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果により、目的タンパク質を含む試料を特定した。
目的タンパク質を含む溶出ピークを回収し、濃縮後、モレキュラーシーブクロマトグラフィーを行い、タンパク質のピーク位置及びＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から、目的タンパク質のサイズ及び純度を判断した（モレキュラーシーブ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果は図１を参照）。モレキュラーシーブの結果によれば、タンパク質のピーク位置が６０～７０ｍＬにあり、これはＦタンパク質三量体の理論的分子量１５０ｋＤａに一致した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果によれば、還元（＋ＤＴＴ）及び非還元（－ＤＴＴ）の条件下でＦタンパク質が約５０Ｋｄａであったことから、Ｆタンパク質のサブユニットは非共有結合で結合して三量体を形成することが分かった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの番号Ｔの試料は、モレキュラーシーブの番号Ｔのコレクションチューブに対応する。
（実施例２）ＲＳＶ Ｆ（ＤＳ－Ｃａｖ１）タンパク質特異的メモリーＢ細胞の単離
ＲＳＶウイルス感染から回復して退院した人のインフォームドコンセントを得て、３～１０ｍＬの血液を採取し、ＰＢＭＣｓを単離した。単離されたＰＢＭＣｓ（１０ ７／ｍＬ）を４００ｎＭのタンパク質ＤＳ－Ｃａｖ１（実施例１で調製したもの）とともに氷上で３０分間インキュベートして結合させた後、ＰＢＳで２回洗浄し、さらに下記抗体（いずれもＢＤから購入）と混合した。ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＰＥ－Ｃｙ５、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１６／ＰＥ－Ｃｙ５、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２３５ａ／ＰＥ－Ｃｙ５、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１９／ＡＰＣ－Ｃｙ７、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２７／Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３８／ＡＰＣ、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ／ＦＩＴＣ、及びａｎｔｉ－Ｈｉｓ／ＰＥ。氷上で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩによりＰＢＭＣｓの選別を行い、ＰＥ－Ｃｙ５－ＡＰＣ－ＡＰＣ－Ｃｙ７＋Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ＋ＦＩＴＣ＋ＰＥ＋細胞（つまり、メモリーＢ細胞）を直接９６ウェルプレートに１細胞／ウェルで回収した。
（実施例３）単一Ｂ細胞ＰＣＲ及びヒト由来のモノクローナル抗体ＩｇＧ１のクローニング
実施例２で得られた細胞をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、５５℃、６０分の反応条件で逆転写した。この逆転写産物を鋳型として、ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｐ Ｐｌｕｓ酵素（ＱＩＡｇｅｎ）を用いてＰＣＲを行い、抗体可変領域配列（ＰＣＲａ）を増幅した（反応条件は、９５℃で５分、９５℃で３０秒、５５℃（重鎖／κ鎖）／５０℃（λ鎖）で３０秒、７２℃で９０秒、３５サイクル、７２℃で７分とした）。これを鋳型としてさらに１回のＰＣＲ（ＰＣＲｂ）を行った（条件は、９５℃で５分、９５℃で３０秒、５８℃（重鎖）／６０℃（κ鎖）／６４℃（λ鎖）で３０秒、７２℃で９０秒、３５サイクル、７２℃で７分とした）。１．２％のアガロースゲル電気泳動を行ってＰＣＲ産物を分離し、４００～５００ｂｐのバンドを切り取って回収した後、配列決定会社に送って配列決定が行われた。ＩＧＢＬＡＳＴサイトで配列決定結果の配列解析を行った。解析結果は以下のとおりである。
計４つのペア抗体ＲＶ７、ＲＶ８、ＲＶ１０及びＲＶ１１を得た。配列決定結果によれば、ＲＶ７は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３であった。ＲＶ８は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５であった。ＲＶ１０は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７であった。ＲＶ１１は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９であった。４つの抗体の軽鎖配列決定結果をそれぞれ生殖系列遺伝子と比較した結果、ＲＶ７はＣＬκを使用し、ＲＶ８はＣＬκを使用し、ＲＶ１０はＣＬλを使用し、ＲＶ１１はＣＬλを使用することが分かった。
後の評価に用いるヒト由来の抗体を取得するために、以下の方策で完全な抗ＩｇＧ１を設計して構築した。
重鎖：ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｈｉｎｄ ＩＩＩ－シグナルペプチド（ＳＰ）－重鎖可変領域（ＶＨ）－重鎖定常領域（ＣＨ）－Ｎｏｔ Ｉ。
軽鎖κ：ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｈｉｎｄ ＩＩＩ－シグナルペプチド（ＳＰ）－軽鎖可変領域（ＶＫ）－軽鎖定常領域（ＣＬκ）－Ｎｏｔ Ｉ。
軽鎖λ：ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｈｉｎｄ ＩＩＩ－シグナルペプチド（ＳＰ）－軽鎖可変領域（ＶＬ）－軽鎖定常領域（ＣＬλ）－Ｎｏｔ Ｉ。
正しい可変領域配列を、対応する重鎖ＣＨ及び軽鎖ＣＬκ（又は軽鎖ＣＬλ）の定常領域にブリッジＰＣＲによりライゲーションし、発現ベクターＫＴ３５１８６１にクローニングして、特定の抗体の軽鎖、重鎖をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドを取得した。ここで、切断部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｏｔ Ｉにより軽鎖・重鎖可変領域を、定常領域を含むベクターに挿入した。重鎖定常領域ＣＨのアミノ酸配列は配列番号１０、軽鎖定常領域ＣＬκのアミノ酸配列は配列番号１１、軽鎖定常領域ＣＬλのアミノ酸配列は配列番号１２、シグナルペプチド（ＳＰ）のアミノ酸配列は配列番号１３であった。
（実施例４）モノクローナル抗体の発現と精製
１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で２９３Ｔ細胞を培養した。実施例３で得られた抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれコードする組換え発現ベクターを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４～６時間後、細胞培養液を無血清ＤＭＥＭに交換し、さらに３日間培養した。上清を回収して、ＤＭＥＭを加え、さらに４日間培養した後、上清を再度回収した。
回収した上清を８０００ｒｐｍで９０分間遠心分離した後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む緩衝液と等容量混合し、次に０．２２μｍフィルターでろ過し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＧ充填済のプレパックカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。プレパックカラムに結合したタンパク質を１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出画分を濃縮して、モレキュラーシーブクロマトグラフィーにより精製した。続いて、精製した目的タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元性及び非還元性）により分析した結果、非還元条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、抗体は単一のバンドを示したが、還元条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、抗体のＦｃ領域のジスルフィド結合が切断されたため、２つのバンドとして示された。また、抗体の純度は９５％超であった。
（実施例５）抗体の結合性アッセイ
（１）ＲＳＶ融合後Ｆタンパク質（ＦΔＦＰ）の構築と発現
Ｃ末端にトロンビン切断部位、６つのヒスチジン配列、１つのＧＳ［グリシン－セリン］リンカーが付加されるＲＳＶ Ａ２株の融合後Ｆタンパク質（ＦΔＦＰ）をコードする配列を、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグをコードする配列及び終止コドンとともに、哺乳類発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ切断部位に挿入した（アミノ酸配列は配列番号１４を参照）。ライゲーション産物をＤＨ５α大腸菌コンピテントセルに形質転換した。その後、単一クローンを選択して４ｍＬのＬＢ培地に植菌し、６～８時間培養した後、３００ｍＬのＬＢ培地に移し、１２～１６時間培養して、集菌し、エンドトキシンフリーのプラスミド抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）によりプラスミドを抽出して、ｐＣＡＧＧＳ－ＲＳＶ－ＦΔＦＰを得た。
抽出したプラスミドｐＣＡＧＧＳ－ＲＳＶ－ＦΔＦＰを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｆタンパク質を発現させた。トランスフェクションの４～５日後、目的タンパク質を含む２９３Ｔ細胞培養上清を遠心分離及びろ過（０．２２μＭ）により細胞破片を除去した後、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ニッケルキレートカラムに結合させ、さらに様々な濃度のイミダゾールでカラムから溶出させた。溶出したタンパク質をそれぞれ回収して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果により、目的タンパク質を含む試料を特定した。
目的タンパク質を含む溶出ピークを回収し、濃縮後、モレキュラーシーブクロマトグラフィーを行い、タンパク質のピーク位置及びＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果から、タンパク質のサイズ及び純度を判断した。
（２）モノクローナル抗体Ｆａｂセグメント全長の調製及び精製
Ａ．試料の準備
完全な抗体タンパク質を１０ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮し、ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を用いてバッファー交換（２００倍）を行い、バッファー交換後の抗体を２０ｍｇ／ｍｌ以上に濃縮し、一定量のｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒにｃｙｓｔｅｉｎｅ・ＨＣｌを２０ｍＭまで添加、ｐＨ７．０）を加えて希釈し、最終濃度≧１０ｍｇ／ｍｌとした。
Ｂ．酵素の準備
先端を切ったピペットチップを用いて、十分に混和されたカップリング酵素ｂｅａｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｐｒｏｄ＃２０３４１）０．５ｍＬを反応容器に加え、１０００ｇ／ｍｉｎで２分間遠心分離して保存液を除去した。ｂｅａｎｓを３ｍＬのｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、溶出液を廃棄した。その後、０．５ｍＬのｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え、穏やかに転倒混和した。
Ｃ．酵素による切断
反応チューブに栓をし、濃縮済抗体（約１０ｍｇ）を加えて蓋を締め、シールフィルムで密閉した。反応チューブを回転ミキサーに固定し、３７℃で一晩インキュベートした。
Ｄ．Ｆａｂの回収
酵素による切断を一晩行った後、１０００ｇ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、下液を保持した。１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｎａ３ＰＯ４、ｐＨ７．０）でｂｅａｎｓを２回洗浄し、下液を回収した。これら２つの工程で得られた下液を混和した後、濃度を測定した。下液を濃縮してＰｒｏｔｅｉｎ Ｇにかけ、目的タンパク質溶出液を濃縮して１×ＰＢＳ緩衝液にバッファー交換し、モレキュラーシーブによりさらに精製した。
（３）Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体の結合力の評価
本実施例において、以下の手順どおりにＢｉａｃｏｒｅ ３Ｋ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて表面プラズモン共鳴分析を行った。
まず、融合前Ｆタンパク質ＤＳ－Ｃａｖ１及び融合後Ｆタンパク質ＦΔＦＰをアミノカップリングによりＣＭ５チップのＦｃ２及びＦｃ４チャネル（ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ、Ｆｃ）にそれぞれ固定化した。次に、抗体での捕捉によって、精製された抗体ＲＶ７、ＲＶ８、ＲＶ１０及びＲＶ１１のＦａｂタンパク質を結合させた。陽性対照としてＰａｌｉｖｉｚｕｍａｂを使用した。また、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ ７．４の溶液で抗体ＲＶ７、ＲＶ８、ＲＶ１０、ＲＶ１１及びＰａｌｉｖｉｚｕｍａｂのＦａｂを段階希釈した。その後、段階希釈したＦａｂを各チャネルに順番に通過させた（低濃度から順に注入した）。ＤＳ－Ｃａｖ１又はＦΔＦＰに対する抗体ＲＶ７、ＲＶ８、ＲＶ１０、ＲＶ１１及びＰａｌｉｖｉｚｕｍａｂのＦａｂ結合の反応速度曲線を描画し、ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ３Ｋ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．）により速度定数ＫＤを算出した。親和性結果を表１に示す。
Figure 2024522670000002
（結果解析）ＲＶ７は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質及びＲＳＶ融合後Ｆタンパク質の両方に結合しない。ＲＶ８は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質（Ｋ Ｄ＝２５．６ｎＭ）及び融合後Ｆタンパク質（Ｋ Ｄ＝１７．５ｎＭ）の両方に結合する。ＲＶ１０は、融合前Ｆタンパク質（Ｋ Ｄ＝１０．１ｎＭ）及び融合後Ｆタンパク質（Ｋ Ｄ＝７．１１ｎＭ）の両方に結合する。ＲＶ１１抗体は、ＲＳＶの融合前Ｆタンパク質（Ｋ Ｄ＝７．１８ｎＭ）に結合するが、融合後Ｆタンパク質に結合しない。
（実施例６）抗体の中和活性アッセイ
フローサイトメトリー染色法により以下の手順で抗体の中和活性を分析した。概して言えば、精製された抗体を段階希釈して、ウイルスと混合し、一定期間インキュベートした後、前日に準備した感受性細胞に感染させた。２日後、細胞を固定して透過処理し、Ｆタンパク質を標的とする一次抗体で染色した後、標識付き二次抗体で再度染色した。その後、フローサイトメトリーを実施して感染細胞の割合を計測した。最後に、抗体の中和活性を算出した。
実験手順
１．細胞の準備
（１）翌日７０％以上増殖後に抗体中和実験を行うために、Ｈｅｐ２細胞を１２～１６時間前に２４ウェルプレートに播種して１０％ＤＭＥＭ培地で培養した。
（２）抗体の希釈
ＲＶ７、ＲＶ８、ＲＶ１０、ＲＶ１１、Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂの計５抗体について、各抗体を精製し、滅菌濾過した後、４８ウェルプレートに抗体を加えて３倍段階希釈した。１ウェル当たり少なくとも３５０μＬ～４００μＬとなるように、ＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ）で希釈した。
（３）ウイルスの希釈
ウイルスを－８０℃の冷蔵庫から取り出して解凍し、適切なウイルス希釈倍率に従ってＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ）でウイルスを希釈した後、抗体入り４８ウェルプレートに３００μＬ／ウェルで添加した。（ＲＳＶ＿Ａ２又はＲＳＶ－Ｌｏｎｇ又はＲＳＶ－Ｂは、４５０μＬから４０ｍＬまで希釈し、最終力価１．２×１０４ＴＣＩＤ５０／１００μＬとした。）
（４）ウイルスと抗体のインキュベート
希釈されたウイルスと抗体をモル比１：１で混合し、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間インキュベートした。
（５）細胞の洗浄
１０分前に、コンフルエント直後のＨｅｐ２細胞をインキュベーターから取り出し、ピペットで培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、各ウェルに５００μＬのＰＢＳを加えた。
（６）ウイルス－抗体混合液の添加
細胞からＰＢＳを除去し、ウイルスと細胞上清との混合物を１ウェル当たり３００μＬで細胞に加え、３７℃で１時間インキュベートした。（１濃度当たり２ウェルで、それぞれ１１濃度にした。各プレート毎に２ウェルのウイルス対照を設けた。）
（７）培地の追加
インキュベーション後、上清を除去し、各ウェルにペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液＋２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１ｍＬを加えた。インキュベーターに入れて約４８時間細胞培養した。
２．フローサイトメトリー分析
（１）感染後の細胞を観察し、適切な細胞変性が起こった後に細胞を回収した。
（２）細胞の消化
細胞培地を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄して、各ウェルにトリプシン１２０μｌを加え、３７℃のインキュベーターに入れて２分間消化させ、細胞が剥がれると、１０％ＦＢＳ＋ＰＢＳ１３０μＬを加えて反応を停止させた。
（３）細胞を丸底９６ウェルプレートに移した。５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去した。
（４）１％ＦＢＳ＋ＰＢＳを１ウェル当たり１５０μＬ加えて洗浄を１回行い、上記と同様に遠心分離して、上清を除去した。
（５）１００μＬのＦｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、４℃、氷上、暗所で細胞の固定及び透過処理を３０分間行った。
（６）１００μＬの１×ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを加えて混和し、５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。１００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁し、９６ウェルプレートの外側にアルコールをスプレーして密閉し、後の操作のためにＰ３からＰ２に移した。念のため、操作の前に４℃で一晩静置するか、或いは、細胞を新しい丸底９６ウェルプレートに移す。
（７）一次抗体の添加
精製されたＰａｌｉｖｉｚｕｍａｂを１×ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２μｇ／ｍＬの濃度となるように希釈し、細胞を遠心分離して、上清を除去し、各ウェルに５０μＬの抗体を加え、氷上で３０分間インキュベートした。その後、１×ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ１５０μＬを加えて混和し、遠心分離して上清を除去した。
（８）二次抗体の添加
１×ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒでＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ－ＩｇＧ（ＦＩＴＣ）を１５０倍希釈し、各ウェルに５０μＬの抗体を加え、氷上で３０分間インキュベートした。その後、１×ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ １５０μＬを加えて混和し、遠心分離して上清を除去した。洗浄を１回繰り返した。最後に１５０μＬのＰＢＳで再懸濁した。
（最後のフローサイトメトリー分析）
ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩでフローサイトメトリー分析を行った。ＦｌｏｗＪｏ７．６．１で解析した。
（結果）
ＲＳＶ Ａ型Ａ２株の場合、抗体の半数阻害濃度（ＩＣ５０）について、ＲＶ８は５３９．５ｎｇ／ｍＬ、ＲＶ１１は４２．３ｎｇ／ｍＬとなり、いずれも市販のｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂの７５１ｎｇ／ｍＬよりも優れた。特に、抗体ＲＶ１１は、ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂより約１８倍強い中和活性を示した。ＲＶ７及びＲＶ１０は、試験した濃度範囲では、中和活性を示さなかった。データを表２に示す。
Figure 2024522670000003
ＲＳＶ Ａ型Ｌｏｎｇ株の場合、抗体の半数阻害濃度（ＩＣ５０）について、ＲＶ８は８４２．９ｎｇ／ｍＬ、ＲＶ１１は５６．３ｎｇ／ｍＬとなり、いずれも市販のｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ（ＩＣ５０＝８９７．４ｎｇ／ｍＬ）よりも優れた。特に、ＲＶ１１抗体は、ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂより約１６倍強い中和活性を示した。ＲＶ７は、試験した濃度範囲では、中和活性を示さなかった。データを表３に示す。
Figure 2024522670000004
ＲＳＶ Ｂ型臨床分離株の場合、抗体の半数阻害濃度（ＩＣ５０）について、ＲＶ８は１８３．１ｎｇ／ｍＬ、ＲＶ１１は３１．４ｎｇ／ｍＬとなり、いずれも市販のｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ（ＩＣ５０＝１４１３．０ｎｇ／ｍＬ）よりも優れた。特に、ＲＶ１１抗体は、ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂより約４５倍強い中和活性を示した。ＲＶ８抗体も、Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂより７．７倍強い中和活性を示した。データを表４に示す。
Figure 2024522670000005
 本開示で言及されたアミノ酸配列は以下のとおりである。
Figure 2024522670000006
Figure 2024522670000007
Figure 2024522670000008

Claims (17)

  1. 呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は下記の組み合わせから選択されるいずれか１つである、前記抗体又はその抗原結合断片：
    （１）アミノ酸配列がＧＦＴＦＳＳＹＡであるＨＣＤＲ１と、
    アミノ酸配列がＩＳＹＤＧＳＮＴであるＨＣＤＲ２と、
    アミノ酸配列がＡＲＤＹＣＳＲＧＴＣＹＨＤＹであるＨＣＤＲ３；
    （２）アミノ酸配列がＧＹＴＦＴＴＹＤであるＨＣＤＲ１と、
    アミノ酸配列がＬＮＰＤＮＧＮＴであるＨＣＤＲ２と、
    アミノ酸配列がＴＲＡＰＷＷＷＹＦＤＹであるＨＣＤＲ３；及び
    （３）アミノ酸配列がＧＦＳＦＴＮＹＧであるＨＣＤＲ１と、
    アミノ酸配列がＩＳＹＤＤＧＳＤＫであるＨＣＤＲ２と、
    アミノ酸配列がＶＲＤＰＴＧＤＹであるＨＣＤＲ３。
  2. 軽鎖可変領域をさらに含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３及び前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は下記の組み合わせから選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片：
    （１）アミノ酸配列がＱＤＩＲＮＤであるＬＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＡＡＳであるＬＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＬＱＤＹＮＹＰＱＴＦＧであるＬＣＤＲ３と、アミノ酸配列がＧＦＴＦＳＳＹＡであるＨＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＩＳＹＤＧＳＮＴであるＨＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＡＲＤＹＣＳＲＧＴＣＹＨＤＹであるＨＣＤＲ３；
    （２）アミノ酸配列がＳＧＳＩＡＳＮＹであるＬＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＥＤＮであるＬＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＱＳＹＤＴＳＮＡＶＦＧであるＬＣＤＲ３と、アミノ酸配列がＧＹＴＦＴＴＹＤであるＨＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＬＮＰＤＮＧＮＴであるＨＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＴＲＡＰＷＷＷＹＦＤＹであるＨＣＤＲ３；及び
    （３）アミノ酸配列がＳＬＮＩＧＳＮＹであるＬＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＫＮＮであるＬＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＡＡＷＤＤＳＬＳＧＶＶＦＧであるＬＣＤＲ３と、アミノ酸配列がＧＦＳＦＴＮＹＧであるＨＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＩＳＹＤＤＧＳＤＫであるＨＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＶＲＤＰＴＧＤＹであるＨＣＤＲ３。
  3. 前記重鎖可変領域は、配列番号４、６若しくは８で表される配列、又は、配列番号４、６若しくは８で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記重鎖可変領域は、配列番号４で表される配列、又は、配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号５で表される配列、又は、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、或いは、
    前記重鎖可変領域は、配列番号６で表される配列、又は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号７で表される配列、又は、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、或いは、
    前記重鎖可変領域は、配列番号８で表される配列、又は、配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号９で表される配列、又は、配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２又は３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記抗体の重鎖定常領域は、配列番号１０で表される配列、又は、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖定常領域は、配列番号１１若しくは１２で表される配列、又は、配列番号１１若しくは１２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記抗体はヒト由来の抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記Ｆタンパク質は融合前コンフォメーションである、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記呼吸器合胞体ウイルスは、Ａ型又はＢ型の呼吸器合胞体ウイルスである、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子。
  10. 請求項９に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  11. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むか、若しくは発現させるか、又は、請求項９に記載の核酸分子を含むか、又は、請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  12. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
  13. 呼吸器合胞体ウイルスに関連する疾患又は症状の治療及び／又は予防のための薬剤を製造するための請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
  14. 治療有効量の請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１２に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、被験者において呼吸器合胞体ウイルスに関連する疾患又は症状の治療及び／又は予防を行う方法。
  15. 前記呼吸器合胞体ウイルスに関連する疾患又は症状は、上気道感染症又は下気道感染症に関連する疾患又は症状であり、好ましくは、前記疾患又は症状は、気管炎、気管支炎及び肺感染症から選択され、より好ましくは、前記疾患又は症状は気管支炎又は肺炎である、請求項１３又は１４に記載の呼吸器合胞体ウイルスに関連する疾患又は症状。
  16. 試料を請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片と接触させ、抗原抗体複合体の形成の有無又は形成された抗原抗体複合体の量を検出することを含む、試料中の呼吸器合胞体ウイルスの存在又は含有量を検出するための方法。
  17. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む呼吸器合胞体ウイルス検出キット。
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