CN117820480A

CN117820480A - 纳米抗体串联体、编码基因及应用

Info

Publication number: CN117820480A
Application number: CN202311865778.4A
Authority: CN
Inventors: 刘拥军; 刘广洋; 米一; 陈瑶瑶; 周敬文; 徐利强
Original assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体涉及纳米抗体串联体、编码基因及应用。本发明提供的抗体包含第一单域抗体和第二单域抗体；所述的第一单域抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；所述的第二单域抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的HCDR4、如SEQ ID NO:5所示的HCDR5、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的HCDR6。本发明的串联单域抗体的结合能力强，且具有较强的阻断能力和稳定性。

Description

纳米抗体串联体、编码基因及应用

技术领域

本发明属于细胞免疫学技术领域，具体涉及纳米抗体串联体、编码基因及应用。

背景技术

IL-17是具有广谱促炎效应的细胞因子，通过激活DCs、单核和中性粒细胞浸润诱导和调节炎性Th17细胞应答。IL-17家族包括IL-17A～IL-17F以及受体IL-17RA、IL-17Rc等，不同组织局部的不同IL-17分子与其相应受体作用，发挥不同的促炎作用。其中IL-17A的分布最广，IL-17A的细胞来源主要有3种，包括适应性免疫细胞CD4+Th17、固有免疫的γδT细胞和固有样淋巴细胞3(ILC3s)，IL-17A可通过激活T细胞和其他免疫细胞产生各种炎性反应，导致机体自身免疫紊乱，在诸如***性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和多发性硬化(MS)、银屑病(Psoriasis)等自身免疫性疾病中均发挥重要作用。

IL-17A可作用于纤维母细胞、上皮细胞以及巨噬细胞，诱导多种炎症前因子及趋化因子例如CXCL1、CCL2、CCL7、CCL20以及基质金属蛋白酶(MMP)等的表达。IL-17A还可以通过介导聚集中性粒细胞和巨噬细胞来参加炎症发生。在一些自身免疫性疾病的研究中，通过阻断IL-17A，可以减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度(Park,H.,et al.,Adistinct lineage of CD4 Tcells regulates tissue inflammation by producinginterleukin 17.Nat Immunol,2005.6(11):1133-41)。

单克隆抗体(mAbs)作为一种新的药物形式，来阻断疾病的可溶性介质，如细胞因子和受体。这种新的药物与传统治疗方法相比有一些特点，如高特异性，靶向选择性，具有治疗自身免疫性疾病的免疫抑制和抗炎药物的优点。

中国专利CN103936854B中公开了一种抗IL-17A单克隆抗体及其制备与应用，该专利中还包含编码所述抗体的多核苷酸序列的表达载体，宿主细胞，以及单克隆抗体用于制备治疗由IL-17A介导的免疫***疾病中的用途。该发明从全合成噬菌体抗体库中筛选出抗IL-17A单克隆抗体，然后用一种构建小容量定点突变的全合成噬菌体抗体库的方法，对筛选出的抗IL-17A单克隆抗体的重链可变区CDR3区突变建库进行抗体体外亲和力成熟，最终获得高亲和力的抗体，同时增加了抗体库的多样性。但单克隆抗体具有一定的缺点，生产成本高，会产生耐药性，并且可能会出现机会性感染和毒性。

单域抗体(sdAb)与常规的单克隆抗体不同，单域抗体缺少轻链，并且重链的可变区与铰链区之间没有CH1区，只有重链的可变区(VHH)和两个常规的CH2和CH3区。单域抗体的分子质量仅为传统抗体的十分之一，是最小的功能性抗原结合片段，由于其分子尺寸小，能够穿透到细胞间隙和组织中，并且能够穿过血脑屏障并在中枢神经***中发挥作用。单域抗体的结构稳定，并且免疫原性低，易于人源化改造。单域抗体的CDR3较长，与抗原的结合方式更加灵活。

对于自身免疫性疾病临床可用的特效药物较少，单克隆抗体治疗存在一定的缺陷。因此，亟需开发一种稳定性高、亲和力强、制备方法简单、生产成本低的单域抗体类的药物。

本发明人致力于抗IL-17A抗体开发，基于筛选出的9个单域抗体(已另案申请)，进行进一步的技术开发，获得了12个亲和力、阻断效果和稳定性相对提升的单域抗体组合，基于专利法单一性的相关规定，对12个不同单域抗体组合分别请求保护。

本发明是针对上述12个单域抗体组合抗体之一所进行的专利申请。

本发明人还基于以上，开发了基因修饰干细胞技术以及后续的应用技术，基于专利法单一性的相关规定，对3个不同的基因修饰干细胞以及3项不同的应用分别请求保护。

为便于理解本发明技术方案，可选地参阅本项目其他专利申请文件。

发明内容

本发明的术语和声明：

1、如本文所用，术语“氨基酸”：包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。

2、如本文所用，术语“抗体”：指特异性结合和识别抗原的包括免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段。术语抗体的使用意指包含全抗体和其抗原结合片段。术语抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。

3、如本文所用，术语“单域抗体(VHH)”、“单域抗体”(singledomain antibody,sdAb，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。“本发明单域抗体”、“本发明的抗IL-17A单域抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于IL-17A的单域抗体。

4、如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，为了进行比较的目的，这些位置可能会被对齐。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。

5、如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。

6、如本文所用，术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照一个方向读取。

7、如本文所用，术语“核酸分子”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明中的核苷酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法或人工合成的方法获得。

8、如本文所用，术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序，即在DNA中为A、T、G、C的排列顺序，或者在mRNA中A、U、G、C的排列顺序，也包括rRNA、tRNA、mRNA中碱基的排列顺序。

9、如本文所用，术语“框架区”即骨架区，在免疫球蛋白的H和L链的近N端约有110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区(V)和恒定区(C)。可变区内包含超变区HVR或称互补决定区CDR与FR骨架区。

10、如本文所用，术语“人源化”抗体是指抗体的可变区(VH或VHH)的Fr区部分，恒定区部分(即CH和CL区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。

11、如本文所用，术语“Fc区”是指免疫球蛋白的C端区域，该区域是由重链恒定结构域中仅CH2和CH3组成的功能性结构单元。Fc没有结合抗原的能力，然而其具有半衰期延长的性质，并且具有恒定的氨基酸序列。

12、如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区或超变区中的三个片段中。本文中，“可变区”与“互补决定区”可互换使用。

13、如本文所用，术语“表达载体”是多核苷酸，其在引入合适的宿主细胞后能够被转录和翻译为多肽。

14、本文所用的术语“高变区”、“超变区”、“互补决定区”、“HVR”或“CDR”，是指在抗体可变结构域区域中序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR或CDR：三个存在于VH中(H1、H2、H3)，三个存在于VL中(L1、L2、L3)。基于Chothia定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L26-L32(L1)、L50-L52(L2)、L91-L96(L3)、H26-H32(H1)、H52-H56(H2)和H96-H101(H3)处(Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。基于Kabat定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L24-L34(L1)、L50-L56(L2)、L89-L97(L3)、H31-H35(H1)、H50-H65(H2)和H95-H102(H3)处(Kabat等人，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,the fifth edtion,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991))。基于IMGT定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L27-L32(L1)、L50-L51(L2)、L89-L97(L3)、H26-H33(H1)、H51-H56(H2)和H93-H102(H3)处(Honjo,T.和Alt,F.W.(1995)Immunoglobulin genes.Academic Press pp.3-443)。本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于CDR移植的抗体人源化设计的参考工具(参见J MolBiol.273:927-48,1997)。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本公开请求保护的范围是基于IMGT定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。

15、本文所用的术语“EC50”是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，即能引起50％最大效应(在本文中为“结合IL-17A能力”)的浓度。

16、本文所用的术语“IC50”是指半抑制浓度(half maximal inhibitoryconcentration)，即能引起50％最大抑制效应(在本文中为“抑制IL-17A和其受体IL-17RA结合的能力)的浓度。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种抗体，所述的抗体包含第一单域抗体和第二单域抗体；

所述的第一单域抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ IDNO:2所示的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；和/或；与SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；

所述的第二单域抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的HCDR4、如SEQ IDNO:5所示的HCDR5、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的HCDR6；和/或；与SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。

优选地，所述抗体的氨基酸序列包含：通过在SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

进一步地，所述抗体的氨基酸序列包含：与SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸差异的氨基酸序列。

在一些实施方式中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守性取代。这种保守性取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、He、Val和Cys；以及(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

在一些具体的实施方式中，保守性取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

SEQ ID NO:1为：ESLLRLYA。

SEQ ID NO:2为：HTTSDTT。

SEQ ID NO:3为：HVTSMRDSQNY。

SEQ ID NO:4为：GFSTHIYA。

SEQ ID NO:5为：ITRGGVT。

SEQ ID NO:6为：NAGGTNGGY。

优选地，所述第一单域抗体或第二单域抗体还包括用于连接重链可变区的至少4个重链框架区。

进一步地，所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

优选地，包含部分或全部选自骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

更优选地，包含部分或全部选自羊驼源的抗体重链框架区或其变体。

第二方面，本发明提供了一种抗体，所述的抗体包括：

(1)第一单域抗体，所述的第一单域抗体的结构为：

FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

(2)第二单域抗体，所述的第二单域抗体的结构为：

FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8；

其中HCDR1、HCDR2和HCDR3选自：

如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO:1-3相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11个氨基酸差异的氨基酸序列；

HCDR4、HCDR5和HCDR6选自：

如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO:4-6相比具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸差异的氨基酸序列；

FR1、FR2、FR3和FR4选自：如SEQ ID NO:7-10所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO:7-10相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

FR5、FR6、FR7和FR8选自：如SEQ ID NO:11-14所示的氨基酸序列；或；与SEQ IDNO:11-14相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

所述的氨基酸差异通过在SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式实现。

优选地，所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的HCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的HCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的HCDR6的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选地，所述的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述的FR5的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述的FR6的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述的FR7的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述的FR8的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

SEQ ID NO:7为：DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS。

SEQ ID NO:8为：MGWYRQLPGQEREWVAI。

SEQ ID NO:9为：

NYRDSVKGRFTLSRDVATNTIYLQMTSLKPEDTAVYYC。

SEQ ID NO:10为：WGQGTQVTVSS。

SEQ ID NO:11为：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS。

SEQ ID NO:12为：MGWYRQAPGKQRELVAT。

SEQ ID NO:13为：

NNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC。

SEQ ID NO:14为：WGQGTQVTVSS。

优选地，所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列直接连接；或；通过连接子间接连接。

进一步地，所述连接子为(GGGGS)n，其中n选自1、2、3、4、5或6；较佳地，所述连接子为(GGGGS)3。

具体地，所述的第一单域抗体和第二单域抗体以任选的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从N端到C端的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从C端到N端的顺序连接。

优选地，所述的抗体为抗IL-17A抗体。

第三方面，本发明提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白包含上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体。

优选地，所述重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌，或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

优选地，所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

优选地，所述的免疫球蛋白Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体；

较佳地，所述的免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG抗体，例如IgG1 Fc、IgG2Fc、IgG3Fc或IgG4 Fc，优选IgG1 Fc。

在一些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区或Fc结构域中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换、缺失和***)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。

在一些实施方案中，所述重组蛋白可以为单聚体、二聚体或多聚体。

第四方面，本发明提供了一种药物偶联物，所述的药物偶联物包括：

(1)上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体或所述的重组蛋白；和

(2)与(1)偶联的偶联部分。

在一些实施方式中，所述偶联部分包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。

第五方面，本发明提供了一种抗体制剂，所述的抗体制剂包括：

(1)第一方面或第二方面任一方面所述的抗体或所述的重组蛋白；和；

(2)药学上可接受的载体。

具体地，所述的药学上可接受的载体包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用。

进一步地，所述的药学上可接受的载体选自赋形剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂、润滑剂中的一种或多种。

第六方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体或所述的重组蛋白或所述的抗体制剂；

任选地，所述的试剂盒还包括装载所述抗体制剂的容器。

第七方面，本发明提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体或所述的重组蛋白。

具体地，所述的核酸可为RNA、DNA或cDNA。

对于一些实施方式，本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可为表达载体，该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。

第八方面，本发明提供了一种表达载体，所述的表达载体包含所述的核酸分子。

优选地，所述的表达载体选自DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、或其组合。

第九方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体、所述的重组蛋白、所述的药物偶联物、所述的抗体制剂、所述的核酸分子或所述的表达载体；

任选地，所述药物组合物还包括至少一种药学上可接受的辅料。

具体地，所述的药学上可接受的辅料选自稀释剂、等渗剂、缓冲剂、乳化剂、增稠剂、甜味剂、崩解剂、防腐剂、吸收剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、溶剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、水合剂、乳化加速剂、着色剂、香味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂中的一种或多种。

第十方面，本发明提供了上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体、所述的重组蛋白、所述的药物偶联物、所述的抗体制剂或所述的药物组合物的用途，所述的用途为以下用途中的至少一种：

(1)制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物；

(2)制备预防和/或治疗癌症的药物；

(3)制备检测试剂或试剂盒。

具体地，所述自身免疫性疾病包括银屑病、类风湿关节炎、卡斯尔曼病、恶性类风湿关节炎、血管炎、自身免疫性肝炎、脊椎关节炎、狼疮性肾炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、恶性贫血、艾迪生病、局灶性硬皮病、特发性艾迪生病、炎症性肠病、结节病、妊娠疱疹、多发性肌炎、巴塞杜病、成人斯蒂尔病、***性红斑狼疮、视神经脊髓炎、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、***性硬皮病、进行性***性硬化症、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、幼年特发性关节炎、混合性***病、干燥综合征、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、IgG4相关疾病、ANCA相关性血管炎、Good-pasture综合征、Cogan综合征、线性IgA大疱性皮肤病、缓慢进展型I型糖尿病、I型糖尿病、RS3PE综合征、颞动脉炎、***、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、银屑病关节炎、类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无***症、习惯性流产、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、***性肥大细胞增多症或包涵体肌炎；

进一步地，所述自身免疫性疾病为斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎或狼疮性肾炎。

具体地，所述癌症包括口腔癌、呼吸***癌、眼癌、皮肤癌、头颈癌、喉癌、食道癌、淋巴瘤、胃癌、骨癌、消化***癌症、肝癌、肝癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、白血病、胶质母细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、子宫内膜癌、乳腺癌、腹膜癌、***、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、***癌、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、直肠癌、唾液腺癌、肉瘤、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿***癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。

第十一方面，本发明提供了一种用于非诊断目的的体外检测样品中IL-17A的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)将上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体、所述的重组蛋白、所述的药物偶联物或所述的抗体制剂与待测样品接触；

(2)检测抗原-抗体复合物；

(3)进行结果判读。

第十二方面，本发明提供了一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：

向受试者施用治疗有效量的上述第一方面或第二方面任一方面所述的抗体、所述的重组蛋白、所述的药物偶联物或所述的抗体制剂。

第十三方面，本发明提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括：

本发明所取得的技术效果：

(1)本发明的串联抗体1-C11+1-G4的亲和力好，可与目标蛋白结合，且结合能力显著优于阳性抗体。

(2)阻断效果好，串联抗体1-C11+1-G4可以阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc；1-C11+1-G4阻断效果显著优于阳性对照抗体。

(3)稳定性强，1-C11+1-G4的Tm值为62.37，Tagg值为63.35，优于阳性抗体。

附图说明

图1为IL-17A重组蛋白的SDS-PAGE结果。其中M为蛋白marker，泳道1为IL-17A重组蛋白精纯前的样品，泳道2为IL-17A重组蛋白精纯后的样品。

图2为羊驼酵母库流式检测结果。

图3为酵母单克隆FACS检测结果。

图4为串联单域抗体1-C11+1-G4的SDS-PAGE结果，图4中左侧条带为marker，右侧条带为1-C11+1-G4。

图5为ELISA检测串联单域抗体亲和力的实验结果。

图6为ELISA检测阳性对照抗体亲和力的实验结果。

图7为FACS检测IL-17A重组蛋白与报告基因细胞株的结合情况。

图8为IL-17A重组蛋白激活报告基因细胞株的实验结果。

图9为阳性抗体Ixekizumab阻断IL-17A重组蛋白的实验结果。

图10为串联单域抗体阻断功能检测的实验结果。

图11为阳性对照抗体阻断功能检测的实验结果。

图12为串联单域抗体的热稳定性检测结果。

图13为阳性对照抗体的热稳定性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的实验试剂：

琼脂(Sigma,CAT#A1296)；蛋白胨(Sigma,CAT#93926)；酵母提取物(OXOID,CAT#:LP0021)；氯化钠(阿拉丁,CAT#:C111533)；氯化钾(阿拉丁,CAT#:P112133)；硫酸镁(国药,CAT#:10013018)；氯化镁(国药,CAT#:10012818)；葡萄糖(生工,CAT#:GT1991)；SfiI(NEB,CAT#:R0123L)；T4 DNA ligase(TaKaRa,CAT#:2011A)；PrimeScript^TMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa,CAT#:6210B)；NuHi power mix(新海生物,CAT#:NH9303)；3M醋酸钠(pH5.2-6)(Sigma,CAT#:126-96-5)；DNA片段回收试剂盒(TakaRa,CAT#:9761)；胶回收试剂盒(Qiagen,CAT#:28706)；天根质粒大抽试剂盒(天根,CAT#:DP117)；HRP-Anti-M13(iCarTab)；PE-anti-Human IgG(eBioscience,Cat#:12-4998-82)；PE-Streptavidin(Biolegend,405204)；Rabbit anti-Llama IgG(H+L)Secondary Antibody[HRP](Novus，CAT#NBP1-75095)；SS320感受态(iCarTab)；pComF噬菌体展示载体(iCarTab)；BL21感受态(Biomed,BC201-02)；NHS-biotin(APExBIO,CAT#:A8002)；HRP-Streptavidin(Boster,CAT#:BA1088)；HRP-ProteinA(Boster，BA1080)；ProA Biosensors(Sartorius,CAT#:18-5010)；PBS(Gbico,CAT#14190-250)；DMEM(Gbico,CAT#41965-062)；RPMI1640(Gbico,CAT#61870044)；FBS(VivaCell,CAT#C04001-500)；Genomic DNA PurificationKit(Lifetech，CAT#K0512)；Mouse-IL-17A-His(ACRO，CT8-M5240)；Bright-LiteLuciferase Assay System(Vazyme,CAT#DD1204-01)；NHS-biotin(APExBIO,CAT#:A8002)。

实验耗材：

50mL Falcon离心管(Corning,CAT#352070)；电击杯(Bio-Rad 0.2cm)；RNasefree 1.5mL EP管(QSP,CAT#:509-GRD-Q)；200μL RNase free PCR管(Axygen,PCR-02D-C)；T125摇瓶(Corning,CAT#431143)；15mL Falcon离心管(Corning,CAT#430052)；6孔板(Corning,CAT#3516)；96孔板(Corning,CAT#3365)；96孔黑板(F-BOTTOM(CHIMNEY WELL)BLACK)。

实验设备：

电转仪(Eppendorf Multiporator)；离心机(Thermo FRESCO-17)；恒温培养箱(上海精宏DNP-9052)；恒温震荡培养箱(精骐CO-O6U)；超净工作台(苏净安泰SW-CJ-1FD)；PCR仪(Applied Biosystems ABI2720)；生物安全柜(海尔，HR40-IIA2)；流式细胞仪(ThermoAttune Nxt flow cytometer)；Thermo 3111CO₂培养箱；ForteBio OCTET R2。

本发明筛选、克隆VHH片段、构建纳米抗体所使用的引物均参照以下文献设计：

Maass DR,Sepulveda J,Pernthaner A,Shoemaker CB.Alpaca(Lama pacos)as aconvenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies(VHHs).JImmunol Methods.2007；324(1-2):13-25。

Lin,J,Gu,Y,Xu,Y et al.Characterization and applications of nanobodiesagainst Pseudomonas aeruginosa exotoxin a selected from single alpaca Bcells.Biotechnol Biotechnol Equip 2020；34:1028-37。

Studies on design of singledomain antibodies by AlpacaVHH phagelibrary and high throughput sequencing toconstruct Fab antibody purificationsystem(http://hdl.handle.net/10232/00030916)。

实施例1IL-17纳米抗体筛选方法

1.1制备IL-17A(Human)重组蛋白(抗原)

从UniProt数据库中检索Human IL-17A(Q16552-1)序列信息(AA Gly 24-Ala155，如SEQ ID NO:15所示)，在C端添加6×His标签，按照原核密码子优化后进行基因合成并亚克隆至pET28a载体中；经Sanger测序验证无误后，进行质粒抽提。

将重组质粒转化BL21感受态，使用0.5mM IPTG诱导过夜，收集菌液裂解；使用镍柱纯化重组蛋白。

SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度，结果显示纯度>90％(图1)。

SEQ ID NO:15:

MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNI HNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINAD GNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA。

1.2羊驼免疫

采用制备的重组抗原对2只羊驼(Alpaca)进行免疫，免疫方式为皮下多点免疫，共免疫6次，间隔时间21天，最后一次免疫10天后，采集外周血，ELISA检测免疫效价。

经6轮免疫，羊驼的免疫效价均达到要求(见表1)。

表1免疫效价检测结果

1.3构建抗体酵母文库

(1)PBMC分离及VHH抗体片段克隆：

采集100mL外周血抗凝样品，使用淋巴细胞分离液分离PBMC细胞；

提取RNA，使用PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，制备cDNA；

PCR扩增VHH片段。

(2)构建单域抗体酵母展示库

1.4酵母展示库淘选和筛选：

使用制备的IL-17A抗原，与链霉亲和素磁珠孵育，将酵母菌液加到结合了抗原的磁珠中，4℃旋转孵育60分钟对构建的酵母展示库使用链霉亲和素磁珠进行2轮磁分选。分选后酵母菌液涂SDCAA平板，挑取单克隆培养，诱导表达48h后进行流式分析。与Biotin-IL-17A-His孵育1h，二抗使用PE Streptavidin，孵育完成后进行流式检测。

根据流式检测结果(图2)，第二次磁分选后，酵母阳性率为37.9％，阳性克隆显著富集，将分选产物直接涂SDCAA平板，挑选单克隆进行流式检测。

1.5FACS筛选

分选后酵母菌液涂SDCAA平板，挑取单克隆培养，诱导表达48h后，与Biotin-抗原孵育，二抗使用PE-Streptavidin，孵育完成后进行流式检测。

结果如图3所示，FACS检测IL17A靶点单克隆与靶点结合情况；对测序获得的候选单域抗体氨基酸序列进行比对，挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体构建真核表达载体。

1.6抗体序列鉴定

富集阳性克隆；挑选富集后的单克降，进行Phage ELISA鉴定，并对克隆进行测序分析，获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息。随机挑取20个单克隆，进行测序分析，序列差异大，库多样性较好。针对候选的单域抗体CDR区域氨基酸序列信息，采用In silico方法对可能的翻译后修饰位点进行分析。

1.7抗体表达纯化

根据候选抗体的ELISA检测结果，挑选阳性克隆，将获得的VHH抗体序列分别进行基因合成，与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

将上述DNA/LVTransm复合物加入到30mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130rpm培养6-8小时后，加入50mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

Protein A柱子纯化抗体的步骤如下所示：

1)将含有目标抗体的样品加入EP管中，轻轻倒置试管混合。

2)将EP管在室温下混合或在旋转器上孵育，(1-4小时或过夜)，可添加100mM PMSF以防止蛋白质降解。

3)使用磁分离架收集磁珠并弃去上清液。

4)向EP管中加入1mL结合/洗涤缓冲液并充分混匀，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液，重复洗涤步骤三遍。

5)向EP管中加入500μL洗脱缓冲液，用移液器吹打或者涡旋震荡下迅速重悬，然后在室温下(约25℃)置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管孵育5分钟。

6)使用磁分离架收集磁珠，将含有洗脱抗体的上清液转移到干净的EP管中。

7)重复步骤1)和2)两次。

8)向每500μl洗脱液中加入1/10的中和缓冲液以中和pH，以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。

9)结合/洗涤缓冲液：1×PBS，pH 7.0。

洗脱缓冲液：(1)0.1M甘氨酸，pH 2-3；(2)0.1M NaAc-HAc，pH 3.6。

中和缓冲液：1M Tris，pH 8.5。

磁珠再生缓冲液：0.1M NaOH。

实施例2制备串联单域抗体

2.1筛选抗IL-17A单域抗体

发明人经过免疫羊驼和酵母库筛选，最终得到了14种抗IL-17A单域抗体。在抗体阻断活性检测中发现，部分单域抗体虽然能够阻断Human IL-17A蛋白激活下游靶标蛋白，但阻断效果均弱于阳性抗体Ixekizumab。因此，发明人将其中两种抗IL-17A单域抗体串联增强其阻断效果。两种抗IL-17A单域抗体为1-C11和1-G4。

第一单域抗体1-C11的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

SEQ ID NO:16：

DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASESLLRLYAMGWYRQLPGQEREWV AIHTTSDTTNYRDSVKGRFTLSRDVATNTIYLQMTSLKPEDTAVYYCHVTSM RDSQNYWGQGTQVTVSS。

编码单域抗体1-C11的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

SEQ ID NO:17：

GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGAAAGCCTCCTCAGGTTGTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAACTTCCAGGGCAGGAGCGCGAGTGGGTCGCAATACACACTACTAGTGACACCACTAATTATAGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACGCTCTCCAGAGACGTCGCCACGAACACGATTTATCTCCAAATGACCAGCCTCAAACCTGAAGACACGGCCGTCTATTATTGTCATGTTACTTCCATGAGAGATTCACAAAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCG。

第二单域抗体1-G4的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

SEQ ID NO:18：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSTHIYAMGWYRQAPGKQRELV ATITRGGVTNNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGG TNGGYWGQGTQVTVSS。

编码单域抗体1-G4的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。

SEQ ID NO:19：

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTAGTACCCACATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGCTGGTCGCAACTATTACTAGAGGTGGTGTAACAAATAATGCAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAGGTGGGACGAACGGGGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

2.2制备串联单域抗体1-C11-1-G4

将候选抗体按照VHH-(GGGGS)₃-VHH-IgG1 Fc的形式构建成双价的单域抗体，并采用ProteinA的磁珠进行纯化，IgG1 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

SEQ ID NO:20：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。

SEQ ID NO:21：

GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAtaa。

具体步骤如下：

1)将上述两种抗IL-17A单域抗体序列进行基因合成，与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用；

2)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

3)将上述DNA/LVTransm复合物加入到30mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130rpm培养6-8小时后，加入50mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

4)连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体，最终得到串联单域抗体1-C11-1-G4。

串联单域抗体1-C11-1-G4的SDS-PAGE结果如图4所示，结果表明，候选抗体分子量大小符合预期，纯度可以进行下一步的实验。

实施例3串联单域抗体亲和力检测

3.1制备阳性对照抗体Ixekizumab

基因合成Ixekizumab重链及轻链可变区(重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)，将重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG4(IgG4氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示)载体中，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgKc载体中(IgG KC的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)；经Sanger测序验证无误后使用质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

从冰箱中取出LVTransm转染试剂及重链与轻链表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入50μg重链和轻链表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入300μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

将上述DNA/LVTransm复合物加入到100mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀，将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱，130RPM继续培养。

连续培养5-7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

SDS-PAGE检测目标抗体蛋白的纯度，结果显示蛋白纯度>95％。

SEQ ID NO:22:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEW MGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARY DYFTGTGVYWGQGTLVTVSS。

SEQ ID NO:23:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQL LIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQ GTKLEIK。

SEQ ID NO:24:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。

SEQ ID NO:25:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC。

3.2ELISA检测Human IL-17A重组蛋白与对照抗体结合活性

(1)使用无菌CBS稀释IL-17A重组蛋白至终浓度为2μg/mL。取一块新的96孔板，加入100μL/孔4℃包被过夜；

(2)去掉抗原包被液，使用PBST(含0.5％的吐温)洗涤3次；

(3)加入200μL/孔的3％MPBS 37℃封闭2小时；

(4)去掉封闭缓冲液后，使用PBST洗涤孔板3次；

(5)阳性对照抗体Ixekizumab使用PBS稀释至10μg/ml，5倍稀释7个点，按100μL/孔加入酶标板中，室温孵育1小时，对照孔为PBS；

(6)去掉孔内的液体，并使用PBST洗涤3次；

(7)加入二抗HRP-ProteinA(Boster，BA1080)1：10000稀释，按100μL/孔加入酶标板中，室温孵育1小时；

(8)去掉孔内的液体后，使用PBST洗涤孔板3次；

(9)加入100μL/孔TMB显色液；

(10)室温避光孵育15分钟；

(11)加入50μL/孔终止液(2M HCL)；

(12)使用酶标仪读取孔内的OD450值。结果如表1所示，阳性抗体与IL-17A抗原蛋白结合良好，可以用于免疫。

表1Human IL17A与阳性抗体结合活性检测

/>

3.3ELISA检测串联单域抗体亲和力

将纯化后的单域抗体2μg/mL包被96孔酶标板，加入Biotin-IL-17A-His，起始浓度为10μg/mL，5倍梯度稀释7个点，采用HRP-Streptavdin进行ELISA检测。结果显示，1-C11+1-G4的EC50为1.542(图5)，远低于阳性对照抗体的10.06(图6)。因此该串联单域抗体可与目标蛋白结合，结合能力显著高于阳性抗体。

实施例4串联单域抗体阻断功能检测

4.1IL-17A报告基因细胞株构建

根据IL-17RA(UniProtKB：Q96F46，SEQ ID NO:26)及IL-17RC(UniProtKB：Q8NAC3，SEQ ID NO:27)的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体并包装慢病毒，共同感染293细胞，筛选同时过表达这两个受体的重组293细胞，进一步稳转NFKB-Luciferase(氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示)和ACT1基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示)，构建IL-17A报告基因细胞株293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。

SEQ ID NO:26:

MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQFLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGWDTMGSESEGPSA。

SEQ ID NO:27:

MPVPWFLLSLALGRSPVVLSLERLVGPQDATHCSPVSLEPWGDEERLRVQFLAQQSLSLAPVTAATARTALSGLSGADGRREERGRGKSWVCLSLGGSGNTEPQKKGLSCRLWDSDILCLPGDIVPAPGPVLAPTHLQTELVLRCQKETDCDLCLRVAVHLAVHGHWEEPEDEEKFGGAADSGVEEPRNASLQAQVVLSFQAYPTARCVLLEVQVPAALVQFGQSVGSVVYDCFEAALGSEVRIWSYTQPRYEKELNHTQQLPDCRGLEVWNSIPSCWALPWLNVSADGDNVHLVLNVSEEQHFGLSLYWNQVQGPPKPRWHKNLTGPQIITLNHTDLVPCLCIQVWPLEPDSVRTNICPFREDPRAHQNLWQAARLQLLTLQSWLLDAPCSLPAEAALCWRAPGGDPCQPLVPPLSWENVTVDKVLEFPLLKGHPNLCVQVNSSEKLQLQECLWADSLGPLKDDVLLLETRGPQDNRSLCALEPSGCTSLPSKASTRAARLGEYLLQDLQSGQCLQLWDDDLGALWACPMDKYIHKRWALVWLACLLFAAALSLILLLKKDHAKGWLRLLKQDVRSGAAARGRAALLLYSADDSGFERLVGALASALCQLPLRVAVDLWSRRELSAQGPVAWFHAQRRQTLQEGGVVVLLFSPGAVALCSEWLQDGVSGPGAHGPHDAFRASLSCVLPDFLQGRAPGSYVGACFDRLLHPDAVPALFRTVPVFTLPSQLPDFLGALQQPRAPRSGRLQERAEQVSRALQPALDSYFHPPGTPAPGRGVGPGAGPGAGDGT。

SEQ ID NO:28:

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV。

SEQ ID NO:29:

atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtg。

SEQ ID NO:30:

ATGCCACCTCAGTTGCAGGAAACTCGGATGAATAGAAGCATCCCCGTGGAAGTGGACGAGAGCGAGCCGTACCCTAGTCAGCTGCTGAAGCCGATCCCTGAGTACTCCCCGGAAGAGGAATCCGAACCACCAGCCCCCAACATTCGCAATATGGCCCCCAATAGCTTGTCCGCACCAACAATGCTGCACAACTCTTCTGGCGACTTCTCTCAGGCCCACTCCACCCTGAAACTGGCGAATCACCAGCGGCCTGTATCCCGGCAGGTGACCTGTCTGAGAACTCAGGTGCTTGAAGACTCCGAGGACTCTTTCTGTAGGCGGCATCCAGGTTTGGGCAAGGCGTTTCCGTCCGGCTGTTCCGCGGTTTCAGAGCCCGCTTCCGAAAGTGTCGTGGGCGCCCTGCCAGCCGAGCACCAGTTCTCCTTCATGGAAAAGCGGAACCAGTGGCTGGTCAGTCAGCTGAGCGCCGCGTCACCTGATACAGGTCACGATTCCGACAAGTCTGACCAGTCTCTGCCCAATGCGTCAGCCGATAGTCTCGGGGGCTCCCAGGAGATGGTGCAGAGACCACAGCCGCACAGAAACCGGGCCGGGCTTGATCTGCCCACCATTGATACAGGCTACGATTCCCAGCCCCAGGACGTCCTTGGCATTCGCCAGCTGGAAAGGCCTCTGCCCTTGACCTCCGTGTGTTACCCCCAGGACCTGCCCCGCCCTTTGAGAAGCCGGGAGTTTCCCCAGTTTGAGCCCCAACGATACCCTGCCTGTGCTCAGATGCTGCCTCCGAACCTGAGCCCACACGCTCCCTGGAACTACCACTATCACTGTCCCGGCAGCCCCGATCACCAGGTGCCTTATGGACACGACTACCCGCGGGCTGCATACCAGCAGGTCATACAGCCTGCCTTGCCGGGTCAGCCGCTGCCCGGAGCTTCTGTGCGCGGCCTGCACCCCGTTCAGAAAGTGATCCTGAACTATCCAAGCCCATGGGACCATGAAGAGAGACCAGCCCAAAGAGATTGCTCTTTTCCTGGGTTGCCTAGACACCAAGACCAGCCTCACCACCAGCCTCCCAATCGGGCAGGCGCCCCAGGCGAAAGTCTCGAGTGCCCCGCCGAACTCAGACCACAGGTCCCTCAGCCCCCTTCCCCCGCGGCAGTACCCAGACCCCCCTCTAACCCACCCGCCCGGGGAACGCTCAAGACTTCAAATCTCCCAGAAGAGCTGCGCAAAGTGTTCATAACCTACAGCATGGACACCGCTATGGAGGTGGTTAAGTTCGTCAACTTCCTGCTGGTCAATGGGTTCCAGACTGCAATCGACATTTTTGAGGATAGAATTCGGGGAATCGACATCATCAAGTGGATGGAGAGATACCTGCGGGATAAGACAGTGATGATTATCGTGGCCATTAGTCCCAAGTACAAGCAAGATGTGGAGGGCGCAGAATCACAGTTGGACGAAGACGAGCACGGACTCCATACAAAATATATCCACAGGATGATGCAGATCGAGTTCATTAAACAAGGCTCCATGAATTTCCGCTTCATACCGGTCCTGTTTCCAAACGCAAAAAAAGAGCATGTACCCACTTGGCTCCAGAATACCCATGTCTACTCCTGGCCCAAGAACAAGAAGAATATCCTGCTGCGCTTGCTCAGAGAAGAAGAGTATGTCGCCCCTCCAAGGGGGCCCCTCCCCACACTCCAAGTAGTGCCACTT。

4.2IL-17A重组蛋白与报告基因细胞株的结合

从液氮中复苏293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞株，调整细胞状态至对数生长期；

将细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为2×10⁵个细胞；

将IL-17A-His蛋白与靶细胞孵育，充分混匀后，室温孵育1小时；

800×g室温离心3分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

加入二抗APC-His(1：500稀释)，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；

800×g室温离心3分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

使用500μL PBS重悬细胞，进行流式分析。

FACS结果显示：构建的IL-17A受体过表达细胞株可以和IL-17A结合，阳性率大于90％(图7)。

采用IL-17A重组蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。结果显示，IL17A重组蛋白可有效激活293F-IL17Ra/IL17Rc-NFκB-Luc报告基因细胞株中荧光素酶表达(图8)。

4.3Ixekizumab阻断IL-17A重组蛋白的功能实验

本实施例采用阳性抗体Ixekizumab检测荧光报告***的有效性。将阳性对照抗体Ixekizumab与IL-17A重组蛋白一起加入293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞，结果所示：阳性对照抗体Ixekizumab可抑制IL17A蛋白与其膜受体结合，并抑制胞内NFκB的信号，呈现剂量效应(图9)。

4.4串联单域抗体阻断功能

使用293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc报告基因细胞株进行串联单域抗体阻断活性检测。结果显示，1-C11+1-G4的IC50为0.654μg/mL，阳性对照抗体的IC50为1.356μg/mL(图10和图11)。因此，1-C11+1-G4和阳性对照抗体均可阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，且串联抗体1-C11-1-G4阻断效果显著优于阳性抗体。

实施例5串联单域抗体稳定性检测

通过微量差示扫描荧光技术(nanoDSF)技术检测荧光变化，可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性，精确地确定蛋白50％处于去折叠状态时的温度(T_m)以及开始出现聚集时的温度(T_agg)；热变性T_m值和T_agg越高说明抗体蛋白越稳定。

取100μL前期项目制备的候选抗体以及Ixekizumab(样本浓度大于200μg/mL)，4℃，12000×g，离心10min后，用毛细管吸取样品，每个样品准备两根毛细管，作为平行对照，按顺序放入对应的卡槽中，确保毛细管吸满样品，无气泡，进行检测分析。

实验结果：

实验结果如图12-图13所示，串联抗体1-C11-1-G4的稳定性较强，Tm＝62.37，Tagg＝63.35，阳性对照的Tm＝56.1，Tagg＝61.86。串联抗体1-C11-1-G4的稳定性优于阳性抗体。

应用实施例1一种抗体制剂

抗体制剂包含：串联单域抗体1-C11+1-G4，缓冲液、表面活性剂、氨基酸、张力剂等。

在本发明的一个实施方案中，所述的抗体制剂的制备包括：称取各物质，加水溶解并混匀，并调节各组分至下述浓度即得：(100-200)mg/ml的串联单域抗体1-C11+1-G4，(1-10)mM柠檬酸盐缓冲液，(0.1-1％w/v)吐温80，(100-200)mM精氨酸和(1-10)％蔗糖，所述制剂的pH为5.0-8.0。

应用实施例2一种试剂盒

试剂盒包含：串联单域抗体1-C11+1-G4、重组蛋白、抗体制剂和/或多克隆抗体，装载抗体制剂的容器，缓冲液等。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒包括：(100-200)mg/ml的串联单域抗体1-C11+1-G4，pH为5.0-8.0的缓冲液。

应用实施例3抗体药物偶联物

抗体药物偶联物包含：串联单域抗体1-C11+1-G4、重组蛋白、抗体制剂和/或多克隆抗体，药物为生理活性物质(如核酸等)和连接抗体与药物的接头(接头包括马来酰亚胺接头、Val-Cit接头、SS接头及DMSS接头)。

在本发明的一个实施方式，将串联单域抗体1-C11+1-G4通过SS接头与药物进行连接，添加(100-200)mM水溶液在室温下混匀，终止接头反应，即得抗体药物偶联物。

应用实施例4药物组合物

药物组合物包括串联单域抗体1-C11+1-G4、重组蛋白、抗体制剂、多克隆抗体、核酸分子、生物学表达载体和/或宿主细胞，还包括药学上可接受的辅料。

在本发明的一个实施方式，所述的药物组合物的制备包括：制备浓度为(100-200)mg/ml的串联单域抗体1-C11+1-G4，加入(1-20w/v)的蔗糖、(10-300)mM的组氨酸和(0.1-10)％的吐温80，即得所述药物组合物。

Claims

1.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包含第一单域抗体和第二单域抗体；

所述的第一单域抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；和/或；与SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；

所述的第二单域抗体的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的HCDR4、如SEQ ID NO:5所示的HCDR5、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的HCDR6；和/或；与SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体的氨基酸序列包含：通过在SEQID NO:1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述抗体的氨基酸序列包含：与SEQ IDNO:1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸差异的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗体，其特征在于：所述第一单域抗体或第二单域抗体还包括用于连接重链可变区的至少4个重链框架区。

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

6.一种抗体，其特征在于：所述的抗体包括：

(1)第一单域抗体，所述的第一单域抗体的结构为：

FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

(2)第二单域抗体，所述的第二单域抗体的结构为：

FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8；

其中HCDR1、HCDR2和HCDR3选自：

如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO:1-3相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸差异的氨基酸序列；

HCDR4、HCDR5和HCDR6选自：

FR5、FR6、FR7和FR8选自：如SEQ ID NO:11-14所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO:11-14相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于：所述的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述的HCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的HCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的HCDR6的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列直接连接；或；通过连接子间接连接。

9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于：所述连接子为(GGGGS)n，其中n选自1、2、3、4、5或6；较佳地，所述连接子为(GGGGS)3。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的第一单域抗体和第二单域抗体以任选的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从N端到C端的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从C端到N端的顺序连接。

11.根据权利要求1-10任意一项所述的抗体，其特征在于：所述的抗体为抗IL-17A抗体。

12.一种重组蛋白，其特征在于：所述的重组蛋白包含权利要求1-11任意一项所述的抗体。

13.根据权利要求12所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白还包含协助其表达和/或分泌，或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

14.根据权利要求13所述的重组蛋白，其特征在于：所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

15.根据权利要求14所述的重组蛋白，其特征在于：所述的免疫球蛋白Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体；

较佳地，所述的免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG抗体，例如IgG1 Fc、IgG2Fc、IgG3 Fc或IgG4 Fc，优选IgG1 Fc。

16.一种药物偶联物，其特征在于：所述的药物偶联物包括：

(1)权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白；和；

(2)与(1)偶联的偶联部分。

17.一种抗体制剂，其特征在于：所述的抗体制剂包括：

(1)权利要求1-11任意一项所述的抗体或权利要求12-15任意一项所述的重组蛋白；和；

(2)药学上可接受的载体。

18.一种试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1-11任意一项所述的抗体或权利要求12-15任意一项所述的重组蛋白或权利要求17所述的抗体制剂；

任选地，所述的试剂盒还包括装载所述抗体制剂的容器。

19.一种核酸分子，其特征在于：所述的核酸分子编码权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白。

20.一种表达载体，其特征在于：所述的表达载体包含权利要求19所述的核酸分子。

21.一种药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物包含权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的药物偶联物、权利要求17所述的抗体制剂、权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的表达载体；

22.权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的药物偶联物、权利要求17所述的抗体制剂或权利要求21所述的药物组合物的用途，其特征在于：所述的用途为以下用途中的至少一种：

(1)制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物；

(2)制备预防和/或治疗癌症的药物；

(3)制备检测试剂或试剂盒。

23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于：所述自身免疫性疾病包括银屑病、类风湿关节炎、卡斯尔曼病、恶性类风湿关节炎、血管炎、自身免疫性肝炎、脊椎关节炎、狼疮性肾炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、恶性贫血、艾迪生病、局灶性硬皮病、特发性艾迪生病、炎症性肠病、结节病、妊娠疱疹、多发性肌炎、巴塞杜病、成人斯蒂尔病、***性红斑狼疮、视神经脊髓炎、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、***性硬皮病、进行性***性硬化症、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、幼年特发性关节炎、混合性***病、干燥综合征、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、IgG4相关疾病、ANCA相关性血管炎、Good-pasture综合征、Cogan综合征、线性IgA大疱性皮肤病、缓慢进展型I型糖尿病、I型糖尿病、RS3PE综合征、颞动脉炎、***、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、银屑病关节炎、类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无***症、习惯性流产、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、***性肥大细胞增多症或包涵体肌炎；

24.根据权利要求22或23所述的用途，其特征在于，所述癌症包括口腔癌、呼吸***癌、眼癌、皮肤癌、头颈癌、喉癌、食道癌、淋巴瘤、胃癌、骨癌、消化***癌症、肝癌、肝癌、肺癌、肾癌、神经母细胞瘤、白血病、胶质母细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、子宫内膜癌、乳腺癌、腹膜癌、***、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、***癌、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、***癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、直肠癌、唾液腺癌、肉瘤、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿***癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。

25.一种用于非诊断目的的体外检测样品中IL-17A的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的药物偶联物或权利要求17所述的抗体制剂与待测样品接触；

(2)检测抗原-抗体复合物；

(3)进行结果判读。

26.一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，其特征在于：所述方法包括：

向受试者施用治疗有效量的权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的药物偶联物或权利要求17所述的抗体制剂。

27.一种预防和/或治疗癌症的方法，其特征在于：所述方法包括：