CN117903294A - 一种发酵生产乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母及其构建方法与应用 - Google Patents
一种发酵生产乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母及其构建方法与应用。本发明提供了一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加分子伴侣Calnexin的表达，从而获得用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。本发明对于提高马克斯克鲁维酵母发酵生产乳铁蛋白的产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种发酵生产乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母及其构建方法与应用。
背景技术
乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，也是中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白。其分子量为80 kDa，它由689个氨基酸组成，无味，粉末呈粉红色，易溶于水。该多肽链由两个球形裂片组成，其中羧基和氨基端由α螺旋连接。每个叶瓣由两个结构域分子组成，结构域被称为C1、C2、N1和N2，它们形成一个β-薄片，且每个乳铁蛋白分子能够螯合两个Fe3+。主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，包括泪液、***、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞。
乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫***等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。这些功能性质密切依赖于乳铁蛋白的结构完整性，特别是其高阶构象。乳铁蛋白还具有调节脂质代谢的能力，这不仅可以更好地调节饱腹感机制，还有助于对抗脂肪组织积累的趋势。乳铁蛋白在疾病防治、营养补充、食品和药品防腐、化妆品等方面有广阔的应用前途。同时，乳铁蛋白由于具备抗氧化活性、杀菌、抑制黑色素生成和皮肤损伤修复的功能，也常作为化妆品中重要添加组分之一。随着人们对健康的关注，越发激起了科研工作者对乳铁蛋白的功能活性研究兴趣。
目前，获取乳铁蛋白的最直接的方法是从人乳中分离提取，但是人乳中的乳铁蛋白含量较低，提取1 g的高纯度乳铁蛋白需要14-18公斤的优质人奶，而且从人乳汁中提取乳铁蛋白有违人伦标准。同时，人体消化吸收异源蛋白可能带来一定的负面影响，如过敏反应。而科研工作者们为了解决这类问题，采用了基因工程方式构建工程菌株，进而发酵获取大量的乳铁蛋白。当前用于生产乳铁蛋白的宿主细胞包括：大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和植物细胞。大肠杆菌作为原核模式生物，具有营养要求低，易生长，周期短的优点，但是其没有成型的细胞器和完整的糖基化修饰***，因此无法产生具有生物活性的目的蛋白，而哺乳动物细胞和植物细胞容易污染、生长环境要求严格、生长周期长等因素不适宜作为大批量生产LF的基底细胞。
酵母细胞能够基本规避上述细胞存在的不足，作为最简单的真核生物，具备了基本的生产条件。研究者通过优化表达***中关键元件后，发现随着目的蛋白表达水平的增强，细胞的分泌***无法满足蛋白分泌，引起蛋白的胞内降解，影响细胞的生长状态，导致目的蛋白的产量降低。因此，为了增加目的蛋白产量，首要解决的是蛋白能够进入内质网进行正确的折叠修饰，从而实现蛋白的大量分泌。
发明内容
为解决上述技术问题，促进乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中正确折叠，并能够快速的分泌到细胞外，实现增强乳铁蛋白的高效表达，本发明在细胞内使用马克斯克鲁维酵母原有启动子Gap3增加分子伴侣Calnexin的表达，并验证了分子伴侣Calnexin对人乳铁蛋白表达量的影响，通过摇瓶发酵菌株，获取上清中的蛋白，进行验证发现，分子伴侣Calnexin对乳铁蛋白的表达量具有促进作用，获得了人乳铁蛋白高效合成的马克斯克鲁维酵母菌株。本发明不仅实现了提高马克斯克鲁维酵母发酵生产人乳铁蛋白产量的目的，同时也提供了一种增加马克斯克鲁维酵母中乳铁蛋白分泌表达水平的方法。
第一方面，本发明要求保护一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法。
本发明要求保护的构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，可包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加分子伴侣Calnexin的表达，从而获得用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。
该方法中，通过增加所述分子伴侣Calnexin的表达，实现促进所述人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达。
其中，所述分子伴侣Calnexin基因来自于里氏木霉QM6a；进一步地，所述分子伴侣Calnexin的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述人乳铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地，在所述马克斯克鲁维酵母受体菌中表达所述人乳铁蛋白可通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述人乳铁蛋白的编码基因实现。
进一步地，采用所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加所述分子伴侣Calnexin的表达可通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述分子伴侣Calnexin的基因表达框实现；在所述分子伴侣Calnexin的基因表达框中，由所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子启动所述分子伴侣Calnexin的编码基因的表达。
更进一步地，所述人乳铁蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
更进一步地，在所述分子伴侣Calnexin的基因表达框中，所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述分子伴侣Calnexin的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明的具体实施方式中，所述分子伴侣Calnexin的基因表达框***并替换了所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的Och1基因。敲除Och1基因是为了阻断酵母的高甘露糖基化修饰，为后续的糖基化修饰做准备。真核生物在内质网中的N糖基化修饰都是高度保守的，不同点在于转运到高尔基体后，酵母通过Och1基因在α-1,3甘露糖上添加了一个α-1,6甘露糖，然后其他的甘露糖转移酶和磷酸甘露糖转移酶以此糖链结构为基础向上继续添加甘露糖，最终形成高甘露糖型结构。
具体地，所述分子伴侣Calnexin的基因表达框***并替换所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的Och1基因是通过同源重组实现的。进行所述同源重组的上游同源臂的序列如SEQ ID No.6所示，下游同源臂的序列如SEQ ID No.7所示。
在本发明的具体实施方式中，所述马克斯克鲁维酵母受体菌为马克斯克鲁维酵母KM::△ura3；所述马克斯克鲁维酵母KM::△ura3为将马克斯克鲁维酵母FIM1基因组中的Ura3基因敲除后所得菌株。因生产要求不得引入抗性筛选标记，故敲除基因组Ura3基因。
本发明所要求保护的构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，其也是促进人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的方法。
第二方面，本发明要求保护一种用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。
本发明所要求保护的用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株是采用前文第一方面中所述方法构建得到的。
第三方面，本发明要求保护前文第二方面中所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株在发酵生产人乳铁蛋白中的应用。
实验证明，与原有的表达体系相比，当分子伴侣Calnexin整合到马克斯克鲁维酵母宿主后，乳铁蛋白的分泌得到明显的改善，减少了降解带的生成，经ELISA检测乳铁蛋白的表达量为对照组的5.1倍，达到了735μg/L。本发明对于提高马克斯克鲁维酵母发酵生产乳铁蛋白的产量具有重要意义。
附图说明
图1为筛选的目的克隆菌株的菌落PCR验证结果。箭头标注的是获取的纯合子菌株KM::△ura3::Calnexin，其余为杂合子即Och1基因仍然存在1个拷贝。
图2为Calnexin基因和LF基因转录水平结果。
图3为乳铁蛋白的表达量的SDS-PAGE图。其中，泳道1为乳铁蛋白标品；泳道2为阴性对照KM::△ura3/pUKDN119-LF的上清蛋白；泳道3为KM::△ura3::Calnexin/pUKDN119- LF上清蛋白。箭头所示为乳铁蛋白。
图4为乳铁蛋白的表达量的Western Blot图。其中，泳道1为乳铁蛋白阳性标品（阳性乳铁蛋白存在降解，故出现一个比目的条带更深的条带）；泳道2为阴性对照KM::△ura3/ pUKDN119-LF的上清蛋白；泳道3为KM::△ura3::Calnexin/pUKDN119-LF上清蛋白。箭头所示为乳铁蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
马克斯克鲁维酵母FIM1（CGMCC No.10621）：记载于“Liu Y, Mo WJ, Shi TF.Mutational Mtc6p attenuates autophagy and improves secretory expression ofheterologous proteins in Kluyveromyces marxianus. Microb Cell Fact. 2018 Sep14;17(1):144. doi: 10.1186/s12934-018-0993-9. PMID: 30217195; PMCID:PMC6138896.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。马克斯克鲁维酵母KM::△ura3为将马克斯克鲁维酵母FIM1的基因组中的Ura3基因敲除后所得菌株，在上述文献中也有相关记载。
实施例1、分子伴侣Calnexin优化策略
本发明中所使用的分子伴侣Calnexin来自于里氏木霉QM6a，其氨基酸序列如SEQID No.1所示。在氨基酸序列不变的情况下，根据马克斯克鲁维酵母密码子高使用频率表（表1）对其核苷酸序列进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2、供体DNA的扩增
选用马克斯克鲁维酵母内源Gap3启动子表达Calnexin分子伴侣，Gap3启动子是一种葡萄糖碳源型启动子，而在发酵过程中使用的碳源又是葡萄糖，有利于Gap3启动子提升Calnexin基因的转录水平。
使用引物Up-F和Up-R（表2），以马克斯克鲁维酵母KM::△ura3基因组为模板进行PCR扩增，获得敲入Och1位点的Up同源臂（SEQ ID No.6）。
使用引物Calnexin-F和Calnexin-R（表2），以重组质粒pUC57-PGap3- Calnexin为模板扩增得到“Gap3启动子及Calnexin基因”片段，所述“Gap3启动子及Calnexin基因”片段为将SEQ ID No.3（Gap3启动子）和SEQ ID No.2（优化后的Calnexin基因）顺次首尾相连后所得。其中，重组质粒pUC57-PGap3-Calnexin为在pUC57质粒的EcoRV位点***“SEQ ID No.3+SEQ ID No.2”所示DNA片段后所得重组质粒。
使用引物Down-F和Down-R（表2），以马克斯克鲁维酵母KM::△ura3基因组为模板进行PCR扩增，获得敲入Och1位点的Down同源臂（SEQ ID No.7）。
进一步地，以上述获得的3个扩增产物为模板，使用引物Up-F和Down-R进行PCR扩增，即可获取Overlap PCR产物。该产物即为供体DNA片段，从5’端到3’端依次包含Och1位点的Up同源臂（SEQ ID No.6）、Gap3启动子（SEQ ID No.3）、Calnexin基因（SEQ ID No.2）和敲入Och1位点的Down同源臂（SEQ ID No.7）。
实施例3、基因编辑质粒的构建
首先使用SapI 内切酶（Takara ，货号1631）对LHZ531质粒（该质粒的全序列见SEQID No.8，在该质粒中具有TEF1启动子、Cas9基因、CYC1终止子、Ura3启动子及其基因、ARS1终止子、氨苄青霉素基因、导向RNA、tRNA-gly）进行酶切，回收大片段。而后在马克斯克鲁维酵母KM::△ura3基因组中找到Och1编辑位点，根据N20序列设计要求在Och1基因内部找到NGG目标序列前的20个碱基。在N20引物（表3）5’端添加SapI酶切位点的连接粘性末端，分别为TCA和AAC。取稀释后两条N20引物（表3中N20）各10 µL混合，95 ℃，3 min，随后室温10min。最后使用T4连接酶（Biolab，货号B0202S）将N20序列与LHZ531大片段相连，并转化DH5a感受态，涂布氨苄LB板。待次日验证，引物使用YY161F 和N20-R，若有1000 bp大小的PCR产物则质粒构建成功，无产物则构建失败。上述所涉及到的引物序列具体如表3所示。
注：SEQ ID No.18中的V表示A或C或G。
最终获得基因编辑质粒，命名为LHZ531-N20。即将LHZ531质粒的两个酶切位点SapI之间的小片段替换为accggcgtataacatgtcag（即SEQ ID No.16的第4-23位）后得到的重组质粒。
实施例4、编辑质粒LHZ531-N20和供体DNA的酵母化学转化
挑取马克斯克鲁维酵母KM::△ura3单菌落于30 mL YPD培养基中，培养至OD600大于10，而后取菌液于2 mL Ep管中离心获取沉淀，取3 mL 1M LiAc和3 mL 10×TE（配方：100mM Tris-HCl，10 mM EDTA 使用NaOH调节pH=8.0）加无菌水至30 mL，混匀即可获取1×LiAc/TE缓冲液。使用1×LiAc/TE缓冲液1mL洗沉淀两次，除去上清，随后在沉淀中央添加5µL Carrier DNA（Takara，货号630440），并添加1 µg实施例2所获取的供体DNA片段和500ng实施例3构建的编辑质粒LHZ531-N20，使用枪头轻柔混匀，最后添加 300 µL PEG/LiAc/TE溶液（配制方法：40 g PEG溶于水至刻度线80 mL，115 ℃，20 min灭菌，取无菌的1 MLiAC和10×TE 各10 mL加入其中混匀即可），温柔混匀，在体系中添加适量1 M DTT，DTT终浓度为10 mM，再次混匀，随后30 ℃水浴15 min，47 ℃水浴15 min，最后离心获取沉淀，添加150 µL 无菌水混匀，涂布SD板，30 ℃培养箱中2-4天，直至长出单菌落，所筛选的目的克隆KM::△ura3::Calnexin如图1，目的条带大小3353 bp。
实施例5、表达质粒pUKDN119-LF的底盘细胞转化
使用SacII（NEB，R0157S）和Spe I（NEB，R3133S）内切酶对pUKDN119质粒（全序列见SEQ ID No.9，该质粒中包含元件：PKD1片段，菊粉酶启动子及信号肽、PMD18-T、菊粉酶终止子、Ura3启动子、Ura3基因）进行酶切，回收大片段。随后使用引物LF-F/R以生工合成的含有人乳铁蛋白编码基因的质粒为模板对乳铁蛋白编码基因进行扩增，并在引物两端添加对应的酶切位点，同时进行剪切，回收处理后与pUKDN119载体大片段按照摩尔比1:4混合，使用T4连接酶连接，所得重组质粒命名为pUKDN119-LF。该重组质粒的结构描述为：将pUKDN119质粒的酶切位点SacII和Spe I之间的小片段替换为人乳铁蛋白编码基因（SEQ ID No.5）后所得的重组质粒。人乳铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其对应的编码基因序列如SEQ ID No.5所示。
最后将重组质粒pUKDN119-LF转化入实施例4所获取的底盘细胞KM::△ura3:: Calnexin中，操作过程参考实施例4。待长出单菌落，使用引物PINU-F和LF-R对其进行验证，扩增出条带为2200 bp的单菌落为正确，随后测序。该实施例所涉及的引物如表4所示。将最终获得的阳性转化子命名为KM::△ura3::Calnexin/pUKDN119-LF。
同时将重组质粒pUKDN119-LF转化入底盘细胞KM::△ura3作为阴性对照，所得转化子命名为KM::△ura3/pUKDN119-LF。
实施例6、重组马克斯克鲁维酵母中分子伴侣和乳铁蛋白转录水平的测定
将上述实施例5获得的阳性转化子KM::△ura3::Calnexin/pUKDN119-LF首先在YPD培养基（配方：20 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 酵母粉，20 g/L葡萄糖）培养16 h，培养至OD600大于10，然后离心收集菌体，重悬于100 µL无菌水，涂布于PS稳定筛选板（配方：YPD培养基中添加5-氟尿嘧啶和琼脂粉，5-氟尿嘧啶终浓度为2 g/L，琼脂粉终浓度为20 g/L），30 ℃培养箱中直至长出单菌落。随后转板于PS板，次日挑取单菌落于YPD平板中，离心收集菌体，无菌水洗涤两次，使用酵母RNA提取试剂盒提取总RNA（庄盟生物，ZP407-1），操作步骤详见说明书。根据反转录试剂盒（Takara，Y1621）说明书获得cDNA，进一步通过KAPA的荧光定量试剂盒（货号：KK4601）对不同菌体中分子伴侣Calnexin和乳铁蛋白的转录水平进行测定。检测引物如表5所示。
结果如图2所示，以18s rDNA为内参基因，以18s rDNA转录水平为1，由图可见，Calnexin基因的转录水平为7.49，LF基因的转录水平为6.01。该结果表明Calnexin基因的加入有利于LF基因的转录，对后续完整乳铁蛋白蛋白的分泌具有辅助作用。
实施例7、重组马克斯克鲁维酵母中乳铁蛋白的翻译水平的检测
将上述实施例5获得的阳性转化子单菌落KM::△ura3::Calnexin/pUKDN119-LF挑取于YG培养基（配方：酵母粉20 g/L，葡萄糖40 g/L），在摇床中200 rpm，30 ℃持续发酵3天。然后，使用台式冷冻离心机8000 rpm，15 min离心收集上清液，并添加上清体积10 %的1M三氯乙酸对上清中的分泌蛋白进行沉淀，4 ℃过夜，次日12000 rpm，20 min，4 ℃离心，弃上清收集沉淀，使用预冷的无水乙醇2 mL清洗两次，弃上清然后开口置于冰上挥发乙醇，最后添加pH 8.5的 50 mM Tris-HCl溶解沉淀即为分泌蛋白。使用SDS-PAGE和westernblot对乳铁蛋白进行定量分析。
乳铁蛋白的表达量的SDS-PAGE图如图3所示，Western Blot图如图4所示。由图可见KM::△ura3::Calnexin/pUKDN119-LF能够表达完整LF，且阴性对照KM::△ura3/ pUKDN119-LF的上清中未出现完整大小的LF片段，说明分子伴侣Calnexin对LF的完整性及分泌具有促进作用。
实施例8、Elisa检测重组马克斯克鲁维酵母中乳铁蛋白的分泌情况
用包被液将实施例7中初期离心获取的上清作为抗原进行5倍稀释，同时使用LF（Saputo，1001102）作为标曲，初始浓度为10 mg/L，而后逐级5倍稀释至1.28×10-4mg/L每孔加100 μL包被液（配方：1.59 g Na2CO3 ，2.93 g NaHCO3，蒸馏水稀释至1000 mL），4 ℃冰箱2 h，倒尽板孔中液体，加150 μL洗涤液（配方：0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4•12H2O，0.5 mLTween-20；加蒸馏水至1000 mL），静止3 min，反复洗涤3次，除去洗涤液。加封闭液（配方：5g脱脂人奶溶解于100 mL洗涤液）100μL，37 ℃放置2 h，再洗涤3次，加稀释2000倍的一抗-兔抗乳铁蛋白（Bioss，bs-5810R）0.1 mL于各反应孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗涤。加0.1mL稀释6000倍的酶标二抗-山羊抗兔（生工，SA00001-2）于各反应孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗涤。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 mL，室温下反应3-10 min，每孔添加50 μL浓度为2 mol/L的H2SO4终止反应，于450 nm处在ELISA检测仪上读取数值，对所构建底盘细胞（即实施例5获得的阳性转化子单菌落KM::△ura3:: Calnexin/pUKDN119-LF）表达乳铁蛋白进行检测，测得OD450值后，根据LF标准曲线y=0.0556x+0.0758（y为OD450读值，x为LF浓度，R2=0.9575）算出乳铁蛋白的产量，三次重复测定的乳铁蛋白分泌产量均值为735 µg/L。具体如表6所示。
注：P<0.05表示两者之间具有显著性差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加分子伴侣Calnexin的表达，从而获得用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分子伴侣Calnexin的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述马克斯克鲁维酵母受体菌中表达所述人乳铁蛋白是通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述人乳铁蛋白的编码基因实现的；
采用所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加所述分子伴侣Calnexin的表达是通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述分子伴侣Calnexin的基因表达框实现的；在所述分子伴侣Calnexin的基因表达框中，由所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子启动所述分子伴侣Calnexin的编码基因的表达。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在所述分子伴侣Calnexin的基因表达框中，所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述分子伴侣Calnexin的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述分子伴侣Calnexin的基因表达框***并替换了所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的Och1基因。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母受体菌为马克斯克鲁维酵母KM::△ura3；所述马克斯克鲁维酵母KM::△ura3为将马克斯克鲁维酵母FIM1基因组中的Ura3基因敲除后所得菌株。
9.一种用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母工程菌株是采用权利要求1-8中任一所述方法构建得到的。
10.权利要求9所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株在发酵生产人乳铁蛋白中的应用。
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