CN113440455B - 青稞发酵液的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物提取领域及日化领域，具体涉及青稞发酵液在制备皮肤外用剂方面的应用，作为皮肤外用剂中的抗衰老的活性成分。本发明的青稞发酵液通过提高基底层蛋白相关基因的表达、细胞外基质相关基因的表达、抗衰老细胞因子基因的表达，稳定皮肤结构、提高皮肤修复活性、延缓皮肤衰老、提升表皮细胞活性、增加表皮厚度，从而实现抗衰老，适用于制备皮肤外用剂，应用前景广阔。本发明的青稞发酵液的制备工艺简单，条件易于控制，生产成本低；本发明的青稞发酵液的活性高，在较低含量下即可产生显著的效果，原料纯天然，安全不刺激，广泛应用于各种皮肤外用剂。
Description
技术领域
本发明属于植物提取领域及日化领域，具体涉及青稞发酵液的应用。
背景技术
众所周知，皮肤是我们最大的器官，能保护我们免受外界严苛环境的干扰。但随着年龄的增加及其他因素的影响，我们皮肤结构中相关蛋白表达的变化能引起皮肤外在表型的变化，例如皱纹增加、弹性减少等。而皮肤中蛋白表达受基因调控。
COL4A1(collagen type IV alpha 1chain)基因编码IV型胶原蛋白，该蛋白是基底膜的主要成分。在基底膜中，Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白5、肝素等许多分子形成形成稳定有序的网格结构，这种结构在基底膜的构建和稳定中发挥重要作用。COL4A1基因表达上调能够促进DEJ(基底膜带)的完整性，延缓皮肤衰老；
TNC(tenascin-C)基因编码细胞粘合素C，主要功能是加强***，成人组织TNC表达上调通常与炎症、损伤、肿瘤新生等疾病状态有关。TNC作为重要的非结构性细胞外基质蛋白，参与组织损伤修复过程，TNC表达水平的提高，可以反映出皮肤的增殖速率增加，可以帮组皮肤抵抗衰老。
CSF2(colony stimulating factor 2)基因编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，主要作用于髓系祖细胞，通过与其高亲和力受体结合发挥生物学效应，使其迅速进入细胞周期向粒系和巨噬系分化，最后成为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，是一种重要的细胞长寿因子，与皮肤衰老密切相关。FGF2(fibroblast growthfactor 2)基因编码成纤维细胞生长因子(bFGF)，是一种生长因子和信号蛋白，调节特定种类细胞的增殖和分化。此外，FGF2在生物体内和体外表现出有效的血管生成作用，刺激平滑肌细胞的生长，促进伤口愈合和组织再生。
青稞(拉丁名Hordeum vulgare L.var.nudum hook.f.，别称Highland Barley、Hulless Barley)属于禾本科大麦属，在植物上属于栽培大麦的变种，主要种植于青藏高原地区，并且是唯一可在4200m以上种植的作物。我国青稞品种资源丰富，不同颜色、不同形状的品种多达上千种。青稞符合“三高两低”(高蛋白质、高纤维素、高维生素、低糖、低脂)的饮食结构，含有丰富的线性非淀粉多糖β-葡聚糖(谷类粮食中最高)、酚类化合物、维生素以及矿物质等营养活性成分。
而目前还未见青稞发酵液对皮肤相关基因的表达水平影响的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供青稞发酵液的应用，尤其是青稞发酵液在制备抗衰老皮肤外用剂方面的应用。
青稞发酵液可稳定皮肤结构、提高皮肤修复活性、延缓皮肤衰老、提升表皮细胞活性、增加表皮厚度，实现抗衰老，适用于制备皮肤外用剂。
本发明的技术方案如下：
青稞发酵液可用于制备皮肤外用剂，作为皮肤外用剂中的抗衰老的活性成分。
所述青稞发酵液作为稳定皮肤结构的活性成分、和/或提高皮肤修复活性的活性成分、和/或延缓皮肤衰老的活性成分，实现抗衰老。
进一步的，所述青稞发酵液作为稳固基底膜的活性成分，稳固皮肤结构；所述青稞发酵液作为促进提高皮肤细胞增殖速率的活性成分，提高皮肤修复活性；所述青稞发酵液作为促进调节细胞的增殖和分化的活性成分、和/或延长成熟细胞的寿命的活性成分，提高皮肤修复活性，延缓皮肤衰老。
所述青稞发酵液作为提高基底层蛋白相关基因表达的活性成分、和/或提高细胞外基质相关基因表达的活性成分、和/或提高抗衰老细胞因子基因的表达的活性成分。
优选地，所述基底层蛋白相关基因为COL4A1基因，所述细胞外基质蛋白相关基因为TNC基因，抗衰老细胞因子基因为CSF2和/或FGF2基因。
进一步的，所述青稞发酵液作为提高IV型胶原蛋白合成的活性成分，稳固基底膜，实现稳固皮肤结构；所述青稞发酵液作为提高细胞粘合素C蛋白合成的活性成分，提高皮肤细胞增殖速率，提高皮肤修复活性；所述青稞发酵液作为提高细胞集落刺激因子合成的活性成分，延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，延缓皮肤衰老；所述青稞发酵液作为提高成纤维细胞生长因子合成的活性成分，调节细胞的增殖和分化，提高皮肤修复活性，延缓皮肤衰老。
在本发明的另一个实施方式中，所述青稞发酵液作为提升表皮细胞活性的活性成分和/或增加表皮厚度的活性成分，实现抗衰老。
青稞发酵液为青稞液体发酵产物滤液的原液，或者青稞液体发酵产物滤液的原液制得的稀释液、浓缩液、浸膏或者干燥物。
青稞发酵液可以通过液体发酵方法获得，将青稞粉碎后与水混合，用酵母进行发酵，经过离心取上清液、过滤后取滤液即得到青稞发酵液。还可以进行稀释、浓缩，或者制成浸膏或干粉。优选的，所述酵母为酿酒酵母。
青稞发酵液的制备方法为：(1)青稞粉碎后与水混合，接入酵母，在15～30℃、150～250rpm条件下恒温培养36～72小时进行液体发酵；(2)步骤(1)得到的发酵液在4～10℃、1000～8000rpm条件下离心10～60min，取上清液；(3)上清液调节pH至5.0～7.0，80～90℃加热30～60min后，1000～8000rpm离心10～30min，取上清液；(4)上清液用孔径0.05～0.22μm滤膜在1～5bar压力下过滤，取发酵滤液。
优选的，青稞为带麸皮的青稞籽粒，产自泛喜马拉雅地区的西藏拉萨市。所述含有青稞粉的培养基中，青稞粉含量为1wt％～5wt％，余量为水。所述的酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae；S.cerevisiae)。优选的，青稞粉碎至20～200目颗粒。优选的，发酵温度为26～30℃。
一种具有稳定皮肤结构、和/或提高皮肤修复活性、和/或延缓皮肤衰老、和/或提升表皮细胞活性、和/或增加表皮厚度作用的皮肤外用剂，含有青稞发酵液，以青稞液体发酵产物滤液的原液为基准计算，其中所述青稞发酵液的含量为0.001wt％～99.9wt％，优选为0.01wt％～50wt％，更优选为0.05wt％～20wt％。
在本发明的一个优选实施方式中，以青稞液体发酵产物滤液的原液为基准计算，所述青稞发酵液的含量为0.5wt％～10wt％。
皮肤外用剂指以涂抹、喷洒或者其它类似方法，散布于人体表面的任何部位，以达到清洁、保养、美容、修饰、改变外观或者修正人体气味，保持良好状态的产品。皮肤外用剂可以是起到清洁、护理、美化或保养等作用的基础化妆品、面部化妆品、头部护理品、身体护理品。
皮肤外用剂的剂型无特殊限制，可根据使用情况而定，如洁面霜、精华液、乳液、霜膏、化妆水(如柔肤水、爽肤水)、面膜、卸妆水、啫喱、气雾或喷雾等。
含有青稞发酵液的皮肤外用剂，还含有其它活性成分，包括补水活性成分、美白活性成分、保湿活性成分、抗氧化活性成分、抗皱活性成分、祛斑活性成分、祛痘活性成分、防晒活性成分、去粉刺/痤疮活性成分、去头屑活性成分、抗过敏活性成分或皮脂腺抑制活性成分中的一种或多种。
皮肤外用剂中还含有增稠剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、柔顺剂、气雾剂溶剂、芳香剂、调色剂、促渗剂、控释剂、缓释剂、保湿剂、乳化剂、塑形剂、或者珠光剂中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果有：
本发明青稞发酵液通过提高基底层蛋白相关基因的表达、细胞外基质相关基因的表达、抗衰老细胞因子基因的表达，稳定皮肤结构、提高皮肤修复活性、延缓皮肤衰老、提升表皮细胞活性、增加表皮厚度，从而实现抗衰老，适用于制备皮肤外用剂，应用前景广阔；青稞发酵液的制备工艺简单，条件易于控制，生产成本低；青稞发酵液的活性高，在较低含量下即可产生显著的效果，原料纯天然，安全不刺激，广泛应用于各种皮肤外用剂。
附图说明
图1是空白对照组(NT)和添加青稞发酵液的COL4A1基因表达结果。
图2是空白对照组(NT)和添加青稞发酵液的TNC基因表达结果。
图3是空白对照组(NT)和添加青稞发酵液的抗衰老细胞因子基因表达结果。
图4是表皮模型组化切片染色结果。
具体实施方式
实施例1青稞发酵液的制备
本发酵产物的基质原料为青稞，产自泛喜马拉雅地区的西藏拉萨市。用去离子水清洗包含麸皮的青稞籽粒，晾干后打粉机打粉，过20～100目筛获得青稞粉。将青稞粉与去离子水混合，发酵培养基/培养液中青稞粉的含量为4wt％；高温高压灭菌后冷却用酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)在26～30℃、150～250rpm条件下发酵48小时。
青稞发酵液的制备：
(1)发酵产物在4～10℃、6000rpm条件下离心10～30min，取上清液；
(2)调节pH至5.0～7.0，80～90℃水浴30～60min后，4000rpm离心30min，取上清液；
(3)选用孔径为0.05、0.10或0.22μm的滤膜，滤膜预浸泡于75％(v/v)乙醇中；过滤滤器及器材用75％(v/v)乙醇清洗，70℃烘箱烘干后使用；
(5)膜过滤装置先使用0.5％NaOH水溶液循环和浸泡5～10min后，改用0.5％NaHSO3水溶液循环或浸泡5～10min，然后用去离子水清洗。将膜片装入设备后，接入灭菌水清洗后将水排空；
(6)接入步骤(2)中的上清液进行过滤，通过调节压力(≤5bar)来控制过滤速度(1.0～2.0L/h)，过滤后的发酵液装在无菌容器中储存。
所得到的青稞发酵液中，干物质含量为1.5wt％。
实施例2实施例1所获得的青稞发酵液用于基因表达活性测试
1.皮肤模型的制备
从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞(NHEK)。将人原代成纤维细胞复苏，培养消化后与胶原混合进行3天的真皮阶段培养，然后将人原代角质细胞消化接种到真皮阶段培养的皮肤模型表面，再依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，培养至26天得到可用于检测的3D皮肤模型。
在人原代角质细胞接种到真皮阶段的皮肤模型表面后浸没培养的第4天，根据所使用培养基的不同进行分组，分为空白对照(NT)组、青稞发酵液(1％，v/v)组和青稞发酵液(5％，v/v)组。
气液相培养的第1天和第4天按相同比例将青稞发酵液稀释到培养基中进行培养，气液培养第8天收皮用于后续RNA提取。
2.RNA的提取
剪取3D皮肤模型组织约2*3mm，放入2mL EP管中；加入1mL Trizol，加入2颗研磨钢珠，用组织破碎仪匀浆，50Hz超声5min后；9000rpm、4℃条件下离心1min，将上清液转移到新的1.5mL EP管中；加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；9000rpm、4℃条件下离心15min；转上层水相(约400μL)于新1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；9000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清液，沉淀用预冷的70％无水乙醇洗1次，8000rpm、4℃条件下离心5min；弃上清液，沉淀于空气干燥5～10分钟，溶于30μL DEPC(焦炭酸二乙酯)水中；分光光度计测定RNA浓度。
3.基因表达分析
根据QuantiGene R 2.0Plex Assay试剂盒进行RNA的纯化和基因定量分析，使用luminex平台对基因表达进行分析，检测相关基因的表达水平，结果如图1～3。
(1)青稞发酵液提高COL4A1基因的表达
由图1可知，相较于空白对照组(NT)，添加1％体积比青稞发酵液后，COL4A1基因表达上调1.81倍，添加5％青稞发酵液后，COL4A1基因表达上调2.38倍。COL4A1编码合成的IV型胶原蛋白与层粘连蛋白5、肝素等许多分子形成网格结构，形成稳定有序的网格结构，促进基底膜的完整性。因此，青稞发酵液通过上调COL4A1基因促进Ⅳ型胶原蛋白表达，稳定基底膜结构，帮助皮肤抵抗衰老。
(2)青稞发酵提取液提高TNC基因的表达
由图2可知，相较于空白对照组(NT)，添加1％青稞发酵液后，细胞外基质相关基因TNC表达上调1.63倍，5％青稞发酵液使TNC基因表达上调1.58倍。不同浓度青稞发酵液对TNC基因表达上调没有明确的比例关系，但是都能提高TNC基因表达的上调。TNC基因编码的细胞粘合素C是重要的细胞外基质蛋白，参与组织损伤修复过程，促进皮肤细胞增殖速率增加。青稞发酵液通过上调TNC基因促进细胞粘合素C蛋白表达，提高皮肤细胞增殖速率，促进肌肤修护再生能力，帮助皮肤抵抗衰老。
(3)青稞发酵液提高抗衰老细胞因子的表达
由图3可知，相较于空白对照组(NT)，添加1％青稞发酵液后，CSF2和FGF2基因表达分别上调3.25倍和1.5倍，添加5％青稞发酵液后，CSF2和FGF2基因表达分别上调5.59倍和1.68倍。CSF2基因编码集落刺激因子是一种重要的细胞长寿因子，能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能。FGF2基因编码成纤维细胞生长因子能调节特定种类细胞的增殖和分化，刺激平滑肌细胞的生长，促进伤口愈合和组织再生。青稞发酵液通过上调CSF2和FGF2基因促进集落刺激因子和成纤维细胞生长因子表达，延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，调节特定种类细胞的增殖和分化，促进伤口愈合和组织再生，延缓皮肤衰老，从而帮助皮肤抵抗衰老。
由以上基因表达测试结果可知，相对于空白对照组(NT)，添加青稞发酵液后，基底层蛋白相关基因COL4A1、细胞外基质蛋白相关基因TNC和抗衰老细胞因子基因CSF2、FGF2的表达均有不同程度的升高。COL4A1基因编码合成的IV型胶原蛋白和层粘连蛋白5、肝素等许多分子形成网格结构稳定有序的网格结构基底膜，促进DEJ的完整性；TNC基因编码合成的细胞粘合素C加强***，参与组织损伤修复过程，提高皮肤的增殖速率增加，可以帮助皮肤抵抗衰老。CSF2基因编码合成的细胞集落刺激因子能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能，是一种重要的细胞长寿因子。FGF2基因编码合成的成纤维细胞生长因子调节特定种类细胞的增殖和分化，促进血管生成，刺激平滑肌细胞的生长，促进伤口愈合和组织再生。由此，本发明青稞发酵液可提高皮肤修复活性、稳固皮肤结构和延缓皮肤衰老。
实施例3青稞发酵液在3D重组人表皮模型上的功效测试
体外人重组表皮模型能够模拟正常人表皮的生长周期，通过表皮角质细胞的增殖、分化和表皮的结构、组分来评估受试物的安全性和功效性。
测试方法：
采用匹配12孔板的悬挂式细胞培养小室Transwell(Corning)构建3D人重组表皮模型。待培养瓶中的人角质形成细胞扩增至70～80％汇合时，消化收获细胞，用3D表皮模型培养液重悬细胞，接种至Transwell中。3D表皮模型培养接种后初期保持浸没相培养，从第4天开始气液相培养直到结束。实验分为空白对照组和5％青稞发酵液处理组，每组设置4个重复孔，其中3个用于MTT细胞活性测试、1个用于组织化学染色和分析。
测试结果：
根据MTT测试的结果(表1)，5％青稞发酵液没有呈现出细胞毒性效应，并且对表皮细胞活性具有非常显著的提升作用。
根据表皮模型组化切片染色和定量分析结果(表1和图4)，添加了5％青稞发酵液的表皮和空白对照组相比，整体结构、角质层和颗粒层形态都更加规则。表皮层总体厚度是衡量表皮状态最重要的指标之一，通过Image Pro-Plus软件对所有样本的表皮显微图片进行量化分析，统计各组图片中表皮的平均厚度(表2)，结果显示5％青稞发酵液处理的表皮能够显著增加表皮厚度(P<0.01)。
由以上测试结果可知，相对于空白对照组，添加青稞发酵液后，表皮细胞活性显著提升，表皮厚度显著增加。由此，本发明青稞发酵液可提升表皮细胞活性、增加表皮厚度，从而实现抗衰老。
表1 MTT法检测细胞活力
| 细胞活力(％) | |
| 空白对照组 | 100 |
| 5％青稞发酵液 | 116.8 |
表2 3D皮肤表皮厚度
| 表皮厚度(pixel) | |
| 空白对照组 | 102.6 |
| 5％青稞发酵液 | 140.7 |
Claims (4)
1.青稞发酵液在制备具有稳定皮肤结构、和/或提高皮肤修复活性、和/或提升表皮细胞活性、和/或增加表皮厚度作用的皮肤外用剂方面的应用，其特征在于，所述青稞发酵液的制备方法为：(1)带麸皮的青稞籽粒粉碎后与水混合，青稞粉含量为1wt％～5wt％，接入酿酒酵母，在15～30℃、150～250rpm条件下恒温培养36～72小时进行液体发酵；(2)步骤(1)得到的发酵液在4～10℃、1000～8000rpm条件下离心10～60min，取上清液；(3)上清液调节pH至5.0～7.0，80～90℃加热30～60min后，1000～8000rpm离心10～30min，取上清液；(4)上清液用孔径0.05～0.22μm滤膜在1～5bar压力下过滤，取发酵滤液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述青稞发酵液作为提高基底层蛋白相关基因表达的活性成分、和/或细胞外基质相关基因表达的活性成分、和/或提高抗衰老细胞因子基因表达的活性成分；所述基底层蛋白相关基因为COL4A1基因，所述细胞外基质蛋白相关基因为TNC基因，抗衰老细胞因子基因为CSF2和/或FGF2基因。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述青稞发酵液为青稞液体发酵产物滤液的原液，或者由所述青稞液体发酵产物滤液的原液制得的稀释液、浓缩液、浸膏或干燥物。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，皮肤外用剂中，以青稞液体发酵产物滤液的原液为基准计算，所述青稞发酵液的含量为：0.001wt％～99.9wt％。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 201403 Shanghai City, Fengxian District Lifenglu No. 12 Applicant after: Shanghai Natural Hall Group Co.,Ltd. Address before: 201403 Shanghai City, Fengxian District Lifenglu No. 12 Applicant before: JALA Group Co. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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