CN118063555A - 一类重复小单元的α-螺旋低毒广谱抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类重复小单元的α‑螺旋低毒广谱抗菌肽及其应用，所述抗菌肽由α‑螺旋抗菌肽模板(X1X2Y1Y2)n改造而来，其结构式为：(KKFL)3，(KKFI)3，(KKFI)4或(OOFI)4，其中O为Orn；所述抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示。该类抗菌肽具有广谱抗菌活性，且结构设计简单，制造成本低。与此同时，该类抗菌肽不仅具有高抗菌效果，还表现出较低的毒性，并且不易诱导细菌产生耐药性；此外，该类抗菌肽对临床多药耐药菌也表现出较好的抗菌活性。因此，本发明的抗菌肽在制备临床抗菌药物方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一类全新结构的重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽，本发明同时还涉及该抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
背景技术
抗生素耐药是对全球公共卫生及经济的巨大威胁(Sci.Adv.2021；7:eabc9917)。目前，全世界每年约有70万人死于耐药菌感染。由抗生素耐药引发的危害在不断加剧，预计到2050年，全球将会有数百万人因耐药菌感染而死亡(BMJ.2013；346:f1493)。因此，开发具有低耐药发生性且能杀死获得性耐药菌的新型抗生素迫在眉睫。
抗菌肽(AMPs，Antimicrobial peptides)存在于多种动物、植物和昆虫中，通常具有广谱抗菌活性，在抗菌防御中起着重要的作用，被认为是抗生素类药物的理想替代品(Methods Mol.Biol.2012；824:501-526)。其可通过多种机制发挥其抗菌活性：抗菌肽具有非受体介导的膜作用机制，通过其本身的正电荷与细菌细胞膜结合，导致细菌细胞膜渗透(Antimicrob.Agents Chemother.2017；61:e02340–16)；此外，抗菌肽还可与细菌DNA、RNA、核酸结合，影响蛋白质的合成，或抑制细胞壁/膜的形成(Applied Microbiology&Biotechnology.2019；103:6593–6604.)。
大多数抗菌肽在进入细菌的膜环境后能够与磷脂生物分子相互作用形成高度稳定的二级结构，从而发挥抗菌活性(Biochimie.2010；92:1236–1241)。因此，二级结构对抗菌肽与细菌细胞膜之间的相互作用十分重要，折叠成规则的二级结构有利于抗菌肽***细菌膜中(Biomater.Sci.2020；8:6858–6866；Biochim.Biophys.Acta(BBA)Biomembr.2018；1860:2108–2117)。随着药物化学家们对抗菌肽的不断深入研究，抗菌肽的开发也从对天然抗菌肽的修饰与改造发展到抗菌肽的从头设计合成(Nat.Rev.Drug Discov.2012；11:37-51)。Wiradharma等人在2011年就创建了α-螺旋抗菌肽模板(X1X2Y1Y2)n，其中X为疏水性残基，Y为阳离子残基，n＝2-4(Biomaterials.2011；32:2204-2212)，基于此α-螺旋抗菌肽模板，大量的抗菌肽被开发。模板的建立降低了抗菌肽的合成成本低，有助于进行广泛的药物筛选，且便于对抗菌肽进行构效关系研究。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类设计简单、易于合成、制备成本低、抗菌活性强且具有低溶血活性和低耐药发生性的重复小单元广谱抗菌肽，通过对上述α-螺旋抗菌肽模板中的亲水性氨基酸X1、X2，疏水性氨基酸Y1、Y2及重复次数n进行筛选，并在新合成的抗菌肽中引入非天然氨基酸Dab和Orn，以期得到易于合成的低毒广谱抗菌肽。
本发明的另一目的是提供上述重复小单元广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一、一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽的结构设计
本发明涉及的一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽，其结构通式为：
(KKFY)n-NH2，记为：(KKFY)n，其中，Y＝Leu、Ile、Phe或Trp，n＝2-4；
或(XXFI)4-NH2，记为：(XXFI)4，其中，Orn、Arg或Dab。
具体地，本发明所述的一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽，其结构如下：
(Lys-Lys-Phe-Y)n-NH2，记为：(KKFY)n，其中，Y＝Leu、Ile、Phe、Trp，n＝2-4；
(X-X-Phe-Ile)4-NH2，记为：(XXFI)4，其中，X＝Dab、Orn、Arg。
上述结构式中，含Orn的抗菌肽记为(OOFI)4，含Dab的抗菌肽记为(BBFI)4；本发明要求保护的α-螺旋低毒广谱抗菌肽为溶血活性较低的(KKFL)3，(KKFI)3，(KKFI)4或(OOFI)4；其氨基酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示；更优选地，上述α-螺旋低毒广谱抗菌肽为溶血活性更低的(KKFL)3，(KKFI)3或(OOFI)4；最优选地，本发明α-螺旋低毒广谱抗菌肽为溶血活性最低的(OOFI)4。
二、一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽的在制备临床抗菌药物中的应用
1、体外抗菌实验
采用经典微量二倍稀释法测定上述抗菌肽对革兰氏阳性菌株(S.aureus ATCC25923，B.subtilis ATCC 23857，S.epidermidis ATCC 12228，E.faecalis ATCC 29212)和革兰氏阴性菌株(E.coli ATCC 25922，K.pneumoniae ATCC 700603，P.aeruginos ATCC27853，A.baumannii ATCC 19606)的最低抑菌浓度(MIC)，评估其抗菌活性。具体实验方法为：用MH肉汤培养基将生长至对数中期的实验细菌稀释成1×106CFU/mL的细菌悬浮液；将抗菌肽溶解于无菌水，经二倍稀释法用MH肉汤配制成一系列不同浓度的抗菌肽类似物溶液，再将其与等体积细菌悬浮液混合，加入96孔培养板中37℃孵育18h后观察，以无明显细菌生长的最小浓度为抗菌肽类似物的最低抑菌浓度(MIC)。以抗生素多粘菌素B作为阳性对照，平行重复三次，结果如表1。
表1本发明中重复小单元α-螺旋抗菌肽对抗标准菌株的最低抑菌浓度
表1结果表明，本发明所设计的重复小单元α-螺旋抗菌肽对常见实验菌株均具有较强抗菌活性，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有很强的抑制作用，表现为广谱抗菌活性。
2、溶血实验
取健康小鼠的新鲜血液，1000g，4℃，离心10min，弃去上层血浆，用生理盐水清洗下层血细胞后，将其配制成含有8％血细胞的悬浮液，100μL/孔加入96孔板中；将抗菌肽类似物溶解于生理盐水中，用二倍稀释法配制成不同浓度的肽溶液，将其等体积加于已加入血细胞悬浮液的96孔板中，37℃孵育1h；共孵物1200g离心15min后，取100uL/孔上清液至新的96孔板，酶标仪检测其490nm处的吸光值。生理盐水组作阴性对照，1％TritonX-100作阳性对照，根据公式：Hemolysis rate(％)＝[(OD490nm peptides-OD490nm negative control)/(OD490nm positive control-OD490nm negative control)]×100％，计算溶血率，结果如图1。
图1结果表明，本发明的重复小单元抗菌肽(KKFL)3，(KKFI)3和(OOFI)4在最高检测浓度(256μg/mL)时溶血率低于10％，(KKFI)4在256μg/mL时引起的溶血率虽然超过了10％，但其溶血发生浓度远大于发挥抗菌活性的有效浓度。总体来说，本发明合成的抗菌肽类似物溶血毒性低，安全性好。
3、诱导细菌耐药实验
选取本发明的优选抗菌肽(OOFI)4，测定其对S.aureus ATCC 25923和P.aeruginosa ATCC 27853的最小抑菌浓度MIC，然后将其1/2×MIC组分别接种于新的MH培养基中培养至对数期，测定抗菌肽在新菌液中的MIC，以此类推，以相同的方法重复20次，观察MIC值的变化，以反映抗菌肽诱导细菌产生耐药特性的能力。抗生素多粘菌素B和庆大霉素做对照药，结果如图2。
图2结果表明，在连续传代20代后，庆大霉素容易引起S.aureus ATCC 25923和P.aeruginosa ATCC 27853产生耐药性，而我们的抗菌肽(OOFI)4不易诱导细菌耐药发生。
4、对临床耐药菌的MIC测定
采用上述经典微量二倍稀释法测定本发明的优选抗菌肽(OOFI)4对临床耐药菌的最低抑菌浓度(MIC)，以抗生素多粘菌素B，庆大霉素，美罗培南，万古霉素以及甲氧西林作为阳性对照，平行重复三次，结果如表2。
表2本发明优选抗菌肽(OOFI)4对抗临床耐药菌株的最低抑菌浓度
表2结果表明，(OOFI)4对临床耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抗菌活性。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
1、本发明重复小单元α-螺旋抗菌肽设计简单，制造成本低，易于临床抗菌药物筛选。
2、本发明由重复小单元构成的抗菌肽具有广谱抗菌活性和低的溶血毒性。
3、与传统抗生素相比，本发明抗菌肽具有低的耐药发生性。
4、本发明抗菌肽对临床耐药菌有较好的抗菌活性。
因此，本发明基于重复序列所设计合成的α-螺旋抗菌肽在制备临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明抗菌肽溶血毒性实验结果图；
图2为本发明抗菌肽诱导耐药实验结果图；
图3为本发明抗菌肽(KKFL)3的质谱图；
图4为本发明抗菌肽(KKFI)3的质谱图；
图5为本发明抗菌肽(KKFI)4的质谱图；
图6为本发明抗菌肽(OOFI)4的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明低毒广谱抗菌肽类似物(KKFL)3、(KKFI)3、(KKFI)4和(OOFI)4的合成方法进行详细说明。
实施例1：抗菌肽(KKFL)3的合成
(1)树脂的活化及预处理
准确称取0.444g(0.2mmol)的MBHA树脂(取代值0.45mmol/g)置于合成仪中，经二氯甲烷溶液溶胀及DMF洗涤后，采用茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，表明树脂正常。
(2)(KKFL)3-resin的合成
对上述检验正常的MBHA树脂用含有20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱去Fmoc保护基团，茚三酮显色法检验，树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱去；DMF洗涤后，将3倍过量(0.6mmol)的Fmoc-Leu-OH、3倍过量(0.6mmol)的HBTU和HOBT，及6倍过量(1.2mmol)的DIEA用重蒸DMF溶解后加入合成仪中，缩合反应1h；茚三酮显色法检验，树脂呈无色透明状，则表明缩合反应成功，得到Fmoc-Leu-resin。
按照上述方法，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH及Fmoc-Lys(Boc)-OH，其中氨基酸、HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-resin。
用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基，得到Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-resin。
(3)多肽切割
将所得的Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Leu-resin依次用二氯甲烷、甲醇洗涤，彻底压缩抽干后，加入60％-90％的三氟乙酸溶液对多肽链进行切割，最终得到Lys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Phe-Leu-NH2，经冰***和水萃取后，冷冻干燥，得到粗肽冻干粉末。
(4)多肽纯化
将上述得到的粗肽冻干粉末经RP-HPLC分离纯化，收集流出液，再冷冻干燥，经质谱鉴定得(KKFL)3-NH2，分子量为1566.05Da，质谱图见图3，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。；其中，RP-HPLC纯化条件为：流动相A：0.1％TFA/水；流动相B：0.1％TFA/乙腈；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
实施例2：抗菌肽(KKFI)3的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)(KKFI)3-resin的合成
同实施例1的方法依次缩合以下氨基酸Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH及Fmoc-Lys(Boc)-OH，用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基团得到Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Ile-resin。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得(KKFI)3-NH2，分子量为1566.05Da，质谱图见图4，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例3：抗菌肽(KKFI)4的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)(KKFI)4-resin的合成
同实施例1的方法依次缩合以下氨基酸Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH及Fmoc-Lys(Boc)-OH，用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基团得到Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Ile-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Ile-resin。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得(KKFI)3-NH2，分子量为2082.40Da，质谱图见图5，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
实施例4：抗菌肽(OOFI)4的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)(OOFI)4-resin的合成
使用同实施例1的方法依次缩合氨基酸得到Fmoc-Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-resin，用含有20％哌啶的DMF溶液脱去末端Fmoc保护基后，得到Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-Orn(Boc)-Orn(Boc)-Phe-Ile-resin。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，经质谱鉴定得(OOFI)4-NH2，分子量为1970.27Da，质谱图见图6，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
Claims (4)
1.一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽由α-螺旋抗菌肽模板(X1X2Y1Y2)n改造而来，其结构通式为：
(KKFY)n-NH2，记为：(KKFY)n，其中，Y＝Leu、Ile、Phe、Trp，n＝2-4；
或(XXFI)4-NH2，记为：(XXFI)4，其中，X＝Dab、Orn、Arg。
2.如权利要求1所述的一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述α-螺旋低毒广谱抗菌肽为(KKFL)3，(KKFI)3，(KKFI)4或(OOFI)4；所述抗菌肽氨基酸序列如SEQID No.1至SEQ ID No.4所示。
3.如权利要求2所述的一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽，其特征在于，所述α-螺旋低毒广谱抗菌肽为(OOFI)4。
4.如权利要求1-3任一项所述的一类重复小单元α-螺旋低毒广谱抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
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