CN117757836A - OsHR突变型基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了OsHR突变型基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用。本发明还公开了基于CRISPR/Cas9技术快速获得褐飞虱抗性水稻的方法。本发明挖掘了OsHR的新功能，从水稻基因组中找到编辑该基因的靶序列，构建到适用于单子叶水稻的基因编辑载体中，利用农杆菌侵染愈伤组织法获得突变体植株。对突变体水稻进行基因突变类型、抗虫性以及表型差异检测。结果表明：OsHR突变体水稻能够显著提高对褐飞虱的抗性。对于一些需要提高抗虫性的其它植物，可以通过敲除该基因的同源基因的方式培育一些新品种，对于植物育种具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于农业科学技术领域的应用领域，具体涉及OsHR突变型基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用。
背景技术
褐飞虱Nilaparvata lugens属半翅目(Hemiptera)飞虱科(Delphacidae)，是亚洲国家最主要的水稻害虫之一。由于其繁殖能力强、发生世代多、可远距离迁飞及高环境适应力等生物学特性，具备在我国水稻产区内暴发成灾的潜力，严重制约水稻产量(程遐年等,2003)。因此，如何有效地压低褐飞虱种群规模成为了我国绿色控虫的重大战略需求。当前对褐飞虱的防治措施主要是依赖于化学杀虫剂，它们的长期过量使用不仅污染环境和危害人类健康，而且促使害虫产生抗药性造成更大的经济成本和防控难度。抗虫品种的培育被认为是当前最为经济有效的防治措施。
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)是近年来迅速发展起来的一种由RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行高效编辑的技术。在这一***中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶位点处切断双链DNA。之后，细胞内的DNA修复***通过同源重组或非同源末端连接修复双链断裂方式，导致核酸序列错配、***、缺失以实现对目标基因的定点编辑。该技术已经从根本上影响了农业、生物技术和生物医学等许多领域，目前在农业研究领域主要涉及农作物的产量、品质、抗逆等农艺性状的改良。
发明内容
发明目的：本发明通过转录组结合蛋白组数据从水稻叶鞘中筛选到1个显著受褐飞虱取食抑制的未知功能基因OsHR，进一步通过借助CRISPR/Cas9基因编辑技术，实现抗虫水稻品种的精准高效选育。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：OsHR突变型基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用。
其中，所述OsHR突变型基因的突变类型包括碱基置换、移码突变、缺失突变或***突变中的一种或几种。
其中，所述OsHR突变型基因采用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到。
其中，OsHR基因的野生型基因序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的mRNA序列和蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明内容还包括基于CRISPR/Cas9技术快速获得褐飞虱抗性水稻的方法，所述方法为设计用于编辑OsHR基因的sgRNA识别位点的靶序列，将其构建CRISPR/Cas9-OsHR基因编辑载体，将该载体转化水稻获得褐飞虱抗性水稻。
其中，所述的sgRNA识别位点的靶序列为SEQ ID NO.4所示。sgRNA识别位点的靶序列为：ATGGGCTTCCTGTCCTTCGCCGG。
其中，所述CRISPR/Cas9-OsHR基因编辑载体的构建方法如下：通过正反向引物克隆sgRNA靶点序列并连接到基因编辑载体中得到，所述正反向引物序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
正反向引物(HR-F：5’-ACTATGGTCTCGGCCGATGGGCTTCCTGTCCTTCGC-3’，HR-R：5’-ACTATGGTCTCTTAAACGCGAAGGACAGGAAGCCCAT-3’)。
本发明通过正反向引物克隆上述sgRNA靶点片段，利用T4连接酶成功构建到基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9pubi-H中，遗传转化水稻日本晴后获得Oshr被成功敲除的突变体植株。所述基因编辑载体可通过使用农杆菌介导的常规生物学方法转化植物种子愈伤组织，并将转化的愈伤组织培育成植株。
本发明内容还包括鉴定所述的方法获得的水稻是否具备褐飞虱抗性的方法，鉴定所述植株是否包含sgRNA识别位点的靶序列，所述sgRNA识别位点的靶序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述鉴定的特异性引物序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
特异性引物(FHR-test-F：5’-TGTATTCACAAGGTGCAAAGAG-3’，FHR-test-R：5’-TCTCCTCCATAACAATCTGACG-3’)。
鉴定方法中，依据DNA提取试剂盒操作步骤提取突变体水稻叶片DNA，在靶序列上下游200bp左右处设计特异性引物(FHR-test-F：5’-TGTATTCACAAGGTGCAAAG AG-3’，FHR-test-R：5’-TCTCCTCCATAACAATCTGACG-3’)，扩增包含靶序列在内的目的片段(片段大小970bp)后测序。最终通过序列比对鉴定获得的突变体植株。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明挖掘了OsHR的新功能，从水稻基因组中找到编辑该基因的靶序列，构建到适用于单子叶水稻的基因编辑载体中，利用农杆菌侵染愈伤组织法获得突变体植株。对突变体水稻进行基因突变类型、抗虫性以及表型差异检测。结果表明：OsHR突变体水稻能够显著提高对褐飞虱的抗性。对于一些需要提高抗虫性的其它植物，可以通过敲除该基因的同源基因的方式培育一些新品种，对于植物育种具有重大的应用价值。
附图说明
图1OsHR在褐飞虱取食水稻不同时间点的mRNA表达水平(**表示处理组与对照组间呈现出极显著差异)；
图2Oshr突变体水稻中编码OsHR蛋白的氨基酸序列；
图3Oshr突变体水稻抗虫性测定(**表示处理组与对照组间呈现出极显著差异)。(A)蜜露分泌量；(B)若虫存活率；(C)雌成虫选择性及产卵量；
图4Oshr突变体水稻生长发育参数测定(**表示处理组与对照组间呈现出极显著差异)。(A)发芽率；(B)根长；(C)株高；(D)分蘖数；(E)千粒重；
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
OsHR在褐飞虱取食水稻不同时间点的mRNA表达水平检测。包括以下步骤：选取生长50天的秀水11水稻(种子来源于嘉兴市农业科学研究院)，茎秆基部固定一个圆筒形玻璃罩(高8cm，直径4cm，筒壁均匀分布48个直径为0.88mm的小孔)，在玻璃罩内接入20头怀卵的雌成虫，顶部以海绵密封。分别在1，3，8，24和48h剪取取食部位的最外面3层叶鞘，提取RNA。生物学重复3次，每个生物学重复来自5个植株混样。在20μL反转录体系中加入1μg RNA进行反转录，并用TB GreenTM Premixc Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa，Otsu，日本)进行qPCR检测。qPCR反应程序:95℃30s、95℃5s以及60℃30s进行40个循环，OsHR基因定量引物为(F：5’-AAAAGCTCTCCAGCCGAAGT-3’，R：5’-TGCGCAATTCTGTGCAAACT-3’)。选用水稻actin基因(F：5’-CTGGTATTGCTGACCGTATF-3’，R：5’-GTTGGAAGGTGCTAAGGGA-3’)作为内参，并将相同时间点未取食水稻的Ct值作为对照，用2-ΔΔCt法计算OsHR RNA相对表达量。结果显示：在取食的1，3，8，24和48h时间点，OsHR基因的表达水平极显著低于未取食水稻组，表明OsHR负调控水稻对褐飞虱的抗性(图1)。
实施例2
OsHR突变体水稻的获得及突变类型检测，包括以下步骤：
(1)构建OsHR突变体。本发明通过正反向引物克隆sgRNA靶点序列，反应体系如下：正反向引物各5μl(HR-F：5’-ACTATGGTCTCGGCCGATGGGCTTCCTGTCCTTCGC-3’，HR-R：5’-ACTATGGTCTCTTAAACGCGAAGGACAGGAAGCCCAT-3’)、1M NaCl 5μl、1MTris-HCl(pH7.4)2.5μl以及H2O 32.5μl，共50μl体系按照95℃变性4min和0.3℃/s梯度降温进行退火处理(95℃1min，85℃1min，75℃1min，65℃1min，55℃1min，45℃1min，35℃1min，25℃1min，16℃1h)，使正反向引物形成双链即为sgRNA片段。
其次，将制备的sgRNA片段利用T4连接酶(NEB，货号：E1601S/L)构建到基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9pubi-H(来源于华南农业大学馈赠，文章发表于A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot andDicot Plants)中，酶切连接体系按Golden Gate Assembly Kit试剂盒说明书进行：T4 DNA Ligase Buffer 2μl，NEB Golden Gate Enzyme Mix(BsaI-HFv2)1.5μl，pYLCRISPR/Cas9pubi-H 150ng，sgRNA片段30ng，加Nuclease-free H2O至20μl，在37℃孵育5min后，置于60℃孵育5min。
之后，将上述连接转化后的载体转化DH5α大肠杆菌感受态，培养后选择测序正确质粒电转农杆菌EHA105后侵染水稻日本晴种子愈伤组织，经分化生根后，将水稻苗移栽到盆钵中培养。在生长到3叶期(约20天后)提取叶片DNA，使用OsHR的检测引物(FHR-test-F：5’-TGTATTCACAAGGTGCAAAGAG-3’，FHR-test-R：5’-TCTCCTCC ATAACAATCTGACG-3’)克隆目的片段，并将该产物送至公司测序。测序结果显示(表1)：我们的T0代总共获得了10株水稻苗，突变率为80％，纯合突变率为40％。对这10株水稻苗与野生型进行编辑靶点序列比对发现：2个株系无突变(Oshr-2和Oshr-14)；1个株系在靶位点处发生碱基大片段删除的纯合突变(Oshr-4)；3个株系在靶位点发生碱基***纯合突变(Oshr-5、Oshr-15和Oshr-21)；4个株系在靶位点处发生杂合突变(Oshr-6、Oshr-9和Oshr-10和Oshr-18)。随后我们选择与未突变水稻(WT)无显著表型差异的阳性纯合突变体水稻Oshr-4和Oshr-15进行多代培养，收获T3代种子进行后续试验。这两种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止，由原来的158个氨基酸缩短为19或24个氨基酸，且它们的氨基酸序列发生变化(图2)。
表1
实施例3
Oshr突变体水稻抗虫性测定，采用实施例2获得的T2代纯合阳性突变体水稻(Oshr-4和Oshr-15)和亲本水稻(WT)进行试验，包括以下步骤：
(1)褐飞虱蜜露分泌量的测定(通过检测褐飞虱雌成虫在水稻上的单雌蜜露分泌量来评价取食量大小)。具体操作简述如下：在水稻茎秆基部固定一只预先用万分之一天平称重过的Parafilm折叠小袋(6cm×5cm)，并在每只小袋中放入1头初羽化的短翅雌成虫。取食24h后取下小袋并移除袋中褐飞虱后再次称重，两次称重差值即为飞虱***的蜜露量。WT作为对照进行相同处理，本实验重复10次。结果显示：褐飞虱在突变体水稻上的取食量显著低于WT(图3A)。
(2)褐飞虱存活率的测定。具体方法简述如下：在Oshr突变体水稻或WT水稻的茎秆基部套1个圆筒形玻璃罩(高8cm，直径4cm，筒壁均匀分布48个直径为0.88mm的小孔)，顶部以海绵密封。接入20头褐飞虱3龄若虫，连续观察7d并记录活虫数，计算存活率。本实验重复10次。结果显示：褐飞虱在突变体水稻上的若虫存活率显著低于WT(图3B)。
(3)褐飞虱雌成虫选择性及产卵量测定。为了研究抑制OsHR基因表达对褐飞虱抗性的影响，把Oshr突变体水稻和WT水稻(生长约50天的植株，苗间距为1cm。)同时暴露于15头褐飞虱怀卵雌成虫中间，分别于1、2、4、8、24和48h统计褐飞虱在水稻上的数目。72h后，去除所有褐飞虱，统一剪掉产卵部位茎秆，在显微镜下计数每株水稻苗上产卵量，本试验重复10次。结果显示：褐飞虱更喜欢在WT植株上取食和产卵(图3C、3D)，表明敲除水稻中OsHR影响了对褐飞虱的抗性。
实施例4
Oshr突变体水稻农艺性状测定。采用实施例2获得的T2代纯合阳性突变体水稻(Oshr-4和Oshr-15)和亲本水稻(WT)进行试验，包括以下步骤：选取颗粒饱满的上述水稻品系种子遮光保湿发芽，5d后测定发芽率，且在催苗20d后使用卷尺测量根长。之后转移至玻璃温室中培养至成熟期，在成熟期测定株高、分蘖数及千粒重。结果显示：突变体水稻Oshr-4和Oshr-15水稻的发芽率(图4A)、根长(图4B)、株高(图4C)、分蘖数(图4D)和千粒重(图4E)与WT间没有显著差异，表明敲除OsHR对水稻的表型无显著影响。
Claims (10)
1.OsHR突变型基因在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsHR突变型基因的突变类型包括碱基置换、移码突变、缺失突变或***突变中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsHR突变型基因采用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，OsHR基因的野生型基因序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的mRNA序列和蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2所示。
5.基于CRISPR/Cas9技术快速获得褐飞虱抗性水稻的方法，其特征在于，所述方法为设计用于编辑OsHR基因的sgRNA识别位点的靶序列，将其构建CRISPR/Cas9-OsHR基因编辑载体，将该载体转化水稻获得褐飞虱抗性水稻。
6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得褐飞虱抗性水稻的方法，其特征在于，所述的sgRNA识别位点的靶序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得褐飞虱抗性水稻的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9-OsHR基因编辑载体的构建方法如下：通过正反向引物克隆sgRNA靶点序列并连接到基因编辑载体中得到，所述正反向引物序列如SEQ ID NO. 5或SEQ IDNO. 6所示。
8.根据权利要求7所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得褐飞虱抗性水稻的方法，其特征在于，所述基因编辑载体为pYLCRISPR/Cas9pubi-H。
9.鉴定权利要求5~8任一项所述的方法获得的水稻是否具备褐飞虱抗性的方法，其特征在于，鉴定所述植株是否包含sgRNA识别位点的靶序列，所述靶序列如SEQ ID NO.4所示。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述鉴定的特异性引物序列如SEQ IDNO. 7或SEQ ID NO. 8所示。
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