CN117904134A - 与玉米穗行数相关的基因、蛋白质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开与玉米穗行数相关的基因、蛋白质及其应用，本发明提供了一种调控玉米穗行数的基因Zm00001d013502基因及其编码蛋白，可为提高玉米穗行数品种的培育提供新的目标基因资源及遗传改良提供新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及与玉米穗行数相关的基因、蛋白质及其应用。
背景技术
玉米(Zeamays L.)是世界三大主粮作物之一，在保障粮食安全，缓解能源危机等方面具有重要作用。保障玉米的高产稳产对我国的粮食安全建设具有重要意义。
穗行数是衡量玉米籽粒产量的重要指标之一。在籽粒大小和重量不变，行粒数也不变的前提下，穗行数的多少决定着玉米穗的产量。作为影响玉米产量的因素，通过改造穗行数实现玉米增产有重要意义。穗行数作为产量构成要素之一，其遗传力高于产量遗传力，且与单株产量成极显著正相关，这表明对穗行数进行遗传改良是提高玉米产量的一种有效途径。故聚焦于穗行数，通过分子水平提高玉米的穗行数及其育种是具有重要的意义的。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明对玉米进行研究，发现位于第5染色体上的Zm00001d013502基因与玉米穗行数相关，就此深入研究，形成了本发明的技术方案，将Zm00001d013502基因应用于对玉米穗行数的调控，为提高玉米的穗行数及其育种提供新的靶点及其方向。
本发明的技术方案如下：
本发明的目的之一是提供：
与玉米穗行数相关的基因，所述基因为位于第5染色体上的Zm00001d013502基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Zm00001d013502基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的目的之二是提供：
Zm00001d013502基因或其编码蛋白的应用，所述基因为位于第5染色体上的Zm00001d013502基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Zm00001d013502基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述应用为下述任一种：
1)在提高玉米穗行数中的应用；
2在玉米育种中的应用
本发明的目的之三是提供：
一种提高玉米穗行数的方法，利用基因编辑技术干扰Zm00001d013502基因在玉米中的表达与翻译或敲除Zm00001d013502基因来实现穗行数的提高。
进一步地，所述的敲除是利用CRISPR/Cas9***靶向敲除Zm00001d013502基因，获得敲除突变体植株。
进一步地，所述CRISPR/Cas9***包括表达靶向Zm00001d013502基因的sgRNA的载体；
所述的靶向Zm00001d013502基因的gRNA序列如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:5所示：
SEQ ID NO:3CCCGCGGCCACGGTGAGGTCGGT；
SEQ ID NO:4CCGTGCTGGCGGGCGTCCTCGCG；
SEQ ID NO:5GTCCTCGCGCGGGTCTGTGGCGG。
本发明的目的之四是提供：
.一种玉米育种方法，育种时，以上获得的敲除突变体植株为玉米种质亲本。
采取上述技术方案，具有的有益效果如下：
本发明提供了一种调控玉米穗行数的Zm00001d013502基因及其编码蛋白，可为提高玉米穗行数的培育及其育种提供新的目标基因资源；通过将Zm00001d013502基因及其编码蛋白在提高穗行数的的应用，具体可通过利用基因编辑技术干扰Zm00001d013502基因在玉米中的表达与翻译或敲除来提高玉米穗行数，并且通过验证，通过CRISPR/Cas9方法靶向敲除Zm00001d013502基因获得的玉米株系，穗行数增加，有利于产量的提升，为高穗行数的玉米的的遗传改良及培育提供新的方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例中定位群体时的亲本材料表型；
图2为qKRN5.02的精细定位过程；
图3为Zm00001d013502表达量分析；
图4为Zm00001d013502敲除事件的基因型；
图5为Zm00001d013502敲除事件的穗行数表型。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步说明。
实施例1：Zm00001d013502基因与玉米穗行数相关性的确定
1、材料
亲本材料：农531(N531)和四路糯。其中，农531是一种温带玉米自交系，穗行数可达18-22行。四路糯是我国云南西双版纳地区的农家地方品种，具有一系列玉米原始性状特征，穗行数很少，一般只有4-6行。通过3年共6个世代的自交与选择，获得了穗行数稳定为4行的四路糯选系。
定位群体：以农531为轮回亲本，通过不断地回交、自交以及分子标记辅助选择，构建了含有四路糯片段的导入系3455。再利用导入系3455和农531杂交构建F2分离群体。亲本材料表型见附图1。
2、实验方法
2.1田间试验设计与表型鉴定
在田间种植农531与IL3455构建的穗行数分离群体，采用随机区组设计的方法，种植于中国农业科学院作物科学研究所昌平试验站(39.48°N，116.28°E)。采用单行区种植，行长3米，每行12株，行距为58厘米。田间管理采用当地管理方式。待植株成熟之后，选取8-12个成熟果穗，进行穗行数表型考察。取平均值用于后续的数据分析。
2.2、玉米叶片基因组DNA提取(CTAB法)
(1)在玉米授粉前后，用打孔器取幼嫩叶片置于96孔板离心管中，放入合适大小的钢珠，同时在每个板上标记清楚；
(2)将装有新鲜嫩叶的96孔板，置于液氮速冻30s，在打样机上进行打样，直至粉碎；
(3)利用12孔的移液器，取400μl提前在65℃预热的CTAB溶液，加到样品粉碎的96孔板之中，盖严帽子，用力摇匀，使叶片充分被CTAB溶液裂解；
(4)在65℃烘箱中裂解30min之后，用同样的方法加入400μl的三氯甲烷-异戊醇溶液(24:1溶液)，轻轻晃动10min，注意用力不可过猛，防止DNA破裂降解；
(5)之后，将96孔板放置于离心机中，4℃，4000rpm，离心20min；
(6)从离心机中轻轻取出96孔板，吸取上清200μl，加入到新的96孔板中；
(7)之后加入同样体积的冰冻异丙醇进行DNA沉淀，在-20度冰箱中放置半小时，使DNA充分沉淀；
(8)待DNA沉淀后，将96孔板放置于离心机中，4℃，4000rpm，离心20min；
(9)倒掉异丙醇，加入75％酒精漂洗DNA，4000rpm，离心20min；
(10)重复一次(9)；
(11)倒掉酒精，加入无水乙醇漂洗一次，4000rpm，离心20min，弃上清液；
(12)将96孔板置于通风橱晾干；
(13)待DNA晾干之后，加入100μl的去离子水，溶解DNA，之后利用移液器转移到96孔PCR板中。
下所用的分子标记为Indel标记，标记信息如下(表1)：
表1：
PCR反应程序如下(表2)：
表2：
2.3、基因型鉴定
8％的非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤如下：
(1)将平玻璃板和凹玻璃板平铺于实验台上，用酒精擦拭干净，之后待酒精蒸发完全之后，用夹子将平板和凹版固定在一起，凹板在上，平板在下；
(2)把提前配置好的8％聚丙烯酰胺溶液缓慢均匀地倒入平板和凹板之间，注意从一侧缓慢倒入，不要产生气泡，如若产生气泡则利用轻薄的拨片将气泡赶出。之后，***102孔的梳子，待胶凝固充分之后，放入到电泳槽之中进行电泳；
(3)将平板和凹板固定在电泳槽之中，加入缓冲液；
(4)轻轻拔出梳子，注意不要用力过大，以防胶孔被破坏，用8孔道的移液器吸取PCR产物1μl。设置电压为240V，电泳时间根据PCR产物大小决定，一般70-80min即可；
(5)待电泳结束之后，断电，之后将玻璃板从电泳槽中取出来，用铁片将平板和凹板分开，将胶轻轻地从玻璃板上剥离下来，放置于塑料盒中，用于银染；
(6)在装有胶的塑料盒中加入200ml的蒸馏水，洗净缓冲液，之后加入200ml的蒸馏水和2ml的1％的硝酸银溶液，放置于摇床之上，轻轻摇晃10min。之后，将硝酸银溶液倒到废液缸中，再次加入蒸馏水，洗涤2到3次，之后加入200ml的氢氧化钠溶液和2ml的甲醛，放置于摇床之上，轻摇10min，待显示出金黄色条带之后，用蒸馏水洗净，放置于玻璃板之上，用保鲜膜进行覆盖，做好标记，包括实验时间和点样样品。
2.4、表达量分析
种植农531和IL3455，待其幼穗发育到2mm和5mm时进行取样，每个材料取三个重复，每个重复含15个单株。提取RNA，并反转获得cDNA，具体步骤如下：
RNA提取采用TRIzol法进行，所有器皿经过180度高温灭菌1小时，喷涂核酸清除剂从而除掉RNase。
(1)向研钵中倒入液氮，之后将-80度保存的幼穗组织取出进行充分研磨，期间不断加入液氮，以免发生组织降解；
(2)将1.5ml的离心管在液氮之中进行速冻，加入研磨充分的样品，不宜过多，加到1/3处，之后加入1ml的TRIzol溶液，使用涡旋仪震荡，使其与样品充分接触，室温下静置10min；
(3)将离心管放置于4度离心机中进行离心，转速12000，时间15min，之后将上清置于新的1.5ml离心管中；
(4)之后加入200μl的氯仿(无RNase)，用手轻轻混匀，静置15min；
(5)将离心管放置于离心机中离心，转速12000，时间15min，用无RNase枪头将上清液移到新的离心管中；
(6)加入等体积的异丙醇，轻微混匀；
(7)将离心管放置于离心机中离心，转速12000，时间15min，用无RNase枪头将上清液吸出扔掉；
(8)加入500μl的75％乙醇，洗涤RNA沉淀；
(9)将离心管放置于离心机中离心，转速12000，时间15min，用无RNase枪头将乙醇吸出扔掉，晾干离心管，加入40μl左右的无RNase的ddH2O，使沉淀充分溶解；
(10)取1μl的RNA溶液和4μl的loadingbuffer混合，利用琼脂糖凝胶电泳检测，判断RNA浓度和纯度；
(11)取3μl的RNA溶液用于反转录合成cDNA，反应体系为20μl，将各组分混匀之后置于0.2ml的无RNase离心管中，具体体系如下表3：
表3：
(12)将以上体系混匀之后，放置于50度水浴锅中，反应15min左右；
(13)取出之后放入到85度水浴锅中，加热5秒；
(14)将得到的cDNA原液，用无RNase的ddH2O稀释5倍，用作模板，以内参基因GAPDH引物进行扩增，检测反转效果，放置于-20度冰箱中备用；
(15)荧光定量分析体系为20μl，各组分体积如下表4所示：
表4：
(16)荧光定量分析PCR程序如下，扩增40个循环(见表5)：
表5：
采用2-ΔΔCt法分析候选基因在不同材料间的表达水平，三次重复，取平均值，计算标准差。
2.5、结果显示
(1)qKRN5.02的精细定位
上利用农531和IL3455构建了穗行数分离群体，通过5个后代重组家系将qKRN5.02定位至222kb区间内。为了进一步缩小区间，开发新的标记并挑选重组家系与轮回亲本农531杂交，构建分离群体，进一步筛选到的3个纯合的重组事件。对重组事件进行穗行数表型鉴定和统计分析，将qKRN5.02精细定位至M13至5-13120562之间，二者在B73_V5参考基因组上相距29.5kb之内(图2)。
(2)qKRN5.02候选基因的表达量分析
在qKRN5.02的定位区间内，Zm00001d013502基因在雌幼穗中特异性高表达(图3a-b)。在幼穗发育的两个关键时期剥取农531和IL3455的幼穗，进行了候选基因的表达量分析。结果表明在2mm和5mm两个时期，Zm00001d013502在IL3455中的表达量均显著高于农531(图3d)。农531和IL3455转录组数据也证实了这一结果(图3c)，且农531穗行数显著多于IL3455(图1b-c)。
(3)以上结果表明，Zm00001d013502的表达水平负调控穗行数的形成，其与玉米穗行数的形状是相关的。
其中Zm00001d013502的核苷酸序列如下SEQ ID NO:1所示：
ATGGCGACGGTGCCGGTGCCGTTGCCGTGGCCGAGCGTGAGGAGGTCGCTGCAGGAGGGGGCCGCCAGCGCGGCATCGTACGAGCGGCGAGCTCCGTGGCAGGGGGCGGCGCGGCCCGCGGCCACGGTGAGGTCGGTGGAGACGCTGGTGGTGATCGTGGCCGCGATCGTGCTCGCCGCCGTGCTGGCGGGCGTCCTCGCGCGGGTCTGTGGCGGGCGGCACGTCGTGCCGAGCGCCCAGTACCACGACGAGGAAGGCTGGGTGGAGAGGCGCTGCCGGAGCTGCCTCGACAGCGGGCTGCCGCCGCCGGAGCAGGGGGCGTCCAAGACGAGCGAGGCCAAATAG；
所述Zm00001d013502编码的蛋白的氨基酸序列如下SEQ ID NO:2所示
MATVPVPLPWPSVRRSLQEGAASAASYERRAPWQGAARPAATVRSVETLVVIVAAIVLAAVLAGVL ARVCGGRHVVPSAQYHDEEGWVERRCRSCLDSGLPPPEQGASKTSEAK。
3、Zm00001d013502基因功能验证
材料：
植物材料：玉米自交系B104
3.1、候选基因基因组DNA的扩增
从玉米Maize sequence数据库(http://www.maizesequence.org)下载参考基因组B73对应的候选基因序列，在基因组5’UTR和3’UTR区域利用Primer5软件设计引物，以玉米自交系B104幼苗基因组DNA为模板扩增候选基因组全长DNA，扩增体系如下表6所示：
表6：
PCR扩增程序如下表7所示：
3.2、候选基因基因组DNA片段回收与测序
片段回收：主要参考南京诺唯赞生物科技股份有限公司的DNA凝胶回收试剂盒说明书。
(1)DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。
(2)加入3倍体积的Buffer GDP。55℃水浴10min，期间颠倒混匀2次加速溶胶。
(3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNAMini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中，把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心60s。
(4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min，12,000×g离心60s。
(5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心60s。
(6)重复步骤5。
(7)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。12,000×g离心2min。
(8)将吸附柱置于1.5ml灭菌的离心管中，加入20-30μl Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。12,000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20度。
回收片段的连接和转化:主要参考天根生物的pLB零背景快速克隆试剂盒说明书。
(1)将上述的DNA回收的片段连接到pLB载体，连接体系(10μl)如下表8所示：
表8：
轻弹离心管以混匀反应液，短暂离心3-5s。
(2)将混合反应液放入22度恒温金属浴中反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上，进行后续的转化实验。
(3)制备含有氨苄青霉素终浓度为100ug/ml的LB琼脂糖平板。将平板放置在37度，预热20min。
(4)将10μl的连接产物加入到100μl的TOP10感受态细胞中(感受态细胞从-80度冰箱取出放置于冰上，待刚刚解冻时加入连接产物)，用手轻弹混匀，冰浴30min。
(5)之后将离心管放置于42度水浴锅中90s，取出后立即冰浴2-3min，期间不要摇动离心管。
(6)向离心管中加入500μl的LB(不含抗生素)培养基，150rpm、37度震荡培养45min，使菌体复苏。
(7)将离心管中的菌液混匀，取100μl加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻地将菌液涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37度恒温培养12-16h。
(8)取出平板，挑取乳白色的阳性单克隆至500μl的LB液体培养基(加入抗生素)，37度震荡培养，带菌液混浊后，利用pLB载体通用引物进行菌液PCR，经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的克隆进行测序。
3.3、候选基因CRISPR-Cas9载体构建及转化玉米自交系B104
(1)载体线性化
用Nco1内切酶37度水浴切割载体。
体系如下表9：
表9：
37度水浴1h，之后切胶回收。
(2)Zm00001d013502gRNA片段设计
利用CRISPR-P2.0网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)设计目标基因的gRNA序列为：
CCCGCGGCCACGGTGAGGTCGGT(SEQ ID NO:3)；
CCGTGCTGGCGGGCGTCCTCGCG(SEQ ID NO:4)；
GTCCTCGCGCGGGTCTGTGGCGG(SEQ ID NO:5)。
(3)之后连接载体线性片段和gRNA片段。体系如下表10：
表10：
轻轻混合，50度反应15分钟。
(4)转化
在冰上融化Trans1-T1感受态细胞，在50μl感受态细胞中加入10μl的重组产物，轻轻弹动离心管混匀，冰上放置30分钟，之后42度水浴中热激30秒，之后马上转移至冰上冷却2分钟，加入500μl常温的LB培养基，之后37度摇床中180rpm培养1小时，之后取100μl细胞均匀涂在具有卡那霉素抗性的LB平板上，在37度培养箱中过夜培养。之后进行阳性克隆筛选，测序正确的菌液提取质粒待用。
(5)将测序正确的质粒送至北京博美兴奥科技有限公司进行玉米自交系B104的遗传转化实验。
3.4、结果分析
(1)Zm00001d013502基因在玉米自交系B104中被敲除
取植株的叶片，提取DNA后扩增目的基因，进行目的基因敲除转基因事件的基因型分析。结果发现，目的基因在阳性转基因事件中被敲除，表明成功获得了目的基因的敲除转基因事件。基因型鉴定结果如下表11和图4所示：
表11：
(2)穗行数表型鉴定
籽粒成熟后，收获基因敲除阳性植株和野生型B104的果穗进行穗行数表型鉴定。结果发现，与转化受体玉米自交系B104植株相比，KO-1、KO-2、KO-3穗行数显著增加(图5)。可以看出，敲除Zm00001d013502基因可提高玉米自交系的穗行数。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.与玉米穗行数相关的基因，其特征在于，所述基因为位于第5染色体上的Zm00001d013502基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Zm00001d013502基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的Zm00001d013502基因或其编码蛋白的应用，其特征在于，
所述应用为下述任一种：
1)在提高玉米穗行数中的应用；
2在玉米育种中的应用。
3.一种提高玉米穗行数的培育方法，其特征在于，利用基因编辑技术干扰Zm00001d013502基因在玉米中的表达与翻译或敲除Zm00001d013502基因来提高玉米穗行数。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的敲除是利用CRISPR/Cas9***靶向敲除Zm00001d013502基因，获得敲除突变体植株。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9***包括表达靶向Zm00001d013502基因的sgRNA的载体；
所述的靶向Zm00001d013502基因的gRNA序列如SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:5所示：
SEQ ID NO:3CCCGCGGCCACGGTGAGGTCGGT；
SEQ ID NO:4CCGTGCTGGCGGGCGTCCTCGCG；
SEQ ID NO:5GTCCTCGCGCGGGTCTGTGGCGG。
6.一种玉米育种方法，其特征在于，育种时，以权利要求4获得敲除突变体植株为玉米种质亲本。
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