CN117987299A

CN117987299A - 一株产海藻酸裂解酶的类芽孢杆菌ky1249、微生物菌剂及其应用

Info

Publication number: CN117987299A
Application number: CN202311706729.6A
Authority: CN
Inventors: 康耀卫; 吴丽欣
Original assignee: Lanpei Biotechnology Guangdong Co ltd
Current assignee: Lanpei Biotechnology Guangdong Co ltd
Priority date: 2023-12-13
Filing date: 2023-12-13
Publication date: 2024-05-07

Abstract

本发明提供了一株产海藻酸裂解酶的类芽孢杆菌KY1249、微生物制剂及其应用，涉及微生物及其应用技术领域。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.28255。本发明的类芽孢杆菌KY1249具有产高活力海藻酸钠裂解酶的能力，对海带的降解转化率高，能够以较低的成本生产海藻多糖，并且该菌株还能够提高植物抗逆性，可用于制备海藻肥料，在农业领域具有良好的应用前景。

Description

一株产海藻酸裂解酶的类芽孢杆菌KY1249、微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及一株产海藻酸裂解酶的类芽孢杆菌KY1249、微生物菌剂及其应用。

背景技术

气候变化引起全球变暖、干旱和洪涝等极端气象灾害频发、水资源短缺等问题将会对农作物的品种特性提出新的要求，特别是对作物的抗逆性有更高的要求，比如耐高温性、耐干旱性以及耐盐碱性等(何群华等，2008)

植物受到外界逆境胁迫，能够产生植物抗毒素、抗菌蛋白等一系列反应来抵御逆境的侵害(SomssichI E等，1998)。植物诱导抗病性(Inducedresistance)是指利用物理、化学或者生物因子预先处理植株，从而使植株对逆境、细菌性、病毒性、真菌性等病虫害产生局部或者***的抗性(I.Baccelli,G等，2017)。利用诱导剂来刺激植物产生抗逆物质，从而增强植物对外界逆境的抵抗能力是一种新的植物保护途径。通过诱导剂诱导，可以增强植物的抗逆能力，降低逆境胁迫对植物造成的损伤，修复部分生理功能。寡糖是目前研究较多的一类植物抗逆诱导剂，自1976年Ebel等发现植物细胞壁上的寡糖碎片能诱导大豆产生大豆抗毒素后，寡糖作为植物抗逆诱导剂越来越受到关注。海藻寡糖(AOS)是由海藻酸钠降解而成的一种寡聚物，由甘露糖醛酸(M)、古罗糖醛酸(G)或二者杂合段组成，其水溶性好，易于被吸收利用，许多研究已经证实海藻寡糖能够在植物生长调节和诱导抗病领域发挥积极的作用。最常见的海藻酸钠降解的方法是化学水解法和酶解法，随着技术的发展，化学水解法还衍化产生了过氧化氢氧化水解法(Li X等，2009)。此外，超声波和热解等物理方法由于其操作简单、速度快等优点，越来越受到人们的重视。然而，不同方法制备的褐藻寡糖在结构上有所不同(Murat S，2011)。海藻酸钠经过酶解法降解的产物为在C4和C5处有双键的不饱和低聚糖，而化学法水解的产物为饱和低聚糖。酸、碱水解的方法虽然简单、成本低，但是大量使用酸、碱试剂使得盐废物回收困难，且会对环境造成破坏。

双氧水氧化降解的方法效率很高，但双氧水腐蚀性很强，对设备的要求很高，且有安全隐患(周燕霞等，2016)。而物理降解法大部分能耗高，反应时间较长，会与其他方法共同使用。酶解法是一种条件温和、可控性强和特异性高的生物降解方法，海藻酸裂解酶是通过β消去机制降解海藻酸,海藻酸的酶解法反应条件易控制，底物特异性高，在寡糖制备各方面明显优于化学和物理降解，从不同的途径寻找和生产具有高活性的海藻酸钠裂解酶已成为研究焦点(杨钊，2007)。海藻寡糖可作为高效、环保的生物肥料代替传统化学肥料，其具有较高的激发子活性，在植物抗病生理过程中能诱导植物产生植保素和防卫响应因子，抵御外来微生物的侵染，或直接作用于病原菌，参与植物的诱导抗病过程(王婷婷等，2011)。研究表明，海藻酸钠寡糖具有调节植物生长、诱导植物抗逆性和直接作用于植物病原菌的作用。ZHANGYH等(2013)研究发现，10～80mg/L的AOS可以诱导小麦根系产生NO，促进小麦根的生长与延伸，并呈剂量依赖效应。KHAN ZH等(2011)发现用物理方法CO-60辐照制得的AOS能够促进罂粟的生长，提高植物产量，增加***和***的含量。LIU R X等(2009)用AOS溶液喷施番茄幼苗叶片，发现AOS增加脯氨酸和可溶性糖的含量，从而达到缓解干旱胁迫闭的作用，提高植物的抗旱性能。一定浓度的海藻寡糖还可促进作物对氮、磷以及许多矿物质元素的吸收，为其作为氮肥增效剂提供有利条件(张朝霞等，2014)。综上所述，AOS具有促进植物生长和诱导植物抗逆作用，在保护农作物，减少化肥使用方面发挥了极大的作用，具有开发为绿色农药的前景。

目前能够产海藻酸钠裂解酶的微生物的研究和报道非常有限，因此，从自然界中筛选高产海藻酸钠裂解酶的优良菌种资源具有较高的研究和开发价值。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一株产海藻酸裂解酶的类芽孢杆菌KY1249、微生物菌剂及其应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

在一个方面，本发明提供了一株产海藻酸裂解酶的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)KY1249，所述类芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.28255。

本发明菌株KY1249产海藻酸裂解酶的酶活力为149.5μg/mL·min，具有较强的、高效快速降解海带的能力。该菌株可将海带降解成海藻寡糖等物质，其发酵液可促进植物生长同时兼具提高作物抗旱、抗盐能力。本发明菌株发酵产生的海藻胶裂解酶能分解海带，使其降解为容易吸收利用的小分子物质，包括海藻多糖。

在一个实施方案中，所述类芽孢杆菌KY1249的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。本发明涵盖上述保藏编号的类芽孢杆菌KY1249菌株以及所述菌株的突变菌株。所述“菌株的突变菌株”是指与本发明的SEQ ID No.1所示的类芽孢杆菌KY1249菌株的16S rRNA同源性≥≥95，优选≥99的同源性的菌株。并且，所述“菌株的突变菌株”具有高产海藻酸裂解酶和提高植物抗逆性的功能。

在另一个方面，本发明提供了含有权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)KY1249的微生物制剂。所述微生物制剂含有不少于10⁵CFU/mL的湿菌体或不少于10⁵CFU/g的干菌体。.所述微生物菌剂含有类芽孢杆菌菌株KY1249作为主要活性成分。

在另一个方面，本发明提供了前述的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)或前述的微生物菌剂在以下至少一个方面的应用：

(a)降解海带；(b)促进植物生长；(c)提高植物抗逆性。

在一个实施方案中，所述降解海带包括将海带发酵并降解为海带降解液。

在一个实施方案中，所述降解海带包括产生海藻酸钠裂解酶完全降解海带。

在一个实施方案中，所述促进植物生长包括促进植物根的生长和/或提高作物对氮的吸收。

在一个实施方案中，所述提高植物抗逆性包括提高植物抗旱和/或抗盐碱能力。在一个具体实施方案中，所述菌株KY1249的海带发酵液提高玉米抗高浓度尿素的毒害。

在一个实施方案中，所述植物为农作物；优选地，所述植物包括玉米、绿豆和小麦。在一个具体实施方案中，所述菌株的菌液和对海带的发酵降解液对玉米种子根茎发育都有促进作用。

在另一个方面，本发明提供了前述的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)或前述的微生物菌剂在制备海藻肥料或海藻饲料或海藻寡糖中的应用。

在另一个方面，本发明提供了一种发酵海带制备海藻多糖的方法，所述方法包括将前述类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)接种到以海藻酸钠为唯一碳源的培养基中进行培养发酵以获得发酵培养物。

在一个实施方案中，所述方法采用的以海藻酸钠为唯一碳源的培养基为海藻酸钠选择培养基：海藻酸钠10g，酵母0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，胰蛋白胨0.5g，蛋白胨0.5g，琼脂粉15g，水1L。

在一个具体实施方案中，将所述类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)KY1249活化后，接入液体培养基中，培养后得到种子液；将得到的种子液接种到液体培养基中，发酵培养得到发酵液，离心，浸提，取上清，即得到含海藻酸裂解酶的发酵液。所述发酵液可进一步制备获得海藻寡糖。

本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)，菌株名为KY1249，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2023年8月25日，保藏编号CGMCCNO.28255。经保藏中心于2023年8月25日检测为存活菌株。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)菌株KY1249是发明人通过大量筛选工作，首筛选得到的，该菌株具有生产海藻酸裂解酶的能力，具有较强的、高效快速降解海带的能力。同时该菌株本身具有促进植物根生长以及提高植物抗逆性的能力。该菌株及含有其的微生物菌剂为生产海藻多糖提供了新的资源和途径，可以广泛地应用于海藻多糖生产相关的领域例如肥料、饲料等。

(2)该菌株降解海带的发酵液具有更强的促根生长的能力以及更强的提高植物抗盐碱的能力。

(3)本发明提供了一种利用类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)菌株KY1249生产海藻多糖的方法，用该菌株发酵进行生产，生产工艺简单且稳定性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的不同产海藻酸裂解酶菌株10％CPC染色结果；

图2为本发明提供的不同菌株与其海带发酵液对玉米种子生长作用的结果；

图3为本发明提供的不同菌株的海带发酵液对玉米种子促氮吸收作用的结果；

图4为本发明提供的不同组别玉米苗在高浓度尿素里的毒害程度结果；

图5为本发明提供的不同组别小麦种子在15％PEG6000条件下生长情况结果；

图6为本发明提供的不同组别小麦种子在200mmol/LNaCl条件下生长情况结果；

图7为本发明提供的不同组别绿豆种子在200mmol/LNaCl条件下的生长情况；

图8为本发明提供的不同组别绿豆种子在15％PEG6000条件下的生长情况结果；

图9为本发明提供的不同组别玉米在15％聚乙二醇6000中的生长情况结果；

图10为本发明提供的不同组别玉米在200mmol/LNaCl中的生长情况结果；

图11为本发明提供的不同组别玉米在干旱条件下的生长情况结果；

图12为本发明提供的不同组别玉米在较轻浓度盐碱土的生长情况结果；

图13为本发明提供的不同组别玉米在较重浓度盐碱土的生长情况结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实验材料：

1.1菌株

类芽孢杆菌Paenibacilluspocheonensis KY1249，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.28255。

商业促生菌株枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 92068，来源于中国农科院农业资源区划研究所。

类芽孢杆菌Paenibacilluspocheonensis KY1248，来源于康生元(肇庆)生物科技有限公司微生物稀有资源库。

印度微小杆菌Exiguobacteriumindicum B10，来源于康生元(肇庆)生物科技有限公司。

1.2培养基

R2A培养基：酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，丙酮酸钠0.3g，七水硫酸镁0.05g，琼脂粉15g，水1L。

富集培养基：干海带100g，酵母0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，胰蛋白胨0.5g，蛋白胨0.5g，水1L。

海藻酸钠选择培养基：海藻酸钠10g，酵母0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，胰蛋白胨0.5g，蛋白胨0.5g，琼脂粉15g，水1L。

1.3主要试剂与种子

1.3.1试剂

海藻酸钠购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯代十六烷基吡啶购于上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3.2种子

玉米种子购于寿光禾之硕农业科技有限公司；小麦种子为鲁原502；绿豆种子购于太谷县绿宝种业有限公司。

实施例1.利用高通量法筛选具有产海藻酸裂解酶功能的微生物菌株

1.1土样的采集

选择具有代表性的样品，样品可以来源于农田、牧草地、森林土等不同的区域，每个点采集15-20克样品，同时标明来源地(省，县)、采集年和月、土壤的来源(植物或其他)，保藏于-80℃冰箱。

1.2利用高通量法筛选具有产海藻酸裂解酶能力的微生物菌株

第一步富集：取1g土样于100mL纯净水中摇匀，取其中1mL混合液于含10％干海带的液体培养基中(121℃灭菌20min)，在30℃下200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

第二步富集：取第一步富集的菌液1mL于含10％干海带的富集液体培养基，在30℃下，200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

第三步富集：取第二步富集的菌液1mL于含10％干海带的富集液体培养基，30℃，200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

1.3CPC染色法筛选具有产海藻酸钠裂解酶功能的微生物菌株

取最后一次富集的菌液各100μL涂布于含1％海藻酸钠选择性培养基(121℃灭菌20min)，利用10％氯代十六烷基吡啶(CPC)对菌落进行染色，观察记录1％海藻酸钠选择性培养基菌株生长及降解海藻酸钠情况。

从上述培养基中挑取具有降解海藻酸钠功能的菌株于R2A培养基(121℃灭菌20min)上划线培养纯化。

1.4重复验证

为了确保菌株产海藻酸钠裂解酶的能力，将所得可降解海藻酸钠的目标菌株，再次针刺于海藻酸钠选择固体培养基，30℃培养后进行CPC染色，验证所挑取的菌落是否具有降解海藻酸钠功能，排除假阳性菌落，并根据透明圈与菌落直径比值，初步判断菌株产海藻酸钠裂解酶的能力。

1.5结果

本发明对所采集到的15个不同省市的50个土壤样品，采用富集-高通量法筛选能高效降解海带的微生物。选择以菌株分解海藻酸钠的能力为判断标准，从这些样品中经平板分离后得到的8株菌可在以海藻酸钠为唯一碳源初筛培养基上生长并用10％氯代十六烷基吡啶染色有透明圈的微生物，见图1。比较它们的透明圈大小，见表1，其中KY1246、KY1248、KY1249、KY1250这4株透明圈直径较大，初步判断它们具有较强的、高效快速降解海带的能力。

表1.不同产海藻酸裂解酶菌株CPC染色透明圈大小比较

实施例2.利用DNS还原糖测定法进一步筛选产海藻酸钠裂解酶酶活性更好的微生物菌株

2.1液体发酵

挑选透明圈与菌落直径比值较大的4株菌株，分别接种到100mL海带液体培养基(同富集培养基，121℃灭菌20min)，30℃，200rpm下摇瓶培养3天，将发酵液于6000r/min条件下离心15min，取上清液利用DNS法测定酶活。

2.2DNS还原糖测定法测定酶活

1.无水葡萄糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中，加适量水溶解，转入容量瓶中并定容至100mL，配成1mg/mL浓度的母液。分别吸取母液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，补水至1mL，加DNS试剂1.5mL，混合后于沸水中煮5min，冷却后定容至10mL，于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

2.取0.1mL粗酶液，加入到盛有0.9mL 1％海藻酸钠底物(用pH 7.5的PBS缓冲液配制)的比色管中，充分混匀，40℃水浴条件下反应10min后，加入0.5mL DNS溶液，然后迅速于沸水浴煮沸5min，冷却后定容至10mL；空白管由灭活的酶液代替粗酶液。然后于540nm下测定各管吸光度。酶活力单位(U)定义为：每分钟产生1μg还原糖所需的酶量。发酵液酶活力单位定义为每毫升发酵液含酶活单位(U/mL)。

2.3结果

根据各个样品测得的吸光度值，计算各发酵液的酶活力。计算公式为：酶活力＝还原糖含量μg/(发酵液体积mL*反应时间min)。

表2.4株菌株与海带的发酵液的酶活力结果比较

由于不同微生物菌株产海藻酸钠裂解酶在酶活性和产物量方面有明显的差异，因此以发酵液中海藻酸钠裂解酶酶活大小进一步确定菌株降解海藻酸钠的能力。从表2可以看出，在液体发酵条件下，菌株KY1249产海藻酸钠裂解酶的酶活力最高，因此本研究以该菌株为研究对象开展后续试验。

实施例3.目标菌株KY1249的16S rDNA测序

3.1CTAB法提取细菌DNA

1、接种一单菌落于5mLR2A中，30℃培养过夜；

2、取1mL种子培养液接入100mLR2A液体中，37℃、220r/min培养16小时；

3、5000r/min离心10分钟，弃去上清。

4、加入10mL TE离心洗涤后，用10mL TE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；

5、取3.5mL菌悬液，加入184μL10％SDS，混匀，加入37μL10 mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时；

6、加入740μL5 mol/L NaCl，再加入512μL CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；

7、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

8、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

9、加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；

10、用1mL TE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL RNaseA，4℃保存。

3.2扩增与测序

采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序。

3.3菌株KY1249的16S rDNA测序结果

菌株KY1249的16S rDNA序列1(SEQ ID No.1)如下：

CCTGCGGGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGAGCACTTCGGTGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCTGTAAGATCGGGATAACTATCGGAAACGATAGCTAAGACCGGATAGCTGGTTTTCTCGCATGAGAGAATCATGAAACACGGAGCAATCTGTGGCTTACAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGCAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCCTAGACGAACAGCAGGGAGAGTAACTGCTCTCTGTGTGACGGTATAGGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTAATTAAGTTGGGTGTTTAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCCAAAACTGGTTGACTTGAGTGTAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCCTATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCATACTAGGTGTTGGGGATTCGATTCCTCGGTGCCGAAGTTAACACAGTAAGTATGCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTGGAGACAGGCCTTCCCTTCGGGGCAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGGC。

根据获得KY1249的16S rDNA序列(SEQ ID No.1)在GenBank搜索同源序列并进行同源序列分析对比，结果表明，该菌株的碱基序列与菌株Paenibacilluspocheonensis具有大于99％的高度同源，确定KY1249为Paenibacilluspocheonensis。

实施例4.菌株KY1249与海带发酵液的生物学测定

4.1菌株KY1249与海带发酵液对玉米的促根生长测定

1.对照组

对照菌株：商业菌株枯草芽孢杆菌92068、海带上分离出的常见菌株B10(Exiguobacteriumindicum)、KY1248(酶活力较小)；

其他对照：沃家福海藻肥(一种商业海藻酸肥料)、CK(无菌海带液)和水；

2.将OD₆₀₀＝0.05的92068、B10、KY1248、KY1249菌株分别接种到100mL含10％海带液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下200r/min培养5天后，6000r/min离心15分钟，得到上清液；

3.将上述不同菌株发酵上清液、沃家福海藻肥以及CK分别稀释相同的500倍，以及92068、KY1248、KY1249和B10菌液稀释成OD₆₀₀＝0.05。取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子先用不同的稀释液以及不同菌液和水分别浸泡1-2小时后种于0.5％琼脂培养基中，每组20粒玉米种子，观察培养基中种子的发芽情况，比较它们对玉米种子的生长是否具有促进作用。

4.1.1菌株KY1249与其海带发酵液对玉米的促根生长测定的结果

从图2可以看出沃家福海藻肥、KY1248发酵液、KY1249发酵液以及KY1248菌液和KY1249菌液对玉米种子根茎发育都有促进作用；KY1249菌液和KY1248菌液与其各自对应的海带发酵液对玉米种子促根生长表现出协同作用，而KY1249菌液及其发酵液都比KY1248菌液和发酵液促根效果要好；KY1249海带发酵液处理的玉米种子的根茎比KY1249菌液、沃家福海藻肥、KY1248海带发酵液以及KY1248菌液处理的要浓密，总体而言KY1249发酵液对玉米种子促根效果最好。

4.2菌株KY1249与海带发酵液对玉米的促氮吸收作用测定

1.对照组

2.将OD600＝0.05的92068、B10、KY1248、KY1249菌株分别接种到100mL含10％海带液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下200r/min培养5天后，6000r/min离心15分钟，得到上清液；

3.将上述不同菌株发酵上清液、沃家福海藻肥以及CK分别稀释相同的500倍，取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子先用不同的稀释液和水分别浸泡1-2小时后种于蛭石盆栽中，每组6粒玉米种子，待玉米种子出苗后，定时浇灌0.1％尿素和不同稀释液，观察盆栽中种子的生长情况，比较不同组别玉米对氮吸收是否具有促进作用。

4.2.1菌株KY1249与海带发酵液对玉米的促氮吸收作用测定的结果

从图3可以看出，浇灌了尿素和不同发酵液的各组别的玉米经过2-3周的生长后，KY1249发酵液处理过的玉米比其他组别玉米更高，叶片更大更绿，说明KY1249发酵液能促进玉米对氮元素的吸收。

4.3菌株KY1249与海带发酵液提高玉米抗高浓度尿素毒害的测定

1.对照组

对照菌株：商业菌株枯草芽孢杆菌92068、海带上分离出的常见菌株B10(Exiguobacteriumindicum)、KY1248(酶活力较小)；其他对照：沃家福海藻肥(一种商业海藻酸肥料)、CK(无菌海带液)和水；

3.将上述不同菌株发酵上清液、沃家福海藻肥以及CK分别稀释相同的500倍，取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子先用不同的稀释液和水分别浸泡1-2小时后种于蛭石盆栽中，每组6粒玉米种子，待生长到小苗时开始浇灌1％尿素和不同稀释液，共浇灌两次，观察盆栽中玉米苗的生长情况，比较不同组别玉米在高浓度尿素的毒害程度。

4.3.1菌株KY1249的海带发酵液提高玉米抗高浓度尿素毒害的测定结果

图4是玉米小苗在浇灌了两次1％尿素后的生长情况，可以看出都受到不同程度的毒害作用，其中毒害程度最严重的是沃家福、水处理、海带本身发酵液、菌株B10海带发酵液，而KY1249的海带发酵液组玉米苗卷曲程度最轻，受到毒害作用最轻，KY1248菌株的海带发酵液也表现出来微弱的降低了尿素对玉米植株的药害，说明KY1249发酵液可以提高玉米抗高浓度尿素毒害作用。

4.4菌株KY1249菌液与其海带发酵液提高小麦种子抗干旱和抗盐作用的测定

1.对照组

3.将上述不同菌株发酵上清液、沃家福海藻肥以及CK分别稀释相同的500倍，以及92068、KY1248、KY1249和B10菌液稀释成OD600＝0.05。取大小均匀、颗粒饱满的小麦种子先用不同的稀释液以及不同菌液和水分别浸泡1-2小时后种于0.5％琼脂培养基中，每皿20粒小麦种子，分别定时浇灌5ml 15％聚乙二醇6000(PEG6000)，用以模拟干旱条件，期间需分别补充适量的各组别稀释液。观察培养基中种子的发芽情况，比较它们对小麦种子在15％聚乙二醇6000中的生长作用情况。

4.取大小均匀、颗粒饱满的小麦种子先用不同的稀释液以及不同菌液和水分别浸泡1-2小时后种于0.5％琼脂培养基中，每皿20粒小麦种子，分别浇灌5mL 200mmol/LNaCl，期间需分别补充适量的各组别稀释液。观察培养基中种子的发芽情况，比较它们对小麦种子在200mmol/L NaCl中的生长作用情况。

4.4.1菌株KY1249与其海带发酵液提高小麦种子抗干旱和抗盐作用测定的结果

从图5可以看出来，KY1248发酵液和KY1249发酵液处理的小麦种子在15％PEG6000条件下根的长度比其他组别的要长，其中KY1249发酵液组别的小麦根长最长。

从图6可以看出KY1248发酵液和KY1249发酵液处理的小麦种子在200mmol/LNaCl条件下根长更长，其中KY1249发酵液组别的小麦根长最长；根据以上两种结果分析，可以得出经过KY1249发酵液处理的小麦种子相比其他对照组提高抗干旱和抗盐的作用最强。

4.5菌株KY1249与海带发酵液提高绿豆种子抗干旱和抗盐作用的测定

1.对照组

其他对照：沃家福海藻肥(一种商业海藻酸肥料)、CK(无菌海带液)还有水；

3.将上述不同菌株发酵上清液、沃家福海藻肥以及CK分别稀释相同的500倍，以及92068、KY1248、KY1249和B10菌液稀释成OD600＝0.05。取大小均匀、颗粒饱满的绿豆种子先用不同的稀释液以及不同菌液和水分别浸泡1-2小时后种于0.5％琼脂培养基中，每皿10粒绿豆种子，分别定时浇灌5ml 15％聚乙二醇6000(PEG6000)，用以模拟干旱条件，期间需分别补充适量的各组别稀释液。观察培养基中种子的发芽情况，比较它们对绿豆种子在15％聚乙二醇6000中的生长作用情况。

4.取大小均匀、颗粒饱满的绿豆种子先用不同的稀释液以及不同菌液和水分别浸泡1-2小时后种于0.5％琼脂培养基中，每皿10粒绿豆种子，分别浇灌5ml 200mmol/LNaCl，期间需分别补充适量的各组别稀释液。观察培养基中种子的发芽情况，比较它们对绿豆种子在200mmol/L NaCl中的生长作用情况。

4.5.1菌株KY1249与其海带发酵液提高绿豆种子抗干旱和抗盐作用测定的结果

从图7-A可以看出经过B10发酵液、KY1248发酵液、KY1249发酵液处理的绿豆种子在200mmol/L NaCl条件下的生长情况与水和CK对照组相比要好，特别是KY1249发酵液处理组的绿豆根系比B10发酵液和KY1248发酵液处理组更发达，植株更高，说明在200mmol/LNaCl条件下具有提高绿豆种子抗盐能力的三组处理组中KY1249发酵液处理组的作用最明显；从图7-B可以看出，看出经过KY1248菌液和KY1249菌液处理的绿豆种子在200mmol/LNaCl条件下的生长情况与水对照组相比要好，其中KY1249菌液处理组比KY1248菌液处理组要稍好一些，其根系生长稍发达一些，说明KY1248菌液和KY1249菌液与各自对应的发酵液在200mmol/L NaCl条件下提高绿豆抗盐能力具有协同作用；从图7-C可以看出，绿豆种子经KY1249发酵液处理后无论是从根系发达情况还是植株高度方面均表现出比KY1249菌液处理组更好的效果，说明KY1249发酵液在200mmol/L NaCl条件下比单纯的KY1249菌液对提高绿豆种子抗盐能力要更优秀。

从图8-A可以看出，沃家福、92068发酵液、KY1248发酵液、KY1249发酵液处理过的绿豆种子比水和CK对照组在15％PEG6000条件下的生长情况更好，说明沃家福、92068发酵液、KY1248发酵液、KY1249发酵液都具有提高绿豆种子抗旱能力的作用；从图8-B可以看出92068菌液、KY1248菌液以及KY1249菌液处理的绿豆种子在15％PEG6000条件下生长情况都比水对照组的要好，说明92068菌液、KY1248菌液以及KY1249菌液与其各自对应的发酵液在提高绿豆种子抗旱能力上都具有协同作用；从整体来看，KY1249发酵液处理组的绿豆苗根系最发达，植株高度最高，可以说明经过KY1249发酵液处理的绿豆种子在15％PEG6000模拟的干旱环境条件下抗干旱能力最强。

4.6菌株KY1249与海带发酵液提高玉米种子抗干旱和抗盐作用的测定

1.对照组

3.将上述不同菌株发酵上清液、沃家福海藻肥以及CK分别稀释相同的500倍，以及92068、KY1248、KY1249和B10菌液稀释成OD600＝0.05。取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子先用不同的稀释液以及不同菌液和水分别浸泡1-2小时后种于0.5％琼脂培养基中，每皿10粒玉米种子，分别定时浇灌5ml 15％聚乙二醇6000(PEG6000)，用以模拟干旱条件，期间需分别补充适量的各组别稀释液。观察培养基中种子的发芽情况，比较它们对玉米种子在15％聚乙二醇6000中的生长作用情况。

4.取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子先用不同的稀释液以及不同菌液和水分别浸泡1-2小时后种于0.5％琼脂培养基中，每皿10粒玉米种子，分别浇灌5ml 200mmol/LNaCl，期间需分别补充适量的各组别稀释液。观察培养基中种子的发芽情况，比较它们对玉米种子在200mmol/L NaCl中的生长作用情况。

4.6.1菌株KY1249与海带发酵液提高玉米种子抗干旱和抗盐作用测定的结果

从图9-A可以看出来，KY1248发酵液以及KY1249发酵液处理的玉米种子比其他处理组的整体生长情况更好，说明KY1248发酵液以及KY1249发酵液在15％PEG6000条件下对提高玉米种子抗旱能力都具有促进作用；从图9-B可以看出，KY1249菌液处理的玉米种子在整体生长情况比其他对照组的要好，说明在15％PEG6000条件下KY1249菌液对提高玉米种子抗旱能力具有促进作用，与KY1249发酵液具有协同作用；但整体而言，KY1249发酵液处理组的玉米根系最发达，植株高度最高，说明KY1249发酵液对提高玉米种子抗旱能力的促进作用最明显。

从图10-A可以看出，KY1249发酵液处理的玉米种子比其他处理组的整体生长情况更好，说明KY1249发酵液在200mmol/L NaCl条件下对提高玉米种子抗盐能力具有促进作用；从图10-B可以看出，KY1248菌液和KY1249菌液处理的玉米相比水对照整体叶片更宽更多，说明KY1248菌液和KY1249菌液在200mmol/L NaCl条件下对提高玉米种子抗盐能力也有一定的作用；但整体而言KY1249发酵液处理组的根长更长，叶片更多更密，说明经过KY1249发酵液处理的玉米种子相比其他对照组提高抗盐的作用最强。

4.7菌株KY1249与海带发酵液提高玉米种子抗干旱和抗盐碱作用盆栽实验测定

1.为了进一步测定菌株KY1249与海带发酵液对作物的抗旱抗盐碱性的作用，利用内蒙的盐碱土壤以及模拟干旱环境条件，进行盆栽种植。

2.将92068海带发酵液、KY1249海带发酵液、KY1248海带发酵液、沃家福海藻肥以及CK分别稀释相同的500倍。取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子分别用以上稀释液以及水浸泡1-2小时后，栽种于盆栽中，每盆6粒种子。在玉米出苗后再让其生长一周左右，期间适当浇淋1-2次对应的处理液，而后就不再浇水，放在干燥的地方控制玉米生长环境的湿度，观察各组的生长情况。

3.两种总含盐量不同的内蒙盐碱土，在水土体积比为1：1的条件下采用电导率仪测定它们的总含盐量，分别测得为15.6ms/cm和24.5ms/cm，15.6ms/cm的为较轻盐浓度，24.5ms/cm的为较重盐浓度。取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子分别用KY1249海带发酵液和沃家福的500倍稀释液以及水浸泡1-2小时后，分别栽种于两种盐碱土中，其中每盆6粒种子，待出苗后适当浇淋1-2次对应的处理液，观察各组的生长情况。

4.8菌株KY1249与海带发酵液提高玉米种子抗干旱和抗盐碱作用盆栽实验测定结果

图11是各处理组玉米在干旱条件下生长两个礼拜后的情况，可以看出KY1248发酵液与KY1249发酵液处理的玉米相比其他对照组枯死程度没那么严重，其中KY1249发酵液处理组的没枯死的叶片比KY1248发酵液处理组的要更多，说明KY1249发酵液对提高玉米种子抗干旱能力更好。

从图12可以看出，水对照和KY1249发酵液处理组在较轻浓度盐碱土里生长都受到明显抑制，但与水对照相比经过KY1249发酵液处理的玉米株高更高、叶片更大，受抑制程度明显较小，说明KY1249发酵液在较轻盐碱土条件下对提高玉米抗盐碱能力具有促进作用。从图13可以看出，在较重盐碱土生长条件下，KY1249发酵液处理组比沃家福海藻肥处理组以及水对照组受抑制程度明显更小，植株更高，叶片更大，说明KY1249发酵液在较重盐碱土条件下对提高玉米抗盐碱能力也具有一定促进作用。

结论

本发明通过采用高通量法筛选方法从广东省韶关市桔头镇采集的土壤中分离到了一株类芽孢杆菌KY1249，该菌株可将海带降解成海藻寡糖等物质，其发酵液可促进植物生长同时兼具提高作物抗旱抗盐能力。经过对该菌株的16S rDNA的序列测定分析，该菌株的碱基序列与菌株Paenibacilluspocheonensis具有99％的高度同源，确定KY1249为Paenibacilluspocheonensis。本发明发现与B10菌株以及枯草芽孢菌株92068相比，KY1248菌株、KY1249菌株本身就具有一定促根生长以及提高植物抗逆能力的作用，而且KY1249菌株的作用更明显；与KY1248菌株、B10菌株以及枯草芽孢菌株92068降解海带的发酵液相比，KY1249的海带发酵液对植物具有更强的促根生长的能力以及提高作物对氮吸收和抗旱抗盐碱的能力；KY1249菌液与KY1248发酵液对提高植物抗逆能力具有协同作用，但KY1249发酵液比单纯的菌液作用效果更明显。该菌产海藻酸钠裂解酶分解海带的功能的报道属于首次，在提高农作物抗逆性，减少化肥使用方面有巨大的潜力，具有开发为绿色农药的市场前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一株产海藻酸裂解酶的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)KY1249，其特征在于，所述类芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCCNo.28255。

2.含有权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)KY1249的微生物制剂。

3.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)或根据权利要求2的微生物菌剂在以下至少一个方面的应用：

(a)降解海带；

(b)促进植物生长；

(c)提高植物抗逆性。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述降解海带包括将海带发酵并降解为海带降解液。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述降解海带包括产生海藻酸裂解酶完全降解海带。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进植物生长包括促进植物根的生长和/或提高作物对氮的吸收。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗逆性包括提高植物抗旱和/或抗盐碱能力。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物包括玉米、绿豆和小麦。

9.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌(Paenibacillus pocheonensis)或根据权利要求2的微生物菌剂在制备海藻肥料或海藻饲料或海藻寡糖中的应用。

10.一种发酵海带制备海藻多糖的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述类芽孢杆菌(Paenibacilluspocheonensis)接种到以海藻酸钠为唯一碳源的培养基中进行培养发酵以获得发酵培养物。