一种薇菜组织培养的方法
技术领域
本发明涉及一种蕨类植物组织培养的方法,特别是一种薇菜组织培养的方法。
背景技术
薇菜是一种生长在山林中的纯天然、无污染绿色保健食品,因富含蛋白质、铁、钙、硒等17种人体所需的营养成分,加上具有独特的清脆爽口的特点,深受日本、韩国及东南亚等国客户的喜爱,被誉为“林海山珍”。薇菜因常规分株繁殖较慢,故目前均采用组织培养的方法进行繁殖。韩敬、赵莉在其文章《蕨类植物繁殖研究进展》(安徽农业科学2005Vol.33No.7P.1261-1263)中指出各种蕨类植物的组织培养主要是孢子无菌萌发,即将孢子表面消毒后均匀涂布于培养基上,于恒温恒湿条件下进行无菌培养,待其萌发后经常规组培扩繁得到大量生根苗,然后炼苗移栽。目前国内薇菜组培均采用孢子无菌萌发,也有直接在温室基质中播种孢子萌发成苗的,但通过孢子萌发组培受季切的限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种薇菜组织培养的方法,它克服了现有技术中通过孢子萌发组培受季节限制的缺点,通过薇菜的茎尖做为外植体进行组培,实现了薇菜组培途径的多样化。
本发明的目的是这样实现的:一种薇菜组织培养的方法,它包括下列步骤:
a、外植体消毒:将薇菜展开叶片及根全部去掉,仅留幼嫩茎尖,用清水冲洗干净,在超净工作台上用0.1%升汞消毒液消毒5分钟-20分钟,然后用无菌水冲洗干净备用;
b、诱导原球茎培养:将a步骤消毒好的薇菜茎尖插于诱导培养基中,于20℃-27℃温度下避光培养3天-7天后光照培养,光照强度由弱渐强,培养20天-40天即可在嫩叶上形成大量原球茎,以一升培养基用量,诱导培养基配方为
MS 250毫升-4000毫升
激动素 0.5毫克-4毫克
3-吲哚丁酸 0.5毫克-4毫克
磷酸二氢钠 100毫克-2000毫克
活性炭 1000毫克-3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克;
以一升培养基用量,诱导培养基的配方还可为
MS 250毫升-4000毫升
6-苄氨基嘌呤 0.5毫克-4毫克
3-吲哚丁酸 0.5毫克-4毫克
磷酸二氢钠 100毫克-2000毫克
活性炭 1000毫克-3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克;
c、扩繁培养:b步骤生成的原球茎继续培养30天-40天便萌发形成原叶体,然后分切原叶体在继代培养基中继代培养25天-35天为一个周期,如此循环培养即可得大量组培苗,以一升培养基用量,继代培养基配方为
MS 250毫升-4000毫升
激动素 0.5毫克-4毫克
3-吲哚丁酸 0.1毫克-4毫克
磷酸二氢钠 100毫克-2000毫克
活性炭 1000毫克-3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克;
以一升培养基用量,继代培养基的配方还可为
MS 250毫升-4000毫升
6-苄氨基嘌呤 0.5毫克-4毫克
3-吲哚丁酸 0.1毫克-4毫克
磷酸二氢钠 100毫克-2000毫克
活性炭 1000毫克-3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克。
d、生根培养:c步骤扩繁培养所得的组培苗转入生根培养基中培养,30天后能形成孢子体,再继续培养30天即可形成羽状叶并长出数条根须,以一升培养基用量,生根培养基的配方为
MS 250毫升-4000毫升
激动素 0.5毫克-4毫克
磷酸二氢钠 100毫克-2000毫克
活性炭 1000毫克-3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克;
e、炼苗移栽:将d步骤已生根的组培苗瓶放到大棚中摆放3天-7天,然后取出组培苗,洗净培养基后栽入基质中,控制环境温度在20℃,湿度在90%,遮荫并逐步增加光照,15天后即可按常规种苗进行管理。
本发明是利用植物细胞的全能性采取适当的外植体,再配以合适的激素配比,即可于短期内扩繁出大量薇菜组培苗。与孢子无菌萌发组培相比,本发明优点在于:提供了一条全新的薇菜组培途径,同时对其它蕨类植物的组培具有借鉴参考价值;突破了孢子组培的季节性限制,可一年四季采集外植体进行组培。
具体实施方式
实施例一
薇菜组织培养的步骤如下:
1、将薇菜展开叶片及根全部去掉,仅留幼嫩茎尖,并用自来水冲洗干净。然后在超净工作台上用0.1%升汞消毒5-20分钟,最后用无菌水冲洗干净备用。
2、将消毒好的薇菜茎尖插于诱导培养基中,于20℃-27℃环境中避光培养3-7天后光照培养,强度由弱渐强。约20-40天即可在嫩叶上形成大量原球茎。
以一升培养基用量,诱导培养基配方为:
MS 250毫升
激动素 0.5毫克
磷酸二氢钠 100毫克
活性炭 1000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
3、原球茎继续培养30天便萌发形成原叶体,然后分切原叶体在继代培养基中进行继代培养,约25-35天一个周期。如此不断循环便可得到大量组培苗。
以一升培养基用量,继代培养基配方为
MS 250毫升
激动素 0.5毫克
3-吲哚丁酸 0.1毫克
磷酸二氢钠 100毫克
活性炭 1000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
4、获得所需数量的组培苗后转入生根培养基中培养,培养30天后就能形成孢子体,再经培养30天即可形成羽状叶并长出数条根须。以一升培养基用量,生根培养基配方为:
MS 250毫升
激动素 0.5毫克
磷酸二氢钠 100毫克
活性炭 1000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
5、将已生根的组培苗瓶搬到大棚中自然摆放3-7天,使组培苗逐渐适应环境的温差变化。然后自瓶中取出组培苗,洗净培养基后栽入基质中。移栽后的一周内应控制环境温度在20℃左右,湿度在90%左右,适当遮荫并逐步增强光照。15天后即可按常规种苗进行管理。
实施例二
薇菜组织培养的步骤及培养条件同实施例一,诱导培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 2500毫升
激动素 2毫克
3-吲哚丁酸 2毫克
磷酸二氢钠 1000毫克
活性炭 2000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
继代培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 2500毫升
激动素 2毫克
3-吲哚丁酸 2毫克
磷酸二氢钠 1000毫克
活性炭 2000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
生根培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 2500毫升
激动素 2毫克
磷酸二氢钠 1000毫克
活性炭 2000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
实施例三
薇菜组织培养的步骤及培养条件同实施例一,诱导培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 4000毫升
激动素 4毫克
3-吲哚丁酸 4毫克
磷酸二氢钠 2000毫克
活性炭 3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
继代培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 4000毫升
激动素 4毫克
3-吲哚丁酸 4毫克
磷酸二氢钠 2000毫克
活性炭 3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
生根培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 4000毫升
激动素 4毫克
磷酸二氢钠 2000毫克
活性炭 3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
实施例四
薇菜组织培养的步骤及培养条件同实施例一,诱导培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 250毫升
6-苄氨基嘌呤 0.5毫克
3-吲哚丁酸 0.5毫克
磷酸二氢钠 100毫克
活性炭 1000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
继代培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 250毫升
6-苄氨基嘌呤 0.5毫克
3-吲哚丁酸 0.1毫克
磷酸二氢钠 100毫克
活性炭 1000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
生根培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 250毫升
激动素 0.5毫克
磷酸二氢钠 100毫克
活性炭 1000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
实施例五
薇菜组织培养的步骤及培养条件同实施例一,诱导培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 2000毫升
6-苄氨基嘌呤 2毫克
3-吲哚丁酸 2毫克
磷酸二氢钠 1000毫克
活性炭 2000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
继代培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 2000毫升
6-苄氨基嘌呤 2毫克
3-吲哚丁酸 1.5毫克
磷酸二氢钠 1000毫克
活性炭 2000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
生根培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 2000毫升
激动素 2毫克
磷酸二氢钠 1000毫克
活性炭 2000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
实施例六
薇菜组织培养的步骤及培养条件同实施例一,诱导培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 4000毫升
6-苄氨基嘌呤 4毫克
3-吲哚丁酸 4毫克
磷酸二氢钠 2000毫克
活性炭 3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
继代培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 4000毫升
6-苄氨基嘌呤 4毫克
3-吲哚丁酸 4毫克
磷酸二氢钠 2000毫克
活性炭 3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克
生根培养基配方为(以一升培养基用量)
MS 4000毫升
激动素 4毫克
磷酸二氢钠 2000毫克
活性炭 3000毫克
蔗糖 30000毫克
琼脂 9000毫克