CN117883353A - 石斛发酵液的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开石斛发酵液的制备方法和应用，涉及微生物发酵领域。包括以下配比的原料：乳酸发酵液提取物20％～35％、石斛发酵液3％～5％、保湿剂2％，去离子水加量至100％；石斛提取物为选取无病害的铁皮石斛，切碎后沸水灭酶2～3分钟，将烫漂好的铁皮石斛段与蒸馏水按照料液比1：10打汁，置于250mL无菌锥形瓶85℃，灭菌20min后过滤，得石斛过滤液再接种乳酸发酵液，添加保湿剂后再去离子水添加至100％后等得到具有抗皱紧致功效的石斛发酵产品。本发明通过选取以石斛为碳源，接种植物乳杆菌和副干酪乳杆菌混合发酵液，更为有效安全地抵达皮肤真皮层，显著提升抗皱紧致的护肤效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物发酵技术领域，具体为一种石斛发酵液的制备和方法。
背景技术
唐代开元年间的《道藏》把：“石斛、天山雪莲、三两重人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、深山野灵芝、海底珍珠、冬虫夏草、苁蓉”并称为中华九大仙草，石斛为九大仙草之首。在美容方面，铁皮石斛中的石斛多糖、酚类化合物、黄酮、氨基酸等活性营养成分具有良好的抗氧化和紧致的功效。
铁皮石斛主要活性成分多存在于细胞的胞浆中，细胞壁是由结构紧密的纤维素、半纤维素等构成。采用乳酸发酵的方法可以在铁皮石斛发酵过程中破坏细胞壁，铁皮石斛经过微生物发酵后生物活性增强，微生物在生长过程中会合成各种对人体有益的酶更有利于皮肤吸收针。市面上的抗皱紧致产品多为添加各种化学试剂，加重皮肤的吸收负担。因此提出一种石斛发酵液的制备方法及其应用，采用微生物发酵石斛的方式减少化学试剂的添加。
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种具有抗皱紧致功效的石斛发酵产品的制备方法和应用，解决了化学试剂多导致加重皮肤负担问题。
发明内容
本发明的目的在于减少化学添加剂对皮肤造成的负担而提供具有抗皱紧致功效的石斛发酵液的制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种石斛发酵液的制备方法，包括以下配比的原料：乳酸发酵液提取物20％～35％、石斛提取物3％～5％、保湿剂2％，去离子水加量至100％；
优选地，一种制备石斛发酵液的制备方法，包括如下步骤
选取无病害的铁皮石斛，切碎后沸水灭酶2～3分钟，将烫漂好的铁皮石斛段与蒸馏水按照料液比1：10打汁，置于250mL无菌锥形瓶85℃，灭菌20min后过滤，得石斛过滤液；
将乳酸发酵液接种以预设投料比至石斛过滤液；
优选地，所述乳酸发酵液由植物乳杆菌和副干酪乳杆菌1:1混合液做种子液，在温度为37℃的条件下培养16-20h，使菌种活化，此菌种为植物乳杆菌和副干酪乳杆菌；
本发明选用植物乳杆菌和副干酪乳杆菌对铁皮石斛进行发酵，植物乳杆菌与副干酪乳杆菌混合接种在石斛发酵过程中可以温和地打开植物的细胞壁，产生的代谢酶系和多糖类物质能有效清除DPHH自由基、羟基自由基和ABTS自由基，更为安全有效地增强抗皱紧致的功效；
优选地，所述乳酸发酵液为植物乳杆菌和副干酪乳杆菌混合液，将-80℃保存的菌种放置在种子液中，在温度为37℃的条件下培养16-20h，使菌种活化，此菌种为植物乳杆菌和副干酪乳杆菌；
优选地，所述石斛发酵液经过过滤灭菌处理后，加入保湿剂；
优选地，所述保湿剂为1，2-己二醇、1，2-丙二醇，添加量为2％，120℃灭菌20min得石斛发酵产物得石斛发酵产物，将所述去离子水添加至所述石斛发酵产物直至100％。；
此外，本发明还公开了一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液由上述方法制备而成，具有良好的抗皱紧致的效果。
同时，本发明还公开了所述铁皮石斛发酵液在护肤产品中的应用。
相比于现有技术，本技术方案的有益效果在于：
(1)采用植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的混合发酵液使得石斛发酵产品所产生的石斛多糖的活性成更易进入皮肤真皮层，在护肤领域更为安全有效地达到抗皱紧致的效果。
附图说明：
图1为collala基因相对表达量与正常对照组比较，*p值<0.05。
图2为eln1基因相对表达量与正常对照组比较，**p值<0.01。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
种子液的培养：
植物乳杆菌的培养：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，吐温80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，琼脂15.0g，蒸馏水加至1L，混合均匀，110℃至130℃灭菌20min至30min，得植物乳杆菌培养基。
副干酪乳杆菌的培养：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，醋酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.2g，吐温80 1mL，加水至1000毫升，琼脂1.5～2.0％，得副干酪乳杆菌。
用接种环挑取植物乳杆菌接种于植物乳杆菌培养基中，在30℃条件下活化72h，得到活化的植物乳杆菌悬液；用接种环挑取副干酪乳杆菌接种于副干酪乳杆菌培养基中，在30℃条件下活化72h，1:1混合比例后得种子液。
实施例1
本发明所述一种铁皮石斛发酵液的一种实施例，本实施例所述石斛发酵液的制备方法如下：
(1)石斛提取物为选取无病害的铁皮石斛，切碎后沸水灭酶2～3分钟，将烫漂好的铁皮石斛段与蒸馏水按照料液比1：10打汁，置于250mL无菌锥形瓶85℃，灭菌20分钟后过滤，得石斛过滤液。
(2)种子液在温度为37℃的条件下培养16-24h，使菌种活化。
(3)将种子液接种至石斛过滤液，投料比为1％(g/mL)，发酵液初始pH为6.0时，在37℃下累计发酵72h后，得石斛发酵液。
(4)石斛发酵液经过过滤灭菌处理后，加入保湿剂，保湿剂为1，2-己二醇、1，2-丙二醇，添加量为2％，120℃灭菌20min得石斛发酵产物，将去离子水添加至石斛发酵产物直至体积的100％，经过匀速摇匀静置。
实施例2
实验方法：斑马鱼抗皱功效试验方法
方法来源：《斑马鱼抗皱功效评价实验标准操作规程》
试验体系：野生型AB品系斑马鱼
试验起止时间：2023年08月01日-2023年08月08日
斑马鱼鱼龄：受精后4天(4dpf)。
每组实验样木量：30尾(三次生物学重复，N-3)
成鱼饲养及繁殖方法：按照本公司实验室标准饲养和繁殖方法，符合国际AAALAC认证(认证编号:001458)的要求。
原理方法：皮肤的生长、修复、营养以及弹性、张力都与胶原蛋白有关，它的流失会使皮肤光滑度下降，产生皱纹。在四足动物中，Ⅰ型胶原蛋白是一个三聚体，主要由两个ɑ1链和一个ɑ2链组成，分别由collala和colla2基因编码在***和骨中执行胶原蛋白相关生物功能。在斑马鱼中存在三种Ⅰ型胶原基因，分别编码ɑ1(Ⅰ)、ɑ2(Ⅰ)和ɑ3(Ⅰ)链的collala、collalb和colla2，因此，通过检测collala或(和)collalb或(和)colla2基因相对表达量可表明样品是否具有抗皱功效。
实验步骤：
1.随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。
2.水溶给予样品，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。三次生物学重复。
3.28C条件下避光孵育24h。
4.提取各实验组斑马鱼总RNA，合成cDNA，利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。
5.用β-actin作为基因表达的内参，计算目的基因的RNA相对表达量。
RNA相对表达量＝2ΔΔC(t)
ΔC(t)＝C(t)基因目的-C(t)β-actin
适用性与局限性：适用于化妆品及其原料的紧致功效测试，要求样品能溶解于水或制备成能在水中均匀分散的悬浮液。
判断依据：统计学分析p＜0.05，判定为有显著性差异。
检测结果：
观察发现，样品VKFerm DO-FL石解发酵液组collala基因对表达量与正常对照组相比，明显增加，揭示了该样品具有抗皱功效。
实施例3
实验方法：斑马鱼抗皱功效试验方法
方法来源：《T/ZHCA 015-2022化妆品紧致功效评价斑马鱼幼鱼弹性蛋白基因相对表达量法》。
试验体系：野生型AB品系斑马鱼。
试验起止时间：2023年08月01日-2023年08月08日；
斑马鱼鱼龄：受精后4天(4dpf)。
每组实验样木量：30尾(三次生物学重复，N-3)
成鱼饲养及繁殖方法：按照本公司实验室标准饲养和繁殖方法，符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
原理方法：弹性蛋白是皮肤组织中弹性纤维的主要成分，能为肌肤提供结构性支撑，让肌肤免受老化、松弛的困扰。弹性蛋白由两种类型的短肤段交替排列构成，eln1、eln2负责编码弹力蛋白不同的肽段，两个基因共同负责调控弹力蛋白的表达水平，使皮肤紧致，具有弹性。斑马鱼具有与人相似的弹性蛋白(eln1、eln2)基因。因此，通过检测eln1或(和)ln2基因相对表达量可明样品是否具有紧致功效。
实验步骤：
1.随机选取斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。
2.水溶给予样品，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。三次生物学重复
3. 28C条件下避光孵育24h。
4.提取各实验组斑马鱼总RNA，合成cDNA，利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。
5.用β-actin作为基因表达的内参，计算目的基因的RNA相对表达量。
RNA相对表达量＝2ΔΔC(t)
ΔC(t)＝C(t)基因目的-C(t)β-actin
适用性与局限性：适用于化妆品及其原料的紧致功效测试，要求样品能溶解于水或制备成能在水中均匀分散的悬浮液。
判断依据：统计学分析p＜0.05，判定为有显著性差异。
检测结果：
观察发现，样品VKFerm DO-FL石解发酵液组的eln基因对表达量与正常对照组相比，明显增加，揭示了该样品具有紧致功效。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种石斛发酵液，其特征在于，包括以下配比的原料：乳酸发酵液提取物20％～35％、石斛提取物3％～5％、保湿剂2％，去离子水加量至100％。
2.一种制备权利要求1所述的石斛发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
选取无病害的铁皮石斛，切碎后沸水灭酶2～3分钟，将烫漂好的铁皮石斛段与蒸馏水按照料液比1：10打汁，置于250mL无菌锥形瓶85℃，灭菌20min后过滤，得石斛过滤液；
将乳酸发酵液接种以预设投料比至石斛过滤液；
混合后加入保湿剂。
3.根据权利要求1所述的石斛发酵液的制备方法，其特征在于，所述乳酸发酵液由植物乳杆菌和副干酪乳杆菌1：1混合液做种子液，在温度为37℃的条件下培养16-20h，使菌种活化，此菌种为植物乳杆菌和副干酪乳杆菌。
4.根据权利要求1所述的石斛发酵液的制备方法，其特征在于，将所述乳酸发酵液接种至石斛过滤液，投料比为1％(g/mL)，发酵液初始pH为6.0时,在37℃下累计发酵72h后，得石斛发酵液。
5.根据权利要求1所述的石斛发酵液的制备方法，其特征在于，所述石斛发酵液经过过滤灭菌处理后，加入保湿剂。
6.根据权利要求5所述的石斛发酵液的制备方法，其特征在于，所述保湿剂为1,2-己二醇、1,2-丙二醇，添加量为2％，120℃灭菌20min得石斛发酵产物，将所述去离子水添加至所述石斛发酵产物直至100％。
7.一种如权利要求1所述铁皮石斛发酵液在护肤产品中的应用。
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