CN105534876A - 一种石斛发酵原浆及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石斛发酵原浆及其制备方法与应用。一种石斛发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将石斛干粉、水和发酵菌混合得到初始体系，并对所述初始体系进行发酵培养，即得到石斛发酵原浆。本发明方法利用发酵工程技术从石斛中提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何外来物质，制备得到的石斛发酵原浆对皮肤安全无伤害，将其应用于化妆品中具有很高的抗衰老活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种石斛发酵原浆及其制备方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)是我国名贵中草药，系兰科石斛属植物，因表皮呈铁绿色而得名，具有生津滋阴、明目养胃、补肾强身等功效。据文献报道，石斛属植物中的主要药效成分为多糖、生物碱、糖苷、菲类、联苄类和氨基酸等。多糖在铁皮石斛中的含量高，且具有良好的抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力以及降低血糖等生理功能。
国内外对于石斛研究中，石斛活性物质的提取方法以水提醇沉法为主，还有酶法提取和超声波辅助提取等方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种石斛发酵原浆及其制备方法与应用。本发明方法利用发酵工程技术从石斛中提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何外来物质，制备得到的石斛发酵原浆对皮肤安全无伤害，将其应用于化妆品中具有很高的抗衰老活性。
本发明提供的一种石斛发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将石斛干粉、水和发酵菌混合得到初始体系，并对所述初始体系进行发酵培养，即得到石斛发酵原浆。
本发明中，所述石斛干粉采用石斛的茎部制成。
上述的制备方法中，所述石斛干粉、所述水和所述发酵菌的配比可为1g：(9～20)mL：(0.1～1)mL，具体可为1g：12mL：0.6mL或1g：(12～20)mL：(0.6～1)mL；
所述发酵菌的浓度可为(105～108)CFU/mL。
上述的制备方法中，所述发酵培养的温度可为35～50℃，具体可为38℃、35～40℃、35～38℃或38～50℃；所述发酵培养的时间可为4.5～6.5h，具体可为6h、4.5～6h或6～6.5h。
上述的制备方法中，所述石斛干粉的粒径可为20～50目，具体可为40目或40～50目，所述石斛干粉可由粉碎机粉碎后过筛得到；
所述发酵菌可为乳杆菌，具体可为德氏乳杆菌，更具体可为德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillusdelbrueckiibulgaricus。
上述的制备方法中，所述发酵菌可以其培养液或悬浮液的形式存在，所述发酵菌的培养液或悬浮液的pH值可为4.0～7.0，具体可为5.0、4.0～5.0或5.0～7.0。
上述的制备方法中，所述方法中在所述发酵培养之后，还可包括对发酵液依次进行灭菌、离心和取上清液的步骤。
上述的制备方法中，所述灭菌的条件如下：所述灭菌的温度可为115～121℃，具体可为115℃；所述灭菌的时间可为15～25min，具体可为20min；
所述离心的条件如下：离心转速可为3000～4000r/min，具体可为3800r/min或3800～4000r/min；离心时间可为15～30min，具体可为20min或20～30min；离心半径可为9cm。
本发明还提供了由上述的制备方法制备得到的石斛发酵原浆。
本发明进一步提供了上述的石斛发酵原浆在制备具有下述1)和/或2)中功能的产品中的应用：
1)清除自由基；
2)抗衰老。
上述的应用中，所述产品可为化妆品、食品和保健品中的至少一种；
所述化妆品可为面膜、精华液和爽肤水中的至少一种；
所述自由基为DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基中的至少一种。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的石斛发酵原浆的制备方法采用发酵工程技术，通过选择合适的菌种及发酵条件，从石斛中提取得到活性物质即石斛发酵原浆。一方面，可最大程度保留植物中的活性成分，且相对与传统的水提法，避免了有机溶剂的引入，安全环保；另一方面，不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。
(2)本发明提供的石斛发酵原浆富含石斛多糖，且由于在制备过程中未引入外来物质，不含任何化学成分，可以直接作为面膜、精华液或爽肤水的成品使用，更加天然，不会给肌肤造成任何负作用。
(3)本发明提供的石斛发酵原浆，具有较强的抗氧化能力可清除自由基和超氧阴离子，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，具有抗衰老的功效。
附图说明
图1为不同体积百分浓度的石斛发酵原浆与DPPH自由基清除率的关系曲线。
图2为不同体积百分浓度的石斛发酵原浆与羟基自由基清除率的关系曲线。
图3为不同体积百分浓度的石斛发酵原浆与超氧阴离子清除率的关系曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养基中的浓度为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。
下述实施例中的石斛(茎部)来自浙江义乌鲜禾有限公司，粉碎过40目筛。
下述实施例中的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiibulgaricus)的ATCC编号为11842，可从ATCC购买得到。
下述实施例中的发酵菌菌液按照如下步骤制得：
1、菌种的活化
挑取德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiibulgaricus)菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液。
2、菌种的纯化
将步骤1得到的活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后德氏乳杆菌。
3、菌种的扩大培养
将步骤2得到的纯化后的菌种接种到MRS培养基(pH值为7.0)中，在25℃的摇床中培养，当OD值＝0.5-1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为105～108CFU/mL)。
实施例1、制备石斛发酵原浆
按照如下步骤制备石斛发酵原浆：
(1)将20mL的9mL浓度为105～108CFU/mL的发酵菌菌液接种到15g的石斛干粉和180mL的水中，得到发酵体系；
(2)将上述发酵体系在38℃摇床中发酵6小时，得到发酵产物；
(3)将上述发酵产物115℃下灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物在3800r/min，离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即得到石斛发酵原浆。
实施例2、石斛发酵原浆在作为化妆品中的应用
一、石斛发酵原浆化妆品的性质
将本发明实施例1所制备所得的发酵提取物经活性炭脱色、去味后，制得石斛发酵原浆化妆品。其外观为粘稠液体、颜色为淡黄色至棕黄色。pH值5.0-6.1，粘度200-500cP，可溶性固含物含量2.0-6.0％，菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵原浆符合化妆品质量要求。
对该石斛发酵原浆化妆品的主要功效成分石斛多糖含量进行测量，检测方法参照GB/T5009.8-2008，测得石斛多糖含量为428.6g/kg。
二、石斛发酵原浆的安全性检测
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。对本发明实施例1中获得的石斛发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、试验方法
称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油(本实施例采用蒸馏水)。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。
3、试验结果
斑贴试验结果如表1所示，表1中各符号表示的含义如下："-"＝阴性反应；"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。
判断标准：根据化妆品卫生规范2007，30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或出现二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。
表1、本发明实施例1获得的石斛发酵原浆的斑贴试验结果
从表1中可以看出：本发明实施例1得到的石斛发酵原浆没有不良反应发生，说明本发明石斛发酵物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
三、石斛发酵原浆的抗氧化性能检测
1、DPPH自由基清除能力检测
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
(1)取等体积(一般为3mL)的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；
(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；
(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(A3管)；
(4)反应30min后，在517nm下测A1、A2、A3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2(1)
以石斛发酵原浆待测液的体积百分浓度为横坐标，清除率为纵坐标，做出石斛发酵原浆对DPPH自由基清除作用曲线，如图1所示。
由图1可知，本发明实施例1中制得的石斛发酵原浆对DPPH清除作用的IC50＝6.01mg/mL，说明本发明石斛发酵原浆具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
2、羟基自由基清除能力检测
在25ml比色管中依次加入3ml2mmol/L的FeSO4，再加入3ml6mmol/L的水杨酸，摇匀之后，再加入3ml1mmol/L的H2O2溶液，摇匀，启动反应。在370C水浴加热15min后取出，测其吸光度值A0。然后分别加入一定浓度的待测夜1ml，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度值AX。空白组以1ml去离子水代替待测夜。为消除后加的共1ml待测夜和去离子水所造成的体系吸光度值得降低，方法同上，恒温15min后测其吸光度值A00，加1ml去离子水，摇匀后在测一次其吸光度值AXX，A降低＝A00—AXX，每个处理分别做3个重复，羟基自由基清除率(％)＝100％(A0—AX—A降低)/A0，实验结果如图2所示。
由图2可知，随石斛发酵原浆浓度增大，其对羟基自由基的清除能力不断增强，说明本发明石斛发酵原浆具有清除羟基自由基的能力。
3、对超氧阴离子清除作用的测定
取0.05mol/LpH8.2的Tris-HCL缓冲液4.5ml于试管中，置于250C水浴中预热20min，取出后分别加入1ml待测液和0.4ml，25mmol/L的邻苯三酚溶液，摇匀在299nm下测其吸光度值，每隔30s测一个吸光度值，取值至5min，以Tris-HCL缓冲液参比，空白对照以1ml去离子水代替待测夜，维生素C做阳性对照，每个处理做3个重复，超氧阴离子自由基清除率(％)＝(F0-FX)/F0×100，F0为空白液的吸光度值随时间的变化率，FX为待测液随时间的变化率，结果如图3所示。
由图3可知，石斛原浆对超氧阴离子具有很强的清除能力，IC50＝27.35mg/ml。过量的超氧阴离子在生物体内会对机体产生毒性并损伤DNA，证明本发明石斛原浆出色的清除超氧阴离子的能力表明具有一定的抗衰老功能。
Claims (10)
1.一种石斛发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将石斛干粉、水和发酵菌混合得到初始体系，并对所述初始体系进行发酵培养，即得到石斛发酵原浆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述石斛干粉、所述水和所述发酵菌的配比为1g：(9～20)mL：(0.1～1)mL；
所述发酵菌的浓度为(105～108)CFU/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为40～50℃；
所述发酵培养的时间为4.5～6.5。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述石斛干粉的粒径为20～50目；
所述发酵菌为乳杆菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵菌以其培养液或悬浮液的形式存在；
所述发酵菌的培养液或悬浮液的pH值为4.0～7.0。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法中在所述发酵培养之后，还包括对发酵液依次进行灭菌、离心和取上清液的步骤。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述灭菌的温度为115～121℃；所述灭菌的时间为15～25min；
所述离心的条件如下：离心转速为3000～4000r/min；离心时间为15～30min；离心半径为9cm。
8.权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的石斛发酵原浆。
9.权利要求8所述的石斛发酵原浆在制备具有下述1)和/或2)中功能的产品中的应用：
1)清除自由基；
2)抗衰老。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产品为化妆品、食品和保健品中的至少一种；
所述化妆品为面膜、精华液和爽肤水中的至少一种；
所述自由基为DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基中的至少一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Changtao Inventor after: Li Meng Inventor after: Zhang Jiachan Inventor after: Wang Dongdong Inventor after: Zhao Dan Inventor after: Xie Yafei Inventor after: Liu Pingping Inventor before: Li Meng Inventor before: Wang Changtao Inventor before: Zhao Dan Inventor before: Zhang Jiachan Inventor before: Wang Dongdong Inventor before: Xie Yafei Inventor before: Liu Pingping |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Changtao Inventor after: Li Meng Inventor after: Zhang Jiachan Inventor after: Zhao Dan Inventor after: Li Guangmin Inventor after: Wang Lianchun Inventor after: Duan Chao Inventor before: Wang Changtao Inventor before: Li Meng Inventor before: Zhang Jiachan Inventor before: Wang Dongdong Inventor before: Zhao Dan Inventor before: Xie Yafei Inventor before: Liu Pingping |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160504 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |