CN117940772A - 使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体的夹心免疫测定装置 - Google Patents
使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体的夹心免疫测定装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种侧向流测定装置,所述侧向流测定装置包括测试条,所述测试条用以接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测所述外泌体的表面上的目标分析物的存在情况。所述测试条包括含有与标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白结合试剂的缀合物垫。每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂被配置为与对应类型的外泌体四次穿膜蛋白结合并且形成包含外泌体的免疫复合物。所述缀合物垫与膜流体连接。所述膜包括包含针对目标分析物的固定化结合试剂的测试线。针对所述目标分析物的所述固定化结合试剂被配置为与包含所述外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的所述目标分析物的蛋白质结合。
Description
对先前申请的权益要求
本申请要求于2021年5月18日提交的美国临时专利申请序列第63/189,682号的权益。美国临时专利申请第63/189,682号的内容通过引用并入本文。
背景技术
免疫测定装置是用于进行检测样品流体中目标分析物的存在(或不存在)的测试的装置。免疫测定装置包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)装置、侧向流测定(LFA)装置等。免疫测定装置可具有不同的形式。夹心形式的免疫测定装置使用两组抗体来捕获和检测目标分析物。竞争性免疫测定装置可用于检测无法同时结合至两种抗体的分析物。
夹心形式的ELISA装置包括具有一组孔(例如,96个孔、384个孔、1536个孔等)的微板。捕获抗体结合至微板的孔底部,并且结合至目标分析物的一个表位(如果有)。然后,检测抗体在不同的表位处结合至目标分析物,并且缀合至能够检测的酶。检测抗体上的酶可与底物相互作用以产生颜色变化。
LFA(也称为侧向流免疫层析测定或侧向流试纸免疫测定)装置通常包括一系列用于转运流体的毛细管垫。现有技术的夹心形式的LFA装置用于检测能够结合至至少两种不同抗体的分析物。在现有技术的夹心形式的LFA装置中,样品垫可用于接收可能包含目标分析物的一定量的流体(称为样品流体)。然后通过毛细管作用将样品流体转运至相邻的缀合物垫。该缀合物垫可含有用检测器诸如胶体金纳米颗粒标记的溶解的抗体。抗体对样品流体中的感兴趣的目标分析物具有特异性。当样品流体流动通过缀合物垫时,样品流体中的分析物(如果有)与缀合物垫上的带标记的抗体结合并且形成免疫复合物。
然后该免疫复合物从缀合物垫流入相邻的膜(或膜垫)中。该膜具有测试区域或测试线,该测试区域或测试线含有固定化未标记抗体。当免疫复合物在测试区域上移动时,该免疫复合物与测试区域上的固定化抗体结合,得到有色测试线。当样品流体不包含目标分析物时,在缀合物垫上不形成免疫复合物,并且无免疫复合物与测试区域上的固定化抗体结合。因此,测试线不改变颜色。
LFA装置还可包括膜上的对照线。在夹心测定形式中,对照线可含有固定化抗体,该固定化抗体结合至用检测器标记的游离抗体,得到有色对照线,其确认测试已正确运行(无论样品中是否已经存在目标分析物)。
在竞争性ELISA装置中,参考目标分析物结合至微板孔的底部。然后将样品和抗体添加至孔中,并且如果样品中存在目标分析物,则目标分析物与参考目标分析物竞争与抗体的结合。然后洗去未结合的材料。样品中的目标分析物越多,则由参考目标分析物最终结合至孔底部的抗体越少,并且信号越低。
竞争形式的LFA装置中的样品垫和缀合物垫与夹心形式的LFA装置中的样品垫和缀合物垫类似。在竞争测定形式中,测试线含有固定化分析物分子。如果样品液体不含有分析物,则带标记的抗体从缀合物垫流入测试线中并且结合至测试线处的分析物,得到有色测试线,其表明样品液体中缺乏目标分析物。另一方面,如果样品液体中存在目标分析物,则分析物结合至缀合物垫上的带标记的抗体,并且阻止该带标记的抗体结合至测试线处的分析物,导致测试线上缺乏颜色。在竞争测定形式中,对照线可含有固定化分析物,该固定化分析物结合至用检测器标记的游离抗体,得到有色对照线,其确认测试已正确运行(无论样品中是否已经存在目标分析物)。
附图说明
现在将详细讨论使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体的本发明的夹心免疫测定装置的各种实施例,其中重点突出有利的特征。这些实施例描绘了新颖且非显而易见的使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体的夹心免疫测定装置,如附图中所示,这些附图仅用于例示性目的。这些附图包括以下图,其中类似的标号指示类似的部件:
图1A至1D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为检测抗体,并且使用对目标分析物具有特异性的抗体作为捕获抗体;
图2示出根据现有技术的对某些肿瘤具有特异性的外泌体蛋白质的实例;
图3A至3F为示出根据本公开的各个方面的LFA装置和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为检测抗体,并且包括用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的多条测试线;
图4A至4D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为检测抗体,并且包括多个条,该多个条具有用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的多条测试线;
图5A至5D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对目标分析物具有特异性的抗体作为检测抗体并且使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为捕获抗体;
图6A至6F为示出根据公开的各个方面的LFA装置和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对目标分析物具有特异性的抗体作为检测抗体,并且包括用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的多条测试线;
图7A至7D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对目标分析物具有特异性的抗体作为检测抗体,并且包括多个测试条,所述多个测试条具有用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的多条测试线;
图8A至8I为示出根据本公开的各个方面的ELISA装置和方法的功能图,该ELISA装置和方法通过使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体以及对目标分析物具有特异性的固定化抗体来检测和捕获目标分析物;并且
图9A至9I为示出根据本公开的各个方面的ELISA装置和方法的功能图,该ELISA装置和方法通过使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的固定化抗体以及对目标分析物具有特异性的抗体来检测和捕获目标分析物。
具体实施方式
本发明的实施例的一个方面包括认识到夹心形式的免疫测定需要两种对目标分析物具有特异性的抗体,使得这些抗体在很大程度上附接至目标分析物而不附接至其他分子。否则,也附接至抗体的其他分子可能成为错误的来源。然而,对于一些目标分析物,可以只存在一种特异性抗体。一种检测这些目标分析物的存在(或不存在)的技术是使用竞争形式的测定装置。然而,竞争形式的测定装置不如夹心形式的测定装置准确。竞争形式的测定装置的另一个缺点是需要具有物理目标分析物材料本身,以便将其用作板底部的参考目标分析物(对于ELISA装置)以及在测试线上使用该目标分析物材料(对于LFA装置)。
本发明的一些实施例通过使用抗体捕获样品液体中的外泌体来解决上述问题。外泌体是从细胞中释放的细胞外囊泡。外泌体可能含有不同蛋白质,具体取决于其宿主细胞。最常见的外泌体标志物蛋白包括四次穿膜蛋白,诸如CD9、CD63、CD81和CD82,它们存在于外泌体的表面上。外泌体还可能携带来自释放它们的细胞的标志物。对于一些目标分析物,诸如例如但不限于癌细胞的蛋白质,由细胞释放的外泌体可能包括作为测定的目标的蛋白质的标志物。
本发明的一些实施例提供了一种方法和免疫测定装置,该方法和免疫测定装置接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测外泌体的表面上的目标分析物的存在。该免疫测定装置包括检测位点和捕获位点。该方法和免疫测定装置进行检测位点与捕获位点之间的流体转移。流体在发生检测动作的位点与发生捕获动作的位点之间转移的机制可以是通过毛细管作用(例如,LFA装置或微流体装置)、微流体芯片或介质、自动化液体处理***(例如,自动化ELISA装置中使用的液体处理)、与微流体装置结合的自动化液体处理***、或手动转移(诸如标准ELISA中使用的移液程序)。在这些免疫测定装置中的一些免疫测定装置中,检测动作和捕获动作在装置上的不同位点上进行。例如,在LFA装置中,检测动作在缀合物垫上进行并且捕获动作在一条或多条测试线上进行。在这些免疫测定装置中的一些免疫测定装置中,检测动作和捕获动作可在装置的同一位点上进行。例如,在ELISA装置中,检测动作和捕捉动作可在ELISA装置的同一孔中进行。
本发明一些实施例的免疫测定装置通过使用针对四次穿膜蛋白(诸如CD9蛋白质、CD63蛋白质、CD81蛋白质、CD82蛋白质等)的结合试剂来进行检测动作,以检测样品流体中的外泌体。这些免疫测定装置可使用一种或多种外泌体结合试剂。不同外泌体可结合至针对CD9、CD63、CD81、CD82等蛋白质的一种或多种结合试剂。这些免疫测定装置通过使用对目标分析物具有特异性的第二结合试剂(例如,抗体)来进行捕获动作,该第二结合试剂用于固定和捕获携带目标分析物的外泌体。
本发明一些实施例的免疫测定装置通过使用对目标分析物特异的结合试剂(例如,抗体)来进行检测动作,以检测样品液体中的目标分析物。这些免疫测定装置通过使用对四次穿膜蛋白(诸如CD9蛋白质、CD63蛋白质、CD81蛋白质、CD82蛋白质等)的一种或多种结合试剂(例如,抗体)来进行捕获动作,以固定并且捕获携带目标分析物的外泌体。不同外泌体可结合至针对CD9、CD63、CD81、CD82等蛋白质的一种或多种抗体。
这些方法和免疫测定装置的若干非限制性实例在第I节参考LFA装置并且在第II节参考ELISA装置进行描述。其余详细描述参考附图来描述本发明的实施例。在附图中,附图标记标注本发明的实施例的元件。下文结合对应附图特征的讨论再现这些附图标记。
I.通过使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体来捕获目标分析物的LFA装置
图1A至1D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置100和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为检测抗体,并且使用对目标分析物具有特异性的抗体作为捕获抗体。LFA装置100可为便携式装置(例如,手持式装置或台式装置),其用于分析样品流体190(也称为基质)以确定一种或多种分析物(称为目标分析物)的存在和/或量。术语分析物是指通过免疫测定装置检测的分子。
参考图1A至1D,LFA装置100可包括可更换盒,该可更换盒可能旨在用于一次性使用。例如,图1A至1D所示的组件可为LFA装置100的一次性盒的一部分。LFA装置100可包括背衬卡140,该背衬卡可用于组装样品垫150、缀合物垫110、膜115和/或芯吸垫120的不同部分。
在一些实施例中,背衬卡140可为位于垫150、110、115和120下方的连续件。在其他实施例中,每个垫可具有单独的背衬卡。例如,在装置制造期间,可使用背衬材料的卷或片,使得该卷或片的宽度与侧向流测定盒的长度(即,在图示的取向上,从样品垫150的左端到芯吸垫120的右端)。然后将垫115、110、150和120以适当的重叠方式放置到背衬卡上(例如,如图1A至1D所示)。这些垫可例如用双面胶带或胶连接至背衬卡。然后可将垫以及所附接的背衬卡切割成单独的条,并且每个条可用于制备不同的LFA装置。
替代性地,每个垫可单独连接至对应的背衬卡。然后,可将带有对应的背衬卡的垫以适当的重叠方式彼此组装在一起以制备LFA装置。LFA装置100可包括壳体。在图1A至1D中,为了清楚起见,仅示出包括盒床层170的壳体的一部分。
施加至LFA装置100的样品流体190可包括人类或动物体液,诸如例如但不限于血液、尿液、血清、血浆、唾液、汗液、乳汁、粘液、***、***或尿道分泌物、脑脊液等中的一种或多种。样品可天然地为液体,可为用另一种液体(诸如水)稀释的液体,或者可最初呈固体形式(例如,组织样品)并且经处理成液体形式以施加至LFA装置100。在本公开的实施例中的一些实施例中,目标分析物可为以下物质,诸如例如但不限于:蛋白质、半抗原、酶、激素、传染病病原体、免疫球蛋白、多核苷酸、类固醇、药物、核酸、基因突变标志物、抗原、简单有机分子等。
LFA装置100可包括样品垫(也称为样品条或样品接收构件)150。样品垫150可由天然和/或合成的多孔、微孔、介孔或大孔材料制成,这些材料能够接收样品流体并且通过毛细管作用将样品流体横向引导至缀合物垫110。样品垫150可由以下材料制成,诸如例如但不限于:纤维素、硝化纤维素、纸、二氧化硅、棉花、玻璃(例如,玻璃纤维)或合成材料(例如,聚酯、聚乙烯、聚合物、人造丝、尼龙等)。根据样品的类型不同(例如,尿液、唾液、血液、血清、血浆、汗液、乳汁、粘液、***、***或尿道分泌物、脑脊液等),样品垫150可通过缓冲液(例如,有机化合物,诸如tris或三(羟基甲基)氨基甲烷)处理以降低样品变异性(pH、蛋白质浓度、粘度、盐浓度等)。在样品垫150制造期间,可将缓冲液化合物包被、浸渍或者以其他方式施加或沉积到样品垫150上,然后干燥。样品流体包括血液的实施例可包括血浆过滤器195。
LFA装置100可包括与样品垫150流体连接(即,能够通过毛细管作用接收流体)的缀合物垫110。在所描绘的实施例中,样品垫150与缀合物垫110接触并且部分地覆盖该缀合物垫。在其他实施例中,样品垫150可与缀合物垫110更多地接触或更少地接触,以便分别提供更慢或更快的结合试剂和/或缀合物释放。施加至样品垫150的样品流体可通过毛细管作用从样品垫150横向转移到缀合物垫110。
缀合物垫110可由天然和/或合成的多孔、微孔、介孔或大孔材料制成,这些材料能够接收来自样品垫150的样品流体。缀合物垫110可由以下材料制成,诸如例如但不限于:玻璃(例如,玻璃纤维)、纤维素、硝化纤维素、纸、二氧化硅、棉花或合成材料(例如聚酯、聚乙烯、聚合物、人造丝、尼龙等)。
在图1A至图1D的实例中,样品流体190可为流体,诸如例如但不限于血液、尿液、血清、血浆、唾液、汗液、乳汁、粘液、***、***或尿道分泌物、脑脊液。如图1A的放大图141所示,除其他组分外,样品流体190可包括外泌体135。当样品流体190包括血液时,其他组分198可包括例如红细胞、白细胞、血小板、血浆等。
外泌体135是由大多数细胞产生的细胞外囊泡。外泌体可存在于血液、尿液或脑脊液中。外泌体也可在体外由培养的细胞释放到其生长培养基中。外泌体的直径通常在30纳米(nm)至150nm之间。在恶性肿瘤诸如癌症中,由癌细胞释放的外泌体可包括可用作目标分析物以诊断癌症的蛋白质。
如图1A的放大图142所示,根据宿主细胞不同,外泌体135可含有大量不同的蛋白质。外泌体的组分通过细胞状态(例如,特定途径的应激、活化或抑制)来进一步调节。四次穿膜蛋白,诸如CD9 156、CD63 157、CD81 158和CD82(未示出),是最常见的经典外泌体标志物蛋白,并且/或者其他类型的四次穿膜蛋白可能存在于外泌体的表面上。哺乳动物中存在34种四次穿膜蛋白,其中33种已在人体内鉴定出来。放大图142中所示的四次穿膜蛋白159是指哺乳动物中34种四次穿膜蛋白中的任一者,包括但不限于CD9 156、CD63 157、CD81158和CD82。
外泌体的其他组分138可包括不同的酶、脂质、转录因子、细胞骨架等。如果外泌体是由恶性肿瘤或感染的细胞释放的,则外泌体还可含有蛋白质137,这些蛋白质可用作一般标志物来鉴定恶性肿瘤。由恶性肿瘤或感染的细胞释放的外泌体还可含有肿瘤特异性蛋白质194,这些肿瘤特异性蛋白质可用于鉴定特定的肿瘤。由器官释放的外泌体可含有器官特异性蛋白196,这些器官特异性蛋白质可用于鉴定器官。
相同类型的多种四次穿膜蛋白(例如,多种CD9标志物蛋白156、多种CD63标志物蛋白157、多种CD81标志物蛋白158、多种CD82标志物蛋白等)、不同类型的多种四次穿膜蛋白、和/或多种目标分析物蛋白137可存在于单个外泌体135上。如本文所述,本发明的实施例的免疫测定可使用外泌体来捕获和鉴定目标分析物137,诸如与不同恶性肿瘤相关的蛋白质(或其他标志物)。
如图1A的放大图143所示,缀合物垫110可含有一种或多种不同类型的结合试剂176至179,这些结合试剂能够结合至样品流体190中的外泌体135的表面上的不同类型的四次穿膜蛋白156至159。结合试剂可为例如但不限于不同类型的四次穿膜蛋白抗体。尽管本文使用了四次穿膜蛋白抗体、目标分析物抗体、肿瘤特异性蛋白质抗体和器官特异性蛋白质抗体的若干实例,但应当指出的是,本发明的实施例的LFA装置中的一些LFA装置可在缀合物垫上、测试线上和/或对照线上使用并非抗体的结合试剂。
除针对三种类型的四次穿膜蛋白156至158的抗体176至178之外或代替这些抗体,缀合物垫110可包括针对其他类型的外泌体四次穿膜蛋白的抗体。放大图143中所示的四次穿膜蛋白抗体179是指四次穿膜蛋白的抗体,包括但不限于CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、CD82抗体等。
缀合物垫110可包括针对一种或多种类型的四次穿膜蛋白的抗体。例如,取决于由LFA 100进行的测试的类型,缀合物垫110可包括针对CD9、CD63、CD81、CD82或其他类型的四次穿膜蛋白中的一种或多种的抗体。因此,本发明的实施例不一定使用针对所有类型的外泌体的四次穿膜蛋白的抗体,并且可使用单一抗体或任意数量的四次穿膜蛋白抗体的组合,其取决于所进行的测试。
结合试剂176至179可偶联至标记180(也称为缀合物、检测缀合物、探针、检测器纳米颗粒或标签),该标记在其天然状态下易于用肉眼或借助滤光器看到。标记180可由小颗粒(例如,纳米颗粒)制成,诸如例如但不限于金属溶胶(例如,胶体金或金溶胶)、染料溶胶、有色乳胶颗粒、碳、荧光颗粒、铕标记等。在缀合物垫110制造期间,可将带标记的结合试剂包被、浸渍或以其他方式施加或沉积到缀合物垫110上,然后干燥。
在样品流体190从样品垫150流入缀合物垫110中之后,样品流体190可溶解带标记的结合试剂。如果样品流体含有外泌体并且外泌体含有四次穿膜蛋白159(例如,四次穿膜蛋白156至158或其他四次穿膜蛋白,其未示出)中的至少一者,其中缀合物垫100包括抗体,则外泌体可与带标记的结合试剂(例如,结合试剂176至179)结合并且可形成免疫复合物。未与外泌体结合的带标记的结合试剂(例如,当样品流体不包括具有四次穿膜蛋白的外泌体时,其中缀合物垫包括抗体或存在过量的带标记的结合试剂)通过毛细管作用向下游流向膜115。样品流体和流路中的任何其他材料(例如,未结合的带标记的结合试剂、清洗流体等)在本文中被称为流体材料。
根据通过LFA装置所进行的测试的类型,装置可不包括单独的样品垫和缀合物垫,并且在一些实施例中可仅包括缀合物垫110。尽管样品垫150被示出为越过缀合物垫110,但是在一些实施例中,缀合物垫110可越过样品垫150。
LFA装置100可包括膜115以及可嵌入该膜中的一条或多条测试线(为简单起见,仅示出一条测试线125)。LFA装置100可任选地包括可嵌入膜115中的对照线130。膜115可由以下材料制成,诸如例如但不限于:纤维素、硝化纤维素、纸、二氧化硅、棉花、玻璃(例如,玻璃纤维)或合成材料(例如,聚酯、聚乙烯、聚合物、人造丝、尼龙等),这些材料允许流体材料从缀合物垫110向下游流入膜115中并且通过毛细管作用从膜115流向芯吸垫120。尽管缀合物垫110被示出为越过膜115,但是在一些实施例中,膜115可越过缀合物垫110。
测试线125可由以下多孔材料制成,诸如例如但不限于:纤维素、硝化纤维素、纸、二氧化硅、棉花、玻璃(例如,玻璃纤维)或合成材料(例如,聚酯、聚乙烯、聚合物、人造丝、尼龙等)。呈夹心测定形式的测试线125可含有未标记的结合试剂,该未标记的结合试剂固定在测试线125上并且当测试线的多孔材料被润湿(例如,被流体材料润湿)时不向下游流动。如放大图144所示,固定在测试线125上的未标记的结合试剂为目标分析物的抗体185。
LFA装置100可任选地包括可嵌入膜115中的对照线130。对照线130可由以下多孔材料制成,诸如例如但不限于:纤维素、硝化纤维素、纸、二氧化硅、棉花、玻璃(例如,玻璃纤维)或合成材料(例如,聚酯、聚乙烯、聚合物、人造丝、尼龙等)。在夹心测定形式中,对照线130可含有固定化抗体,该固定化抗体结合至游离带标记的结合试剂(例如,游离带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179),得到有色对照线130,其确认测试已正确运行(无论样品中是否已经存在目标分析物)。
如放大图145所示,对照线130上的固定抗体可为包括一种或多种类型的外泌体的四次穿膜蛋白(例如,CD9 156、C63 157、CD81 158、CD82等)的免疫复合物。一般而言,本发明的实施例的LFA装置的对照线可含有针对缀合物垫110上所包括的结合试剂(例如,抗体)类别的固定化结合试剂(例如,固定化抗体)。例如,当缀合物垫上的抗体为免疫球蛋白G(IgG)类时,对照线可包括固定化抗IgG抗体。除包括一种或多种类型的外泌体的四次穿膜蛋白的免疫复合物之外,或者代替该免疫复合物,对照线130可包括针对缀合物垫110上所包括的四次穿膜蛋白类别的抗体。
未结合至测试线125或对照线130的流体材料可继续从膜115流入芯吸垫120中以吸收未被测试线125和对照线130吸收的流体材料,同时维持从膜125到芯吸垫120中的毛细管流。芯吸垫120可由以下多孔材料制成,诸如例如但不限于:纤维素、硝化纤维素、纸、二氧化硅、棉花、玻璃(例如,玻璃纤维)或合成材料(例如,聚酯、聚乙烯、聚合物、人造丝、尼龙等)。根据通过LFA装置所进行的测试的类型,该装置可不包括芯吸垫120。尽管芯吸垫120被示出为越过膜115,但是在一些实施例中,膜115可越过芯吸垫120。
所显示的图1A至1D包括四个阶段101至104。在阶段101(图1A)中,将样品流体190施加到样品垫150上。当样品流体190包括血液时,LFA 100可具有血浆过滤器195并且可将样品流体190施加至血浆过滤器195。在不包括样品垫150的实施例中,可将样品流体190施加至缀合物垫110(或者当样品流体包括血液时施加至位于缀合物垫上的血浆过滤器)。
在阶段102(图1B)中,流体材料可能已经到达缀合物垫110。如放大图146所示,流体材料中的外泌体135的表面上的四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)可与对应的四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)结合。在阶段102中,外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图147所示)可在其表面上含有目标分析物137,而外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图148所示)可不含有目标分析物137。应当指出的是,根据从中抽取样品流体190(图1A)的受试者(例如,人或动物)的状况,该样品流体中可能存在或可能不存在带有目标分析物137的任何外泌体。
与对应的四次穿膜蛋白抗体176至179结合的外泌体135可形成免疫复合物。免疫复合物与流体材料198的其余部分可通过毛细管作用继续从缀合物垫110移动至膜115。
在阶段103(图1C)中,流体材料可能已经到达测试线125。如放大图149所示,固定在测试线上的目标分析物的抗体185可与外泌体135上的目标分析物137结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。该结合得到第二免疫复合物(放大图149中所示的免疫复合物)。固定化第二免疫复合物上的标记180使测试线125着色。
有色测试线的强度与样品流体中的外泌体135的表面上的目标分析物137的密度相关。第二免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化目标分析物的抗体185结合(通过其表面上的目标分析物137),并且(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合。当样品流体不包含目标分析物时,无免疫复合物与测试线125上的固定化抗体结合。因此,测试线125不改变颜色。
其表面上缺乏目标分析物137的外泌体可能不结合至测试线125上的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向对照线130和芯吸垫120移动。
在阶段104(图1D)中,流体材料可能已经到达对照线130。如放大图151所示,流体材料中的游离带标记的四次穿膜蛋白抗体(例如,176至179四次穿膜蛋白抗体)可结合至固定化四次穿膜蛋白(例如,对应的四次穿膜蛋白156至159)。该结合可得到有色对照线,其确认测试已正确运行(无论样品流体中是否已经存在目标分析物)。
LFA装置的一些实施例可包括多条测试线。在这些实施例的一些实施例中,测试线中的一些测试线可用于检测对某些肿瘤具有特异性和/或对某些器官具有特异性的外泌体蛋白质。器官特异性蛋白质被定义为在一种或多种特定人体器官中表达显著升高的蛋白质。器官特异性蛋白质可能与对应器官相关的人类疾病有关。肿瘤特异性蛋白质被定义为在一种或多种特定肿瘤中表达显著升高的蛋白质。
图2示出根据现有技术的对某些肿瘤具有特异性的外泌体蛋白质的实例。参考图2,表200的外泌体蛋白列211标识外泌体蛋白质的名称。肿瘤列212标识与列211的外泌体蛋白质相对应的肿瘤的类型。体液列标识其中已发现外泌体蛋白质的体液。
参考图2,外泌体蛋白质211中的一些外泌体蛋白质,诸如Glypican-1 220,可指示多于一种器官(在本实例中为乳腺、胰腺、结肠和直肠)中的肿瘤。外泌体蛋白211中的一些外泌体蛋白质,诸如PSA 230,也可为可能存在于从健康***细胞释放的外泌体中的器官特异性蛋白质。
图3A至3F为示出根据本公开的各个方面的LFA装置300和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为检测抗体,并且包括用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的多条测试线。LFA装置300可为便携式装置(例如,手持式装置或台式装置),其用于分析样品流体190以确定一种或多种分析物、一种或多种肿瘤特异性蛋白质和/或一种或多种器官特异性蛋白质的存在和/或量。
参考图3A至3F,LFA装置300可包括测试线125以检测目标分析物137。在一些实施例中,目标分析物137可为鉴别恶性肿瘤的一般标志物的蛋白质。LFA装置300的测试线125可类似于如上所述的LFA装置100的测试线125。除测试线125之外,LFA装置300还可包括n条(其中n是大于或等于1的整数)测试线321至322以检测器官特异性和/或肿瘤特异性蛋白质。测试线321至322可由如上文参考LFA装置100的测试线125所述的多孔材料制成。
所显示的图3A至3F包括六个阶段301至307。在阶段301(图3A)中,可将样品流体190施加至样品垫150。当样品流体190包括血液时,LFA 300可具有血浆过滤器195并且可将样品流体190施加至血浆过滤器195。在不包括样品垫150的实施例中,可将样品流体190施加至缀合物垫110(或者当样品流体包括血液时施加至位于缀合物垫上的血浆过滤器)。图3A的放大图141至145示出与图1A的对应放大图类似的项目。
固定在每条测试线321至322上的未标记的结合试剂可为针对器官特异性蛋白质(诸如器官特异性蛋白质196)或肿瘤特异性蛋白质(诸如肿瘤特异性蛋白质194)的抗体371至372。如上所述,一些蛋白质可同时用作肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质。LFA装置300可被配置为使得结合至固定化抗体371至372的器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质为不同的蛋白质。
参考图3A,可将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体371固定在测试线321上(如放大图331所示),可将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体372固定在测试线322上(如放大图332所示)等。尽管示出两条测试线321至322用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质,但是LFA装置300的不同实施例可包括类似于测试线321至322的任意数量的一条或多条测试线,用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质。LFA装置300的其他组件可类似于上文参考图1A至1D所述的LFA装置100的对应组件。
在阶段302(图3B)中,流体材料可能已经到达缀合物垫110。如放大图335所示,流体材料中的外泌体135的表面上的四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)可与对应的四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)结合。在阶段302中,外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图336和337所示)可在其表面上含有目标分析物137,而外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图338所示)可不含有目标分析物137。此外,外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图337和338所示)可在其表面上含有一种或多种肿瘤特异性蛋白质194和/或一种或多种器官特异性蛋白质196,而外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图336所示)在其表面上可不含有任何肿瘤特异性蛋白质或器官特异性蛋白质。应当指出的是,根据从中抽取样品流体190(图1A)的受试者(例如,人或动物)的状况,样品流体可包括或可不包括在其表面上带有目标分析物、肿瘤特异性蛋白质194、或器官特异性蛋白质196的任何外泌体137。
在阶段302(图3B)中,与对应的四次穿膜蛋白抗体176至179结合的外泌体135可形成免疫复合物。免疫复合物与流体材料198的其余部分可通过毛细管作用继续从缀合物垫110移动至膜115。
在阶段303(图3C)中,流体材料可能已经到达测试线321。如放大图339所示,固定在测试线321上的肿瘤特异性或器官特异性抗体371可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。该结合得到第二免疫复合物(放大图339中所示的免疫复合物)。固定化第二免疫复合物上的标记180使测试线321着色。
有色测试线321的强度与对应于固定化抗体371的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。第二免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体371结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线321上的固定化抗体371结合。因此,测试线321不改变颜色。
其表面上缺乏对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线321上的固定化抗体371,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试线342移动。应当指出的是,LFA装置300的一些实施例可仅包括测试线341和125。这些实施例可不包括阶段304。在这些实施例中,未结合的材料可从列表线321向测试线125移动,如下文参考阶段305所述。
在阶段304(图3D)中,流体材料可能已经到达测试线322。如放大图340所示,固定在测试线322上的肿瘤特异性或器官特异性抗体372可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。应当指出的是,对应于固定在测试线322上的抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196不同于对应于固定在测试线321上的抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196。测试线342上的结合得到第三免疫复合物(放大图340中所示的免疫复合物)。固定化第三免疫复合物上的标记180使测试线322着色。
有色测试线322的强度与对应于固定化抗体372的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。第三免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体372结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线322上的固定化抗体372结合。因此,测试线322不改变颜色。
其表面上缺乏对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线322上的固定化抗体372,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试线125移动。应当指出的是,LFA装置300的一些实施例可包括多于两条(例如,三条或更多条)测试线341至342以捕获肿瘤特异性和/或器官特异性蛋白质。这些实施例可包括类似于304的另外的阶段。
在阶段305(图3E)中,流体材料可能已经到达测试线125。如放大图149所示,固定在测试线上的目标分析物的抗体185可与外泌体135上的目标分析物137结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。结合得到免疫复合物(放大图149中所示的免疫复合物)。固定化第二免疫复合物上的标记180使测试线125着色。
有色测试线的强度与样品流体中的外泌体135的表面上的目标分析物137的密度相关。放大图149中的免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化目标分析物的抗体185结合(通过其表面上的目标分析物137),并且(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合。当样品流体不包含目标分析物时,无免疫复合物与测试线125上的固定化抗体结合。因此,测试线125不改变颜色。
其表面上缺乏目标分析物137的外泌体可能不结合至测试线125上的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向对照线130和芯吸垫120移动。
在阶段306(图3F)中,流体材料可能已经到达对照线130。如放大图151所示,流体材料中的游离带标记的四次穿膜蛋白抗体(例如,176至179四次穿膜蛋白抗体)可结合至固定化四次穿膜蛋白(例如,对应的四次穿膜蛋白156至159)。该结合可得到有色对照线,其确认测试已正确运行(无论样品流体中是否已经存在目标分析物)。未结合至对照线130的流体材料可继续从膜115流入芯吸垫120中以吸收未被测试线125和对照线130吸收的流体材料,同时维持从膜125到芯吸垫120中的毛细管流。
参考图3A至3F,LFA装置300上的测试结果可被解释如下。当测试线321至322和125在测试结束时均未着色时,其抗体固定在测试线321至322上的目标分析物137、肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质均未以可检测的量存在于样品流体190中。当测试线125在测试结束时着色但测试线321至322均未着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物),但该恶性肿瘤可能不能归因于任何特定的肿瘤或特定的器官。
当测试线125、以及测试线321至322中的至少一者在测试结束时被着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物)。此外,恶性肿瘤很可能归因于其外泌体蛋白质194/196在有色测试线321至322上被捕获的特定肿瘤或特定器官。
当测试线125在测试结束时未着色但测试线321至322中的至少一者被着色时,未检测到归因于恶性肿瘤的目标分析物137。在此情景下,测试线321至322可能已经由于健康器官释放的外泌体的表面上存在器官特异性蛋白质或者由于肿瘤释放的检测到的外泌体蛋白质不具有一般标志物(即,目标分析物蛋白质)而被着色。
在图3A至3F的实施例中,将多条测试线321至322和125放置在同一测试条上,该测试条还包括样品垫150、缀合物垫110、膜115、对照线130和芯吸垫120。一些实施例可将测试线321至322和125中的每一者放置在单独的测试条上,其中每个测试条可包括样品垫150、缀合物垫110、膜115、对照线130和芯吸垫120。可将多个条放置在同一个测试盒内部。
图4A至4D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置400和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为检测抗体,并且包括多个条,所述多个条带有用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的测试线。LFA装置400可为便携式装置(例如,手持式装置或台式装置),其用于分析样品流体190以确定一种或多种分析物、一种或多种肿瘤特异性蛋白质和/或一种或多种器官特异性蛋白质的存在和/或量。
参考图4A至4D,LFA装置400可包括若干测试条481至483。每两个相邻的测试条可由间隙470分开,该间隙可防止任何流体从一个测试条流入另一个测试条中。为清楚起见,间隙470被显示为成比例地宽于LFA装置400的其他组件。
多测试条LFA装置400可包括涵盖测试条481至483的盒(为清楚起见,仅示出该盒的床层170)。测试条481至483中的每一者可包括单独的样品垫150、单独的膜115、单独的测试线321至322和125、单独的对照线130以及单独的芯吸垫120。
测试线125可位于条483上并且可用于检测目标分析物137。在一些实施例中,目标分析物137可为鉴别恶性肿瘤的一般标志物的蛋白质。LFA装置400的测试线125可类似于如上所述的LFA装置100和300的测试线125。
除位于测试条483上的测试线125之外,LFA装置400还可包括位于对应的测试条481至482上的n条(其中n是大于或等于1的整数)测试线321至322以检测器官特异性和/或肿瘤特异性蛋白质。测试线321至322可由如上文参考LFA装置100和300的测试线125所述的多孔材料制成。
所显示的图4A至4D包括四个阶段401至404。在阶段401(图4A)中,可将样品流体190施加至每个测试条481至483的样品垫150。当样品流体190包括血液时,LFA 400可在每个测试条481至483上具有血浆过滤器195,并且可将样品流体190施加至血浆过滤器195。在不包括样品垫150的实施例中,可以将样品流体190施加至缀合物垫110(或者当样品流体包括血液时施加至位于缀合物垫上的血浆过滤器)。图4A的放大图141至145示出与图1A和3A的对应放大图类似的项目。
固定在每条测试线321至322上的未标记的结合试剂可为针对器官特异性蛋白质(诸如器官特异性蛋白质196)或肿瘤特异性蛋白质(诸如肿瘤特异性蛋白质194)的抗体371至372。如上所述,一些蛋白质可同时用作肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质。LFA装置400可被配置为使得结合至固定化抗体371至372的器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质为不同的蛋白质。
参考图4A,可以将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体371固定在位于测试条481上的测试线321上(如放大图331所示),可以将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体372固定在位于测试条482上的测试线322上(如放大图332所示)等。尽管示出两个测试条481至482和对应的测试线321至322用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质,但是LFA装置400的不同实施例可包括类似于测试条481至482和测试条321至322的任意数量的一个或多个测试条和对应的测试线,用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质。LFA装置400的其他组件可类似于上文参考图1A至1D和图3A至3F所述的LFA装置100和300的对应组件。
在阶段402(图4B)中,流体材料可能已经到达测试条481至483的缀合物垫110。如放大图335所示,流体材料中的外泌体135的表面上的四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)可与对应的四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)结合。
在阶段402中,外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图336和337所示)可在其表面上含有目标分析物137,而外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图338所示)可不含有目标分析物137。此外,外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图337和338所示)可在其表面上含有一种或多种肿瘤特异性蛋白质194和/或一种或多种器官特异性蛋白质196,而外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图336所示)在其表面上可不含有任何肿瘤特异性蛋白质或器官特异性蛋白质。应当指出的是,根据从中抽取样品流体190(图1A)的受试者(例如,人或动物)的状况,样品流体可包括或可不包括在其表面上带有目标分析物、肿瘤特异性蛋白质194、或器官特异性蛋白质196的任何外泌体137。
在阶段402(图4B)中,与对应的四次穿膜蛋白抗体176至179结合的外泌体135可形成免疫复合物。免疫复合物与流体材料198的其余部分可通过毛细管作用继续从每个测试条的缀合物垫110移动至测试条的膜115。
在阶段403(图4C)中,流体材料可能已经到达测试线321至322和125。如放大图339所示,固定在测试线321上的肿瘤特异性或器官特异性抗体371可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。结合得到免疫复合物(放大图339中所示的免疫复合物)。固定化免疫复合物上的标记180使测试线321着色。
有色测试线321的强度与对应于固定化抗体371的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。放大图339中所示的免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体371结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线321上的固定化抗体371结合。因此,测试线321不改变颜色。
如放大图340所示,固定在测试线322上的肿瘤特异性或器官特异性抗体372可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。应当指出的是,对应于固定在测试线322上的抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196不同于对应于固定在测试线321上的抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196。测试线342上的结合得到免疫复合物(放大图340中所示的免疫复合物)。固定化免疫复合物上的标记180使测试线322着色。
有色测试线322的强度与对应于固定化抗体372的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。放大图340中所示的免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体372结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线322上的固定化抗体372结合。因此,测试线322不改变颜色。
如放大图149所示,固定在测试线上的目标分析物的抗体185可与外泌体135上的目标分析物137结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。结合得到免疫复合物(放大图149中所示的免疫复合物)。固定化第二免疫复合物上的标记180使测试线125着色。
有色测试线125的强度与样品流体中的外泌体135的表面上的目标分析物137的密度相关。放大图149中所示的免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化目标分析物的抗体185结合(通过其表面上的目标分析物137),并且(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合。当样品流体不包含目标分析物137时,无免疫复合物与测试线125上的固定化抗体结合。因此,测试线125不改变颜色。
其表面上缺乏对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线321上的固定化抗体371,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试条481上的对照线130移动。
其表面上缺乏对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线322上的固定化抗体372,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试条482上的对照线130移动。应当指出的是,LFA装置400的一些实施例可包括多于两条测试线341至342以捕获肿瘤特异性和/或器官特异性蛋白质。这些实施例可包括类似于测试条481至482的另外的测试条。LFA装置400的一些实施例可包括一条测试线341以捕获肿瘤特异性和/或器官特异性蛋白质。这些实施例可以不包括测试条482。
在阶段404(图4D)中,流体材料可能已经到达测试条481至483的对照线130。如放大图151所示,流体材料中的游离带标记的四次穿膜蛋白抗体(例如,176至179四次穿膜蛋白抗体)可结合至固定化四次穿膜蛋白(例如,对应的四次穿膜蛋白156至159)。该结合可得到有色对照线130,其确认测试已正确运行(无论样品流体中是否已经存在目标分析物)。未结合至对照线130的流体材料可继续从测试条481至483的膜115流入测试条481至483的芯吸垫120中以吸收未被测试线125和对照线130吸收的流体材料,同时维持从膜125到芯吸垫120中的毛细管流。
参考图4A至4D,LFA装置400上的测试结果可被解释如下。当测试线321至322和125在测试结束时均未着色时,其抗体固定在测试线321至322上的目标分析物137、肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质均未以可检测的量存在于样品流体190中。当测试线125在测试结束时着色但测试线321至322均未着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物),但该恶性肿瘤可能不能归因于任何特定的肿瘤或特定的器官。
当测试线125、以及测试线中的至少一者321至322在测试结束时被着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物)。此外,恶性肿瘤很可能归因于其外泌体蛋白质194/196在有色测试线321至322上被捕获的特定肿瘤或特定器官。
当测试线125在测试结束时未着色但测试线中的至少一者321至322被着色时,未检测到归因于恶性肿瘤的目标分析物137。在此情景下,测试线321至322可能已经由于健康器官释放的外泌体的表面上存在器官特异性蛋白质或者由于肿瘤释放的检测到的外泌体蛋白质不具有一般标志物(即,目标分析物蛋白质)而被着色。
在图1A至1D的实施例中,缀合物垫110含有用作检测抗体的带标记的抗体(例如,带标记的抗体176至179),并且测试线130含有用作捕获抗体的固定化目标分析物的抗体185。在其他实施例中,诸如下文参考图5A至5D所述的实施例,捕获抗体和检测抗体的作用可以互换。
图5A至5D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置500和方法的功能图,该LFA装置和方法使用对目标分析物具有特异性的抗体作为检测抗体并且使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的一种或多种抗体作为捕获抗体。LFA装置500可为便携式装置(例如,手持式装置或台式装置),其用于分析样品流体190以确定一种或多种目标分析物的存在和/或量。
图5A至5D的LFA装置500可包括与图1A至1D的LFA装置100类似的组件和配置,不同之处在于,LFA装置500的缀合物垫110、测试线125和对照线130含有与LFA装置100不同的抗体。
参考图5A,样品流体190可与样品流体190类似,外泌体135可与外泌体135类似,并且目标分析物可与上文参考图1A至1D所述的目标分析物137类似。如图5A的放大图543所示,缀合物垫110可含有目标分析物的抗体185作为结合试剂。目标分析物的抗体185可偶联至标记180,该标记在其天然状态下易于用肉眼或借助滤光器看到。标记180可由小颗粒(例如,纳米颗粒)制成,诸如但不限于金属溶胶(例如,胶体金或金溶胶)、染料溶胶、有色乳胶颗粒、碳、荧光颗粒、铕标记等。在缀合物垫110制造期间,可将带标记的结合试剂包被、浸渍或以其他方式施加或沉积到缀合物垫110上,然后干燥。
在样品流体190从样品垫150流入缀合物垫110中之后,样品流体190可溶解带标记的目标分析物的抗体185。如果样品流体含有外泌体135并且外泌体135含有目标分析物137,如图5A的放大图142所示,则目标分析物137可结合至带标记的目标分析物的抗体185。
如放大图544所示,测试线125可含有针对一种或多种对应的四次穿膜蛋白(例如,CD9四次穿膜蛋白0156、CD63四次穿膜蛋白157、CD81四次穿膜蛋白158等)的固定化抗体(例如,抗体176至179等)。测试线可包括针对其他类型的四次穿膜蛋白的固定化抗体,为清楚起见,未显示这些抗体。放大图142中所示的四次穿膜蛋白159是指哺乳动物中34种四次穿膜蛋白中的任一者,包括但不限于CD9 156、CD63 157、CD81158和CD82。放大图143中所示的四次穿膜蛋白抗体179是指四次穿膜蛋白的抗体,包括但不限于CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体、CD82抗体等。
如放大图545所示,对照线可含有固定化目标分析物137,以便结合至游离的带标记的目标分析物抗体。一般而言,本方面的实施例的LFA装置的对照线可含有针对缀合物垫110上包括的抗体类别的固定化抗体。例如,当针对目标分析物的抗体为IgG类时,对照线130可包括固定化抗IgG抗体。在LFA装置500的实例中,除固定化目标分析物之外,或者代替该固定化目标分析物,LFA装置500的对照线130可包括针对IgG类抗体的抗体。
所显示的图5A至5D包括四个阶段501至504。在阶段501(图2A)中,将样品流体190施加到样品垫150上。当样品流体190包括血液时,LFA 500可具有血浆过滤器195并且可将样品流体190施加至血浆过滤器195。在不包括样品垫150的实施例中,可将样品流体190施加至缀合物垫110(或者当样品流体包括血液时施加至位于缀合物垫上的血浆过滤器)。
在阶段502(图5B)中,流体材料可能已经到达缀合物垫110。如放大图546和547所示,流体材料中的外泌体135的表面上的目标分析物137可与目标分析物抗体185结合。应当指出的是,根据从中抽取样品流体190(图5A)的受试者(例如,人或动物)的状况,该样品流体中可能存在或可能不存在带有目标分析物137的任何外泌体。
其表面上带有与目标分析物抗体185结合的目标分析物137的外泌体135可形成免疫复合物。免疫复合物与流体材料198的其余部分可通过毛细管作用继续从缀合物垫110移动至膜115。
在阶段503(图5C)中,流体材料可能已经到达测试线125。如放大图549所示,固定在测试线125上的四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)可与已经结合至目标分析物的抗体185的外泌体135上的四次穿膜蛋白156至159结合。
该结合得到第二免疫复合物(放大图549中所示的免疫复合物)。固定化第二免疫复合物上的标记180使测试线125着色。由于四次穿膜蛋白的抗体176至179被固定在测试线125上,因此不具有目标分析物137并且不与带标记的靶分析物的抗体结合的外泌体也可以与四次穿膜蛋白的抗体176至179结合,并且变得固定在测试线125上。因此,测试线可固定不具有标记的一些颗粒。这些未标记的颗粒结合至并且消耗测试线125上的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179中的一些固定化四次穿膜蛋白抗体。
因此,本发明的实施例的LFA装置500的测试线125被设计为使得足够的四次穿膜蛋白抗体176至179被固定在测试线125上,以允许一定百分比的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179被不携带标记的外泌体消耗并且当样品流体包括目标分析物时测试线仍然改变颜色。在一些实施例中,测试线上固定的四次穿膜蛋白抗体176至179的量可通过一系列实验测试来确定,以确保当目标分析物存在于样品流体中时测试线改变颜色。未结合至目标分析物137的带标记的目标分析物的抗体185可与流体材料的其余部分一起继续向对照线130和芯吸垫120移动。
在阶段504(图5D)中,流体材料可能已经到达对照线130。如放大图551所示,流体材料中的游离带标记的目标分析物的抗体185可结合至对照线130上的固定化目标分析物137。该结合可得到有色对照线130,其确认测试已正确运行(无论样品流体中是否已经存在目标分析物)。
如上所述,LFA装置的一些实施例可包括多条测试线。在这些实施例的一些实施例中,测试线中的一些测试线可用于检测对某些肿瘤具有特异性和/或对某些器官具有特异性的外泌体蛋白质。图6A至6F为示出根据本公开的各个方面的LFA装置600和方法的功能图,该LFA和方法使用对目标分析物具有特异性的抗体作为检测抗体,并且包括用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的多条测试线。LFA装置600可为便携式装置(例如,手持式装置或台式装置),其用于分析样品流体190以确定一种或多种分析物、一种或多种肿瘤特异性蛋白质和/或一种或多种器官特异性蛋白质的存在和/或量。
参考图6A至6F,LFA装置600可包括测试线125以检测目标分析物137。在一些实施例中,目标分析物137可为鉴别恶性肿瘤的一般标志物的蛋白质。LFA装置600的测试线125可类似于如上所述的LFA装置100、300和500的测试线125。除测试线125之外,LFA装置600还可包括n条(其中n是大于或等于1的整数)测试线321至322以检测器官特异性和/或肿瘤特异性蛋白质。LFA装置600的测试线321至322可类似于图3A至3F的LFA装置300的测试线321至322。
所显示的图6A至6F包括六个阶段601至607。在阶段601(图6A)中,可将样品流体190施加至样品垫150。当样品流体190包括血液时,LFA装置600可具有血浆过滤器195并且可将样品流体190施加至血浆过滤器195。在不包括样品垫150的实施例中,可将样品流体190施加至缀合物垫110(或者当样品流体包括血液时施加至位于缀合物垫上的血浆过滤器)。图6A的放大图141至145示出与图1A、3A和5A的对应放大图类似的项目。
固定在每条测试线321至322上的未标记的结合试剂可为针对器官特异性蛋白质(诸如器官特异性蛋白质196)或肿瘤特异性蛋白质(诸如肿瘤特异性蛋白质194)的抗体371至372。如上所述,一些蛋白质可同时用作肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质。LFA装置600可被配置为使得结合至固定化抗体371至372的器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质为不同的蛋白质。
参考图6A,可将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体371固定在测试线321上(如放大图331所示),可将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体372固定在测试线322上(如放大图332所示)等。尽管示出两条测试线321至322用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质,但是LFA装置600的不同实施例可包括类似于测试线321至322的任意数量的一条或多条测试线,用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质。LFA设备600的其他组件可类似于上述LFA装置100、300和500的对应组件。
在阶段602(图6B)中,流体材料可能已经到达缀合物垫110。如放大图546和547所示,流体材料中的外泌体135的表面上的目标分析物137可与目标分析物抗体185结合。应当指出的是,根据从中抽取样品流体190(图5A)的受试者(例如,人或动物)的状况,该样品流体中可能存在或可能不存在带有目标分析物137的任何外泌体。
其表面上带有与目标分析物抗体185结合的目标分析物137的外泌体135可形成免疫复合物。免疫复合物与流体材料198的其余部分可通过毛细管作用继续从缀合物垫110移动至膜115。
在阶段603(图6C)中,流体材料可能已经到达测试线321。如放大图339所示,固定在测试线321上的肿瘤特异性或器官特异性抗体371可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。该结合得到第二免疫复合物(放大图339中所示的免疫复合物)。固定化第二免疫复合物上的标记180使测试线321着色。
有色测试线321的强度与对应于固定化抗体371的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。第二免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体371结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线321上的固定化抗体371结合。因此,测试线321不改变颜色。
其表面上缺乏对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线321上的固定化抗体371,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试线342移动。应当指出的是,LFA装置600的一些实施例可仅包括测试线341和125。这些实施例可不包括阶段604。在这些实施例中,未结合的材料可从列表线321向测试线125移动,如下文参考阶段305所述。
在阶段604(图6D)中,流体材料可能已经到达测试线322。如放大图340所示,固定在测试线322上的肿瘤特异性或器官特异性抗体372可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。应当指出的是,对应于固定在测试线322上的抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196不同于对应于固定在测试线321上的抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196。测试线342上的结合得到第三免疫复合物(放大图340中所示的免疫复合物)。固定化第三免疫复合物上的标记180使测试线322着色。
有色测试线322的强度与对应于固定化抗体372的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。第三免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体372结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线322上的固定化抗体372结合。因此,测试线322不改变颜色。
其表面上缺乏对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线322上的固定化抗体372,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试线343移动。应当指出的是,LFA装置600的一些实施例可包括多于两条测试线341至342以捕获肿瘤特异性和/或器官特异性蛋白质。这些实施例可包括类似于304的另外的阶段。
在阶段605(图6E)中,流体材料可能已经到达测试线125。如放大图549所示,固定在测试线125上的四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)可与已经结合至目标分析物的抗体185的外泌体135上的四次穿膜蛋白156至159结合。结合得到免疫复合物(放大图549中所示的免疫复合物)。固定化免疫复合物上的标记180使测试线125着色。
由于四次穿膜蛋白的抗体176至179被固定在测试线125上,因此不具有目标分析物137并且不与带标记的靶分析物的抗体结合的外泌体也可以与四次穿膜蛋白的抗体176至179结合,并且变得固定在测试线125上。因此,测试线可固定不具有标记的一些颗粒。这些未标记的颗粒结合至并且消耗测试线125上的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179中的一些固定化四次穿膜蛋白抗体。
因此,本发明的实施例的LFA装置600的测试线125被设计为使得足够的四次穿膜蛋白抗体176至179被固定在测试线125上,以允许一定百分比的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179被不携带标记的外泌体消耗并且当样品流体包括目标分析物时测试线仍然改变颜色。在一些实施例中,测试线上固定的四次穿膜蛋白抗体176至179的量可通过一系列实验测试来确定,以确保当目标分析物存在于样品流体中时测试线改变颜色。
当样品流体不包含目标分析物时,无免疫复合物与测试线125上的固定化抗体结合。因此,测试线125不改变颜色。未结合至目标分析物137的带标记的目标分析物的抗体185可与流体材料的其余部分一起继续向对照线130和芯吸垫120移动。
在阶段606(图6F)中,流体材料可能已经到达对照线130。如放大图551所示,流体材料中的游离带标记的目标分析物的抗体185可结合至对照线130上的固定化目标分析物137。该结合可得到有色对照线130,其确认测试已正确运行(无论样品流体中是否已经存在目标分析物)。未结合至对照线130的流体材料可继续从膜115流入芯吸垫120中以吸收未被测试线125和对照线130吸收的流体材料,同时维持从膜125到芯吸垫120中的毛细管流。
参考图6A至6D,LFA装置600上的测试结果可被解释如下。当测试线321至322和125在测试结束时均未着色时,其抗体固定在测试线321至322上的目标分析物137、肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质均未以可检测的量存在于样品流体190中。当测试线125在测试结束时着色但测试线321至322均未着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物),但该恶性肿瘤可能不能归因于任何特定的肿瘤或特定的器官。
当测试线125、以及测试线中的至少一者321至322在测试结束时被着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物)。此外,恶性肿瘤很可能归因于其外泌体蛋白质194/196在有色测试线321至322上被捕获的特定肿瘤或特定器官。
当测试线125在测试结束时未着色但测试线中的至少一者321至322被着色时,未检测到归因于恶性肿瘤的目标分析物137。在此情景下,测试线321至322可能已经由于健康器官释放的外泌体的表面上存在器官特异性蛋白质或者由于肿瘤释放的检测到的外泌体蛋白质不具有一般标志物(即,目标分析物蛋白质)而被着色。
在图6A至6F的实施例中,将多条测试线321至322和125放置在同一测试条上,该测试条还包括样品垫150、缀合物垫110、膜115、对照线130和芯吸垫120。一些实施例可将每条测试线321至322和125放置在单独的条上,其中每个条可包括样品垫150、缀合物垫110、膜115、对照线130和芯吸垫120。可将多个条放置在同一个测试盒内部。
图7A至7D为示出根据本公开的各个方面的LFA装置700和方法的功能图,该LFA和方法使用对目标分析物具有特异性的抗体作为检测抗体,并且包括多个测试条,所述多个测试条具有用于捕获一组一种或多种器官特异性或肿瘤特异性蛋白质和目标分析物的多条测试线。LFA装置700可为便携式装置(例如,手持式装置或台式装置),其用于分析样品流体190以确定一种或多种分析物、一种或多种肿瘤特异性蛋白质和/或一种或多种器官特异性蛋白质的存在和/或量。
参考图7A至7D,LFA装置700可包括若干测试条781至783。每两个相邻的测试条可由间隙770分开,该间隙可防止任何流体从一个测试条流入另一个测试条中。多条LFA装置700可包括涵盖测试条781至783中的两者的盒(为清楚起见,仅示出该盒的床层170)。测试条781至783中的每一者可包括单独的样品垫150、单独的膜115、单独的测试线321至322和125、单独的对照线130和单独的芯吸垫120。
测试线125可位于条783上并且可用于检测目标分析物137。在一些实施例中,目标分析物137可为鉴别恶性肿瘤的一般标志物的蛋白质。LFA装置700的测试线125可类似于如上所述的LFA装置100和300的测试线125。
除位于测试条783上的测试线125之外,LFA装置700还可包括位于对应的测试条781至782上的n条(其中n是大于或等于1的整数)测试线321至322以检测器官特异性和/或肿瘤特异性蛋白质。测试线321至322可由如上文参考LFA装置100、300、400和500的测试线125所述的多孔材料制成。
所显示的图7A至7D包括四个阶段701至704。在阶段701(图7A)中,可将样品流体190施加至每个测试条781至783的样品垫150上。当样品流体190包括血液时,LFA 700可在每个测试条781至783上具有血浆过滤器195,并且可将样品流体190施加至血浆过滤器195。在不包括样品垫150的实施例中,可以将样品流体190施加至缀合物垫110(或者当样品流体包括血液时施加至位于缀合物垫上的血浆过滤器)。图7A的放大图141至145示出与图1A、3A、5A和6A的对应放大图类似的项目。
固定在每条测试线321至323上的未标记的结合试剂可为针对器官特异性蛋白质(诸如器官特异性蛋白质196)或肿瘤特异性蛋白质(诸如肿瘤特异性蛋白质194)的抗体371至372。如上所述,一些蛋白质可同时用作肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质。LFA装置700可被配置为使得结合至固定化抗体371至372的器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质为不同的蛋白质。
参考图7A,可以将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体371固定在位于测试条781上的测试线321上(如放大图331所示),可以将一定量的针对器官特异性蛋白质或肿瘤特异性蛋白质的抗体372固定在位于测试条782上的测试线322上(如放大图332所示)等。尽管示出两个测试条781至782和对应的测试线321至322用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质,但是LFA装置700的不同实施例可包括类似于测试条781至782和测试条321至322的任意数量的一个或多个测试条和对应的测试线,用于捕获肿瘤特异性或器官特异性蛋白质。LFA装置700的其他组件可类似于上文参考图1A至1D和图3A至3F所述的LFA装置100、300、500和600的对应组件。
在阶段702(图7B)中,流体材料可能已经到达测试条781至783的缀合物垫110。如放大图546和547所示,流体材料中的外泌体135的表面上的目标分析物137可与目标分析物抗体185结合。应当指出的是,根据从中抽取样品流体190(图5A)的受试者(例如,人或动物)的状况,该样品流体中可能存在或可能不存在带有目标分析物137的任何外泌体。
其表面上带有与目标分析物抗体185结合的目标分析物137的外泌体135可形成免疫复合物。免疫复合物与流体材料198的其余部分可通过毛细管作用继续从缀合物垫110移动至膜115。
在阶段703(图7C)中,流体材料可能已经到达测试线321至322和125。如放大图339所示,固定在测试线321上的肿瘤特异性或器官特异性抗体371可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。结合得到免疫复合物(放大图339中所示的免疫复合物)。固定化第二免疫复合物上的标记180使测试线321着色。
有色测试线321的强度与对应于固定化抗体371的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。放大图339中所示的免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体371结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线321上的固定化抗体371结合。因此,测试线321不改变颜色。
如放大图340所示,固定在测试线322上的肿瘤特异性或器官特异性抗体372可与外泌体135上的对应的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196结合,该外泌体已通过其四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)中的一者结合至四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)。应当指出的是,对应于固定在测试线322上的抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196不同于对应于固定在测试线321上的抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196。测试线342上的结合得到免疫复合物(放大图340中所示的免疫复合物)。固定化免疫复合物上的标记180使测试线322着色。
有色测试线322的强度与对应于固定化抗体372的样品流体中的外泌体135的表面上的肿瘤特异性或器官特异性蛋白质的密度相关。放大图340中所示的免疫复合物包括外泌体135,该外泌体与固定化抗体372结合(通过其表面上的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196),并且与带标记的四次穿膜蛋白抗体176至179中的一者结合(通过其表面上的四次穿膜蛋白156至159中的一者)。当样品流体不包括对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196时,无免疫复合物与测试线322上的固定化抗体372结合。因此,测试线322不改变颜色。
如放大图549所示,固定在测试线125上的四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体176至179)可与已经结合至目标分析物的抗体185的外泌体135上的四次穿膜蛋白156至159结合。结合得到免疫复合物(放大图549中所示的免疫复合物)。固定化免疫复合物上的标记180使测试线125着色。
由于四次穿膜蛋白的抗体176至179被固定在测试线125上,因此不具有目标分析物137并且不与带标记的靶分析物的抗体结合的外泌体也可以与四次穿膜蛋白的抗体176至179结合,并且变得固定在测试线125上。因此,测试线可固定不具有标记的一些颗粒。这些未标记的颗粒结合至并且消耗测试线125上的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179中的一些固定化四次穿膜蛋白抗体。
因此,本发明的实施例的LFA装置700的测试线125被设计为使得足够的四次穿膜蛋白抗体176至179被固定在测试线125上,以允许一定百分比的固定化四次穿膜蛋白抗体176至179被不携带标记的外泌体消耗并且当样品流体包括目标分析物时测试线仍然改变颜色。在一些实施例中,测试线上固定的四次穿膜蛋白抗体176至179的量可通过一系列实验测试来确定,以确保当目标分析物存在于样品流体中时测试线改变颜色。
当样品流体不包含目标分析物时,无免疫复合物与测试线125上的固定化抗体结合。因此,测试线125不改变颜色。未结合至目标分析物137的带标记的目标分析物的抗体185可与流体材料的其余部分一起继续向对照线130和芯吸垫120移动。
其表面上缺乏对应于固定化抗体371的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线321上的固定化抗体371,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试条781上的对照线130移动。
其表面上缺乏对应于固定化抗体372的肿瘤特异性蛋白质194或器官特异性蛋白质196的外泌体可能不结合至测试线322上的固定化抗体372,并且可能与流体材料的其余部分一起继续向测试条782上的对照线130移动。应当指出的是,LFA装置700的一些实施例可包括多于两条测试线341至342以捕获肿瘤特异性和/或器官特异性蛋白质。这些实施例可包括类似于测试条781至782的另外的测试条。LFA装置700的一些实施例可包括一条测试线341以捕获肿瘤特异性和/或器官特异性蛋白质。这些实施例可以不包括测试条782。
在阶段704(图7D)中,流体材料可能已经到达测试条781至783的对照线130。如放大图551所示,流体材料中的游离带标记的目标分析物的抗体185可结合至对照线130上的固定化目标分析物137。该结合可得到有色对照线130,其确认测试已正确运行(无论样品流体中是否已经存在目标分析物)。
未结合至对照线130的流体材料可继续从测试条781至783的膜115流入测试条781至783的芯吸垫120中以吸收未被测试线125和对照线130吸收的流体材料,同时维持从膜125到芯吸垫120中的毛细管流。
参考图7A至7D,LFA装置700上的测试结果可被解释如下。当测试线321至322和125在测试结束时均未着色时,其抗体固定在测试线321至322上的目标分析物137、肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质均未以可检测的量存在于样品流体190中。当测试线125在测试结束时着色但测试线321至322均未着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物),但该恶性肿瘤可能不能归因于任何特定的肿瘤或特定的器官。
当测试线125、以及测试线中的至少一者321至322在测试结束时被着色时,在样品流体中检测到目标分析物137(例如但不限于,恶性肿瘤诸如癌症的一般标志物)。此外,恶性肿瘤很可能归因于其外泌体蛋白质194/196在有色测试线321至322上被捕获的特定肿瘤或特定器官。
当测试线125在测试结束时未着色但测试线中的至少一者321至322被着色时,未检测到归因于恶性肿瘤的目标分析物137。在此情景下,测试线321至322可能已经由于健康器官释放的外泌体的表面上存在器官特异性蛋白质或者由于肿瘤释放的检测到的外泌体蛋白质不具有一般标志物(即,目标分析物蛋白质)而被着色。
II.通过使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体来检测和捕获目标分析物的ELISA装置
图8A至8I为示出根据本公开的各个方面的ELISA装置800和方法的功能图,该ELISA装置和方法通过使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的抗体以及对目标分析物具有特异性的固定化抗体来检测和捕获目标分析物。ELISA装置800可为便携式装置(例如,手持式装置或台式装置),其通常在实验室环境中使用以分析样品流体,以确定一种或多种目标分析物的存在和/或量。
ELISA装置800可包括微板810。微板810可包括不同数量的孔(或腔)820。例如,夹心形式ELISA装置中的微板可包括96个、384个、1536个孔等。在图8A至8I的实例中,ELISA装置800包括排列成8行和12列的96个孔。
微板810可由以下塑料材料制成,诸如例如并且不限于:聚苯乙烯、聚苯乙烯的衍生物、聚氯乙烯(PVC)等。不同的孔820可包括来自相同或不同受试者的样品。例如,两个或更多个孔可用于包括在不同时间取自同一人的样品流体并且/或者可包括取自同一人的不同浓度的样品。两个或更多个孔可包括来自不同人的样品流体。可对所有孔820中的样品并行地进行相同的测试。
所显示的图8A至8I包括九个阶段801至809。如阶段801(图8A)中的放大图841所示,目标分析物的抗体185可固定在孔820中的一者或多者的底部。目标分析物的抗体185可在阶段801中作为适当稀释的包被缓冲液施加至可用于测试的一个或多个孔820。可将包被缓冲液孵育,直至其吸附至孔820的表面。由于抗体185上的氨基酸侧链与孔820的塑料表面之间的疏水相互作用,可能被动地发生吸附。吸附可能取决于时间、温度和包被缓冲液的pH以及抗体185的浓度。
在阶段802(图8B)中,可将样品流体190添加至在测试中使用的孔820中。如放大图842所示,样品流体可具有与图1A的样品流体类似的组成。如放大图843所示,外泌体135可具有与如上文参考图1A所述的外泌体类似的组成。
在阶段803(图8C)中,在其表面上包含目标分析物137的流体样品中的外泌体可与孔820中的固定化目标分析物抗体185结合。如放大图844所示,在其表面上不包含目标分析物的外泌体(诸如外泌体835)可能不与固定化目标分析物抗体185结合。流体样品可在孔820中静置合适的时间,以便目标分析物137与固定化目标分析物抗体185结合。
在阶段804(图8D)中,可洗去未结合的材料198和835(图8C)。在一些实施例中,可通过施加清洗缓冲液进行一次或多次清洗以彻底去除未结合的材料。如放大图845所示,在阶段804结束时,仅带有与固定化目标分析物的抗体185结合的目标分析物137的外泌体135可留在孔820中。
在阶段805(图8E)中,可将一定量的含有四次穿膜蛋白抗体的流体860添加至孔820中。如放大图846所示,四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体876至879)可包括抗体,以结合至可能在阶段804中固定在孔820中的外泌体的表面上的对应的四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)(图8D)。四次穿膜蛋白抗体876至879可包括在与底物材料相互作用后可能改变颜色的酶,该底物材料可在测试的后期阶段添加至孔中。
在阶段806(图8F)中,四次穿膜蛋白抗体可与固定化外泌体的表面上的对应的四次穿膜蛋白结合。如放大图847所示,四次穿膜蛋白抗体876至879可与固定化外泌体135的表面上对应的四次穿膜蛋白156至159结合。四次穿膜蛋白抗体870中的一些四次穿膜蛋白抗体可能不与任何外泌体结合,因为在含有四次穿膜蛋白抗体的流体860(图8E)中可能存在过量的四次穿膜蛋白抗体,或者在外泌体135的表面上可能不存在匹配的四次穿膜蛋白。
在阶段807(图8G)中,可洗去未结合的四次穿膜蛋白抗体870(图8F)。在一些实施例中,可通过施加清洗缓冲液进行一次或多次清洗以彻底去除未结合的材料。如放大图848所示,在阶段807结束时,仅与固定化外泌体135的表面上对应的四次穿膜蛋白156至159结合的四次穿膜蛋白抗体876至879可留在孔820中。
在阶段808(图8H)中,可将含有一定量的底物885的液体880添加至孔820中。放大图849中所示的底物885可被四次穿膜蛋白抗体876至879上的酶转化。
如阶段809中的放大图851所示(图8I),底物885可被四次穿膜蛋白抗体876至878上的酶转化以产生颜色变化895,该颜色变化的强度与存在的目标分析物137的量成比例。根据所使用的酶和底物,读数也可为荧光或发光。有色最终产物可在分光光度计中作为吸光度值读数,这些吸光度值代表分析物浓度。如果样品流体不含有带有目标分析物的外泌体,则最终产物的颜色可能不变,表明样品流体中缺乏目标分析物。
在图8A至8I的实施例中,将目标分析物的抗体185固定在ELISA装置孔820中。在其他实施例中,诸如下文参考图9A至9I所述的实施例,可将四次穿膜蛋白抗体固定在ELISA装置孔820中。
图9A至9I为示出根据本公开的各个方面的ELISA装置900和方法的功能图,该ELISA装置和方法通过使用对含有目标分析物的外泌体具有特异性的固定化抗体以及对目标分析物具有特异性的抗体来检测和捕获目标分析物。ELISA装置900的结构可类似于图8A至8I的ELISA装置800的结构。
所显示的图9A至9I包括九个阶段901至909。如阶段901(图9A)中的放大图941所示,一种或多种类型的四次穿膜蛋白的抗体179可固定在孔820中的一者或多者的底部。抗体179可为针对四次穿膜蛋白159的抗体(图1A),诸如例如并且不限于CD9四次穿膜蛋白、CD63四次穿膜蛋白、CD81四次穿膜蛋白和CD82四次穿膜蛋白等中的一者或多者,它们存在于外泌体的表面上。
四次穿膜蛋白抗体179可在阶段901中作为适当稀释的包被缓冲液施加至可用于测试的一个或多个孔820。可将包被缓冲液孵育,直至其吸附至孔820的表面。由于抗体179上的氨基酸侧链与孔820的塑料表面之间的疏水相互作用,可能被动地发生吸附。吸附可能取决于时间、温度和包被缓冲液的pH以及抗体179的浓度。
在阶段902(图9B)中,可将样品流体190添加至在测试中使用的孔820中。如放大图842所示,样品流体可具有与图1A和8B的样品流体类似的组成。如放大图843所示,外泌体135可具有与如上文参考图1A所述的外泌体类似的组成。
在阶段903(图9C)中,外泌体135的表面上的四次穿膜蛋白可与孔820中的固定化四次穿膜蛋白抗体179结合。
如放大图944所示,样品流体材料中的外泌体135的表面上的四次穿膜蛋白(例如,四次穿膜蛋白156至159)可与对应的四次穿膜蛋白抗体(例如,四次穿膜蛋白抗体179)结合。在阶段903中,外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图945所示)可在其表面上含有目标分析物137,而外泌体135中的一些外泌体(例如,如放大图946所示)可不含有目标分析物137。应当指出的是,根据从中抽取样品流体190(图9C)的受试者(例如,人或动物)的状况,该样品流体中可能存在或可能不存在带有目标分析物137的任何外泌体。
与对应的四次穿膜蛋白抗体179结合的外泌体135可形成免疫复合物。流体样品可在孔820中静置合适的时间,以便外泌体135的表面上的四次穿膜蛋白与固定化的对应的四次穿膜蛋白抗体179结合。
在阶段904(图9D)中,可洗去未结合的材料198和835(图9C)。在一些实施例中,可通过施加清洗缓冲液进行一次或多次清洗以彻底去除未结合的材料。如放大图947所示,在阶段904结束时,仅带有与固定化四次穿膜蛋白抗体179结合的四次穿膜蛋白的外泌体135可留在孔820中。
在阶段905(图9E)中,可将一定量的含有目标分析物的抗体185(如放大图948所示)的流体960添加至孔820中。目标分析物的抗体185可包括在与底物材料相互作用后可能改变颜色的酶,该底物材料可在测试的后期阶段添加至孔中。
在阶段906(图9F)中,目标分析物的抗体185可与位于结合至固定化四次穿膜蛋白抗体179的外泌体的表面上的目标分析物137结合(如放大图949所示)。例如,目标分析物抗体185中的一些目标分析物抗体可能不与任何目标分析物137结合,因为在含有目标分析物的抗体185的流体860(图9E)中可能存在过量的目标分析物的抗体185。
在阶段907(图9G)中,可洗去未结合的目标分析物的抗体185(图9F)。在一些实施例中,可通过施加清洗缓冲液进行一次或多次清洗以彻底去除未结合的材料。如放大图950所示,在阶段907结束时,仅与固定化外泌体135的表面上的目标分析物137结合的目标分析物抗体185可留在孔820中。
在阶段908(图9H)中,可将含有一定量的底物885的液体880添加至孔820中。放大图951中所示的底物885可被四次穿膜蛋白抗体876至878上的酶转化。
如阶段909(图9I)中的放大图952所示,底物885可被目标分析物抗体185上的酶转化以产生颜色变化895,该颜色变化的强度与存在的目标分析物137的量成比例。根据所使用的酶和底物,读数也可为荧光或发光。有色最终产物可在分光光度计中作为吸光度值读数,这些吸光度值代表分析物浓度。如果样品流体不含有带有目标分析物的外泌体,则最终产物的颜色可能不变,表明样品流体中缺乏目标分析物。
在第一方面,提供了一种侧向流测定装置。该侧向流测定装置包括测试条,该测试条被配置为接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测该外泌体的表面上的目标分析物的存在情况。该测试条包括缀合物垫。该缀合物垫被配置为含有与标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白结合试剂。每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂被配置为与对应类型的外泌体四次穿膜蛋白结合并且形成包含外泌体的免疫复合物。缀合物垫被配置为在测试开始后接收流体并且通过毛细管作用移动该流体。测试条包括与缀合物垫流体连接的膜。该膜被配置为通过毛细管作用使流体移动。该膜包括包含针对目标分析物的固定化结合试剂的测试线。针对该目标分析物的该固定化结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的该目标分析物的蛋白质结合。
在第一方面的实施例中,其中测试线为第一测试线,膜进一步包括第二测试线,该第二测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂。该第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者。对该第一类型的蛋白质的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的第一类型的蛋白质结合。
在第一方面的另一个实施例中,针对目标分析物的结合试剂为目标分析物的抗体。每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂都是一种类型的四次穿膜蛋白抗体。对第一类型的蛋白质的结合试剂为针对第一类型的蛋白质的抗体。
在第一方面的另一个实施例中,其中测试线为第一测试线,膜进一步包括除第一测试线之外的多条测试线,其中所述多条测试线中的每条测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,其中所述多条测试线中的每条测试线上的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的对应类型的蛋白质结合。
在第一方面的另一个实施例中,其中测试条为第一测试条,侧向流测定装置进一步包括第二测试条。该第二测试条包括缀合物垫。该第二测试条的缀合物垫被配置为含有与标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白抗体。该第二测试条的缀合物垫被配置为在测试开始后接收流体并且通过毛细管作用移动该流体。该第二测试条包括与该第二测试条的缀合物垫流体连接的膜。该第二测试条的膜被配置为通过毛细管作用使流体移动。该第二测试条的膜包括测试线,该测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂。该第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者。对该第一类型的蛋白质的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的第一类型的蛋白质结合。
在第一方面的另一个实施例中,其中测试条为第一测试条,侧向流测定装置进一步包括除第一测试条之外的多个测试条。所述多个测试条中的每个测试条包括缀合物垫。所述多个测试条中的每个测试条的缀合物垫被配置为含有与标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白抗体。所述多个测试条中的每个测试条的缀合物垫被配置为在测试开始后接收流体并且通过毛细管作用移动该流体。所述多个测试条中的每个测试条包括与对应的测试条的缀合物垫流体连接的膜。所述多个测试条中的每个测试条的膜被配置为通过毛细管作用使流体移动。所述多个测试条中的每个测试条的膜包括测试线,该测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂。所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者。所述多个测试条中的每个测试条的测试线上的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的对应类型的蛋白质结合。
在第一方面的另一个实施例中,膜包括对照线,该对照线包含针对缀合物垫所含有的一类四次穿膜蛋白结合试剂的固定化结合试剂。
在第一方面的另一个实施例中,标记为包含以下项中的至少一者的检测器:包含胶体金的金属溶胶;染料溶胶;有色乳胶颗粒;碳;荧光颗粒;铕标记等。
第一方面的实施例进一步包括芯吸垫,该芯吸垫被配置为维持从膜到该芯吸垫中的毛细管流;以及样品垫,该样品垫被配置为接收流体并且通过毛细管作用使样品流体转移至缀合物垫。
第一方面的实施例进一步包括血浆过滤器,该血浆过滤器被配置为接收流体并且使流体转移至侧向流测定装置的缀合物垫和样品垫中的一者。
在第二方面,提供了一种侧向流测定装置。该侧向流测定装置包括测试条,该测试条被配置为接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测该外泌体的表面上的目标分析物的存在情况。该测试条包括缀合物垫。缀合物垫被配置为包含与标记缀合的针对目标分析物的结合试剂。针对目标分析物的固定化结合试剂被配置为与外泌体的表面上的该目标分析物的蛋白质结合并且形成包含外泌体的免疫复合物。缀合物垫被配置为在测试开始后接收流体并且通过毛细管作用移动该流体。测试条包括与缀合物垫流体连接的膜。该膜被配置为通过毛细管作用使流体移动。该膜包括测试线,该测试线包含固定在测试线上的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白结合试剂。每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的对应类型的外泌体四次穿膜蛋白结合。
在第二方面的实施例中,其中测试线为第一测试线,膜进一步包括第二测试线,该第二测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂。该第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者。对该第一类型的蛋白质的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的第一类型的蛋白质结合。
在第二方面的另一个实施例中,针对目标分析物的结合试剂为目标分析物的抗体。每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂都是一种类型的四次穿膜蛋白抗体。对第一类型的蛋白质的结合试剂为针对第一类型的蛋白质的抗体。
在第二方面的另一个实施例中,其中测试线为第一测试线,膜进一步包括除第一测试线之外的多条测试线。所述多条测试线中的每条测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂。所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者。所述多条测试线中的每条测试线上的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的对应类型的蛋白质结合。
在第二方面的另一个实施例中,其中测试条为第一测试条,侧向流测定装置进一步包括第二测试条。该第二测试条包括缀合物垫。第二测试条的缀合物垫被配置为含有与标记缀合的针对目标分析物的结合试剂。该第二测试条的缀合物垫被配置为在测试开始后接收流体并且通过毛细管作用移动该流体。该第二测试条包括与该第二测试条的缀合物垫流体连接的膜。该第二测试条的膜被配置为通过毛细管作用使流体移动。该第二测试条的膜包括测试线,该测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂。该第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者。对该第一类型的蛋白质的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的第一类型的蛋白质结合。
在第二方面的另一个实施例中,其中测试条为第一测试条,侧向流测定装置进一步包括除第一测试条之外的多个测试条。所述多个测试条中的每个测试条包括缀合物垫。所述多个测试条中的每个测试条的所述缀合物垫被配置为含有与标记缀合的针对目标分析物的结合试剂。所述多个测试条中的每个测试条的缀合物垫被配置为在测试开始后接收流体并且通过毛细管作用移动该流体。所述多个测试条中的每个测试条包括与对应的测试条的缀合物垫流体连接的膜。所述多个测试条中的每个测试条的膜被配置为通过毛细管作用使流体移动。所述多个测试条中的每个测试条的膜包括测试线,该测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂。所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者。所述多个测试条中的每个测试条的测试线上的结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的对应类型的蛋白质结合。
在第二方面的另一个实施例中,膜包括对照线,该对照线包含针对缀合物垫所含有的针对目标分析物的一类结合试剂的固定化结合试剂。
在第二方面的另一个实施例中,标记为包含以下项中的至少一者的检测器:包含胶体金的金属溶胶;染料溶胶;有色乳胶颗粒;碳;荧光颗粒;铕标记等。
第二方面的实施例进一步包括芯吸垫,该芯吸垫被配置为维持从膜到该芯吸垫中的毛细管流;以及样品垫,该样品垫被配置为接收流体并且通过毛细管作用使样品流体转移至缀合物垫。
第二方面的另一个实施例进一步包括血浆过滤器,该血浆过滤器被配置为接收流体并且使流体转移至侧向流测定装置的缀合物垫和样品垫中的一者。
在第三方面,提供了一种方法和免疫测定装置,该方法和免疫测定装置接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测该外泌体的表面上的目标分析物的存在。该免疫测定装置包括检测位点和捕获位点。该方法和免疫测定装置进行检测位点与捕获位点之间的流体转移。该检测位点被配置为含有与标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白结合试剂。每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂被配置为与对应类型的外泌体四次穿膜蛋白结合并且形成包含外泌体的免疫复合物。该捕获位点包括针对目标分析物的固定化结合试剂。针对该目标分析物的该固定化结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的该目标分析物的蛋白质结合。
在第三方面的实施例中,检测位点和捕获位点为免疫测定装置的不同区域。
在第三方面的实施例中,其中检测位点和捕获位点为免疫测定装置的不同区域,该免疫测定装置为侧向流测定装置。
在第三方面的实施例中,检测位点和捕获位点为免疫测定装置的相同区域。
在第三方面的实施例中,检测位点和捕获位点为免疫测定装置的相同区域,该免疫测定装置为ELISA装置。
在第三方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过毛细管作用进行。
在第三方面的实施例中,其中检测位点与捕获位点之间的流体转移通过毛细管作用进行,免疫测定装置为LFA装置和微流体装置中的一者。
在第三方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过微流体芯片或介质进行。
在第三方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过自动化液体处理***进行。
在第三方面实施例中,其中检测位点与捕获位点之间的流体转移自动化液体处理***进行,免疫测定装置为ELISA装置。
在第三方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过自动化液体处理***结合微流体装置进行。
在第三方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过手动转移进行。
在第三方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过手动转移进行,免疫测定装置为ELISA装置。
在第四方面,提供了一种方法和免疫测定装置,该方法和免疫测定装置接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测该外泌体的表面上的目标分析物的存在。该免疫测定装置包括检测位点和捕获位点。该方法和免疫测定装置进行检测位点与捕获位点之间的流体转移。检测位点被配置为包含与标记缀合的针对目标分析物的结合试剂。针对目标分析物的固定化结合试剂被配置为与外泌体的表面上的该目标分析物的蛋白质结合并且形成包含外泌体的免疫复合物。捕获位点包括固定在捕获位点上的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白结合试剂。每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂被配置为与包含外泌体的免疫复合物中的对应类型的外泌体四次穿膜蛋白结合。
在第四方面的实施例中,检测位点和捕获位点为免疫测定装置的不同区域。
在第四方面的实施例中,其中检测位点和捕获位点为免疫测定装置的不同区域,该免疫测定装置为侧向流测定装置。
在第四方面的实施例中,检测位点和捕获位点为免疫测定装置的相同区域。
在第四方面的实施例中,检测位点和捕获位点为免疫测定装置的相同区域,该免疫测定装置为ELISA装置。
在第四方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过毛细管作用进行。
在第四方面的实施例中,其中检测位点与捕获位点之间的流体转移通过毛细管作用进行,免疫测定装置为LFA装置和微流体装置中的一者。
在第四方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过微流体芯片或介质进行。
在第四方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过自动化液体处理***进行。
在第四方面实施例中,其中检测位点与捕获位点之间的流体转移自动化液体处理***进行,免疫测定装置为ELISA装置。
在第四方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过自动化液体处理***结合微流体装置进行。
在第四方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过手动转移进行。
在第四方面的实施例中,检测位点与捕获位点之间的流体转移通过手动转移进行,免疫测定装置为ELISA装置。
以上描述以完整、清楚、简洁和准确的术语呈现了设想的实施本发明的实施例的最佳模式以及实践它们的方式和过程,以使它们所属领域的任何技术人员均能够实践这些实施例。然而,本发明的实施例易于采用与上文所述内容完全等价的修改和替代构造。因此,本发明不限于所公开的特定实施例。相反,本发明涵盖落入本公开的精神和范围内的所有修改和替代构造。
Claims (20)
1.一种侧向流测定装置,其包括:
测试条,其被配置为接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测所述外泌体的表面上的目标分析物的存在情况;
其中所述测试条包括:
缀合物垫,
其中所述缀合物垫被配置为含有与标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白结合试剂,其中每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂被配置为与对应类型的外泌体四次穿膜蛋白结合并且形成包含外泌体的免疫复合物;并且
其中所述缀合物垫被配置为在测试开始后接收所述流体并且通过毛细管作用使所述流体移动,以及
与所述缀合物垫流体连接的膜,
其中所述膜被配置为通过毛细管作用使所述流体移动,并且
其中所述膜包括测试线,所述测试线包含针对所述目标分析物的固定化结合试剂,其中针对所述目标分析物的所述固定化结合试剂被配置为与包含所述外泌体的免疫复合物中的外泌体的表面上的所述目标分析物的蛋白质结合。
2.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其中所述测试线为第一测试线,其中所述膜进一步包括第二测试线,所述第二测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,并且其中针对所述第一类型的蛋白质的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的所述第一类型的蛋白质结合。
3.根据权利要求2所述的侧向流测定装置,其中针对所述目标分析物的所述结合试剂为所述目标分析物的抗体,其中每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂为一种类型的四次穿膜蛋白抗体,并且其中针对所述第一类型的蛋白质的所述结合试剂为针对所述第一类型的蛋白质的抗体。
4.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其中所述测试线为第一测试线,其中所述膜进一步包括除所述第一测试线之外的多条测试线,其中所述多条测试线中的每条测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,其中所述多条测试线中的每条测试线上的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的对应类型的蛋白质结合。
5.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其中所述测试条为第一测试条,其中所述侧向流测定装置进一步包括第二测试条,其中所述第二测试条包括:
缀合物垫,
其中所述第二测试条的所述缀合物垫被配置为含有与所述标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白抗体;并且
其中所述第二测试条的所述缀合物垫被配置为在所述测试开始后接收所述流体并且通过毛细管作用使所述流体移动,以及
与所述第二测试条的所述缀合物垫流体连接的膜,
其中所述第二测试条的所述膜被配置为通过毛细管作用使所述流体移动,并且
其中所述第二测试条的所述膜包括测试线,所述测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,并且其中针对所述第一类型的蛋白质的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的所述第一类型的蛋白质结合。
6.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其中所述测试条为第一测试条,其中所述侧向流测定装置进一步包括除所述第一测试条之外的多个测试条,其中所述多个测试条中的每个测试条包括:
缀合物垫,
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述缀合物垫被配置为含有与所述标记缀合的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白抗体;并且
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述缀合物垫被配置为在所述测试开始后接收所述流体并且通过毛细管作用使所述流体移动,以及
与对应的测试条的所述缀合物垫流体连接的膜,
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述膜被配置为通过毛细管作用使所述流体移动,并且
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述膜包括测试线,所述测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,并且其中所述多个测试条中的每个测试条的所述测试线上的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的对应类型的蛋白质结合。
7.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其中所述膜包括对照线,所述对照线包含针对所述缀合物垫所含有的一类所述四次穿膜蛋白结合试剂的固定化结合试剂。
8.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其中所述标记为包含以下中的至少一者的检测器:包含胶体金的金属溶胶;染料溶胶;有色乳胶颗粒;碳;荧光颗粒;和铕标记。
9.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其进一步包括:
芯吸垫,其被配置为维持从所述膜到所述芯吸垫中的毛细管流;和
样品垫,其被配置为接收所述流体并且通过毛细管作用使样品流体转移至所述缀合物垫。
10.根据权利要求1所述的侧向流测定装置,其进一步包括血浆过滤器,所述血浆过滤器被配置为接收所述流体并且使所述流体转移至所述侧向流测定装置的所述缀合物垫和样品垫中的一者。
11.一种侧向流测定装置,其包括:
测试条,其被配置为接收包含一定量的外泌体的一定量的流体并且检测所述外泌体的表面上的目标分析物的存在情况;
其中所述测试条包括:
缀合物垫,
其中所述缀合物垫被配置为含有与标记缀合的针对所述目标分析物的结合试剂,其中针对所述目标分析物的所述结合试剂被配置为与外泌体的表面上的所述目标分析物的蛋白质结合并且形成包含外泌体的免疫复合物;并且
其中所述缀合物垫被配置为在测试开始后接收所述流体并且通过毛细管作用使所述流体移动,以及
与所述缀合物垫流体连接的膜,
其中所述膜被配置为通过毛细管作用使所述流体移动,并且
其中所述膜包括测试线,所述测试线包含固定在所述测试线上的一组一种或多种类型的四次穿膜蛋白结合试剂,其中每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂被配置为与包含所述外泌体的免疫复合物中的对应类型的外泌体四次穿膜蛋白结合。
12.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其中所述测试线为第一测试线,其中所述膜进一步包括第二测试线,所述第二测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,并且其中针对所述第一类型的蛋白质的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的所述第一类型的蛋白质结合。
13.根据权利要求12所述的侧向流测定装置,其中针对所述目标分析物的所述结合试剂为所述目标分析物的抗体,其中每种类型的四次穿膜蛋白结合试剂为一种类型的四次穿膜蛋白抗体,并且其中针对所述第一类型的蛋白质的所述结合试剂为针对所述第一类型的蛋白质的抗体。
14.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其中所述测试线为第一测试线,其中所述膜进一步包括除所述第一测试线之外的多条测试线,其中所述多条测试线中的每条测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,其中所述多条测试线中的每条测试线上的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的对应类型的蛋白质结合。
15.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其中所述测试条为第一测试条,其中所述侧向流测定装置进一步包括第二测试条,其中所述第二测试条包括:
缀合物垫,
其中所述第二测试条的所述缀合物垫被配置为含有与所述标记缀合的针对所述目标分析物的所述结合试剂;并且
其中所述第二测试条的所述缀合物垫被配置为在所述测试开始后接收所述流体并且通过毛细管作用使所述流体移动,以及
与所述第二测试条的所述缀合物垫流体连接的膜,
其中所述第二测试条的所述膜被配置为通过毛细管作用使所述流体移动,并且
其中所述第二测试条的所述膜包括测试线,所述测试线包含针对第一类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述第一类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,并且其中针对所述第一类型的蛋白质的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的所述第一类型的蛋白质结合。
16.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其中所述测试条为第一测试条,其中所述侧向流测定装置进一步包括除所述第一测试条之外的多个测试条,其中所述多个测试条中的每个测试条包括:
缀合物垫,
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述缀合物垫被配置为含有与所述标记缀合的针对所述目标分析物的所述结合试剂;并且
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述缀合物垫被配置为在所述测试开始后接收所述流体并且通过毛细管作用使所述流体移动,以及
与对应的测试条的所述缀合物垫流体连接的膜,
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述膜被配置为通过毛细管作用使所述流体移动,并且
其中所述多个测试条中的每个测试条的所述膜包括测试线,所述测试线包含针对对应的多种类型的蛋白质中的一种类型的蛋白质的固定化结合试剂,其中所述多种类型的蛋白质中的每种类型的蛋白质为肿瘤特异性蛋白质和器官特异性蛋白质中的一者,并且其中所述多个测试条中的每个测试条的所述测试线上的所述结合试剂被配置为与包含外泌体的所述免疫复合物中的所述外泌体的所述表面上的对应类型的蛋白质结合。
17.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其中所述膜包括对照线,所述对照线包含针对所述缀合物垫所含有的针对所述目标分析物的一类所述结合试剂的固定化结合试剂。
18.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其中所述标记为包含以下中的至少一者的检测器:包含胶体金的金属溶胶;染料溶胶;有色乳胶颗粒;碳;荧光颗粒;和铕标记。
19.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其进一步包括:
芯吸垫,其被配置为维持从所述膜到所述芯吸垫中的毛细管流;和
样品垫,其被配置为接收所述流体并且通过毛细管作用使样品流体转移至所述缀合物垫。
20.根据权利要求11所述的侧向流测定装置,其进一步包括血浆过滤器,所述血浆过滤器被配置为接收所述流体并且使所述流体转移至所述侧向流测定装置的所述缀合物垫和样品垫中的一者。
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