CN117946996A - 粒型相关水稻蛋白OsCSLC2及其生物材料和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了粒型相关水稻蛋白OsCSLC2及其生物材料和应用。本发明提供了OsCSLC2蛋白或其编码基因在调控植物粒长和/或粒重和/或产量中的应用；抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达提高植物种子粒重、粒长和/或产量。本发明对OsCSLC2进行了基因编辑，获得了2个OsCSLC2基因编辑突变体，对突变体农艺性状的分析表明，其种子粒长和千粒重均比对照显著增加。表明OsCSLC2参与水稻种子粒长负调控，其功能缺失突变体的粒长增加，千粒重提高，为作物高产分子育种提供新的基因资源。
Description
技术领域
本发明属于遗传工程领域，涉及粒型相关水稻蛋白OsCSLC2及其生物材料和应用。
背景技术
种子的粒型是种子作物生产中的重要农艺性状之一，不仅影响种子产量，且为种子的外观品质，往往影响其商业价值。
半纤维素是几种不同类型多糖的混合物，与纤维素紧密结合，构成植物细胞初生壁。木葡聚糖是半纤维素的主要成分之一，其合成过程涉及糖基转移酶超基因家族中的多种成员。申请人在研究水稻乙烯传导途径时鉴定到纤维素合酶-Like C2，OsCSLC2(CELLULOSE SYNTHASE LIKE C2)，编码基因OsCSLC2(LOC_Os09g25900)为乙烯响应基因。尚未见报道此类蛋白与种子粒型相关。
发明内容
本发明的目的是提供粒型相关水稻蛋白OsCSLC2及其生物材料和应用。
第一方面，本发明提供了OsCSLC2蛋白或其编码基因在调控植物粒长和/或粒重和/或产量中的应用；
所述OsCSLC2蛋白为如下任一种：
A1)序列2所示的蛋白质；
A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且相同功能的蛋白质；
A3)将A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
第二方面，本发明提供了抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的物质，或，抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的活性或含量的物质在如下任一种的应用：
B1)提高植物种子粒重；
B2)提高植物种子粒长；
B3)提高植物种子产量；
B4)培育高粒重种子植物；
B5)培育高粒长种子植物；
B6)培育高产植物；
B7)制备提高植物种子粒重的产品；
B8)制备增加植物种子粒长的产品；
B9)制备提高植物产量的产品；
B10)植物育种和/或制备植物育种产品；
所述OsCSLC2蛋白为如下任一种：
A1)序列2所示的蛋白质；
A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且相同功能的蛋白质；
A3)将A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上文中，所述蛋白中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白中，序列2由个698个氨基酸残基组成。将其命名为OsCSLC2蛋白或蛋白质OsCSLC2或蛋白OsCSLC2。其编码基因为OsCSLC2基因。
所述OsCSLC2蛋白来源于水稻。
上文中，所述抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上文中，所述抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的物质为如下任一种：
C1)抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述基因的表达盒；
C4)含有C2)所述基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
上文中，所述抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的物质可抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白编码基因表达。抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。
所述基因敲除(gene knock out)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，C1)所示核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
所述RNA可为gRNA。
C1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的抑制或降低或下调蛋白质OsCSLC2编码基因OsCSLC2表达的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的抑制或降低或下调蛋白质OsCSLC2编码基因表达的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，且具有抑制或降低或下调蛋白质OsCSLC2编码基因表达的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述C4)中，所述重组载体可为用植物基因编辑载体。所述植物基因编辑载体的骨架可选择BGK032载体。
作为一个具体实施例，上述所述重组载体为重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1或BGK032-sgOsCSLC2-T2。
上述C5)所述的微生物可为农杆菌，所述农杆菌为EHA105。
上文所述核酸分子为靶向所述OsCSLC2蛋白编码基因的gRNA。
进一步地，所述gRNA的靶点为序列3(或序列1)的第363位核苷酸或序列3(或序列1)的第669位核苷酸。更进一步地，所述gRNA的靶序列为序列3或序列1第347-366位，或序列3或序列1第654-673位。
第二方面，本发明提供如下任一方法：
本发明提供了一种提高植物种子粒长和/或种子粒重和/或种子产量的方法，为如下E1)-E2)中任一种：
E1)包括如下步骤：通过敲除或抑制或降低或下调植物中第一方面中所述OsCSLC2蛋白的编码基因的表达，实现提高植物种子粒长和/或种子粒重和/或种子产量；
E2)包括如下步骤：通过敲除或抑制或降低或下调植物中第一方面中所述OsCSLC2蛋白的含量，实现提高植物种子粒长和/或种子粒重和/或种子产量。
或，本发明提供了一种培育高种子重量和/或高种子粒长和/或高产量植物的方法，为如下F1)-F2)中任一种：
F1)包括如下步骤：敲除或抑制或降低或下调出发植物中第一方面中所述OsCSLC2蛋白的编码基因的表达量，得到目的植物，所述目的植物的种子重量和/或种子粒长和/或产量高于所述出发植物；
F2)包括如下步骤：敲除或抑制或降低或下调出发植物中第一方面中所述OsCSLC2蛋白的含量，得到目的植物，所述目的植物的种子重量和/或种子粒长和/或产量高于所述出发植物。
上文所述方法中，所述敲除或抑制或降低或下调出发植物中第一方面中所述OsCSLC2蛋白的编码基因的表达量为向所述目的植物中导入以序列3为靶序列的基因敲除载体。
上文中，所述基因敲除***的骨架载体可以为BGK032载体。所述以序列3为靶序列的基因敲除***在本发明实施例中可为重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1或BGK032-sgOsCSLC2-T2。
或，本发明提供了一种培育高种子粒重和/或高产和/或高种子体积和/或高种子粒长的水稻的方法，包括如下步骤：将目的水稻的基因组进行如下任一操作：
K1)将目的水稻基因组序列表中序列3或对应于序列3的第363位胞嘧啶脱氧核糖核苷酸残基删除，得到高种子粒重和/或高产和/或高种子体积和/或高种子粒长的水稻；
K2)将目的水稻基因组序列表中序列3或对应于序列3的第669位鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸残基删除，得到高种子粒重和/或高产和/或高种子体积和/或高种子粒长的水稻。
上文所述应用或所述方法中，所述植物为如下任一种：
D1)双子叶植物或单子叶植物；
D2)禾本科植物；
D3)稻属植物；
D4)水稻，在本发明实施例中，以水稻品种日本晴为例。
上文中，所述种子粒长为成熟种子的长度。
本发明构建了OsCSLC2基因敲除载体：重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1和BGK032-sgOsCSLC2-T2。保持BGK032BGK032载体的其他序列不变，重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1是将gRNA靶点序列片段GGCTGATGTACGGGTTCATC整合到BGK032载体；重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T2是将gRNA靶点序列片段GATTGAAGGGGACCCGTTCA整合到BGK032载体。将重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1或BGK032-sgOsCSLC2-T2转入农杆菌EHA105感受态细胞,得农杆菌EHA105/p BGK032-sgOsCSLC2-T1或EHA105/p BGK032-sgOsCSLC2-T2。使用农杆菌EHA105/pBGK032-sgOsCSLC2-T1或EHA105/p BGK032-sgOsCSLC2-T2侵染水稻(日本晴,Nip)获得两种OsCSLC2基因敲除的纯合植株Oscslc2-1和Oscslc2-2。在温室和大田中种植Oscslc2-1和Oscslc2-2及其对照日本晴，结果表明，Oscslc2-1和Oscslc2-2的种子粒长和千粒重均显著高于其对照日本晴。表明，OsCSLC2负调控水稻种子长度和千粒重，降低OsCSLC2编码基因OsCSLC2的表达量可显著提高水稻种子长度(粒长)和千粒重。
本发明的实验证明，在研究水稻乙烯信号传导中发现OsCSLC2(LOC_Os09g25900)为乙烯响应基因。为进一步研究其功能，根据数据库中LOC_Os09g25900的序列，对OsCSLC2进行了基因编辑，获得了2个OsCSLC2基因编辑突变体，对突变体农艺性状的分析表明，其种子粒长和千粒重均比对照显著增加。表明OsCSLC2参与水稻种子粒长负调控，其功能缺失突变体的粒长增加，千粒重提高，为作物高产分子育种提供新的基因资源。
附图说明
图1为水稻OsCSLC2基因编辑的位点和靶点；图示以日本晴为本底的OsCSLC2两个基因编辑的位点和靶点。
图2为日本晴和突变体Oscslc2-1和Oscslc2-2中OsCSLC2的表达。
图3为水稻OsCSLC2基因编辑突变体与对照的粒型比较。A,20粒日本晴对照与突变体Oscsls2-1和Oscsls2-2种子的表型(比例尺为10mm)；B,日本晴与突变体Oscsls2-1和Oscsls2-2种子的长度、宽度和厚度；C,日本晴对照与突变体Oscsls2-1和Oscsls2-2种子的千粒重统计。OsCSLC2基因表达水平的数据代表平均值±SD(n＝3)。种子粒长统计的数据为平均值±SD(n≥20)，星号代表与相应对照存在显著性差异(***,P<0.001)，每组柱形图中从左到右依次为日本晴Nip、突变体Oscsls2-1和Oscsls2-2。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示。与日本晴比较，采用Two-tailed Student’s t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
水稻品种日本晴(O.Sativa L.spp.japonica，var nipponbare，AA genome，Nip)属粳亚种，记载于如下文献：傅秀林等,水稻品种日本晴,农业科技通讯,1973,2,11-15；由中国科学院遗传与发育生物学研究所朱立煌提供。
根癌农杆菌EHA105记载在下述文献中：Rodrigues SD,Karimi M,Impens L,VanLerberge E,Coussens G,Aesaert S,Rombaut D,Holtappels D,Ibrahim HMM,VanMontagu M,Wagemans J,Jacobs TB,De Coninck B,Pauwels L.,Efficient CRISPR-mediated base editing in Agrobacterium spp.,.Proc Natl Acad Sci U S A.2021Jan,12；118(2):e2013338118.doi:10.1073/pnas.2013338118.
基因编辑由百格生物科技有限公司(现名未米生物科技公司)完成，所用BGK032载体(货号为Cat#BGK032)由百格生物科技有限公司提供。
实施例1、水稻OsCSLC2及其编码基因OsCSLC2
日本晴OsCSLC2(LOC_Os09g25900)具有序列表中序列1的核苷酸序列，即为OsCSLC2基因编码基因(CDS)，含2097bp；该基因编码的蛋白命名为OsCSLC2。OsCSLC2蛋白含698个氨基酸残基，氨基酸序列为序列表中的序列2。OsCSLC2基因的基因组序列如序列3所示。
实施例2、水稻OsCSLC2基因编辑株系制备
1、BGK032-OsCSLC2基因编辑载体的构建
设计gRNA靶点序列，靶点设计原则如下：1)敲除位点处于编码区且尽量在ATG前端或重要功能结构域区；2)尽量涵盖更高比例的转录本；3)避免脱靶；4)优先选择编辑效率较高的靶点；5)序列GC含量适中且不易形成二级结构。本发明基因编辑为单基因(单靶点)敲除。用U6启动子进行驱动，构建到CRISPR/Cas9载体BGK032上，构建过程参考载体构建试剂盒(BGK032)。细菌抗性为卡那，植物抗性为潮霉素。
靶序列的选择：所选靶位点为靶位点OsCSLC2-1和靶位点OsCSLC2-2：
靶位点OsCSLC2-1：为序列3(或序列1)的第363位核苷酸；CRISPR/Cas9载体靶向后删除序列3(或序列1)第363位C；
靶位点OsCSLC2-2：为序列3(或序列1)的第669位核苷酸；CRISPR/Cas9载体靶向后删除序列3(或序列1)第669位G。
靶位点OsCSLC2-1和OsCSLC2-2在OsCSLC2编码基因OsCSLC2中的位置示于图1。
启动子的选择：使用水稻来源的OsU6启动靶位点。
含有靶位点的sgRNA表达盒的制备：(参考试剂盒说明操作)使用引物合成方法，直接合成靶序列。将合成的Oligo加水溶解至10μM，按比例混合反应体系后，在PCR仪上，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，获得引物二聚体，即为sgRNA。
具体为：将Sense-U6-T1和Anti-U6-T1加水溶解至10μM，按比例混合反应体系后，在PCR仪上，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，获得引物二聚体，即为sgRNA1。
将Sense-U6-T2和Anti-U6-T2加水溶解至10μM，按比例混合反应体系后，在PCR仪上，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，获得引物二聚体，即为sgRNA2。
线性化载体的制备：将BGK032载体使用Bsa I酶切线性化，得到线性化载体。
重组载体的制备：将上述制备的sgRNA1或sgRNA2分别与线性化载体混合，在连接酶作用下室温反应1小时，连接产物转化大肠杆菌，提取单克隆的质粒，送去测序，获得正确的重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1和BGK032-sgOsCSLC2-T2。
重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1含有sgRNA1的编码序列(GGCTGATGTACGGGTTCATC)，该载体表达sgRNA1，sgRNA1的靶序列为序列3或序列1第347-366位；
重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T2含有sgRNA2的编码序列(GATTGAAGGGGACCCGTTCA)，该载体表达sgRNA2，sgRNA2的靶序列为序列3或序列1第654-673位。
引物具体如下：
Sense-U6-T1：5’-TGATTGGGCTGATGTACGGGTTCATC-3’；
Anti-U6-T1：5’-AAACGATGAACCCGTACATCAGCCCA-3’；
Sense-U6-T2：5’-TGATTGGATTGAAGGGGACCCGTTCA-3’；
Anti-U6-T2：5’-AAACTGAACGGGTCCCCTTCAATCCA-3’；
2、OsCSLC2基因编辑植株Oscslc2-1和Oscslc2-2的获得
分别将上述制备的两种重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1和BGK032-sgOsCSLC2-T2通过电击转化的方法转到农杆菌EHA105菌株中，获得EHA105/重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1和EHA105/重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T2。EHA105/重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1和EHA105/重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T2分别为含有重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T1或重组载体BGK032-sgOsCSLC2-T2的农杆菌EHA105。
转化步骤：首先对发育成熟的水稻日本晴(Nip)种子进行脱壳，不要损伤到种胚，剔除表面发黑或发育不好的种子，将种子用75％酒精及2.5％次氯酸钠进行灭菌然后接入诱导培养基，愈伤组织处理28天后进行继代培养，用农杆菌介导的方法对水稻愈伤组织进行遗传转化，约8-10天后将愈伤组织接种到抗性培养基上进行筛选、分化、生根，长出幼苗。
将上述幼苗分别使用引物对idCas9CSLC2-363C和idCas9CSLC2-669G通过PCR产物测序的方法进一步确认，若各个扩增产物与野生型日本晴相比，基因组中OsCSLC2基因对应的区域发生了突变，则得到水稻编辑阳性转化株系；
将上述水稻编辑阳性转化株系自交2代，通过引物对idCas9CSLC2-363C和idCas9CSLC2-669G的PCR产物测序鉴定到纯合的株系，将其命名为Oscslc2-1和Oscslc2-2，即为两个基因编辑等位突变体。
靶基因鉴定引物：
idCas9CSLC2-363C cslc2-1-F：GACCATGGAGAGTCCCAACTA
cslc2-1-R:CCTGATCCTTCCCTGAACGGGT
idCas9CSLC2-669G cslc2-2-F:AATGCTCTCGTCGCTGGAAT
cslc2-2-R:CGAGCCGACTACATCAGGAG
水稻基因编辑由百格生物科技公司(现名未米生物科技有限公司)完成。
上述测序结果如下：
两个基因编辑等位突变体：
在Oscslc2-1中，与野生型日本晴相比，基因组中OsCSLC2基因对应的区域发生了突变：两条同源染色体中，在序列表中序列3第363位核苷酸C被删除，导致编码的蛋白从第120氨基酸开始移码翻译，并在之后第91个氨基酸后终止翻译。
在Oscslc2-2中，与野生型日本晴相比，基因组中OsCSLC2基因对应的区域发生了突变：两条同源染色体中，在序列表中序列3第669位核苷酸G被删除，导致编码的蛋白从第223氨基酸开始移码翻译，并在之后第42个氨基酸后终止翻译，从而将OsCSLC2基因敲除。
实施例3、OsCSLC2基因编辑材料的表型分析
(一)水稻日本晴OsCSLC2基因编辑材料的分子鉴定
将水稻日本晴Nip及OsCSLC2基因编辑突变体Oscslc2-1和Oscslc2-2种于盆中，分别提取其幼苗总RNA，进行反转录，得到Nip、Oscslc2-1和Oscslc2-2的cDNA，以反转录得到的cDNA作为模板(Nip、Oscslc2-1和Oscslc2-2的cDNA)。以水稻UBIQUITIN(LOC_Os05g06770)基因内标[以Primer-TF(5′-TCACCAGGCTCAGGAAGGAG-3′)和Primer-TR(5′-CAGATCAGAGCAAAGCGAGC-3′)作为内标检测引物]，以OsCSLC2-up(5‘-GCAGCGGAGAGGGATACAAA-3)和OsCSLC2-dp(5‘-TTGAGCAGACAAGAGGCTCC-3’)为特异性检测的引物进行Real Time-PCR鉴定日本晴Nip、Oscslc2-1和Oscslc2-2中OsCSLC2基因的表达量。
结果如图2所示，纵坐标为相对表达量，OsCSLC2基因的表达设为1.0，Nip中OsCSLC2基因相对表达量为1.0±0.035，而Oscslc2-1和Oscslc2-2中OsCSLC2基因的表达量分别为0.49±0.160和0.46±0.044，表明Oscslc2-1和Oscslc2-2中OsCSLC2的表达量极显著下降。
(二)Oscslc2田间表型初步分析
将日本晴Nip和突变体Oscslc2-1、Oscslc2-2种于大田，所有种子均分别种于3块0.2亩的田块中，待种子成熟后，单株收获的种子在37℃下，干燥一周，测量受体对照日本晴、Oscslc2-1和Oscslc2-2种子粒型和千粒重(即彻底干燥种子的千粒重)。每个等位突变体株系分别从3个田块中随机各选取5个单株的种子，每个单株称量100粒种子，再换算为千粒重，生物学实验重复三次，结果取平均值±标准差表示。与日本晴比较，采用Two-tailedStudent’s t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
农场：
试验地概况
2022年将Nip与Oscslc2-1和Oscslc2-2突变体在北京市中国科学院遗传与发育生物学昌平基地进行种植，试验具体地点位于北京市昌平区北七家镇七北路32号中国科学院遗传与发育生物学研究所，坐标：40°2′18″N，115°50′16″E。将上述日本晴与Oscslc2-1和Oscslc2-2种子进行下述种植。
日本晴和Oscslc2-1和Oscslc2-2种子种于大田，日本晴和Oscslc2-1和Oscslc2-2种子均随机选取自3块0.2亩的田块，行距20cm，株距15cm。
试验设计
实验采用随机区组设计，每个栽培区3次重复。每个小区的面积均为0.2亩。
栽培水稻
预处理土地
于2022年5月7日对土地进行深耕翻，疏松土壤除杂草，对土地进行灌溉
播种
本实施例于2022年5月12日播种，本实施例所有试验区播种在一天内完成。
插秧
于2022年6月12日插秧，在平整的试验地，先灌水，拉线以助于控制行距与株距，人工插秧。行距20cm，株距15cm，插深5cm。
田间管理
人工灌溉；定期进行杂草防除，采用人工拔除的方式，整个实验阶段没有施肥。
待水稻长生长至完熟期，日本晴及Oscslc2-1和Oscslc2-2各40株，单株收取种子，随机选取Nip与Oscslc2-1和Oscslc2-2成熟籽粒烘干至恒重，进行种子粒型和千粒重检测，实验重复生物学三次。籽粒带壳，进行20粒籽粒纵向排列长度(20粒长)比较。
结果如图3A所示，显示Oscslc2-1和Oscslc2-2籽粒长度大于对照Nip(比例尺为10mm)。
用游标卡尺(得力DL91150)对种子粒长、粒宽和粒厚进行测量统计，结果取平均值±标准差表示。
结果如图3B所示，与日本晴比较，采用Two-tailed Student’s t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。图3B纵坐标为毫米，显示Nip和Oscslc2-1和Oscslc2-2种子粒长平均约为7.3、7.7和7.7毫米，平均粒宽分别约为3.1、3.1和3.1毫米，平均粒厚分别约为2.2、2.2和2.2毫米，Oscslc2-1和Oscslc2-2突变体粒长极显著高于对照Nip，而粒宽和粒厚则与对照Nip无明显差异。
随机选取15株的Nip与Oscslc2-1和Oscslc2-2的种子，分别进行千粒重检测，结果取平均值±标准差表示。
结果如图3C所示，与日本晴比较，采用Two-tailed Student’s t-test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。图3C显示Nip与Oscslc2-1和Oscslc2-2的千粒重分别为23.1±0.5、23.8±0.4和24.9±0.6克，Oscslc2-1和Oscslc2-2种子千粒重极显著高于对照Nip。
上述结果说明Oscslc2-1和Oscslc2-2的粒长和粒重均大于对照日本晴，OsCSLC2负调控种子粒长和粒重。上述实验三个生物学实验重复统计。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.OsCSLC2蛋白或其编码基因在调控植物粒长和/或粒重和/或产量中的应用；
所述OsCSLC2蛋白为如下任一种：
A1)序列2所示的蛋白质；
A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且相同功能的蛋白质；
A3)将A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的物质，或，抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的活性或含量的物质在如下任一种的应用：
B1)提高植物种子粒重；
B2)提高植物种子粒长；
B3)提高植物种子产量；
B4)培育高粒重种子植物；
B5)培育高粒长种子植物；
B6)培育高产植物；
B7)制备提高植物种子粒重的产品；
B8)制备增加植物种子粒长的产品；
B9)制备提高植物产量的产品；
B10)植物育种和/或制备植物育种产品；
所述OsCSLC2蛋白为如下任一种：
A1)序列2所示的蛋白质；
A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且相同功能的蛋白质；
A3)将A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的物质为如下任一种：
C1)抑制或降低或下调OsCSLC2蛋白的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述基因的表达盒；
C4)含有C2)所述基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为靶向权利要求1中所述OsCSLC2蛋白编码基因的gRNA。
5.根据权利要求1-4中任一所述应用，其特征在于：所述植物为如下任一种：
D1)双子叶植物或单子叶植物；
D2)禾本科植物；
D3)稻属植物；
D4)水稻。
6.一种提高植物种子粒长和/或种子粒重和/或种子产量的方法，为如下E1)-E2)中任一种：
E1)包括如下步骤：通过敲除或抑制或降低或下调植物中权利要求1或2中所述OsCSLC2蛋白的编码基因的表达，实现提高植物种子粒长和/或种子粒重和/或种子产量；
E2)包括如下步骤：通过敲除或抑制或降低或下调植物中权利要求1或2中所述OsCSLC2蛋白的含量，实现提高植物种子粒长和/或种子粒重和/或种子产量。
7.一种培育高种子重量和/或高种子粒长和/或高产量植物的方法，为如下F1)-F2)中任一种：
F1)包括如下步骤：敲除或抑制或降低或下调出发植物中权利要求要求1或2中所述OsCSLC2蛋白的编码基因的表达量，得到目的植物，所述目的植物的种子重量和/或种子粒长和/或产量高于所述出发植物；
F2)包括如下步骤：敲除或抑制或降低或下调出发植物中权利要求要求1或2中所述OsCSLC2蛋白的含量，得到目的植物，所述目的植物的种子重量和/或种子粒长和/或产量高于所述出发植物。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述敲除或抑制或降低或下调出发植物中权利要求要求1或2中所述OsCSLC2蛋白的编码基因的表达量为向所述目的植物中导入以序列3为靶序列的基因敲除载体。
9.一种培育高种子粒重和/或高产和/或高种子体积和/或高种子粒长的水稻的方法，包括如下步骤：将目的水稻的基因组进行如下任一操作：
K1)将目的水稻基因组序列表中序列3或对应于序列3的第363位胞嘧啶脱氧核糖核苷酸残基删除，得到高种子粒重和/或高产和/或高种子体积和/或高种子粒长的水稻；
K2)将目的水稻基因组序列表中序列3或对应于序列3的第669位鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸残基删除，得到高种子粒重和/或高产和/或高种子体积和/或高种子粒长的水稻。
10.根据权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述植物为如下任一种：
D1)双子叶植物或单子叶植物；
D2)禾本科植物；
D3)稻属植物；
D4)水稻。
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