CN118028356A - TaSPL6基因在负调控小麦产量和氮利用效率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种TaSPL6基因在负调控小麦产量和氮利用效率中的应用。所述基因编码SQUAMOSA promoter binding protein‑like(SPL)转录因子蛋白。本发明通过构建RNAi载体获得TaSPL6 RNAi转基因植株，结果表明TaSPL6 RNAi转基因植株在正常条件以及低氮条件下均能增加单株有效分蘖数，增加产量。可见，本发明的TaSPL6基因在提升小麦产量和氮肥利用效率上具有潜在的应用价值，可以通过沉默该基因对作物进行遗传改良，有望实现作物高产和氮高效协同改良的育种目标。

Description

TaSPL6基因在负调控小麦产量和氮利用效率中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及TaSPL6基因在负调控小麦产量和氮利用效率中的应用。

背景技术

目前小麦产量的提升很大程度上依赖于氮肥的大量使用，这已经造成了一些不可修复的生态损伤。所以，在保障小麦产量的前提下提高植株的氮素利用效率是小麦育种与生产中亟待解决的问题。分蘖数是影响小麦产量和氮响应的关键性状，氮调控分蘖的基因在水稻中的应用较多，但小麦中氮响应分蘖发育上的基因较少且分子机制解析尚浅，真正应用到育种中的相关基因更少。

SQUAMOSA promoter binding protein-like(SPL)基因编码植物特有的一类转录因子，SPL在植物生长发育过程中具有很多重要的作用，例如：参与建成植株的形态、发育时期的转变、叶片发育、花和果实的发育、GA信号和对外部环境胁迫信号的应答等多种生理生化过程。在水稻中过表达TaSPL20/21，引起一级分蘖和二级分蘖数增多，穗粒数增多，圆锥花序增长，TaSPL20可增加粒长粒宽，提高千粒重。总体而言，SPL转录因子对植物生长发育至关重要，其在禾本科作物中的已报道功能主要是在穗发育，关于其对氮的响应及氮素利用效率仍未见报道。目前相关研究专家已经提出了水稻、小麦“少投入、多产出”新一代“绿色革命”株型设计模型和作物高产和氮高效协同改良的新育种策略。挖掘响应氮响应的SPL基因将为小麦高产高效基因的挖掘、分子机制解析，以及及时应用到小麦育种上提供重要的基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供TaSPL6基因在负调控小麦产量和氮利用效率中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

本发明采用的TaSPL6基因，其信使RNA(mRNA)序列长度为1751bp，TaSPL6基因的编码序列长度为1224bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括407个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体以及含有所述载体的宿主细胞在提高小麦产量和氮利用效率方面的功能也落入本发明的保护范围之内。其中所述宿主细胞为微生物细胞，例如，真菌细胞或细菌细胞，例如但不限于，大肠杆菌、农杆菌和酵母菌等。

本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述TaSPL6基因，还包括小麦中与TaSPL6基因具有较高同源性的直系同源基因在提高小麦产量和氮利用效率方面的功能。

本发明公开的TaSPL6基因在提高小麦产量和氮利用效率中的生物学功能，具体表现在：在田间正常对照条件下，TaSPL6RNAi转基因株系的有效分蘖数和单株产量高于野生型；在田间低氮条件下，TaSPL6 RNAi转基因株系的总分蘖数、有效分蘖数和单株产量高于野生型，且增加的幅度大于田间正常对照条件，并且TaSPL6RNAi转基因株系氮利用效率也得到提高。

根据其功能，可以通过转基因的方式来获得高产和氮素利用率高的植株，具体地，可以通过将含TaSPL6基因片段的RNAi载体或CRISPR/Case9基因编辑载体导入小麦优良品种中，得到转基因小麦，该植株的产量和氮素利用效率均高于未导入相关载体的野生型植株。

TaSPL6基因片段具体可通过所述重组表达载体导入小麦。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化小麦细胞或组织，并将转化的组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆、油菜、棉花等双子叶植物。

为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，所述方法为以下(1)或(2)或(3)：

(1)通过增加植物中TaSPL6蛋白的活性或促进植物中TaSPL6基因的表达，获得在低氮条件下产量及产量构成因素低于野生型的植株；

(2)通过抑制/阻断植物中TaSPL6基因的转录/表达，获得在低氮条件下产量及产量构成因素高于野生型的植株；

(3)通过将包含TaSPL6基因或其活性片段的植株与另一植株杂交获得含有TaSPL6基因或活性片段的后代植株，与未导入所述基因或其活性片段或所述重组表达载体的对照植株或未杂交的植株相比，所述转基因植株或杂交后代植株具有降低的氮素利用效率。

“促进植物中TaSPL6基因的表达”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)：

(1)将TaSPL6基因导入植物；

(2)引入强启动子和/或增强子；

(3)本领域内的其它常见方法。

“抑制/阻断植物中TaSPL6基因的转录/表达”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)或(4)：

(1)利用RNA干扰技术引入小的双链TaSPL6 RNA，产生TaSPL6表达量降低的转基因株系；；

(2)通过CRISPR/Case9技术构建TaSPL6基因编辑载体获得突变体；

(3)通过EMS等化学试剂和/或γ射线等物理途径获得TaSPL6基因突变体；

(4)本领域内的其它常见方法。

调控基因表达水平包括利用DNA同源重组技术、病毒介导的基因沉默技术和农杆菌介导的转化体系调控所述TaSPL6的表达，获得转基因植物株系。涉及TaSPL6的表达载体、转基因细胞系、宿主细胞。其中所述宿主细胞为微生物细胞，例如，真菌细胞或细菌细胞，例如但不限于，大肠杆菌和农杆菌等。

所述植物包括，但不限于，小麦、水稻、拟南芥玉米、棉花、油菜或大豆。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根、花、穗子、组织和器官。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根等。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

(1)本发明通过分析TaSPL6 RNAi转基因小麦植株，创新性地发现SPL转录因子在小麦产量和氮利用效率提升上的功能，为作物高产高效分子育种提供重要基因资源。

(2)可以通过转基因的方式来获得高产且氮利用效率高的小麦植株，具体地，可以通过获得TaSPL6 RNAi转基因小麦，该小麦植株的产量和氮利用效率高于野生型，为植物高产高效育种提供一种新的途径。

附图说明

图1是TaSPL6基因在不同组织中的表达模式；

图2是野生型小麦材料Fielder中TaSPL6基因对正常氮和低氮的响应情况；

图3是TaSPL6 RNAi植株中TaSPL6表达水平分析；

图4是TaSPL6 RNAi在正常条件下的表型展示和数据统计分析；

图5是TaSPL6RNAi和野生型Fie1der在正常对照田和低氮田下的表型统计分析。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、***发育树的构建、转基因方法、转基因载体的构建、转基因植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

生物材料

小麦品种Fielder种子为实验室保存；

RNAi载体空载体和阳性对照载体PC414C、PC336为实验室保存；

大肠杆菌DH5a和农杆菌GV3101为实验室保存；

引物合成及测序，由华大六合生物技术有限公司完成。

实验试剂

RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、质粒小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购买自北京天根生物技术有限公司；

荧光定量Mix购买自诺唯赞生物科技有限公司；

各种核酸内切酶购买自莫纳生物科技有限公司；

一步克隆酶购买自诺唯赞生物科技有限公司。

实验设备

PCR仪购买自Applied Biosystems公司；

制冷离心机购买自Eppendorf公司；

定量PCR仪购买自Bio-rad公司；

激光共聚焦显微镜购买自蔡司公司；

高温高压灭菌器MLS-3750购买自日本三洋公司；

核酸检测仪Nanodrop 2000C购买自Thermo Scientific公司；

常温离心机、酶标仪SpectraMax iD5购买自Thermo Scientific公司。

实施例1 TaSPL6基因的克隆及RNAi载体的构建

提取小麦品种Fielder分化至小穗分化时期的幼穗的RNA，以反转录反应获得的相应cDNA为模板，由Ensembl Plants数据库中获得的基因序列经Geneious软件设计特异性引物，经过PCR扩增反应，克隆得到TaSPL6基因的CDS序列。

为了探究TaSPL6发挥作用的时期和部位，发明人首先分析了小麦品种Fielder中不同组织和部位中TaSPL6的表达模式。取田间种植的生长发育状态至拔节期的Fielder的根、茎、叶、幼穗、分蘖芽、雄蕊、雌蕊和发育6天、16天的种子，提取RNA并反转录成cDNA，随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TaSPL6基因的表达水平。结果发现，TaSPL6基因在小麦幼穗、分蘖芽和雌雄蕊中的表达量较高(图1)。这一结果暗示，TaSPL6基因可能参与调控小麦幼穗生长发育和分蘖芽的生长，从而影响小麦产量。

因为考虑到小麦的分蘖能力是决定产量的关键因素，分蘖受到氮肥水平的影响，生产上外施氮肥等肥料可以使小麦的穗数显著增加从而提高小麦的产量。发明人分析了TaSPL6基因对氮的响应情况。分别取正常对照条件下和低氮条件下生长的野生型小麦材料Fielder三叶一心时期的分蘖芽，提取RNA并反转录成cDNA，随后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同氮素条件下TaSPL6基因的表达水平。结果显示TaSPL6的相对表达量在低氮(图中LN)条件下比正常对照条件下高(图2)。

为了分析TaSPL6是否对小麦产量和氮素利用效率有影响，首先发明人构建了TaSPL6RNAi株系。具体过程简要介绍如下。

第一，由EnsemblPlants数据库中获得TaSPL6在小麦中的三个亚基因组上的基因TaSPL6-A、TaSPL6-B和TaSPL6-D的CDS序列，通过Geneious软件对这三条序列进行比对，选择较为保守的一段CDS序列作为载体***序列。发明人针对TaSPL6的保守区域300bp，设计含相应酶切位点的引物，以实例1制备的cDNA样品为模板，进行PCR扩增，并纯化回收扩增产物。同时对PC414C载体进行酶切，对酶切产物进行纯化。把PCR扩增产物和酶切后的PC414C载体进行同源重组连接，将TaSPL6的保守区域300bp克隆到PC414C载体中；

第二，利用Gateway技术将TaSPL6的保守区域300bp连同反向互补序列***RNAi载体PC336中，创制了TaSPL6-RNAi和TaSPL6-RNAi重组载体；

第三，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，进行K⁺(卡那霉素，50μg/mL)抗性筛选，选择阳性菌落进行PCR检测，对PCR检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用。

第四，将所提取的质粒转化至农杆菌菌株EHA105中，利用农杆菌侵染法转化小麦品种Fielder。利用抗性基因和载体特异性引物筛选转基因阳性系。

取潜在转基因植株的幼穗或分蘖芽，提取RNA并反转录成cDNA，利用qRT-PCR分析潜在转基因植株中TaSPL6-A、TaSPL6-B和TaSPL6-D的表达水平。结果发现，TaSPL6的表达量在3个株系中有不同程度的下调(图3)。

实施例2通过TaSPL6转基因材料验证其在小麦产量和氮利用效率中的功能

首先发明人在正常田间条件下对TaSPL6 RNAi转基因材料的表型鉴定发现，TaSPL6RNAi植株促进开花，穗长增加，小穗数减少，但是穗粒数增加；有效分蘖增加，千粒重减少，最后的单株产量显著增加(图4)。

随后发明人在田间试验中设置了低氮处理，在正常对照条件下、相对于野生型材料Fielder，低氮条件下TaSPL6 RNAi均显著增加小麦分蘖数和单株产量。值得注意的是，在低氮条件下，相对于野生型材料Fielder，TaSPL6 RNAi株系的总分蘖数增加，且增加分蘖数和单株产量的幅度增加(图5)。这说明TaSPL6抑制了氮素增加分蘖的效应。换言之，降低TaSPL6的表达量会增加小麦分蘖数和产量，尤其是在相对较低的氮素供应水平下。

综上，沉默TaSPL6基因后小麦的产量和氮利用效率增加，尤其是在低氮条件下。可见，TaSPL6基因不仅在调控小麦产量上也在氮素利用效率上发挥着重要的作用，这对于创制氮素高效利用且高产的小麦新种质具有重要的意义。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (6)

1.TaSPL6基因在负调控小麦产量和氮利用效率中的应用，其特征在于：所述TaSPL6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1中所述TaSPL6基因的表达载体、重组载体以及含有所述表达载体或重组载体的宿主细胞在提高小麦产量和氮利用效率中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过构建RNAi载体获得TaSPL6 RNAi转基因植株，在田间正常对照条件下，TaSPL6 RNAi转基因株系的有效分蘖数和单株产量高于野生型；在田间低氮条件下，TaSPL6 RNAi转基因株系的总分蘖数、有效分蘖数和单株产量高于野生型，且增加的幅度大于田间正常对照条件，TaSPL6 RNAi转基因植株的氮利用效率也提高。

4.根据权利要求3所述的应用，所述低氮条件具体为：田间土壤深度1-10cm，全氮量0.084％；田间土壤深度10-20cm，全氮量0.084％；田间土壤深度20-30cm，全氮量0.063％；田间土壤深度30-40cm，全氮量0.043％；正常条件具体为：田间土壤深度1-10cm，全氮量0.107％；田间土壤深度10-20cm，全氮量0.105％；田间土壤深度20-30cm，全氮量0.068％；田间土壤深度30-40cm，全氮量0.046％。

5.一种提高小麦产量和氮利用效率的育种方法，其特征在于，所述方法为：通过抑制/阻断小麦中TaSPL6基因的转录/表达，获得在低氮条件下产量及产量构成因素高于野生型的植株；所述TaSPL6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的育种方法，其特征在于，抑制/阻断小麦中TaSPL6基因的转录/表达的方法包括：

(1)利用RNA干扰技术引入小的双链TaSPL6 RNA，产生TaSPL6表达量降低的转基因株系；

(2)通过CRISPR/Case9技术构建TaSPL6基因编辑载体获得突变体；

(3)通过EMS化学试剂和/或γ射线物理途径获得TaSPL6基因突变体。