CN106754968B

CN106754968B - 水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用

Info

Publication number: CN106754968B
Application number: CN201710050196.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡新忠; 徐幼平; 郭伟毅; 程维舜
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2020-01-07
Anticipated expiration: 2037-01-23
Also published as: CN106754968A

Abstract

本发明提供一个水稻抗病调控基因，命名为OsASR2。该基因的开放阅读框长549bp，编码一种ASR蛋白，由182个氨基酸组成。该基因编码蛋白包含ABA/WDS结构域。本发明通过构建OsASR2基因表达受到抑制的RNAi水稻，首次阐明了该基因对水稻细菌性条斑病抗性的调控作用。OsASR2‑RNAi植株表现出强烈的水稻细菌性条斑病抗性，从而揭示了OsASR2基因对水稻细菌性条斑病抗性的强烈负调控功能。本发明同时提供了OsASR2基因通过创制其RNAi水稻来获取强烈抗细菌性条斑病水稻新材料的应用。本发明提供的OsASR2基因是一种适用于创制和选育高抗细菌性条斑病的水稻新材料和新品种的新基因资源。

Description

水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一个水稻基因(OsASR2)及抗病调控功能的应用。

背景技术

1、植物基因克隆技术

植物基因克隆方法有很多种，随着基因组序列测定完成的植物物种的增多，基于数据库序列的植物基因克隆方法得到越来越广泛的应用。该方法操作步骤主要包括基于保守序列的引物设计，目的植物组织RNA提取，反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)，PCR产物与载体的连接，连接产物的细菌转化，质粒提取，酶切检验，测序分析等。

2、植物基因表达控制和基因功能分析技术

植物基因的功能通过基因表达和蛋白积累来执行。因此，基因功能通常通过比较分析基因的超常规表达与正常表达情况下的表型(Phenotype)或功能发挥情况来判断和明确。基因的超常规表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(Over-expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过RNA干扰(RNA interfering,RNAi)、基因敲除(Knock-out)等方式来达到。RNAi通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向***一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲除(Knock-out)则通过在植物基因组中的目的基因中***一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。构建基因超表达植株和/或RNAi植株、基因敲除突变体，比较这些植株的表型和性状与野生型/正常植株的差异，就能明确目的基因对该性状的调节功能。

3、植物转基因技术

用于将外源基因导入目的植物，从而获取携带外源基因的转基因植物。包括基因枪法，农杆菌介导法等。农杆菌介导法包括将目的基因克隆入植物表达载体，表达载体对农杆菌的转化，携带表达载体的农杆菌对目的植物组织的感染，转基因植株的再生以及植株中基因转化和表达情况的检测分析等步骤。

4、植物抗病性检测分析技术

植物病原物包括真菌、卵菌、细菌、菌原体、病毒和线虫等多种类型。不同类型病原物的接种方法各不相同。对于真菌，能产生分生孢子的，通常以分生孢子悬浮液喷雾接种植物。不产生分生孢子的，则以菌丝块等接种植物。对于卵菌，一般先培养产生大量孢子囊，而后低温培养使之释放游动孢子，最后以游动孢子悬浮液接种植物。对于细菌，常以菌体悬浮液剪叶、针刺、注射、喷雾等法接种植物。对于病毒，常以提纯的病毒粒子或人工体外转录产物摩擦、注射、或通过昆虫等传播媒介接种植物。对于菌原体，常通过传播介体接种或者嫁接接种。对于线虫，常以一定数量的二龄幼虫接触植物根部茎基部或根围土壤中接种植物。多数情况下，接种后需要保持较高的相对湿度，合适的温度和光照条件。接种后按不同时间点连续观察病害发生症状，统计发病率和发病严重度，计算病情指数，采用RT-PCR检测病原物生物量。通过与感病对照植物发病情况的对比分析，明确目标植物的抗病性。

5、植物抗病育种技术

主要可以分为传统抗病育种和通过基因工程抗病育种两大类。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而基因工程育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一个水稻(Oryza sativa)基因OsASR2，本发明克隆的OsASR2核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因的开放阅读框(ORF)长549bp，编码一种ASR(Abscisic acid，stress，ripening protein)蛋白，由182个氨基酸组成，其序列如SEQ IDNO：2所示。该基因编码蛋白包含ABA/WDS结构域。本发明克隆的OsASR2序列与水稻品种日本晴的基因组注释的LOC_Os01g73250.1一致。本发明构建了OsASR2基因表达受到抑制的RNAi水稻，这些OsASR2-RNAi植株表现出强烈的对水稻细菌性条斑病(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)的抗性。本发明揭示了OsASR2基因对水稻细菌性条斑病抗性的强烈负调控功能(具体见实施例中的说明)。

本发明的另一个目的是提供所述基因通过创制OsASR2-RNAi水稻来获取强烈抗细菌性条斑病水稻材料的应用，是在通过创制OsASR2-RNAi转基因水稻纯合系来获得针对水稻细菌性条斑病菌不同菌株的广谱抗病材料中的应用，通过以下步骤实现：

(1)OsASR2基因RNAi结构的构建和获取

将OsASR2基因的一个特异性序列片段克隆入中间表达载体pENTR，再将重组结构pENTR-OsASR2与RNAi载体(pANDA载体)进行LR酶反应，获取RNAi结构pANDA-OsASR2。

(2)转化OsASR2基因RNAi结构的农杆菌的获取

将OsASR2基因RNAi结构(pANDA-OsASR2)通过电击等方法转化对水稻具有强侵染能力的农杆菌菌株。

(3)转OsASR2基因RNAi结构水稻的创制和获取

通过农杆菌介导法将OsASR2基因RNAi结构导入水稻，获取转OsASR2基因RNAi结构的水稻。

(4)转OsASR2基因RNAi结构水稻纯合系的获取

分别以抗生素抗性和OsASR2基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转OsASR2基因RNAi结构的水稻纯合系。

(5)抗细菌病害的OsASR2-RNAi水稻纯合系的筛选鉴定和获取

以转OsASR2基因RNAi结构(pANDA-OsASR2)的水稻纯合系为材料，检测分析对各类细菌病原物所致病害的抗性，获取抗细菌病害的OsASR2基因RNAi水稻。

本发明的优点：(1)本发明提供的OsASR2基因是优质抗细菌病害调控基因资源，利用该基因获取的抗病材料具有抗病性强烈等优点。水稻对细菌性条斑病菌(Xoc)的抗性还没有显性主效的抗病基因(Resistance gene)被发现和鉴定，目前尚缺乏高抗的抗性品种和资源。本发明提供的OsASR2基因对水稻细菌性条斑病抗性具有强烈的负调控作用，OsASR2-RNAi水稻表现对该病害的强烈抗性。因此，OsASR2基因适用于对水稻细菌性条斑病的高抗水稻材料和品种的创制和选育。(2)获取抗病材料周期短。获取抗病植物材料和品种的方法主要有常规的传统育种方法和利用抗病调控基因的基因工程育种方法。传统育种方法具有可用抗病资源范围受天然遗传隔离限制，选育周期长，需要大量人工物力等缺点。而基因工程育种方法则具有可用抗病资源范围广、操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力、特别适宜培育广谱、持久、高抗病性品种等优点。本发明利用抗病调控基因OsASR2，采用基因工程方法，创制培育强烈抗细菌病害的水稻材料，具有周期短，选育快速等特点。

附图说明

图1为OsASR2-RNAi水稻纯合系及其亲本水稻叶片接种水稻细菌性条斑病菌后的症状和菌量检测分析结果比较图。OsASR2-RNAi水稻纯合系165-3及其亲本水稻叶片采用针筒浸润法接种水稻细菌性条斑病菌(Xoc)菌株oxy04和ROS105。左：接种10天后的症状；右：接种10天后叶片内的Xoc菌量检测结果。结果表明，与亲本相比，OsASR2-RNAi水稻纯合系165-3不形成扩展病斑，菌量受到强烈抑制。表明OsASR2基因的RNAi强烈提高了对水稻细菌性条斑病的抗性，揭示OsASR2对水稻抗细菌性条斑病起强烈负调控作用。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

本发明克隆了一个水稻基因OsASR2，通过构建RNAi转基因水稻，首次阐明了该基因的抗细菌性条斑病菌不同菌株的调控功能。同时，本发明构建的OsASR2-RNAi水稻具有增强的抗病性，因此，本发明提供了一套通过构建该基因的RNAi转基因水稻、采用基因工程技术创制和获取抗细菌性条斑病菌(Xoc)不同菌株水稻新材料的技术体系。主要步骤包括：

1)水稻OsASR2基因的克隆和保存

本发明提供的水稻OsASR2基因通过以下步骤克隆获得。先根据水稻基因组数据库中OsASR2序列设计了引物OsASR2-F3(5’-caggcgcgcc atg acg gag tac tac tcc agc-3’，斜体部分为AscⅠ酶切位点)(序列如SEQ ID NO：3所示)，以及OsASR2-R2(5’-caggtacc gttgca gta gta gcc ctg ctg-3’，斜体部分为KpnⅠ酶切位点)(序列如SEQ ID NO：4所示)。采用TRIZOL试剂提取水稻叶片总RNA，采用RT-PCR方法扩增获取OsASR2cDNA，通过1％琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收PCR产物，连接pMD19-mT载体，热击转化大肠杆菌DH5α，在LB培养基中摇菌培养过夜，提取质粒，采用AscⅠ/KpnⅠ酶切的方法和以OsASR2-F3/OsASR2-R2为引物对的PCR方法分别检验所提取的质粒是否包含OsASR2基因，最后送公司测序验证，从而成功克隆和获取OsASR2基因cDNA全长序列。OsASR2核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因的开放阅读框(ORF)长549bp，编码一种ASR(Abscisic acid，stress，ripening protein)蛋白，由182个氨基酸组成，其序列如SEQ ID NO：2所示。该基因编码产物包含ABA/WDS结构域。经过BLASTn分析发现，本发明克隆获得的OsASR2基因与水稻品种日本晴的基因组注释的LOC_Os01g73250.1一致。

转化了携带有OsASR2基因序列的载体的大肠杆菌，保存于－80℃冰箱。因此，可随时通过活化菌株，提取质粒，通过PCR扩增和酶切，将OsASR2基因亚克隆至目的载体中，用于转基因等研究。

2)OsASR2基因RNAi结构的构建和获取

根据本发明克隆的OsASR2序列设计引物OsASR2-F4(5’-ttggatcc ggc cag cagcag gag tac tac-3’，斜体部分为Bam HI酶切位点)(序列如SEQ ID NO：5所示)，以及OsASR2-R3(5’-ttctcgag gtt gca gta gta gcc ctg ctg-3’，斜体部分为XhoI酶切位点)(序列如SEQ ID NO：6所示)。以上述1)中获取的pMD19-OsASR2质粒为模板，OsASR2-F4/OsASR2-R3为引物对，通过PCR扩增获取长为300bp的OsASR2片段，然后通过Bam HI/XhoI双酶切、连接、转化、卡那霉素培养基平板筛选、酶切和PCR鉴定等步骤获取亚克隆了300bpOsASR2片段的中间表达载体pENTR(pENTR-OsASR2)。再将重组结构pENTR-OsASR2与RNAi载体(带有水稻ubi启动子、GUS Linker序列和T-NOS终止子的pANDA载体)进行LR酶反应过夜，加蛋白激酶K后37℃反应10min以充分终止反应，反应产物转化大肠杆菌后用含卡那霉素的培养基筛选阳性克隆，然后用SacI+KpnI双酶切和PCR鉴定是否在pANDA载体的GUS Linker两端正反双向***了300bp的OsASR2片段，从而获取RNAi结构pANDA-OsASR2。

3)转化OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2的农杆菌的获取

将OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2通过电击等方法转化对水稻具有强侵染力的农杆菌菌株，如EHAl05，在含链霉素和卡那霉素的YEP培养基上筛选转化子，再通过SacI+KpnI双酶切和PCR鉴定，获取携带OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2的农杆菌。用于下一步水稻的遗传转化。

4)转OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2水稻的创制和获取

通过农杆菌介导法将OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2导入水稻。分为水稻愈伤组织的诱导、携带pANDA-OsASR2的农杆菌感染水稻愈伤组织、潮霉素抗性植株的再生和鉴定等几大步骤，最后获取再生的转pANDA-OsASR2的水稻T₀代。具体操作步骤如下：

(i)水稻愈伤组织的诱导

种胚表面的消毒和清洗：取成熟完好的日本晴水稻种子，剥去种皮，留下完整的种胚。用70％乙醇溶液浸泡种胚1min，倒掉乙醇后用50％次氯酸钠溶液浸泡种胚，放在摇床上28℃，180rpm消毒40min。倒掉次氯酸钠溶液，用灭菌的ddH₂O洗涤种胚至少10次，直至液体干净透明为止。用灭菌的滤纸风干种胚后，用镊子小心把种胚放入NB1固体培养基上，每个培养皿约30粒种子。之后用保鲜膜密封，置于培养箱中28℃暗培养。

愈伤组织的诱导：将种胚放在NB1上培养15天后，将分化出的愈伤组织转移到新鲜的NB2培养基上，在28℃黑暗条件下再培养10天。将健康亮黄的愈伤组织转移到NB3上培养大约10天。注意，为了提供充足营养，一个NB2板转成2个NB3板进行培养。

愈伤组织的继代培养：将健康的愈伤组织从NB3换至NB4上，在28℃黑暗条件下培养9天，此时的愈伤组织最适合农杆菌感染。

(ii)水稻愈伤组织的农杆菌感染

农杆菌的培养：将携带有OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2的根癌农杆菌EHA105菌株从-80℃中取出，在含链霉素和卡那霉素的LB平板上划线，置于28℃恒温箱内培养(约2d)，长出菌落后挑取单菌落，分别接种于含相应抗生素的50mL YEP培养液中，27℃恒温摇床(180rpm)培养约48h至OD₆₀₀为0.5-0.8，转入无菌离心管中，室温条件下5000×g离心10min，去掉上清液，菌体用25mL AAM-AS培养液重新悬浮清洗后，再在相同的条件下离心一次，最后用约50mL AAM-AS培养液重新悬浮菌体到OD₆₀₀为0.05-0.1(约10⁹个细胞/mL)，置于冰上即可用于水稻的转化。

农杆菌侵染：选择生长健康带亮黄色的愈伤组织，用勺子小心地刮进无菌的的小培养皿中，然后将重悬好的农杆菌液倒入培养皿中，尽量使菌液浸没所有愈伤组织，保持浸泡约30min，期间不时地轻轻摇晃。之后用灭菌的胶头滴管将菌液尽可能多地吸出。

共培养：将侵染过的愈伤组织放入NB-AS培养基上22℃黑暗培养3d。

带菌愈伤组织在抗性筛选前的清洗：共培养3d后，将带菌的愈伤组织集中放到500mL无菌瓶中，用灭菌的蒸馏水清洗愈伤组织8～10次直到液体透明，然后加入200mL含Amp(200mg/mL)和Cef(300mg/mL)的ddH₂O，将其放到摇床，180rpm、27℃恒温下摇动30min，然后用灭菌的胶头滴管将洗出液吸出，最后将清洗干净的愈伤转入NB-CHA培养基，在28℃黑暗下培养14d后用于抗性筛选。

(iii)潮霉素抗性植株的再生

抗性筛选培养：将愈伤组织分系转入含抗生素(Cef，300mg/mL；Hyg，50mg/mL)的NB-CH1筛选培养基上，在28℃黑暗下培养，进行抗生素抗性筛选；

继代培养：将NB-CH1上经抗性筛选再生的潮霉素抗性愈伤组织，以系的方式转入含抗生素(Cef，300mg/mL；Hyg，50mg/mL)的NB-CH2筛选培养基上，在28℃黑暗下继代培养一次，培养时间大约1周。

抗性愈伤组织的预分化培养：将具有抗潮霉素的愈伤组织以系的方式转入含抗生素(Hyg，50mg/mL)预分化培养基Pre-H上，在28℃黑暗下培养15d。

抗性愈伤组织的再分化培养：将预分化充分的抗性愈伤以系的方式转入含抗生素(Hyg，50mg/mL)再分化培养基R-50上，在27℃光条件下培养大约3周。

生根培养：待潮霉素抗性愈伤组织分化出小根和绿色小芽，且小根长到1cm以上进行生根培养。用镊子将变绿的抗性芽从分化培养基上挑出，转入到含有抗生素(Hyg，50mg/mL)的1/2MS生根培养基上进行生根培养。

土壤种植：等潮霉素抗性苗长到根系完全后，将T₀代无菌小苗在27℃下开盖培养锻炼2d，然后移栽到水田取回的熟土中，置于温室中进行常规管理，最后收获得到T₀种子。

5)转OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2的水稻纯合系的筛选鉴定和获取

分别以潮霉素抗性和OsASR2基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况。潮霉素抗性筛选在含潮霉素的平板上针对水稻种子开展进行，观察能否在潮霉素抗性平板上正常生长成健康小苗。基因表达采用实时荧光定量PCR等方法进行检测。获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转OsASR2基因RNAi结构pANDA-OsASR2的水稻纯合系。这些水稻纯合系在潮霉素抗性平板上全部能正常生长成健康小苗、且OsASR2基因表达水平显著低于转空载体的对照。

6)抗细菌病害的OsASR2-RNAi水稻纯合系筛选鉴定和获取

以转OsASR2基因RNAi结构(pANDA-OsASR2)的水稻纯合系为材料，检测分析对水稻细菌病原物所致病害的抗性，获取强烈抗细菌病害的OsASR2-RNAi水稻。

检测分析的病原物包括：水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola,Xoc)菌株oxy04和ROS105、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)菌株PXO99和PXO112。对于Xoc，采用浸润法接种。先摇菌制成浓度为OD₆₀₀＝1.0的Xoc细菌悬浮液，再以无菌一次性针筒浸润水稻叶片。对于Xoo，采用剪叶法接种。先摇菌制成浓度为OD₆₀₀＝1.0的Xoo细菌悬浮液，再以无菌剪刀蘸取菌液，在离叶尖3cm处剪叶，置于大塑料筐中覆膜保湿48h。

接种结果显示，亲本对照水稻叶片在浸润接种Xoc菌株oxy04和ROS105后10天，分别在浸润区域以外形成长度达10.0mm和6.7mm的沿维管束扩展的水渍状病斑，上面还形成菌脓。然而，OsASR2-RNAi水稻纯合系165-3叶片在浸润接种这两个Xoc菌株后，在浸润区域以外均不出现明显水渍状病斑(图1左)。菌量检测分析结果显示，亲本对照水稻叶片在接种Xoc菌株oxy04和ROS105的发病区域菌量分别达9.24×10⁸cfu/叶和2.86×10⁸cfu/叶。然而，OsASR2-RNAi水稻纯合系165-3叶片在这两个Xoc菌株的接种区域的菌量只有1.57×10⁶cfu/叶和2.86×10⁷cfu/叶，分别只有亲本对照的0.17％和10％，即菌量较亲本对照分别下降了3个和1个数量级(图1右)。对水稻白叶枯病菌Xoo菌株PXO99和PXO112的类似分析结果显示，OsASR2-RNAi水稻纯合系165-3在接种后的症状严重度(病斑长度)和菌量均与亲本对照相似。这些结果表明，OsASR2-RNAi水稻纯合系165-3对Xoo菌株PXO99和PXO112的抗性与亲本对照没有显著差异，但对Xoc菌株oxy04和ROS105的抗性显著强于亲本对照。

以上结果表明，OsASR2对水稻抗细菌性条斑病起强烈负调控作用。可以通过构建OsASR2-RNAi水稻纯合系来创建获取高抗水稻细菌性条斑病的水稻新材料和新品种。

7)广谱高抗细菌性病害的OsASR2-RNAi水稻纯合系的筛选鉴定和获取

以OsASR2-RNAi水稻纯合系为材料，检测分析对各类细菌病原物所致病害的抗性，比如水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌的更多其它菌株等。通过接种分析和抗病评价，筛选和获取对更多Xoc和Xoo菌株表现出抗性的、广谱高抗细菌病害的OsASR2-RNAi水稻材料。

<110> 浙江大学

<120> 水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用

<160> 6

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<221> CDS

<222> (1)…(549)

<400> 1

atgacggagt actactccag caccgtggac gagtgctacg agaccaccgg caggcagcac 60

ggccacgggc acggccacgg tcacgggcac gggcacgggc atggtggcat gagggtggag 120

tcccacaccg acgactacta cagcgagggc ggcgagatcg accgtgggag gaggaacaac 180

tccatgcact cgcaggagta cctgatgagg cagcagagcg gccatggcgg ctacggctac 240

ggcggcggcc agcagcagga gtactacaag cgggaggagc gcgagcacaa gcagcgcgag 300

cgcgtcggcg agatcggcgc cctcgccagc ggcgccttcg ctctctatga ggggcaccag 360

gcgaagaagg acccggcgaa cgcgcagagg cacaggatcg agcagggcgt ggcggcggtg 420

gcggcggtgg gcgccggcgg ctacgcctac cacgagcacc gcgagcagaa gcaggccagc 480

tacggcgcca aggagcagca gtacggctac gccaggatgc cgcagcagca gggctactac 540

tgcaactga 549

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

Met Thr Glu Tyr Tyr Ser Ser Thr Val Asp Glu Cys Tyr Glu Thr Thr

1 5 10 15

Gly Arg Gln His Gly His Gly His Gly His Gly His Gly His Gly His

20 25 30

Gly His Gly Gly Met Arg Val Glu Ser His Thr Asp Asp Tyr Tyr Ser

35 40 45

Glu Gly Gly Glu Ile Asp Arg Gly Arg Arg Asn Asn Ser Met His Ser

50 55 60

Gln Glu Tyr Leu Met Arg Gln Gln Ser Gly His Gly Gly Tyr Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gln Gln Gln Glu Tyr Tyr Lys Arg Glu Glu Arg Glu His

85 90 95

Lys Gln Arg Glu Arg Val Gly Glu Ile Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ala

100 105 110

Phe Ala Leu Tyr Glu Gly His Gln Ala Lys Lys Asp Pro Ala Asn Ala

115 120 125

Gln Arg His Arg Ile Glu Gln Gly Val Ala Ala Val Ala Ala Val Gly

130 135 140

Ala Gly Gly Tyr Ala Tyr His Glu His Arg Glu Gln Lys Gln Ala Ser

145 150 155 160

Tyr Gly Ala Lys Glu Gln Gln Tyr Gly Tyr Ala Arg Met Pro Gln Gln

165 170 175

Gln Gly Tyr Tyr Cys Asn

180

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 根据水稻基因组数据库提供的水稻基因序列设计和人工合成，用作引物

<400> 3

caggcgcgcc atg acg gag tac tac tcc agc

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggtacc gtt gca gta gta gcc ctg ctg

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 根据克隆的水稻基因序列设计和人工合成，用作引物

<400> 5

ttggatcc ggc cag cag cag gag tac tac

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 根据克隆的水稻基因序列设计和人工合成，用作引物

<400> 6

ttctcgag gtt gca gta gta gcc ctg ctg

Claims

1.一种水稻抗病调控基因OsASR2在通过创制RNAi转基因水稻来获取抗病材料中的应用，其特征在于，在通过创制OsASR2-RNAi转基因水稻纯合系来获得针对水稻细菌性条斑病菌不同菌株的广谱抗病材料中的应用，所述水稻抗病调控基因OsASR2的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，该基因的开放阅读框长549 bp，编码的蛋白由182个氨基酸组成，其序列如SEQ ID NO：2所示，该蛋白包含ABA/WDS结构域，所述水稻细菌性条斑病菌为oxy04和ROS105。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）OsASR2基因RNAi结构的构建和获取

将OsASR2基因的一个特异性序列片段克隆入中间表达载体pENTR，再将重组结构pENTR-OsASR2与RNAi载体进行LR酶反应，获取RNAi结构pANDA-OsASR2；

（2）转化OsASR2基因RNAi结构的农杆菌的获取

将OsASR2基因RNAi结构通过电击方法转化对水稻具有强侵染能力的农杆菌菌株；

（3）转OsASR2基因RNAi结构水稻的创制和获取

通过农杆菌介导法将OsASR2基因RNAi结构导入水稻，获取转OsASR2基因RNAi结构的水稻；

（4）转OsASR2基因RNAi结构水稻纯合系的获取

分别以抗生素抗性和OsASR2基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转OsASR2基因RNAi结构的水稻纯合系；

（5）抗细菌病害的OsASR2-RNAi水稻纯合系的筛选鉴定和获取

以转OsASR2基因RNAi结构的水稻纯合系为材料，检测分析对各类细菌病原物所致病害的抗性，获取抗细菌病害的OsASR2-RNAi水稻。