CN118047848A - 一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1及其编码基因与应用 - Google Patents
一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，提供了一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1及其编码基因与应用，核糖毒素CfRibo1为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质；本发明通过模拟自然界微生物多样性的接种方式证明，本发明所提供的核糖毒素CfRibo1对梨炭疽病菌的致病力至关重要，通过利用PEG介导的遗传转化获得的敲除突变体，与分离自寄主叶围的微生物共同接种时，几乎丧失了对寄主的致病力，同时CfRibo1是梨炭疽病菌在自然环境中侵染、致病的关键因子，可作为梨炭疽病防治的一个分子靶标，本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说是一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1及其编码基因与应用。
背景技术
中国是全球最大的梨生产与消费国，梨产业已成为我国地方经济发展和农民增收致富的支柱产业。然而，梨炭疽病菌引起的梨炭疽病是梨上重大病害之一，每年对我国梨产量造成重大损失，已成为制约我国梨产业健康发展的一个主要因素。2007年后，梨炭疽病在我国黄河故道的梨种植地区迅速蔓延，危害果实病造成梨大面积腐烂，对砀山酥梨、黄冠梨、鸭梨等多个梨品种造成巨大经济损失。2009年后，梨炭疽病在我国南方梨产区逐渐爆发，可危害叶片，造成树叶异常早落，致使浙江、安徽、湖北、江苏、四川等省份的梨产量锐减；
梨炭疽病菌的致病因子不明、致病机制不清，是梨炭疽病难以有效防治的主要原因。大量研究表明，病原菌分泌的效应子(effectors)在病菌致病过程中发挥关键作用。梨炭疽病菌基因组序列最早于2012年被公布，预测编码超过700个效应子，且很多效应基因在病菌与寄主互作过程中高表达，但是迄今仅极少数效应子被报道，致病关键效应子的报道更是少之又少。因此，***性挖掘该病菌效应子，找到关键致病因子，可为其致病机制提供科学基础，对未来梨炭疽病的科学防控具有重要指导意义。
为此，本领域技术人员提出了一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1及其编码基因与应用来解决背景技术提出的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1及其编码基因与应用，以解决现有技术中存在的问题。
一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1，所述核糖毒素CfRibo1为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质，所述蛋白质可为(A1)、(A2)、(A3)或(A4)；(A1)为SEQ ID NO.1所示的蛋白质；(A2)在(A1)蛋白质的N端或C端连接标签得到的融合蛋白质；(A3)将(A1)或(A2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代得到的、来源于梨炭疽病菌且与SEQ ID NO.1所示的蛋白质活性相关的由其衍生的蛋白质；(A4)与SEQ ID NO.1所示的蛋白质氨基酸序列具有80％及以上同一性，且与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有相似功能的序列；
具体的，所述(A3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代为不超过4个氨基酸残基的取代；所述(A3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到；所述(A3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列取代一个或几个氨基酸残基的密码子，在其5’端或3’端连上表1所示的标签编码序列得到。
优选的，所述SEQ ID NO.1由176个氨基酸残基组成，为了使(A1)中的蛋白便于纯化，可在SEQ ID NO.1所示蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上表1所示的标签：
表1标签的序列
一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1的编码基因，所述编码基因编码如权利要求1-2所述的梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1。
优选的，编码所述梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述SEQ ID NO.2由531个核苷酸组成，且SEQ ID NO.2编码SEQ ID NO.2所示的蛋白质(CfRibo1)；
优选的，所述编码蛋白质CfRibo1的核酸分子可为(B1)或(B2)或(B3)或(B4)所示的DNA分子：(B1)编码区如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；(B1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；(B3)在严格条件下与(B1)或(B1)限定的DNA分子杂交，且编码CfRibo1蛋白质的DNA分子；(B4)来源于梨炭疽病菌，且与(B1)或(B2)限定的DNA分子具有75％或75％以上同一性、编码CfRibo1蛋白质的DNA分子；
其中，所述DNA分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易采用已知的方法，例如定点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质CfRibo1的核苷酸序列进行突变；那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的所述蛋白质CfRibo1的核苷酸序列具有75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质CfRibo1，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指天然核苷酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质(CfRibo1)的核苷酸序列具有75％或更高的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
优选的，提供所述核苷酸分子相关的生物材料，包括重组载体和重组菌；所述重组载体为重组载体pColdTF-CfRibo1；所述重组菌可以通过所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到。
优选的，所述含有上述任意所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点***SEQ ID NO.2所示的DNA分子得到的重组质粒；所述重组载体pCold TF-CfRibo1可为将载体pCold TF的限制性内切酶NdeI和BamHI之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO.2所示的DNA分子，所到的重组质粒；所述出发微生物为细菌或者真菌；所述细菌具体为大肠杆菌BL21(DE3)；
优选的，所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为BL21(DE3)/pCold TF-CfRibo1；所述BL21(DE3)/pCold TF-CfRibo1可为将重组质粒pCold TF-CfRibo1导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组大肠杆菌。
优选的，一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1或其编码基因的应用，所述应用为下述任一种或多种：
D1)在调控核糖核酸酶活性中的应用；
D2)在调控抗菌活性中的应用；
D3)在调控梨炭疽病菌致病力中的应用；
D4)在抑制和/或杀灭梨炭疽病菌中的应用。
优选的，所述应用中包括通过抑制SEQ ID NO.1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活SEQ IDNO.1所述的CfRibo1蛋白的活性来实现D1)-D4)所述的应用。
优选的，所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录或抑制上述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活上述CfRibo1蛋白的活性来调控梨炭疽病菌的致病力，从而能够抑制和/或杀灭梨炭疽病菌。
一种降低梨炭疽病菌致病力的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录或抑制上述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活上述CfRibo1蛋白的活性。
优选的，所述降低梨炭疽病菌致病力为降低梨炭疽病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，所述蛋白的灭活是通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现，所述编码基因表达为基因敲除，所述基因敲除是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象；基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活；
所述基因进行敲除的方法是聚乙二醇(PEG)介导的遗传转化，具体的，将目的基因敲除盒转入梨炭疽病菌筛选得到所述目的基因的敲除灭活的重组菌，所述目的基因敲除盒为含有依次连接的待敲除目的基因上游600-800bp的序列、抗性筛选片段(可以为新霉素磷酸转移酶基因(neo)或潮霉素B磷酸转移酶基因(hph))和待敲除目的基因下游600-800bp的序列的重组核酸片段；
抑制CfRibo1蛋白表达和/或活性的物质在制备梨炭疽病杀菌/抑菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所提供的CfRibo1具有抗菌活性，是病菌占据微生物生态位的一个决胜因子，在梨炭疽病菌侵染致病过程中发挥关键作用，通过利用PEG介导的遗传转化获得的敲除突变体，与分离自寄主叶围的微生物共同接种时，几乎丧失了对寄主的致病力，同时CfRibo1是梨炭疽病菌在自然环境中侵染、致病的关键因子，可作为梨炭疽病防治的一个分子靶标，本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明的CfRibo1蛋白序列的结构示意图；
图2为本发明的CfRibo1基因在梨炭疽病菌不同侵染时间点的相对表达量示意图；
图3为本发明的CfRibo1蛋白及原核表达检测示意图；
图4为本发明的CfRibo1蛋白的核糖核酸酶活性检测示意图；
图5为本发明的CfRibo1基因敲除突变体在PDA培养基上的营养生长表型示意图；
图6为本发明的CfRibo1基因敲除突变体的致病力分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1编码基因的克隆
(1)本实施案例中的梨炭疽病菌CfRibo1蛋白及其编码基因(或cDNA)可以本实验室保存的梨炭疽病菌株DSCF-02的cDNA为模板，通过5’-ATCGAAGGTAGGCATATGAACCCCATCGCCCTCGAAAAG-3’(SEQ ID NO.3)和5’-AAGCTTGAATTCGGATCCTTAAGCGGTAAGGGCAAGCAG-3’(SEQID NO.4)组成的引物扩增获得，得到约531bp的PCR扩增产物；
(2)将PCR扩增产物进行测序；测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；SEQ ID NO.2核苷酸所对应的CfRibo1蛋白序列结构见图1。
实施例二：CfRibo1编码基因在侵染寄主过程中的表达模式分析
(1)用梨炭疽病菌分生孢子接种梨果实，分别于0h，12h，24h，36h，48h后取样，用Vazyme公司的植物总RNA提取试剂盒抽提样品的总RNA，用分光度计检测其RNA含量和质量；
(2)取1μg RNA作模板，根据Vazyme公司HiScript II反转录试剂盒使用说明进行cDNA合成，取适量的反转录产物用于随后的实时定量PCR反应；
(3)检测CfRibo1基因的引物为5’-CTATGCCAACAACCAGCAG-3’(SEQ ID NO.5)和5’-AGACGAGATGATGGGGAAC-3’(SEQ ID NO.6)，检测CfActin基因的引物为5’-ATCAACCCCAAGTCCAACAG-3’(SEQ ID NO.7)和5’-CGATTTCACGCTCGGCAGT-3’(SEQ ID NO.8)；检测结果见图2；结果显示，CfRibo1基因在侵染寄主的过程中上调表达。
实施例三：CfRibo1重组蛋白表达和纯化
(1)用NdeI和BamHI内切酶对pCold TF载体进行酶切，获得线性化的pCold TF载体，用Vazyme公司的ClonExpress一步克隆试剂盒，将实施案例1中PCR扩增的产物连接至上述线性化的pCold TF载体，获得pCold TF-CfRibo1重组质粒；
(2)通过热激法将pCold TF-CfRibo1重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态，经过氨苄霉素筛选后挑取单克隆至LB培养基进行培养，并按照比例(1:100)于100mL LB中扩大培养至OD600＝0.6；随后加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导表达(16℃，200rpm培养24h)；将培养后的菌体重悬于裂解缓冲液(20mM Na2HPO4，300mM NaCl，pH7.4，1mg/mLlysozyme，1mMPMSF，1.98mM巯基乙醇)，超声破碎15min，离心后获得的上清液为CfRibo1重组蛋白的粗蛋白；
(3)用适量的Ni-NTA(Thermo Scientific)树脂填充层析柱；根据使用说明，将CfRibo1重组蛋白的粗蛋白缓慢加入层析柱中，用两倍树脂床体积的洗脱缓冲液(含250mM咪唑的PBS，pH7.4)将CfRibo1重组蛋白洗脱下来，并用PBS(20mM磷酸钠、300mM氯化钠；pH7.4)缓冲液透析；所获得的CfRibo1重组蛋白见图3。
实施例四：CfRibo1重组蛋白核糖核酸酶活性分析
(1)通过实施案例2中描述的方法，分别提取获得梨果实的总RNA和梨炭疽病菌的总RNA；
(2)取适量梨果实的总RNA和梨炭疽病菌的总RNA，分别与1μM的CfRibo1重组蛋白混合，37℃孵育30min，将混合物进行凝胶电泳检测；检测结果见图4；结果显示，CfRibo1重组蛋白能够有效降解梨果实的总RNA和梨炭疽病菌的总RNA，证明CfRibo1具有核糖核酸酶活性；
实施例五：CfRibo1基因敲除突变体在PDA培养基上的生长表型
(1)用Vazyme公司的FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit试剂盒，根据操作说明提取获得菌株DSCF-02的基因组DNA；以基因组DNA为模板，通过5’-GTGAGCTCGGTACCGGATCCTGTGGCTTTGATTTGCTGA-3’(SEQ ID NO.9)和5’-ACTAGCTCCAGCCAAGCCGTTGCTGTAACGGATTTGAGA-3’(SEQ ID NO.10)组成的引物扩增获得CfRibo1基因上游663bp的片段，通过5’AGATGCCGACCGCGGGTTAGGGAGTAATAATGGTGGC-3’(SEQ ID NO.11)和5’-TGAGTAAGGTTACCGAATTCCGTTGATGTCAAGCGTTG-3’(SEQ ID NO.12)组成的引物扩增获得CfRibo1基因下游673bp的片段，再将两个片段与hph基因片段融合获得CfRibo1基因敲除盒；
(2)通过PEG介导的遗传转化，将CfRibo1基因敲除盒转入梨炭疽病菌的原生质体中，并通过潮霉素B作为抗性筛选获得CfRibo1基因敲除转化子；
(3)分别将梨炭疽病菌野生型菌株DSCF-02和CfRibo1基因敲除突变体培养于PDA培养基)(28℃)，3d后观察菌落形状、统计菌落半径并拍照；营养生长结果见图5；结果显示，CfRibo1基因敲除突变体生长表型与野生型DSCF-02相比无明显差异。
实施例六：CfRibo1基因敲除突变体在梨果实上的致病力分析
(1)将梨炭疽病菌野生型菌株DSCF-02和CfRibo1基因敲除突变体的菌丝置于PDB培养基中培养4d(28℃，180rpm)，通过显微镜观察能看到培养液中有大量分生孢子形成；用Miracloth滤布对培养液进行过滤，再将滤液离心，获得病菌的分生孢子；
(2)从安徽砀山县里果园梨采样获得梨叶片，从叶片上分离、纯化获得叶围细菌；的分离方法为植物病理学研究的普通分离方法；
(3)用无菌水稀释分生孢子至合适浓度(1×106分生孢子/mL)，用无菌水将叶围细菌浓度稀释至OD600＝0.2；将稀释后的DSCF-02和CfRibo1基因敲除突变体的分生孢子分别与稀释后的叶围细菌混合，接种于梨果实上；的梨果实品种为砀山酥梨；致病力分析结果见图6；结果显示，CfRibo1基因敲除突变体与野生型DSCF-02相比，几乎丧失了致病力；这说明CfRibo1是梨炭疽病菌的一个关键致病因子。
由上可知，本发明提供的梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1具有抗菌活性，对梨炭疽病菌占据微生物生态位、侵染寄主至关重要，可作为梨炭疽病防治中的一个分子靶标，在新型杀/抑菌剂的开发中具有重要应用前景。
下面对序列进行说明
CfRibo1蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO.1
MVSLKSTLAVALCAVLAAANPIALEKRQGTTGLGSIRCGDAKYSRKQVDEAVAEGCRLYANNQQVGTSEYPHRFNNREGLTFDTSGPYQEFPIISSGNYTGRAPGPDRVVFDPDYRGSCVFVGAMTHTGAVQRNGFVSCNESSSSSGSGSSAASSITTSGSFGVLLPVLSLLALTA；
CfRibo1基因的核苷酸序列：SEQ ID NO.2
ATGGTCAGCCTCAAATCCACCCTCGCCGTGGCCCTCTGCGCCGTCCTCGCCGCCGCCAACCCCATCGCCCTCGAAAAGCGCCAGGGCACCACCGGCCTCGGCTCCATCCGCTGCGGCGACGCAAAGTACTCCCGCAAGCAGGTCGACGAGGCCGTCGCCGAGGGCTGCCGCCTCTATGCCAACAACCAGCAGGTCGGCACCAGCGAGTACCCCCACCGCTTCAACAACCGCGAGGGGCTCACCTTCGACACCTCCGGCCCCTACCAAGAGTTCCCCATCATCTCGTCTGGAAACTACACTGGCAGGGCACCCGGCCCCGACCGTGTGGTCTTCGACCCCGACTACCGGGGCAGCTGCGTCTTTGTCGGCGCAATGACCCACACCGGCGCCGTCCAGCGCAACGGCTTTGTCTCGTGCAATGAGAGCTCTTCAAGCAGCGGCAGTGGTAGCTCGGCGGCCTCGAGTATCACTACCTCAGGCTCATTTGGGGTCCTACTGCCTGTGCTGTCTCTGCTTGCCCTTACCGCTTAA；
实施案例1中的PCR引物扩增序列：
SEQ ID NO.3
ATCGAAGGTAGGCATATGAACCCCATCGCCCTCGAAAAG；
SEQ ID NO.4
AAGCTTGAATTCGGATCCTTAAGCGGTAAGGGCAAGCAG；
实施案例2中的PCR引物扩增序列：
SEQ ID NO.5
CTATGCCAACAACCAGCAG；
SEQ ID NO.6
AGACGAGATGATGGGGAAC；
SEQ ID NO.7
ATCAACCCCAAGTCCAACAG；
SEQ ID NO.8
CGATTTCACGCTCGGCAGT；
实施案例5中的PCR引物扩增序列：
SEQ ID NO.9
GTGAGCTCGGTACCGGATCCTGTGGCTTTGATTTGCTGA；
SEQ ID NO.10
ACTAGCTCCAGCCAAGCCGTTGCTGTAACGGATTTGAGA；
SEQ ID NO.11
AGATGCCGACCGCGGGTTAGGGAGTAATAATGGTGGC；
SEQ ID NO.12
TGAGTAAGGTTACCGAATTCCGTTGATGTCAAGCGTTG。
参考文献：
炭疽病菌遗传转化的方法在文献“Liu W,Liang X,Gleason M L,etal.Transcription factor CfSte12 of Colletotrichum fructicola is a keyregulator of early apple Glomerella leaf spot pathogenesis.Appliedandenvironmental microbiology,2020,87(1):e02212-20.”中公开过。
病菌接种方法在文献“Shang S,Wang B,Zhang S,et al.A novel effectorCfEC92 of Colletotrichum fructicola contributes to glomerella leaf spotvirulence by suppressing plant defences at the early infectionphase.Molecular plant pathology,2020,21(7):936-950.”中公开过。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1，其特征在于：所述核糖毒素CfRibo1为SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的蛋白质。
2.如权利要求1所述一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1，其特征在于：所述SEQ ID NO.1由176个氨基酸残基组成。
3.一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1的编码基因，其特征在于：所述编码基因编码如权利要求1-2所述的梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于：编码所述梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于：所述SEQ ID NO.2由531个核苷酸组成，且SEQ ID NO.2编码SEQ ID NO.2所示的蛋白质。
6.如权利要求5所述的编码基因，其特征在于：提供所述核苷酸分子相关的生物材料，包括重组载体和重组菌；所述重组载体为重组载体pColdTF-CfRibo1；所述重组菌可以通过所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到。
7.一种梨炭疽病菌核糖毒素CfRibo1或其编码基因的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种或多种：
D1)在调控核糖核酸酶活性中的应用；
D2)在调控抗菌活性中的应用；
D3)在调控梨炭疽病菌致病力中的应用；
D4)在抑制和/或杀灭梨炭疽病菌中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用中包括通过抑制SEQ ID NO.1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活SEQ IDNO.1所述的CfRibo1蛋白的活性来实现D1)-D4)所述的应用。
9.如权利要求7-8任意一项所述的一种降低梨炭疽病菌致病力的方法，其特征在于：包括下述步骤：抑制如所述的编码基因的转录或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活所述CfRibo1蛋白的活性。
10.如权利要求9所述的一种降低梨炭疽病菌致病力的方法，其特征在于：所述降低梨炭疽病菌致病力为降低梨炭疽病菌对寄主的侵染能力和/或对寄主的致病性，所述蛋白的灭活是通过所述抑制或降低待抑制活性或待灭活的蛋白的编码基因表达来实现，所述编码基因表达为基因敲除。
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