CN117487029B - 一种双功能抗菌肽及其合成方法和应用 - Google Patents
一种双功能抗菌肽及其合成方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双功能抗菌肽及其合成方法和应用。该双功能抗菌肽由34个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。本发明提供了一种新的双功能抗菌肽，其具有分子量小、合成简单、溶血活性低及稳定性好的特点；通过实验研究显示，本发明设计的新型双功能抗菌肽，其既能破坏细菌的膜完整性，又可以提高细菌胞内抗菌肽的浓度，抑制蛋白质翻译，发挥双重抑制效果，降低细菌耐药性的产生，减少毒副作用。此外，该双功能抗菌肽可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双功能抗菌肽及其合成方法和应用。
背景技术
革兰阴性菌常会引起腹腔内感染、***、菌血症以及诱发全身炎症反应，而耐药菌的出现增加了感染性疾病的治疗难度，严重增加了病人的经济负担。
抗菌肽（Antibacterial peptide，AMP）作为宿主天然防御***的一部分，是小分子肽类物质，由10-100个氨基酸残基组成，具有一定的抗菌活性。由于其天然的抗菌功能和低概率的耐药性，被认为是抗生素的有效替代品，其按照抗菌机制主要分为靶向细菌膜和胞内生物大分子两大类，但两类单靶点天然抗菌肽存在毒副作用大和渗透性差等不足。细菌的膜和核糖体是临床抗生素的重要靶点，研究表明两种抗生素或抗菌肽在体外和体内具有协同作用。多肽药物分子具有较高的安全性和靶标亲和力，易合成和改造，免疫原性较低等诸多优势。但是目前很多抗菌肽的抗菌活性不高，效率低，并且对细胞具有很大毒害性或其他等一系列的副作用。因此，一种安全有效的可以针对性作用于革兰阴性菌的，而既能破坏细菌的膜完整性，又可以提高细菌胞内抗菌肽的浓度，抑制蛋白质翻译，发挥双重抑制效果，降低细菌耐药性的产生是抗菌研究的技术难点和需求。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种双功能抗菌肽及其制备方法和应用，具体采用以下的技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种双功能抗菌肽，所述抗菌肽由34个氨基酸组成，其氨基酸序列：
Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly SerPhe Trp Lys Lys Ile Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe，所有氨基酸均为L-型。
上述双功能抗菌肽的氨基酸序列简写序列如SEQ ID No.1所示：VDKPPYLPRPRPGGGGSFWKKIKNSVKKRAKKFF。
上述双功能抗菌肽分子量为3915.62，等电点为11.7。
本发明的另一目的是提供一种双功能抗菌肽的制备方法，如下：通过对蛇Cathelicidin家族FP-CATH（其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：KRFKKFWKKIKNSVKKRAKKFFRKPRVIAVSIPF）和脯氨酸抗菌肽家族Oncocin（其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：VDKPPYLPRPRPPRRIYNR）进行对比分析。通过将多肽截短，检测截短肽段的抗菌活性、脂多糖及核糖体蛋白的亲和力，初步筛选出可以结合脂多糖和核糖体蛋白的两类肽类药效团，通过将两类药效团肽段进行不同的排列组合，抗菌活性检测筛选，设计出N端（Oncocin12）采用VDKPPYLPRPRP氨基酸序列（检测发现不具有抗菌活性）顺序，C端（FP-CATH17）采用FWKKIKNSVKKRAKKFF氨基酸序列顺序，用GGGGS氨基酸linker序列将其连接，最终得到的序列如SEQ ID No.1所示，命名为三十四肽（FPON），将设计的多肽通过人工固相合成，HPLC-C18反相柱层析脱盐纯化，LC-MS/MS法测定其分子量，高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度后，即完成该抗菌肽的制备。
本发明创新在膜抗菌肽FP-CATH结构基础上，引入抑制细菌蛋白质翻译的肽类药效团，设计合成了双功能肽FPON，体外实验表明FPON破坏细菌膜完整性和抑制细菌蛋白质翻译，表明其具有双功能抗菌作用，其溶血活性低且对革兰氏阴性菌表现出良好的抗菌活性。本发明设计的新型双功能抗菌肽，其既能破坏细菌的膜完整性，又可以提高细菌胞内抗菌肽的浓度，抑制蛋白质翻译，发挥双重抑制效果，降低细菌耐药性的产生，减少毒副作用。
在本发明的第二方面，还提供了上述双功能抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
先通过对蛇Cathelicidin（导管素）家族和脯氨酸抗菌肽家族进行对比分析；然后将多肽截短，检测截短肽段的抗菌活性、脂多糖及核糖体蛋白的亲和力，初步筛选出可以结合脂多糖和核糖体蛋白的两类肽类药效团的氨基酸序列，最后采用自动多肽合成仪合其全序列，通过高效液相色谱法反相柱层析脱盐纯化得到。
除上述步骤之外还包括：用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，采用LC-MS/MS鉴定序列，等电聚焦电泳测定等电点，圆二色谱测定的二级结构，SWISS软件预测氨基酸序列的三级结构。
在本发明的第三方面，还提供了一种用于抑制细菌生长的药物组合物，包含上述的双功能抗菌肽，还包含药学上可接受的载体；其中上述细菌包括大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌中的至少一种。
在本发明的第四方面，还提供了一种双功能抗菌肽在制备防腐剂中的用途。
在本发明的第五方面，还提供了一种双功能抗菌肽在制备动物饲料添加剂中的用途。
在本发明的第六方面，还提供了一种双功能抗菌肽在制备化妆品添加剂中的用途。
在本发明的第七方面，还提供了一种双功能抗菌肽在制备抗菌剂中的用途。此外，本发明提供的双功能抗菌肽能够应用在抗生素佐剂中，该双功能抗菌肽能够与任何抗生素联合应用。
本发明的有益效果为：
本发明提出的双功能抗菌肽FPON可以通过化学合成的方式获得，实验结果显示，该肽对临床上多重耐药的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌等，均有比较强的抗菌活性。此外，该抗菌肽具有分子量小、合成简单、溶血活性低及稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。
附图说明
图1所示为双功能抗菌肽质谱鉴定图；
图2所示为双功能抗菌肽损伤革兰氏阴性菌膜透射电镜图；
图3所示为双功能抗菌肽体外抑制细菌蛋白质翻译图；
图4所示为双功能抗菌肽对红细胞溶血活性图；
图5所示为双功能抗菌肽对Raw264.7细胞毒性。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的若干个实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本文中，除非另有说明，用语“％”是指“质量％”；用语“μg/mL”是指：微克每毫升。在本文中，除非另有说明，本文用语“％”均是指基于本申请组合物的总重量而言的。
在本文中，限定的所有范围是指：包括给定范围内的每个特定范围以及给定范围之间的子范围的组合。例如，1～5的范围具体包括1、2、3、4和5，也包括如2～5、3～5、2～3、2～4、1～4等子范围。
实施例1
分别截短FP-CATH为FP-CATH9（其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示：KRFKKFWKK）、FP-CATH16（其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示：KKFFRKPRVIAVSIPF）和FP-CATH17（其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示：FWKKIKNSVKKRAKKFF）；截短Oncocin为Oncocin7（其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示：VDKPPYL）、Oncocin10（其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示：PRPPRRIYNR）和Oncocin12（其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示：VDKPPYLPRPRP）；检测截短肽段的抗菌活性、脂多糖及核糖体蛋白的亲和力，初步筛选出可以结合脂多糖（FP-CATH17）和核糖体蛋白（Oncocin12）的两类肽类药效团，但是抗菌活性结果显示Oncocin12不具备抗菌活性（表1）。通过将两类药效团肽段N端到C端进行不同的排列组合，再次检测抗菌活性、脂多糖及核糖体蛋白的亲和力，筛选发现FPON抗菌效果最好，进一步检测FPON是一种双功能抗菌肽，该抗菌肽由34个氨基酸组成，其氨基酸序列如下所示：
Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly SerPhe Trp Lys Lys Ile Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe，氨基酸简写为VDKPPYLPRPRPGGGGSFWKKIKNSVKKRAKKFF，所有氨基酸均为L-型。
实施例2
一种双功能抗菌肽的合成方法，其具体包括以下步骤：
步骤1：首先通过人工固相合成合成FPON多肽，通过HPLC-C18反相柱层析脱盐纯化；
步骤2：采用LC-MS/MS法测定其分子量，结果见图1；
步骤3：将纯化的FPON用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度>95％，分子量为3915.62，等电聚焦电泳测定等电点为11.7。
实施例3
本实施例为双功能抗菌肽FPON抗菌活性检测实验，采用对倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，选择E.coliBW25113、K. pneumoniae KPC-2MDR、K. pneumoniae NDM-1MDR，P. aeruginosaATCC 27853、A. baumanniiATCC 19606、S. aureus和S. aureusMRSA菌株为受试菌，进行MIC测定实验。
挑取单克隆试验菌株（上述），接种到新鲜的MH液体培养基(购自上海冠导生物工程有限公司)中，37℃恒温振荡培养6h左右（为对数生长期），用新鲜MH液体培养基液稀释到1.5×108cfu/mL备用；将10μLMH液体培养基先加入无菌96孔板各孔中，然后分别各吸取10μL的肽样品（FPON、FP-CATH17和Oncocin 12）溶液(精确称取8mg多肽，溶解于1mL生理盐水中，经0.22μm孔滤膜过滤)，依次按顺序逐个稀释，最后一孔为阴性对照孔；将上述菌液稀释200倍，吸取菌液90μL加入每孔，然后将96孔板放置于37℃恒温培养箱静止培养18h，于OD600测定光吸收；最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度，结果如表1所示；
本实验中K. pneumoniae KPC-2MDR、K. pneumoniae NDM-1MDR，P. aeruginosaATCC27853、A. baumanniiATCC 19606、S. aureus和S. aureusMRSA的MIC测定实验步骤与上述步骤相同。
表1 不同肽对各细菌中的革兰氏阴性菌有抗菌活性
由上表可知，Oncocin 12不具有抗菌活性；FPON的有效MIC比FP-CATH17低4~8倍，FPON的有效MIC比Oncocin 12低64~128倍；FPON的抗菌活性优于FP-CATH17和Oncocin 12，且特异性抗革兰氏阴性菌。
实施例4
本实施例为双功能抗菌肽FPON损伤细菌膜检测实验：
将受试菌E.coliBW25113（-80℃）三区划线法分别接种于灭菌的Luria-Bertani(LB)固体培养基平板中，于37℃恒温培养箱中倒置培养12小时；然后用接种环挑取单菌落分别转接到灭菌的液体LB培养基中，在37℃、150rpm条件下在震荡培养至对数生长期，OD600值为0.6-0.8之间；然后用生理盐水洗3次，在OD600重悬至0.8，细菌与肽的混合物（2× MIC终浓度）在37℃孵育60 min；用3% (w/v)戊二醛和0.075% (w/v)钌红在0.1 M PBS中黑暗固定1小时，后用0.075% (w/v)钌红和1% (w/v)四氧化锇在黑暗中固定2小时；样品通过分级乙醇脱水，转移到纯Spurr树脂中，树脂凝固后***后，经超薄切片机切片后，用醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察，如图2细胞表面和胞质内容物释放，细胞膜明显不规则，细菌外膜有缺口；经过多肽处理的细菌细胞比对照细胞表现出更多的聚集和凝结。
实施例5
本实验为体外蛋白质翻译抑制检测实验：
肽对无细胞GFP合成的抑制作用，通过基于大肠埃希菌裂解物的转录-翻译偶联法测定。按照myTXTL Sigma70 Master Mix Kit说明书，其基于E.coli的裂解液，将Ready-to-Use预混液（4μL）与deGFP质粒（1μL）混合，加入反应缓冲液（4μL），加入FPON/多粘菌素B（1μL，浓度为100 μg/mL），使总的微量反应体系为10μL，使肽/药物的终浓度为10μg/mL。检测肽存在或不存在下对体外转录-翻译的影响。通过检测30 min内GFP蛋白表达进行量化（λ激发=460nm，λ发射= 525nm），30 min时间点的荧光信号来计算荧光强度，所有测定一式三份；结果如图3所示，多粘菌素B（PB）没有体外翻译抑制效果，FPON体外可以抑制体外大肠埃希菌GFP的蛋白质体外翻译。
实施例6
本实施例为双功能抗菌肽FPON的细胞毒性检测实验：
（1）溶血活性的测定
取标准人血细胞试剂（长春***生物技术有限公司），用生理盐水洗涤3次，配制成107细胞/mL红细胞悬液。将红细胞悬浮液与溶解在生理盐水中的不同浓度的双功能抗菌肽混合，在37℃下孵育1小时，然后以1000rpm，4℃离心10分钟；吸取上清液100μL，并在OD540下测量吸光度值。使用生理盐水用作阴性对照用A阴性对照表示，1%TritonX-100用作阳性对照用A阳性对照表示，加入多肽用A样品表示；本实施例还对多粘菌素B进行了溶血活性的测定，实验过程和双功能抗菌肽的实验过程相同，其结果如图4所示，且由图4可知，本发明的双功能抗菌肽的溶血活性低于多粘菌素B的溶血活性。
溶血率百分比按以下公式计算：溶血率％＝A样品 -A阴性对照/A阳性对照×100％。
（2）细胞毒性的测定
用CCK8法测定双功能肽对小鼠Raw264.7细胞的细胞毒性。将双功能肽溶于无血清RPMI 1640培养基中，稀释配置成不同浓度梯度（256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL），然后分别加入含有小鼠Raw264.7细胞的96孔板（2×104个细胞/孔）中，每个浓度肽设3个复孔，以不含肽的无血清RPMI 1640培养液作为空白对照；37℃恒温孵育24小时后，向每个孔中加入10μL CCK8试剂；孵育4小时后，测量在OD450处的吸光度；对三个独立实验的结果进行平均，并将细胞活力计算为%=[A给药-空白]/[A0给药-空白]×100%。其中，空白表示含有培养基和不含细胞的CCK8溶液的孔的吸光度；A给药表示含有肽、培养基和细胞的CCK8溶液的孔的吸光度；A0给药表示不含有肽，含有培养基和细胞的CCK8溶液的孔的吸光度；其结果如图5所示。
图4所示为双功能抗菌肽对红细胞溶血活性图；由图4可知，本发明的双功能抗菌肽具有较低的溶血活性，且在浓度为256 μg/mL时，溶血活性为7.2±1.2%左右，其浓度远远超过其有效杀菌浓度，表明该双功能抗菌肽溶血毒性小。
图5所示为双功能抗菌肽对Raw264.7细胞毒性图；由图5可知，该双功能抗菌肽具有较低的细胞毒性，且在浓度为256 μg/mL时，细胞存活率为92.3±3.5%左右。
综上所述，本发明提出的双功能抗菌肽FPON可以通过化学合成的方式获得，该双功能抗菌肽对临床上多重耐药的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌等，均有比较强的抗菌活性。其次该抗菌肽具有分子量小、合成简单、溶血活性低及稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。
尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。
Claims (10)
1.一种双功能抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽由34个氨基酸组成，其氨基酸序列为：
Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ser PheTrp Lys Lys Ile Lys Asn Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe，所有氨基酸均为L-型。
2.根据权利要求1所述的双功能抗菌肽，其特征在于，所述双功能抗菌肽分子量为3915.62，等电点为11.7。
3.一种权利要求1-2任一项所述的双功能抗菌肽的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
先通过对蛇导管素家族和脯氨酸抗菌肽家族进行对比分析；然后将多肽截短，检测截短肽段的抗菌活性、脂多糖及核糖体蛋白的亲和力，初步筛选出能够结合脂多糖和核糖体蛋白的两类肽类药效团的氨基酸序列，最后采用自动多肽合成仪合其全序列，通过高效液相色谱法反相柱层析脱盐纯化得到。
4.一种用于抑制细菌生长的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-2任一项所述的双功能抗菌肽。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述细菌包括大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌中的至少一种。
7.权利要求1-2任一项所述的双功能抗菌肽在制备防腐剂中的应用。
8.权利要求1-2任一项所述的双功能抗菌肽在制备动物饲料添加剂中的应用。
9.权利要求1-2任一项所述的双功能抗菌肽在制备化妆品添加剂中的应用。
10.权利要求1-2任一项所述的双功能抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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