CN113151297B - 一个同时改良棉花纤维长度、强度、伸长率的b3转录因子基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个同时改良棉花纤维长度、强度、伸长率的B3转录因子基因。该转录因子基因GHFLS在四倍体陆地棉TM‑1中的cDNA序列为：SEQ ID NO.1，基因组序列为：SEQ ID NO.2；基因GHFLS包含一个非同义突变的SNP位点，位于编码区序列的1391bp位置处，该SNP位点碱基从A变为G，对应的氨基酸从Lys变为Arg。在模式植物拟南芥中过表达GHFLS基因，发现过表达该基因造成T2代拟南芥根长的显著缩短，证明该基因在细胞伸长机制中的重要作用。单倍型AA的棉花品种(系)的纤维品质显著优于单倍型GG的棉花材料。该基因在高效鉴定优质纤维陆地棉品种、改良棉花纤维品质性状和培育棉花优质纤维新品种中具有重要的研究价值和应用前景。

Description

一个同时改良棉花纤维长度、强度、伸长率的B3转录因子基因 及其应用

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一个与棉花纤维长度、纤维强度、纤维伸长率均相 关的B3家族转录因子基因。

背景技术

棉花作为天然纤维的主要来源，是一种重要的经济作物。棉花生产不仅对我国农业乃至 国民经济的发展有着重要的影响，而且在世界棉花贸易市场上也起着举足轻重的作用。此外， 棉花纤维是优良的、使用最为广泛的天然纤维，更是纺织工业的重要原材料，在国民经济发 展中具有举足轻重的地位。随着人们生活水平的提高，对天然纯棉织物的需求不断增加，对 纤维品质的要求也愈来愈高。因此，深入挖掘和利用棉花品质相关的遗传变异就显得格外重 要。

全基因组关联分析(Genome-wide association study；GWAS)是以基因组中数以百万计的单 核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism，SNP)为分子遗传标记，进行全基因组水平上的 相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。随着基因组测序技术的 提高及测序成本的降低，并结合生物信息学的高度发展，GWAS成为挖掘和剖析人类疾病及 作物农艺性状及抗性性状基因及其相关遗传机制最有效的方法之一。利用全基因组关联分析 挖掘和克隆农艺性状相关基因，无需事先假定候选基因，其检测能力强，精度高，是分子育 种研究的热点。Belo等(2008)对553份优良自交系的8,950的SNP进行了GWAS分析，鉴 定出与油酸含量相关的位点，这是玉米首次真正意义上的全基因组关联分析。Huang等(2011)利用第二代测序技术对517份水稻地方种进行了重测序并获得上百万的SNP，然后对水稻的 14个农艺性状进行GWAS分析，并成功鉴定出80个性状关联的位点。此外，他们还对多达 950份水稻群体进行重测序，对开花期和10个产量相关性状进行GWAS分析，鉴定出了很多 已知功能基因(Huang et al.2012)。Lin等(2014)对世界各地的360份番茄种质进行全基因 组重测序，通过群体分化分析，首次发现决定粉果果皮颜色的关键变异位点，即SlMYB12基 因启动子区域的603bp缺失，进而抑制该基因的表达，从而使得成熟的粉果番茄果皮中不能 积累类黄酮，导致鲜食番茄和加工番茄的差异。Zhou等(2015)对302份大豆野生、地方品 种以及改良品种进行重测序，结合GWAS分析技术，发现96个GWAS关联位点与之前报道 的QTL有关联，并鉴别出含油量、株高和茸毛生成相关的新的关联位点。Fang等(2017)通过对318份陆地棉材料进行全基因组重测序，鉴定出25个棉花改良过程中的选择信号，通 过GWAS分析，共鉴定出119个关联位点，其中产量相关的关联位点71个，纤维品质相关 的位点45个，还有3个位点与黄萎病抗性相关(Fang et al,2017)。Ma等(2018)重测序分 析419个核心种质的陆地棉材料，发现7383个SNP与这些性状显著相关，位于4820个基因 内或基因附近。并且对控制开花，影响纤维长度，纤维强度的部分候选基因进行了重点分析 (Ma et al.,2018)。Liu等(2021)则利用290份陆地棉栽培种组成的自然群体经过多年田间 鉴定，结合高密度的SNP标记对棉花枯萎病抗性进行了全基因组关联分析，鉴定得到主效抗 病位点Fov7，并确定基因GhGLR4.8是一种新的植物非典型主效抗病基因(Liu et al.,2021)。 以上结果充分说明，全基因组关联分析具有很高的定位精度，甚至可以达到单基因的水平， 利用获得的与目标性状相关的功能标记，进行目标性状的筛选，可以大大加快育种进程和效 率。

植物转录因子的数量和种类繁多，它们参与各种信号转导途径及生长发育的过程，是真 核生物中最大的一个功能类别，大约占了全基因组的8％(Weirauch and Hughes,2011)。常见 的植物转录因子有：MYB、AP2/EREBP、NAC、bZIP、homeobox、zinc finger、MADS、WRKY、 B3、YABBY、Dof等。此外，B3家族是植物所特有的，且广泛存在的转录因子家族。B3家族含有B3-DNA结合结构域，通过结合特异性DNA序列，在植物生长发育中起重要调控作 用。根据结构特征和功能可将B3家族分为5个亚家族:ARF家族、ABI3家族、HSI家族、 RAV和REM亚家族，这些基因家族在调控植物的生长发育、器官形态建成、花芽分化以及 应答多种逆境胁迫中发挥重要作用(刘颖慧等，2017)。

发明内容

本发明的目的是提供一个B3转录因子家族基因Fiber length and strengthrelated(GHFLS)。 全基因组关联分析结果表明该基因与棉花纤维长度、纤维强度和纤维伸长率这三个重要的纤 维品质性状均密切相关。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

B3转录因子家族基因GHFLS，所述的B3转录因子基因GHFLS在四倍体陆地棉TM-1中的cDNA序列为：SEQ ID NO.1，基因组序列为：SEQ ID NO.2；所述的转录因子基因GHFLS含有一个非同义突变的SNP位点，位于基因组序列的1391bp的位置处，该SNP位点碱基从 A突变为G，对应的氨基酸从Lys变为Arg，并且基因型为AA的棉花品种的纤维长度，纤 维强度，纤维伸长率等纤维品质性状均显著高于基因型为GG的棉花品种。有意思的是，很 多新疆培育的品种单倍型为GG，有很大的利用价值。

本发明所述的转录因子基因GHFLS在鉴定优质纤维品质陆地棉品种中的应用。

本发明所述的转录因子基因GHFLS在改良棉花纤维品质性状中的应用。

本发明所述的转录因子基因GHFLS在通过基因工程手段培育棉花优质纤维新品种中的 应用。

一种用于检测所述的SNP位点的引物对，上游引物为：SEQ ID NO.3，下游引物为：SEQ ID NO.4。

所述的引物对在筛选高产棉花品种中的应用。

一种筛选高产棉花品种的方法，检测所述的一个SNP位点，选择基因组序列的1391bp位 置上的碱基为A的棉花即为优质纤维棉花品种。

本发明的优点表现在：

本发明通过棉花品种群体重测序和全基因组关联分析挖掘了一个与棉花品质性状，纤维 长度、纤维强度和纤维伸长率这三个重要的纤维品质性状同时密切关联的B3转录因子家族 基因GHFLS。本发明的转录因子基因GHFLS在全基因组关联分析中与棉花品质性状密切相 关。本发明提供的GHFLS cDNA和基因组序列由PCR技术获得，该技术具有起始模板量小， 试验步骤简单易行而且灵敏度高的优点。

GHFLS在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析由转录组测序所得。该基因在棉花开 花前-3、-1天的胚珠，开花后1天、3天、5天、10天、20天胚珠种子中优势表达，表明该基因与纤维品质性状构成因子相关。

GHFLS在相对高纤维品质和低纤维品质品种群体中的SNP基因型通过PCR技术进行了 验证，较易操作、灵敏度高和准确性好。

在模式植物拟南芥中过表达GHFLS基因，发现过表达该基因造成T2代拟南芥根长的显 著缩短，证明该基因在细胞伸长机制中的重要作用。

根据GHFLS的不同SNP基因型可以将品种群体分为两大类，统计学分析方法发现，这 两类群体之间的纤维长度、纤维强度和纤维伸长率存在显著性差异，进一步证明该基因与棉 花品质性状之间的相关性。

附图说明

图1.棉花不同产量性状GWAS关联分析结果。

FE、FS和FL分别代表品质性状纤维伸长率、纤维强度和纤维长度。横坐标表示染色体 上的位置(Mb)，纵坐标表示SNP位点关联的显著性，用-log₁₀(P value)表示。

图2.GHFLS在棉花不同组织和发育时期的表达水平。

横坐标代表不同组织，包括根(Root)、茎(Stem)、叶(Leaf)、胚珠(ovule)和纤维(fiber)。 胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到25天。纤维组织包括开花后5到 25天。

图3.GHFLS的序列信息和不同单倍型的鉴定。

在品种群体中检测到GHFLS序列存在一个非同义突变的SNP位点，位于基因组序列的 1391bp的位置上，该SNP位点碱基从A变为G，对应的氨基酸从Lys变为Arg。

图4.GHFLS的不同单倍型之间产量性状的比较分析。

箱图代表品种群体的品质性状的分布情况。横坐标为不同的种植环境，纵坐标为相应的 品质性状数值，分别为品质性状中的纤维伸长率、纤维强度和纤维长度。含有AA和GG两 种单倍型的品种分别是280和118个。白色代表单倍型AA的品质性状分布，黑色代表GG的品质性状分布。方框内的横线代表性状分布的中值。**表示在0.01水平上有差异；*表示在0.05水平上有差异。

图5.GHFLS基因负调控拟南芥根部发育。

左面箱图代表转基因拟南芥与野生型的根长统计情况。纵坐标为拟南芥根部长度，**表 示在0.01水平上有差异。右面照片为不同株系的转基因拟南芥与野生型的根部生长照片。

具体实施方式

实施例1棉花品质性状关联的转录因子基因GHFLS的挖掘：

针对486份现代陆地棉品种或者品系，从2016到2017年，分别在新疆库尔勒、新疆石 河子每个品种田间种植三个重复进行了品质性状(纤维伸长率、纤维强度、纤维长度、马克 隆值、纤维整齐度)的详细调查。同时，对这486份棉花品种(系)进行了全基因组重测序，获得7.55Tb测序数据，平均测序深度10.51×。将这些序列比对到棉花陆地棉TM-1的基因组序列，利用生物信息学软件进行全基因组SNP的鉴定，共挖掘到4 489 601个高质量的SNP(最小基因频率>0.05)用于后续分析。首先进行全基因组关联分析，再根据P<1×10^-6筛选SNP关联信号位点。对这些关联位点进行分析，我们发现了D11染色体上的一个SNP信号关联位点(D11:23877270)可以同时关联纤维伸长率、纤维强度、纤维长度三个品质性状(图1)。这个SNP位点正好处于基因外显子区，并造成了氨基酸序列的突变。该基因为B3转录 因子家族基因，命名为GHFLS。

实施例2转录因子基因GHFLS的获得：

从陆地棉基因组序列中获取了GHFLS的cDNA序列和基因组序列，见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。根据cDNA两端设计基因全长引物，进行PCR扩增，引物序列为F1：SEQ ID NO.3和R1：SEQ ID NO.4。PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃ 退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物进行测序， 与cDNA进一步比对确定序列的准确性。

实施例3GHFLS在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析：

本实验采集了棉花TM-1品种不同组织和不同发育时期的RNA样本进行转录组测序。样 本材料包括了根、茎、叶、胚珠和纤维。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花 后1到25天。纤维组织包括开花后5到25天。转录组测序采用Illumina HiSeq 2500平台，每个样本平均测序深度达到6Gb。基因表达水平的计算是将测序得到的reads与陆地棉基因组进行比对，计算出的表达水平以每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序 片断数(FPKM)表示。实验结果如图2所示，该基因在TM-1棉花开花前-3、-1天的胚珠， 开花后1天、3天、5天、10天、20天胚珠种子中优势表达，表明该基因与纤维品质性状构 成因子相关。

实施例4B3转录因子基因GHFLS在鉴定高品质棉花品种和改良品质性状中的应用：

基于SNP位点(D11:23877270)在染色体D11上的位置，在其两端设计基因组扩增引物， 引物序列为F2：SEQ ID NO.5和R2：SEQ ID NO.6。利用这对引物，在486个品种的DNA 中进行PCR扩增并测序。PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退 火1min，72℃延伸45sec，30个循环；最后72℃延伸10min。根据测序结果分析该SNP位 点上每个品种群体的基因型。我们证实了GHFLS序列中含有一个非同义突变的SNP位点， 位于基因组序列的1391bp的位置处，该SNP位点碱基从A突变为G，对应的氨基酸从Lys 变为Arg。根据该SNP位点的碱基信息，将陆地棉现代品种(系)分为AA及GG两种单倍 型(图3)。

根据GHFLS基因组序列1391bp位置上SNP对基因型，我们从该自然群体中鉴定出单倍型AA材料280个，单倍型GG的材料118个(图3和表1)。其中对于我国陆地棉品种选 育工作做出了突出贡献的岱字棉15，斯字棉2B，108Ф，KK1543，611Б等均为高纤维品质 单倍型AA，进一步反映了美棉及乌兹别克斯坦等中亚国家棉花品种对我国棉花品种改良的 深远影响(Fang et al.,2017；Han et al.,2020)。大部分新疆选育的品种为GG单倍型，说明高纤维品质单倍型AA还有很重要的利用价值。

利用t-test统计学检测方法，我们计算了两组单倍型之间品质性状的相关性(图4)。结 果显示，单倍型AA的纤维伸长率在2016年库尔勒、两年两点(2016石河子，2016库尔勒， 2017石河子，2017库尔勒)的均值以及库尔勒2016、2017两年的均值等三个环境中均优于 GG单倍型的棉花材料，均呈现出极显著差异(P<0.01)；单倍型AA的纤维强度在2016库尔勒环境中也显著高于GG单倍型材料(P＝0.032)；同时，单倍型AA的纤维长度在2016库尔勒，2016石河子，2017石河子，两年两点的均值，库尔勒2016、2017两年的均值以及石河 子两年的均值中均表现为显著优于GG单倍型材料(P<0.01)。

构建GHFLS基因过表达载体CaMV 35S：：GHFLS(载体名称为pBinGFP4)，采用蘸花法侵染拟南芥，经过硫酸卡那霉素筛选及PCR检测，鉴定阳性植株。通过自交和筛选，获得纯合T2代阳性克隆。测量比较过表达GHFLS不同株系与野生型拟南芥根长，发现过表达拟南芥的根长显著缩短(图5)。该结果进一步证明GHFLS基因在细胞伸长机制中的重要作用。

通过以上结果可以看出，基因GHFLS在改良棉花品质性状和培育棉花优质纤维新品种 中具有重要的研究价值。一方面可以根据基因GHFLS的单倍型设计分子标记，从而有效的鉴 定棉花品质性状，在优质纤维棉花品种选育研究中具有很好的应用价值。另一方面，可以通 过基因工程的手段将含有优质单倍型AA的基因转入棉花品种中以提高棉花品质，也可以将 单倍型GG中的SNP位点进行定点突变，改造成优质单倍型从而培育优质纤维棉花新品种。

表1高纤维品质和低纤维品质单倍型在群体品种材料中的鉴定

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一个同时改良棉花纤维长度、强度、伸长率的B3转录因子基因及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

atggatcgaa gggtgaagaa ggaagctgaa gagataccgc aaagaacgat gtcatttgct 60

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<210> 2

<211> 6693

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 2

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ggcttatgtt taactgacaa ccatataact tttcaaatgc atggtgaggt ttgttagcag 4680

agatgttaag aaccttaatt tttattatga aaccttattc tttgagatgt agttggggcg 4740

aatgtatgaa acctgaatgt taaagattct gaaaatgtat ttgccttatt atgaggtcac 4800

acattgaagg gctaagtagg tgaaaaacaa tgtcaggggt tttagatatc taactatacg 4860

ggatatactg ttttattaag attggtctgt agtacttgag caagccgata tatcactctc 4920

caaagacttg catatgttgt tttttaagtt tgcttgattt gtaggaggaa tggagagaga 4980

caatatactt agttccagct aactacgcca gagctttaag ggtgcacttg attgagtgga 5040

aaagtggaag gagggaatgt caaggtggaa agaaaataaa ttttgaatgt gtttggtggg 5100

aaagaaaagt gagaggaaag aaaacaaaag agatgactat tttccacctt aatgcatcaa 5160

aacaaatcat tccaaattgg aatgataaga ggagagaaaa tgagaggtga atttatgcta 5220

gttaaaattt atgcattttt ctaaggtttc attttctttc tcttattttt atactctacc 5280

aagcgatgaa tggaaagaaa atttcttttt ctctcaaatt ttccattcta ttccttccta 5340

ccaagcacat cagtggaaag aaaaattata tttttcatct ttttattttt ctactcgtac 5400

aattttctat ccctccaatt tttttttctc tctttcaagt aaagcctaga agtttccata 5460

agaactacat gggtaataga gaactagtgc agagttcata ttatgtttat tccaaatcat 5520

tatatcagca aaacaaaatg actgcttagc aatgtttcta acctggcccc atcagtatat 5580

cgtagaacct aagactgcat taatataaga ggatgcaagg aattaggttt cctcctctat 5640

ttgaagggag attatctttt atttgtttta aatgcatata tttttgtgaa agtacagtta 5700

tttacattag taattactct ctatctaacg tgtatcatct tatttttgta gatatacata 5760

ataagggcac atgatttaaa tgaattggat ggggctcttg gcctcctaaa tttggatgct 5820

tatacaaaac aaagtgatgc aggcaagttg tttggtgtct ttgttaggtc tcttaattat 5880

catgcttgca tgtcagaagt tttgcattat aactgaattt ctggggaaaa aataatagat 5940

gatgcagaaa ctggtccaac ggtctctaaa agtacaaaga ggaaacgtcc aaaacctctt 6000

ccactagctt ctgttaggaa gaagaacaag aggtctggcc tacaaagatt gtcttgtaac 6060

gttgggcagc cggcagagca atctgaaaat gatagtgaag aagttggttc agaagttttg 6120

gaaggtttca agcgaaccga gtctgcaatt caattcaaag acataacaag tttcgagaac 6180

atattggttg atggcttggt tatagatcct gagctctcgg aagacattcg cagtaaatac 6240

taccagctat gctgtagtca aaatgctttt cttcatgaaa atattatcca gggtataagt 6300

tttaaattta aagttggaat tatttccgaa actgtcaata ttgctgatgc tataagaact 6360

tgcaagctca caacttctcg agatgaattt gatagttggg acaggacctt gaaagccttt 6420

gagttgttgg gcatgaatgt tggtttctta cgaactcgtc ttcaccggct tgtaaacctt 6480

gcatttgaat cagaaggtgc tgctgagaca aggaggtatt ttgaagctaa agcagaacga 6540

gatcagacag agaatgagat acgaaacctt gaagcaaaac tcacggagct gaaggatgca 6600

agtaaaacct ttggatttga aatcgagagt ttgcaatcta aagcggaaac aaatgaattc 6660

aggtttgaga aagaagttaa ggctccatgg tga 6693

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggatcgaa gggtgaagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaccatgga gccttaactt 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgaaacctt gaagcaaaac tca 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggaggaag ccaatttctg 20

Claims (4)

1. B3转录因子基因GHFLS在鉴定优质纤维陆地棉品种中的应用，其特征在于，检测B3转录因子基因GHFLS，选择B3转录因子基因GHFLS的基因组序列的1391bp位置上的碱基为A的棉花即为优质纤维陆地棉品种，所述B3转录因子基因GHFLS的基因组序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述B3转录因子基因GHFLS具有一个SNP位点，SNP位点位于B3转录因子基因GHFLS基因组序列的1391 bp位置处，该SNP位点碱基为A或G，对应的氨基酸为Lys或Arg。

3.一种筛选高产棉花品种的方法，其特征在于，检测B3转录因子基因GHFLS，选择B3转录因子基因GHFLS的基因组序列的1391bp位置上的碱基为A的棉花即为优质纤维棉花品种，所述B3转录因子基因GHFLS的基因组序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，检测B3转录因子基因GHFLS的引物具体为：上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示。

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