CN117777276B

CN117777276B - 一种促进马克斯克鲁维酵母分泌表达人乳铁蛋白的方法

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Publication number: CN117777276B
Application number: CN202410199208.4A
Authority: CN
Inventors: 田愉; 金城; 葛亚平
Original assignee: Beijing Guoke Xinglian Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Guoke Xinglian Technology Co ltd
Priority date: 2024-02-23
Filing date: 2024-02-23
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2044-02-23
Also published as: CN117777276A

Abstract

本发明公开了一种促进马克斯克鲁维酵母分泌表达人乳铁蛋白的方法。本发明提供了一种促进人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的方法，包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加EmP47蛋白的表达，从而促进所述人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达。本发明对于提高马克斯克鲁维酵母发酵生产人乳铁蛋白的产量具有重要意义。

Description

一种促进马克斯克鲁维酵母分泌表达人乳铁蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种促进马克斯克鲁维酵母分泌表达人乳铁蛋白的方法。

背景技术

乳铁蛋白（Lactoferrin, LF）为一种能结合铁的糖蛋白，分子量大小约为80 kDa，转铁蛋白家族的成员之一。它的等电点（pI）为8.0-8.5。乳铁蛋白广泛存在于许多哺乳动物分泌物中，包括哺乳动物乳汁，唾液，眼泪，支气管和肠道分泌物以及中性粒细胞的次级颗粒。乳铁蛋白约700个氨基酸，由两个球形小叶组成，并且通过一个α-螺旋连接，它们被称为氨基端区域和羧基端区，在两个不同的温度下发生变性：约60℃和约90℃。乳铁蛋白的二级结构主要是α-螺旋和β-折叠交替排列，其高级结构是在二级结构的基础上，由多肽链折叠而成。

乳铁蛋白具有广泛的生物学特性，包括抗菌，抗病毒，抗炎，抗氧化剂，抗癌，免疫调节和酶活性等。同时，乳铁蛋白在体内还发挥着转运铁离子的作用。它被称为天然抗生素，是连接哺乳动物先天和适应性免疫***的重要成分。乳铁蛋白在生命的各个阶段都可以发挥其保护细胞的作用，因此，它被认为是一种新的抗菌、抗癌的药物。目前，乳铁蛋白在许多商品中皆有添加，如婴幼儿配方奶粉、营养补充剂、牙膏和化妆品等。乳铁蛋白具有多种促进健康的功能，在现实生活中应用广泛，越来越多的研究者将目光转向这个功能性蛋白。

目前，获得乳铁蛋白的方式主要是从牛乳中分离提取，然而，牛乳仅含有0.03-0.49g/L乳铁蛋白。在提取的过程中不仅价格昂贵，而且人体食用异源蛋白可能会带来一定的负面影响，产生抗原反应。为了获得大量乳铁蛋白，同时避免其带来的副作用，科研工作者们采用了基因工程方式构建工程菌株，进而发酵获取大量的乳铁蛋白。目前，生产乳铁蛋白的宿主细胞主要包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及植物细胞。大肠杆菌表达***缺乏糖基化修饰机制，导致不能生产具有生物活性的乳铁蛋白。哺乳动物细胞和植物细胞虽然能够进行适当的糖基化修饰，但是由于细胞生长周期长、培养复杂，难以实现大规模生产。

酵母细胞能够基本规避上述细胞存在的不足，作为最简单的真核生物，具备了基本的生产条件。在过去的十几年中，研究者以酵母细胞作为宿主进行了人乳铁蛋白的异源表达。酵母表达***虽然具有生长快，操作简单的特点，以及翻译后加工和修饰功能，但其***固有的一些缺陷比如人源性蛋白分子、细胞因子不能在酵母中高效表达，并且蛋白产物容易形成多聚体进而导致蛋白降解。

研究者主要通过优化酵母表达***中的关键表达元件（启动子、终止子、增强子以及沉默子），增强外源蛋白的表达水平。但是当外源蛋白在细胞内大量积累时，对细胞分泌***造成很大的压力，易引起细胞的崩溃，导致外源蛋白的降解，减少蛋白的产量。为了增强外源基因的表达水平，必须解决外源蛋白顺利分泌的问题，从而实现目的蛋白的大量生产。

发明内容

为解决上述技术问题，促进人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中正确折叠，并能够快速的分泌到细胞外，实现增强人乳铁蛋白的高效表达，本发明在细胞内使用马克斯克鲁维酵母原有启动子Gap3增加Emp47的表达，并验证了Emp47对人乳铁蛋白表达量的影响，通过摇瓶发酵菌株，沉淀上清中的蛋白进行验证，发现Emp47对人乳铁蛋白的分泌表达量具有促进作用，从而获得改善合成人乳铁蛋白分泌量的重组马克斯克鲁维酵母菌株。本发明不仅实现了提高马克斯克鲁维酵母发酵生产人乳铁蛋白产量的目的，同时也提供了一种提升马克斯克鲁维酵母中人乳铁蛋白分泌表达水平的方法。

第一方面，本发明要求保护一种促进人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的方法。

本发明所提供的促进人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的方法，可包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加EmP47蛋白的表达，从而促进所述人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达。

该方法中，通过增加所述EmP47蛋白的表达，实现促进所述人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达。

其中，所述Emp47蛋白的核苷酸序列来自于里氏木霉QM6a。进一步地，所述EmP47蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述人乳铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，在所述马克斯克鲁维酵母受体菌中表达所述人乳铁蛋白可通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述人乳铁蛋白的编码基因实现。

进一步地，采用所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加所述EmP47蛋白的表达可通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述EmP47蛋白的基因表达框实现。在所述EmP47蛋白的基因表达框中，由所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子启动所述EmP47蛋白的编码基因的表达。

更进一步地，所述人乳铁蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

更进一步地，在所述EmP47蛋白的基因表达框中，所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述EmP47蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的具体实施方式中，所述EmP47蛋白的基因表达框***并替换了所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的Och1基因。真核生物在内质网中的N糖基化修饰都是高度保守的，不同点在于转运到高尔基体后，酵母通过Och1基因在α-1,3-甘露糖上添加了一个α-1,6-甘露糖，然后其他的甘露糖转移酶和磷酸甘露糖转移酶以此糖链结构为基础向上继续添加甘露糖，最终形成高甘露糖型结构。乳铁蛋白是一种糖基化蛋白，酵母表达糖基化蛋白的劣势在于其糖基化方式与哺乳动物细胞不同，容易形成高甘露糖化蛋白。敲除Och1基因是为了阻断酵母的高甘露糖基化修饰，为后续的糖基化修饰做准备。

具体地，所述EmP47蛋白的基因表达框***并替换所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的Och1基因是通过同源重组实现的。进行所述同源重组的上游同源臂的序列如SEQ ID No.6所示，下游同源臂的序列如SEQ ID No.7所示。

在本发明的具体实施方式中，所述马克斯克鲁维酵母受体菌为马克斯克鲁维酵母KM::△ura3；所述马克斯克鲁维酵母KM::△ura3为将马克斯克鲁维酵母FIM1基因组中的Ura3基因敲除后所得菌株。因生产要求不得引入抗性筛选标记，故敲除基因组Ura3基因。

第二方面，本发明要求保护一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法。

本发明要求保护的构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，可包括前文第一方面中所述的步骤。

第三方面，本发明要求保护一种用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。

本发明要求保护的用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株是采用前文第二方面中所述方法构建得到的。

第四方面，本发明要求保护前文第三方面中所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株在发酵生产人乳铁蛋白中的应用。

实验证明，与原有的表达体系相比，当Emp47基因整合到马克斯克鲁维酵母宿主后，人乳铁蛋白的分泌量显著增加，增加了约3倍，达到了378μg/L。本发明通过增强Emp47的表达能够有效的提高人乳铁蛋白的分泌表达量。本发明对于提高马克斯克鲁维酵母发酵生产人乳铁蛋白的产量具有重要意义。

附图说明

图1为筛选的目的克隆菌株的菌落PCR验证结果。箭头标注的是获取的纯合子菌株KM::△Ura3::Emp47，其余为野生型菌株即Och1基因仍然存在。

图2为人乳铁蛋白的表达量的SDS-PAGE图。其中，1是对照的KM::△Ura3/ pUKDN119-LF的上清蛋白（阴性对照）；2是乳铁蛋白阳性标品；3和4是KM::△Ura3::Emp47/ pUKDN119-LF上清蛋白。箭头所示为乳铁蛋白。

图3为人乳铁蛋白的表达量的Western Blot图。其中，1是乳铁蛋白阳性标品；2是作为对照的KM::△ura3/pUKDN119-LF的上清蛋白（阴性对照）；3和4是KM::△ura3::Emp47/ pUKDN119-LF上清蛋白。箭头所示为乳铁蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

马克斯克鲁维酵母FIM1：（CGMCC No.10621）：记载于“Liu Y, Mo WJ, Shi TF.Mutational Mtc6p attenuates autophagy and improves secretory expression ofheterologous proteins inKluyveromyces marxianus. Microb Cell Fact. 2018 Sep14;17(1):144. doi: 10.1186/s12934-018-0993-9. PMID: 30217195; PMCID:PMC6138896.”一文，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用。马克斯克鲁维酵母KM::△ura3为将马克斯克鲁维酵母FIM1的基因组中的Ura3基因敲除后所得菌株，在上述文献中也有相关记载。

实施例1、Emp47优化策略

本发明中所使用的Emp47来自于里氏木霉QM6a，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。在氨基酸序列不变的情况下，根据马克斯克鲁维酵母密码子高使用频率表（表1）对其核苷酸序列进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2、供体DNA的扩增

选用马克斯克鲁维酵母内源Gap3启动子表达Emp47，GAP3启动子是一种葡萄糖碳源型启动子，而在发酵过程中使用的碳源是葡萄糖，有利于GAP3启动子提升Emp47基因的转录水平。

使用引物Up-F和Up-R（表2），以马克斯克鲁维酵母KM::△ura3的基因组为模板进行PCR扩增，获得敲入Och1位点的Up同源臂（SEQ ID No.6）。

使用引物Emp47-F和Emp47-R（表2），以重组质粒pUC57-P_Gap3-Emp47为模板扩增得到“Gap3启动子及Emp47基因”片段，所述“Gap3启动子及Emp47基因”片段为将SEQ ID No.3（Gap3启动子）和SEQ ID No.2（优化后的Emp47基因）顺次首尾相连后所得。其中，重组质粒pUC57-P_Gap3- Emp47为在pUC57质粒的EcoRV位点***“SEQ ID No.3+SEQ ID No.2”所示DNA片段后所得重组质粒。

使用引物Down-F和Down-R（表2），以马克斯克鲁维酵母KM::△ura3的基因组为模板进行PCR扩增，获得敲入Och1位点的Down同源臂（SEQ ID No.7）。

进一步地，以上述获得的3个扩增产物为模板，使用引物Up-F和Down-R进行PCR扩增，即可获取Overlap PCR产物。该产物即为供体DNA片段，从5’端到3’端依次包含Och1位点的Up同源臂（SEQ ID No.6）、Gap3启动子（SEQ ID No.3）、Emp47基因（SEQ ID No.2）和敲入Och1位点的Down同源臂（SEQ ID No.7）。

实施例3、基因编辑质粒的构建

首先使用SapI 内切酶（Takara，货号1631）对LHZ531质粒（该质粒的全序列见SEQID No.8，在该质粒中具有TEF1启动子、Cas9基因、CYC1终止子、Ura3启动子及其基因、ARS1终止子、氨苄青霉素基因、导向RNA、tRNA-gly）进行酶切，回收大片段产物。而后在马克斯克鲁维酵母KM::△ura3的基因组中找到Och1编辑位点，根据N20序列设计要求在Och1基因内部找到NGG目标序列前的20个碱基。在N20引物（表3）5’端添加SapI酶切位点的连接粘性末端，分别为TCA和AAC。取稀释后两条N20引物（表3中N20）各10 µL混合，95 ℃，3min，随后室温10 min。最后使用T4连接酶（Biolab，货号B0202S）将N20序列与LHZ531大片段相连，并转化DH5α感受态，涂布氨苄抗性的LB固体培养基。待次日验证，引物使用YY161F 和N20-R，若有1000bp大小的PCR产物则质粒构建成功，无产物则构建失败。上述所涉及到的引物序列具体如表3所示。

注：SEQ ID No.18中的V表示A或C或G。

最终获得基因编辑质粒，命名为LHZ531-N20。即将LHZ531质粒的两个酶切位点SapI之间的小片段替换为accggcgtataacatgtcag（即SEQ ID No.16的第4-23位），从而得到重组的基因编辑质粒。

实施例4、编辑质粒LHZ531-N20和供体DNA的酵母化学转化

挑取马克斯克鲁维酵母KM::△ura3单菌落于30 mL YPD培养基中，培养至OD₆₀₀大于10，而后取菌液于2 mL Ep管中离心获取沉淀，取3mL 1M LiAc和3mL 10×TE（配方：100mMTris-HCl，10mM EDTA 使用NaOH调节pH=8.0）加无菌水至30mL混匀，获取1×LiAc/TE缓冲液。使用1×LiAc/TE缓冲液洗沉淀两次，除去上清，随后在沉淀中央添加5 µL Carrier DNA（Takara，货号630440），并添加实施例2所获取的供体DNA片段1 µg和500 ng 实施例3构建的编辑质粒LHZ531-N20，使用枪头轻柔混匀，最后添加 300 µL PEG/LiAc/TE溶液（配制方法：40g PEG溶于水至刻度线80mL，115℃，20min灭菌，取无菌的1M LiAC和10×TE 各10mL加入其中混匀即可），温柔混匀，在体系中添加适量1M DTT，至DTT终浓度为10mM，再次混匀，随后30℃水浴15min，47℃水浴15min，最后离心获取沉淀，添加150 µL 无菌水混匀，涂布SD平板，30℃培养箱中2-4天，直至长出单菌落，所筛选的目的克隆KM::△ura3::Emp47如图1所示，目的条带大小2832bp。

实施例5、表达质粒pUKDN119-LF的底盘细胞转化

使用SacII（NEB，R0157S）和Spe I（NEB，R3133S）内切酶对pUKDN119质粒（全序列见SEQ ID No.9，该质粒中包含元件：PKD1片段，菊粉酶启动子及信号肽、PMD18-T、菊粉酶终止子、Ura3启动子、Ura3基因）进行酶切，回收大片段。随后使用引物LF-F/R以生工合成的含有人乳铁蛋白编码基因的质粒为模板对人乳铁蛋白编码基因进行扩增，并在引物两端添加对应的酶切位点，同时进行剪切，回收处理后与pUKDN119载体大片段按照摩尔比1:4混合，使用T4连接酶连接，所得重组质粒命名为pUKDN119-LF。该重组质粒的结构描述为：将pUKDN119质粒的酶切位点SacII和Spe I之间的小片段替换为人乳铁蛋白编码基因（SEQ IDNo.5）后所得的重组质粒。人乳铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其对应的编码基因序列如SEQ ID No.5所示。

最后将重组质粒pUKDN119-LF转化入实施例4所获取的底盘细胞KM::△ura3:: Emp47中，操作过程参考实施例4。待长出单菌落，使用引物PINU-F和LF-R对其进行验证，扩增出条带为2200 bp的单菌落为正确，随后测序。该实施例所涉及的引物如表4所示。将最终获得的阳性转化子命名为KM::△ura3::Emp47/pUKDN119-LF。

同时将重组质粒pUKDN119-LF转化入底盘细胞KM::△ura3作为阴性对照，所得转化子命名为KM::△ura3/pUKDN119-LF。

实施例6、重组KM酵母中人乳铁蛋白的翻译水平的检测

将上述实施例5获得的阳性转化子单菌落KM::△ura3::Emp47/pUKDN119-LF挑取于YG培养基（配方：酵母粉20g/L，葡萄糖40g/L），在摇床中200rpm，30℃持续发酵3天。然后，使用台式冷冻离心机8000rpm，15min离心收集上清液，并添加上清体积10%的1M三氯乙酸对上清中的分泌蛋白进行沉淀，4℃过夜，次日12000rpm，20min，4℃离心，弃上清收集沉淀，使用预冷的无水乙醇2mL清洗两次，弃上清然后开口置于冰上挥发乙醇，最后添加pH8.5的50mM Tris-HCl溶解沉淀即为分泌蛋白。使用SDS-PAGE和Western blot对人乳铁蛋白进行定量分析。同时设置以实施例5所得菌株KM::△ura3/pUKDN119-LF作为阴性对照。

人乳铁蛋白的表达量的SDS-PAGE图如图2所示，Western Blot图如图3所示。由图可见KM::△ura3::Emp47/pUKDN119-LF能够表达完整的人乳铁蛋白，且对照KM::△ura3 / pUKDN119-LF上清中未出现完整大小的人乳铁蛋白片段，说明Emp47对人乳铁蛋白形成正确空间结构、增加人乳铁蛋白稳定性及分泌具有促进作用。

实施例7、Elisa检测重组KM酵母中人乳铁蛋白的分泌情况

用包被液将实施例6中初期离心获取的上清作为抗原进行5倍稀释，同时使用乳铁蛋白（Saputo，1001102）作为标曲，初始浓度为10 mg/L，而后逐级5倍稀释至1.28×10^-4mg/L，每孔加100 μL包被液（配方：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，蒸馏水稀释至1000 mL），4 ℃冰箱2h，倒尽板孔中液体，加150μL洗涤液（配方：0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄•12H₂O，0.5 mLTween-20；加蒸馏水至1000 mL），静止3 min，反复洗涤3次，除去洗涤液。加封闭液（配方：5g脱脂牛奶溶解于100mL洗涤液）100μL，37 ℃放置2h，再洗涤3次，加稀释2000倍的一抗-兔抗乳铁蛋白（Bioss，bs-5810R）0.1 mL于各反应孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗涤。加0.1 mL稀释6000倍的酶标二抗-山羊抗兔（生工，SA00001-2）于各反应孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗涤。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 mL，室温下反应3-10 min，每孔添加50μL浓度为2 mol/L的H₂SO₄终止反应，于450 nm处在ELISA检测仪上读取数值，对所构建的底盘细胞（即实施例5获得的阳性转化子单菌落KM::△ura3::Emp47/pUKDN119-LF）表达的人乳铁蛋白进行检测，测得OD450值后，根据LF标准曲线y = 0.0556x + 0.0758（y为OD450读值，x为LF浓度，R²= 0.9575）算出人乳铁蛋白的产量，三次重复测定的人乳铁蛋白分泌产量均值为378 µg/L。具体如表5所示。

注：P<0.05表示两者之间具有显著性差异。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.一种促进人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的方法，包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加EmP47蛋白的表达，从而促进所述人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达；

采用所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子增加所述EmP47蛋白的表达是通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述EmP47蛋白的基因表达框实现的；在所述EmP47蛋白的基因表达框中，由所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子启动所述EmP47蛋白的编码基因的表达；

所述EmP47蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述EmP47蛋白的基因表达框***并替换了所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的Och1基因。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述马克斯克鲁维酵母受体菌中表达所述人乳铁蛋白是通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述人乳铁蛋白的编码基因实现的。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述EmP47蛋白的基因表达框中，所述马克斯克鲁维酵母内源的Gap3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述EmP47蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母受体菌为马克斯克鲁维酵母KM::△ura3；所述马克斯克鲁维酵母KM::△ura3为将野生型马克斯克鲁维酵母基因组中的Ura3基因敲除后所得菌株。

7.一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，其特征在于：采用权利要求1-6中任一所述的方法构建所述用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。

8.一种用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母工程菌株是采用权利要求7所述方法构建得到的。

9.权利要求8所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株在发酵生产人乳铁蛋白中的应用。