TWI830774B - 抗cd47抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，包含抗CD47抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段具有顯著的抗腫瘤活性，與人CD47蛋白的親和力較高，可阻斷SIRPa結合到細胞表面CD47的能力，且不具有顯著的紅血球凝集活性，可在製備抗腫瘤的藥物中應用。

Description

抗CD47抗體及其應用
本發明涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，包含抗CD47抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。
CD47蛋白又稱整合素相關蛋白(IAP)，屬於IgG超家族的一個五次跨膜糖蛋白，廣泛表現於不同組織細胞。CD47可與配體TSP-1或SIRPα結合，調控不同的細胞功能，包括細胞遷移、黏附、凋亡，軸突延伸，細胞因子產生及T細胞活化。SIRPα是一個含有典型免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)跨膜蛋白，主要表現於髓系造血細胞膜表面，如巨噬細胞，樹突狀細胞等。CD47與SIRPα結合後，導致ITIMs的磷酸化，從而招募SHP-1/SHP-2，進而抑制肌球蛋白IIA在吞噬突觸的積累，最終抑制吞噬細胞的吞噬功能。
腫瘤細胞的「免疫逃逸」被認為是腫瘤發生、發展和抗藥的主要機制。腫瘤細胞透過高表現CD47分子，與巨噬細胞表面的SIRPα相互作用，可顯著抑制巨噬細胞的吞噬活性，避免被巨噬細胞吞噬掉。當阻斷CD47與SIRPα的結合時，可消除因腫瘤導致的免疫抑制或免疫耐受，有效殺傷腫瘤細胞。這為CD47的腫瘤免疫靶向治療提供了極為有力的理論依據。
近年來，國內外針對CD47/SIRPα信號通路的各種治療方式進行了大量研究，例如抗CD47抗體、抗SIRPα抗體、重組SIRPα蛋白、雙特異性抗體。其中，CD47阻斷性抗體被認為是其中最有希望的腫瘤治療方案。人CD47阻斷型單抗的有效性已經在多種臨床前模型中證實，比如淋巴瘤、膀胱癌、結腸癌、成膠質細胞瘤、乳腺癌、急性淋巴細胞性白血病和急性骨髓性白血病等。
此外，由於紅血球、血小板也表現CD47分子，當抗體阻斷CD47與SIRPα的相互作用時，可能導致這些細胞失去「別吃我」信號的保護，進而被巨噬細胞吞噬。因此要避免抗CD47抗體的副作用，比如血小板降解、紅血球凝集、紅血球耗竭、貧血等也是應用抗CD47抗體需要考慮的一個重點。
因此，需要提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其具有優異的抗腫瘤活性且不具有顯著的紅血球凝集活性。
本發明一方面提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含重鏈可變區的互補決定區1(HCDR1)、重鏈可變區的互補決定區2(HCDR2)和/或重鏈可變區的互補決定區3(HCDR3)，所述輕鏈可變區包含輕鏈可變區的互補決定區1(LCDR1)、輕鏈可變區的互補決定區2(LCDR2)和/或輕鏈可變區的互補決定區3(LCDR3)。
在一些實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： (1)所述重鏈可變區包含選自如下組的HCDR1、HCDR2和HCDR3： (a1) 如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列； (a2) 如SEQ ID NO:10、2和11所示的胺基酸序列； (a3) 如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列；和 (a4) 如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列； (a5) 與(a1)、(a2)、(a3)或(a4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR；和 (2)所述輕鏈可變區包含選自如下組的LCDR1、LCDR2和LCDR3： (a6)如SEQ ID NO:12、13和14所示的胺基酸序列； (a7)如SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列；和 (a8)如SEQ ID NO:18、19和20所示的胺基酸序列； (a9)與(a6)、(a7)或(a8)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR。
在一個具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO:1、2和3或與SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:12、13和14或與SEQ ID NO:12、13和14所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一個具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO:10、2和11或與SEQ ID NO:10、2和11所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:12、13和14或與SEQ ID NO:12、13和14所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一個具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO:4、5和6或與SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:15、16和17或與SEQ ID NO:15、16和17所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一個具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO:7、8和9或與SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO:18、19和20或與SEQ ID NO:18、19和20所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一些具體的實施例中，根據本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段是單株抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施例中，根據本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段或人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中 (1) 所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (b1) 如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列； (b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b3) 與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 (2)所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (b4) 如SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28所示的胺基酸序列； (b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b6) 與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:21功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:21具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:24功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:22功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:22具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:25經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:25功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:23功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:23具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:26經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:26功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:26具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:27經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:27功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:24功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:23功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:23具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:28經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:28功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:28具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:21經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:21功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:21具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:24功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO:12、13和14所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:22經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:22功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:22具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:25經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:25功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:25具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:23功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:23具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:26經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:26功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:26具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 18、19和20所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:27經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:27功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:27具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:1、2和11所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:24經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:24功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:24具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 12、13和14所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:23經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:23功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:23具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:28經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:28功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:28具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 18、19和20所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，根據本發明的抗CD47抗體為鼠源抗體，其還含有鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和鼠源的κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施例中，根據本發明的抗CD47鼠源抗體還含有鼠源的IgG1或IgG2或其變體的重鏈恆定區，和鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些具體的實施例中，本發明提供抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中： (1)所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1) 如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列； (c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3) 與(c1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 (2)所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4) 如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示的胺基酸序列； (c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6) 與(c4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:29功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:29具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:32經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:32功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:32具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:31經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:31功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:31具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:34經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:34功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:29經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:29功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:29具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:10、2和11所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:32經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:32功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:32具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 12、13和14所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:30具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:33經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:33功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:33具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 15、16和17所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施例中，本發明提供抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:31經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:31功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:31具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:34經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:34功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:34具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 18、19和20所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，所述輕鏈包含人源的κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施例中，所述的鼠源抗CD47抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或進一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施例中，所述的抗CD47嵌合抗體或其抗原結合片段的抗體輕鏈進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。所述的抗CD47嵌合抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、gG4或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1或IgG2重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後顯著降低ADCC (抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4恆定區。
在一些具體的實施例中，本發明的抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。在一些較佳的實施例中，本發明的抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1或IgG2或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些實施例中，本發明提供抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗原結合片段為Fab、Fv、sFv或F(ab)2。
本發明的另一方面提供一種分離的核酸，其編碼根據本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施例中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示；編碼輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示。
在一個具體的實施例中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區SEQ ID NO:29的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示；編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:32的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在一個具體的實施例中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區SEQ ID NO:30的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示；編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:33的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。
在一個具體的實施例中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區SEQ ID NO:31的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示；編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:34的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。
本發明的另一方面提供一種表現載體，其表現本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段。根據本發明的表現載體其包含本發明的分離的核酸分子。
本發明的另一方面提供一種如上所述的表現載體轉化的宿主細胞。
在一些實施例中，根據本發明的宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。在一些實施例中，所述的宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌。在另一個較佳的實施例中，所述的宿主細胞為哺乳動物細胞。
本發明的另一方面提供製備本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段的方法，包括在所述宿主細胞中表現抗體以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
本發明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發明的抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。在一些實施例中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明的抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段，還包含其他活性組分，如其他抗體、靶向藥物等。在一些實施例中，所述藥學可接受的載體選自抗氧化劑、多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、糖醇、離子和界面活性劑。在一個具體的實施例中，所述藥學可接受的載體為緩衝水溶液。在另一個具體的實施例中，所述藥學可接受的載體為脂質體的形式。
可以將本發明的抗CD47人源化抗體或其抗原結合片段與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、腦內、眼內、氣管內、皮下、鼻內途徑。所述製劑可以透過任何途徑施用，例如透過輸注或推注，透過經上皮或皮膚黏膜(例如口腔黏膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。所述製劑可透過本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的另一方面提供抑制CD47活性的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物。
本發明的另一方面提供本發明的抗CD47抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備抑制CD47活性的藥物中的應用。在一些實施例中，所述抑制CD47活性的藥物用於治療白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、子宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和/或黑素瘤。在一些實施例中，本發明提供上述抗CD47抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備抗腫瘤的藥物中的應用，較佳地，所述腫瘤選自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、子宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和黑素瘤。
本發明提供的抗CD47抗體或其抗原結合片段具有顯著的抗腫瘤作用，可明顯抑制腫瘤增長，且不具有顯著的紅血球凝集活性，人源化後的抗體免疫原性大大降低，有效消除人體免疫系統對外源性單抗的排異反應，可在製備用於治療各類腫瘤疾病的藥物中應用，具有廣闊的市場前景。
定義：
除非另有定義，本文中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。本文中所述的細胞和組織培養、分子生物學以及蛋白質和寡或多核苷酸化學及雜交中使用的命名和技術是本領域習知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養與轉化(如電穿孔、脂質轉染)，使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域習知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約冷泉港(1989))。本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥學化學中使用的命名以及實驗室方法和技術是本領域習知且普遍使用的。
在本發明中，術語「至少80%序列同一性」是指至少80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在本發明中，術語「至少85%序列同一性」是指至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在一些較佳的實施例中，本發明所述的序列同一性可以至少為90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以透過National Center For Biotechnology Instutute網站上的BLASTN/BLASTP演算法來進行。
在抗體分子中，輕鏈的三個高度變異區和重鏈的三個高度變異區在三維空間中以相對彼此的位置排列以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原的三維表面互補，且每條重鏈和輕鏈的三個高度變異區均被稱作「互補決定區」或「CDR」。胺基酸向每個結構域的分配是根據Kabat《免疫學感興趣的蛋白質的序列》(國立衛生研究院，馬裡蘭州貝塞斯達(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等，Nature 342:878-883(1989)定義。
本發明所述的「抗原結合片段」是指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2 片段及與人CD47結合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)。
本發明所述的抗體指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特異性結合抗原(與其免疫反應)的抗原結合位點的分子。「特異性結合」指抗體與抗原的一種或多種抗原決定位反應而不與其他多肽反應或以很低的親和性(Kd>10-6 )結合其他多肽。抗體包括但不限於多複製、單複製、嵌合、dAb(結構域抗體)、單鏈、Fab、Fab’和F(ab’)2 片段、Fv、scFv及Fab表現文庫。單株抗體(mAb)是由單一的複製細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的複製細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術及合成技術如CDR grafting或其它現有技術進行重組得到。
本發明所述的「鼠源抗體」為根據本領域知識和技能製備的對人CD47的單株抗體。製備時用CD47抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。
本發明所述的「嵌合抗體」是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中複製可變區基因，再根據需要複製人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後***人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。
本發明所述的「人源化抗體」也稱為CDR移植抗體，是將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架(FR)中產生的抗體。此類可變區框架序列可以從公共的DNA資料庫或公開的參考文獻獲得，例如從ImMunoGeneTics (IMGT)網站http://imgt.cines.fr得到或從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
下面代表性的實施例是為了更好地說明本發明，而非用於限制本發明的保護範圍。以下實施例中未註明條件的實驗方法通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊、分子複製手冊等，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件進行。實施例中使用的材料、試劑如無特殊說明均為商購獲得。
實施例1、抗原蛋白及陽性對照抗體的製備：
1、抗原蛋白及陽性對照抗體的表現載體構建：
(1)抗原蛋白的表現載體構建：
合成編碼CD47蛋白全長的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:41所示，然後複製到真核表現質體pTargeT上，獲得其表現質體pTargeT-CD47。
融合人源CD47蛋白胞外區胺基酸序列與hIgG1-Fc或his標籤胺基酸序列，胺基酸序列設計分別如SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示。對上述胺基酸序列進行密碼子最佳化後合成帶有標籤的CD47蛋白胞外區基因片段CD47-hFc、CD47-his，並將其分別複製至真核表現質體pHR中，獲得其表現質體pHR-CD47-hFc、pHR-CD47-his。
融合人源CD47蛋白胞外區胺基酸序列與mIgG1-Fc胺基酸序列，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:44所示。對該胺基酸序列進行密碼子最佳化後合成完整的表現質體pcDNA3.1(+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc。
SIRPα的序列如SEQ ID NO:45所示，對所述序列進行密碼子最佳化後合成完整的表現質體pcDNA3.1(+)-SIRPα-myc-His。
(2)陽性對照抗體的表現載體構建：
使用專利申請WO2013/119714中公開的抗體AB6.12-IgG4P (本文簡稱AB06.12-4P)作為陽性對照抗體，AB06.12-4P的胺基酸序列如下所示： AB06.12-4P重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:46； AB06.12-4P輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:47。
對上述抗體序列所對應的胺基酸序列進行密碼子人工最佳化，獲得陽性對照抗體AB06.12-4P的重鏈及輕鏈表現質體pcDNA3.1(+)-SHC025-hG4、pcDNA3.1(+)-SHC025-hk。並將其重鏈基因片段複製到含有IgG4輕鏈恆定區的真核表現質體pHR上，獲得AB06.12-4P的重鏈真核表現質體pHR-SHC025-hG4-4PE，其輕鏈表現質體為pcDNA3.1(+)-SHC025-hk。
2、抗原蛋白及陽性對照抗體的表現與純化：
(1)抗原蛋白的穩轉細胞株的構建：
將真核表現質體pTargeT-CD47在160V電壓，15msec的方形脈衝下以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所)，置37℃，5% CO2 的培養箱中培養。24h後採用含500ug/ml G418的培養基加壓培養。16天後採用FACS檢測pool陽性率，將電轉質體後的細胞培養盤(1x106 個/ml的細胞密度，100ul/孔)，採用PE mouse anti-human CD47抗體(BD，556046)與細胞孵育，以流式細胞儀(BD，FACSJazz)讀取585nm波長下mean值，使用GraphPad 進行數據分析。將陽性細胞株進行亞複製，挑選出複製化的CHO-K1細胞株，該細胞株高程度表現CD47分子，命名為CHO-K1-E5。
(2)標籤抗原蛋白及陽性對照抗體的表現：
在1L細胞培養瓶中接種密度為0.5 x 106 個細胞/ml的293F細胞，加入新鮮的預熱的FreeStyle 293表現培養基，使接種後總體積達到250mL，置37℃，8% CO2 ，加濕的CO2 培養箱中培養過夜。取8.5 mL FreeStyle 293表現培養基，加入1mg/ml的PEI溶液500 ul，混合均勻，取250ug待轉染質體加入8.5 ml FreeStyle 293表現培養基中，混合均勻，其中標籤抗原蛋白質體pHR-CD47-hFc、pHR-CD47-his、pcDNA3.1(+)-TPA-CD47-mIgG1-Fc、pcDNA3.1(+)-SIRPα-myc-His分別轉染；陽性對照抗體AB06.12-4P重鏈質體pHR-SHC025-hG4-4PE和輕鏈質體pcDNA3.1(+)-SHC025-hk共同轉染。將PEI與FreeStyle 293表現培養基的混合溶液加入到質體中，混合均勻，然後加入細胞培養物中，置37℃，8% CO2 ，加濕的CO2 培養箱中培養。在細胞轉染後第1天和第3天對細胞進行饋料，每瓶加入2.5ml的穀氨醯胺(母液濃度為200mM)和5ml的葡萄糖(母液濃度為180g/L)。當細胞的細胞活力降至65%~75%時，收集細胞上清液。將細胞培養物1500rpm離心5min，收集上清液，再8000rpm離心20min，收集上清液。
(3)親和層析柱純化：
利用AKTA(GE，AKTA pure-150)根據蛋白性質採用不同的親和層析柱進行純化(不同蛋白適配的親和層析柱見表1)，具體純化步驟如下：
表1 不同蛋白適配的親和層析柱
蛋白屬性 適配柱子 品牌 型號
鼠單抗(融合瘤)/CD47-mFc Protein G 預裝柱 博格隆 Ezfast Protein G 4FF
CD47-his/ SIRPα-myc-His NI柱預裝柱 GE His Trap, HP 5ml
CD47-hFc/嵌合抗體、人源化抗體 Protein A 預裝柱 GE Hi Trap, Mabselect SuRe  5ml
Protein A 自裝柱 GE Mabselect LX  18ml
清洗：超純水清洗設備及管路2min，流速10mL/min，後用0.1M NaOH清洗層析系統；
接柱：將層析柱接入層析設備，並用超純水沖洗5min；後0.1M NaOH沖洗30min，保留時間5min；
平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV(柱體積)；
上樣：將細胞表現上清液上樣，保留時間5min；
後平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV；
洗脫：50mM醋酸，pH =3.4洗脫，保留時間5min。UV280至50 mAu左右時開始收集，降至50 mAu左右時停止收集。用1M Tris-HCl，pH 9.0將樣品pH調節至7.0；
再平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡3個CV，保留時間5min；
在線清洗：0.1M NaOH清洗30min，保留時間5min；
清洗保存：純化水清洗10min，後20%乙醇2個CV。
實施例2、單株抗體的製備：
1、融合瘤單複製的製備：
(1)動物免疫：
採用不同標籤的抗CD47抗原蛋白與佐劑共同免疫的方法免疫SJL品系的實驗小鼠，首次抗原使用50ug抗原，後期使用25ug抗原免疫。
免疫佐劑可以是Quick Antibody-Mouse5W(北京博奧龍免疫技術有限公司)或Titer Max(Sigma)與CpG(金斯瑞生物科技有限合成)/Alum(thermo)佐劑間隔。將不同標籤的CD47抗原蛋白樣品逐滴加入到佐劑溶液中，邊滴加邊渦旋以充分混合，佐劑使用劑量參考說明書進行。混合均勻形成油包水的乳狀後免疫SJL小鼠。
高程度表現CD47分析的細胞系如CCRF-CEM和CHO-K1-E5也用來免疫小鼠，使之產生抗體。用胰蛋白酶消化處理正在培養的人急性淋巴白血病細胞(CCRF-CEM)和實施例1中獲得的CHO-K1-E5陽性單細胞，1000rpm離心5min，棄上清液，用PBS重懸細胞沉澱，取樣用細胞計數儀計數，剩餘樣品1000rpm離心5min，棄上清液，用PBS重懸細胞沉澱，計入適量的PBS以獲得1x108 個細胞/ml的細胞懸浮液。實驗組小鼠每隻免疫1x107 個細胞。
免疫方案如表2所示：
表2 小鼠免疫方案
組別 抗原 佐劑 免疫途徑*
1 PBS 無  
2 CD47-his/CD47-mFc Quick Antibody-Mouse5W i.m.
3 CD47-his/CD47-mFc Titer Max/CpG/Alum s.c./i.m.
4 CD47-mFc Quick Antibody-Mouse5W i.m.
5 CD47-mFc Titer Max/CpG/Alum s.c./i.m.
6 CCRF-CEM/CHO-K1-E5 無 i.p.
* i.m. 肌內注射；s.c. 皮下注射；i.p. 腹腔注射。
(2)融合瘤融合：
脾細胞的獲取和製備：將加強免疫後的小鼠處死後浸泡75%的酒精中。解剖取出脾臟，用研磨棒研磨後，經細胞篩網過濾後製備成單細胞懸浮液。將脾細胞懸浮液2000rpm離心5min，棄上清液。加入2mL紅血球裂解液，室溫裂解紅血球2 min，加入PBS至20mL，1500 rpm離心7min，棄上清液，重懸後進行活細胞計數。收集培養瓶中的Sp2/0細胞，1000rpm離心5min後棄上清液，重懸後進行活細胞計數。按脾細胞：Sp2/0細胞=1:1的比例混合細胞，1500rpm離心7min後棄上清液。用20mL電轉緩衝液重懸細胞，1500rpm 離心7 min。棄上清液，重複一次。分別用適量電轉緩衝液重懸細胞，保證細胞濃度2×107 個細胞/mL左右。把細胞懸浮液加入9mL 電轉融合槽中融合。融合後將細胞懸浮液轉入到含有20% FBS的15mL RPMI 1640完全培養基中，室溫放置20 min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20％FBS的RPMI 1640培養基重懸融合細胞。按100μl/孔將細胞懸浮液加到若干塊96孔細胞培養盤中，保證每孔細胞量約為4×104 個細胞/孔，置於37℃細胞培養箱中培養。5天後補加100µL/孔RPMI 1640完全培養基(含20% FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。
(3)融合瘤及亞複製上清液的篩選：
融合一周後，取細胞上清液，透過ELISA篩選出能結合CD47-his蛋白或細胞表面CD47的融合瘤上清液，利用CD47-his篩選針對CD47而非hFc、mFc的抗體。然後利用ELISA分析融合瘤上清液阻斷CD47-SIRPα相互作用的能力。包被SIRPα-myc-his於免疫酵素分析微量盤上，加入重組人源蛋白CD47-hFc與融合瘤上清液的混合物孵育2 h，加入HRP標記的anti human IgG Fc特異性抗體(Jackson Immuno Research)孵育1 h，利用免疫酵素分析儀檢測450nm處的吸光值。將篩選獲得的具有結合能力及阻斷能力的融合瘤母複製株擴大培養，進行結合活性及阻斷活性的複測，再次篩選獲得具有結合及阻斷能力的融合瘤陽性複製。
利用有限稀釋法將陽性細胞株進行亞複製，培養一周後利用ELISA檢測亞複製上清液與CD47分子的結合活性以及阻斷CD47-SIRPα相互作用的活性，獲得3種雙陽性細胞株，分別標記為SHC025-26、SHC025-34、SHC025-58。
2、亞型的鑒定：
參照鼠抗體亞型鑒定試劑盒SBA Clonotyping Systerm-C57BL/6-HRP(SouthernBiotech，貨號：5300-05B)說明書對抗體進行亞型鑒定，結果如表3所示：
表3  抗體亞型鑒定結果
命名 抗體亞型
SHC025-26 IgG1/k
SHC025-34 IgG2c/k
SHC025-58 IgG2b/k
3、單株抗體的製備：
根據亞複製上清液活性分析結果確定單株抗體母複製株SHC025-26、SHC025-34、SHC025-58，將其擴大培養。培養條件是含有10%胎牛血清、1x NAEE、1x 丙酮酸鈉、1%青鏈黴素雙抗的1640培養基，待細胞匯合度大於>80%時，進將細胞繼代培養，待培養至約50 ml時收集上清液，純化抗體。獲得抗體經SDS-PAGE凝膠電泳確定純度良好。
4、單株抗體定序：
將經亞複製操作的陽性融合瘤細胞進行擴大培養，取適量細胞按RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen，74134)試劑盒說明書提取總RNA，利用Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，6110A)反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。
根據小鼠抗體亞型可變區設計特異性引子(5’端含有用於與真核表現載體發生同源重組的同源臂序列)，以cDNA為模板進行抗體可變區基因的PCR擴增，從而分別獲得小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區的基因片段；設計引子(參考文獻：1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester etal. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35–55;2. Simon KorenMiha KosmačAnja Colja Venturini etal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071–1078)，進行DNA定序獲得序列，定序結果見表4。
表4  抗CD47鼠源單株抗體序列表
抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
SHC025-26 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:24
SHC025-34 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:25
SHC025-58 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:26
實施例4、嵌合抗體的構建：
將純化後(純化步驟見實施例1)的小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區基因片段分別與線性化的含有人抗體輕鏈或重鏈恆定區的真核表現質體共轉化大腸桿菌DH5α勝任細胞，將混合液均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單一菌落進行DNA定序；將定序正確的嵌合抗體分別標記為SHC025-26CHI、SHC025-34CHI、SHC025-58CHI。
將定序正確的陽性複製接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37℃振盪培養12小時以上，然後收集菌體進行質體提取，從而獲得嵌合抗體輕鏈與重鏈表現質體，使用核酸定量分析儀檢測質體的濃度與純度。
將嵌合抗體轉染HEK293E細胞，表現純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
定序發現，在SHC025-26的重鏈CDR第118位，以及SHC025-58的輕鏈CDR第56位各自含有一個半胱胺酸，CDR區域的半胱胺酸在表現時會與抗體分子上的其他半胱胺酸隨機配對氧化形成二硫橋，從而極大的影響抗體純度。為解決之一問題，對SHC025-26CHI、SHC025-58CHI胺基酸序列進行如下改造：將SHC025-26CHI重鏈之C118突變為T，標記為SHC025-26CHI-T；將SHC025-58CHI輕鏈之C56突變為A，標記為SHC025-58CHI-A，利用定點突變的方法構建突變基因。嵌合抗體定序結果見表5。
表5  抗CD47嵌合抗體序列表
嵌合抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
SHC025-26CHI SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:24
SHC025-26CHI-T SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:24
SHC025-34CHI SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:25
SHC025-58CHI SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:26
SHC025-58CHI-A SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:28
實施例5、人源化抗體的構建及生產：
根據嵌合抗體的活性分析、親和力KD 值等結果選擇SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T進行人源化抗體改造。
抗體的人源化改造，首先是透過與免疫基因資料庫(IMGT)中的小鼠抗體序列進行比對，確認SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T抗體可變區的鼠源種系，經過同源比對，SHC025-34CHI、SHC025-58CHI-A、SHC025-26CHI-T抗體的重鏈可變區序列的FR區分別與小鼠抗體種系基因IGHV1-8*01、IGHV3-21*04以及IGHV1-2*02最為相似；抗體輕鏈可變區的FR序列則分別與小鼠抗體IGKV3-11*01、IGKV1-5*01以及IGKV4-1*01最為相似。以SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A抗體框架區序列FR1-FR3作為模板，在人框架區庫中尋找3D結構相似但是免疫原性較低的全人框架替代SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A的FR1-FR3序列，重鏈/輕鏈全長序列進行3D建模並和原抗體重鏈/輕鏈序列進行結構比對分析，綜合考慮抗原性和3D結構相似度，最終選擇SHC025-34CHI的6條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:48、49、50、51、52、53)和4條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO: 54、55、56、57)及SHC025-58CHI-A的6條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO: 58、59、60、61、62、63)和5條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO: 64、65、66、67、68)進行下一步最佳化。SHC025-34CHI/SHC025-58CHI-A人源化抗體非CDR區序列均達到95%以上人源化。用SHC025-26CHI-T重輕鏈的可變區序列，在Protein Data Bank中進行結構比對分析，選擇最相近的FR1-FR3序列替換掉鼠源序列，並將在結構模擬中顯示對抗體結構穩定起到關鍵作用的的胺基酸位點回突變為鼠源性胺基酸殘基。最終獲得SHC025-26CHI-T的4條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:69、70、71、72)和2條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO: 73、74)。
將以上設計好的人源化抗體輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列反轉錄成相對應的核苷酸序列，並生成相鄰片段之間含有互補序列的寡核苷酸片段，透過Overlap PCR將寡核苷酸片段退火後連接起來，再利用特異性引子(5’端含有用於與真核表現載體發生同源重組的同源臂序列)擴增出完整的輕鏈與重鏈可變區核苷酸片段；將純化後的輕鏈可變區核苷酸片段與線性化的含有IgG4輕鏈恆定區的真核表現質體共轉化大腸桿菌DH5α勝任細胞，將純化後的重鏈可變區核苷酸片段與含S228P/L235E突變的IgG4重鏈恆定區的真核表現質體共轉化大腸桿菌DH5α勝任細胞，分別將轉化質體的勝任細胞均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單一菌落進行DNA定序。
將定序正確的陽性複製接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37℃振盪培養12小時以上，然後收集菌體進行質體提取，從而獲得人源化抗體輕鏈與重鏈表現質體，使用核酸定量分析儀檢測質體的濃度與純度。
將質體轉染HEK293E細胞，表現純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
挑選純度、活性和親和力均較好的人源化抗體，標記為Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE，序列見表6。人源化抗體來源見表7。
表6  抗CD47人源化抗體序列表
人源化抗體 胺基酸序列 核苷酸序列
重鏈可變區 輕鏈可變區 重鏈可變區 輕鏈可變區
Hu26T-31-PE SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:38
Hu34-39-PE SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:39
Hu58A-14-PE SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:40
表7 人源化序列設計資訊
重鏈人源化設計
人源序列來源 重組人源化序列
X62106 Homsap IGHV1-2*02 F SEQ ID NO:29
X92343 Homsap IGHV1-46*01 F SEQ ID NO:30
HM855688 Homsap IGHV3-21*04 F SEQ ID NO:31
輕鏈人源化設計
人源序列來源 重組人源化序列
X97473 Homsap IGLV3-9*01 F SEQ ID NO:32
X71966 Homsap IGLV3-21*01 F SEQ ID NO:33
Z73648 Homsap IGLV4-69*01 F SEQ ID NO:34
實施例6、與猴CD47結合活性測定(ELISA)：
採用protein based Elisa分析抗體的結合活性。食蟹猴CD47-His(0.1 μg/孔，ACRO Biosystems，Cat.No. CD7-C52H1-50ug)包被96孔免疫酵素分析微量盤。本發明提供的抗CD47抗體作為一抗從2μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入免疫酵素分析微量盤，共8個濃度，濃度分別為2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL、0ng/mL，37℃孵育1.5h，陽性對照抗體為AB06.12-4P。二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，加入顯色液TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)，終止後利用免疫酵素分析儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖1所示。
實驗結果顯示本發明提供的人源化抗CD47抗體Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均具有與食蟹猴CD47結合的能力，且結合能力與陽性對照抗體AB06.12-4P相當。
實施例7、與人CD47結合活性測定(ELISA)：
採用ELISA分析抗體的結合活性。將人CD47-His蛋白(0.1 ug/孔，實施例1、2中製得)包被到96孔免疫酵素分析微量盤，37℃孵育2h。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4℃封閉過夜。用1xPBST清洗3次後，本發明提供的抗CD47抗體作為一抗從2μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入免疫酵素分析微量盤，共8個濃度，濃度分別為2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL、0ng/mL，37℃孵育1.5h，陽性對照抗體為AB06.12-4P；用1xPBST清洗5次後，二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，37℃孵育40min。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用免疫酵素分析儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖2所示。
實驗結果顯示本發明提供的人源化抗CD47抗體Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均具有與人CD47結合的能力，且結合能力與陽性對照抗體AB06.12-4P相當。
實施例8 、與細胞表面CD47結合的測定(ELISA)：
採用Cell based Elisa分析抗體的結合活性。CHO-K1-E5細胞以每孔1x105 個細胞的方式鋪細胞盤，置於37℃，5% CO2 的條件下過夜培養；第二天用4%的多聚甲醛固定後用脫脂牛奶封閉1h；用1xPBS輕柔清洗細胞盤；本發明提供的抗CD47抗體作為一抗從2μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入細胞盤，共8個濃度，濃度分別為2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL、0ng/mL，37℃孵育1.5h，陽性對照抗體為AB06.12-4P；二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，加入顯色液TMB，終止後利用免疫酵素分析儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖3所示。
實驗結果顯示，本發明提供的人源化抗CD47抗體Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均可與細胞表面CD47結合，且結合能力與陽性對照抗體AB06.12-4P相當。
實施例9 、與人CD47蛋白的親和力測定：
利用Fortebio Octet對實施例1、2中製得的人源化抗CD47抗體結合抗原CD47(19-136)-hFC的親和力進行測定。先將抗原CD47(19-136)-hFc生物素化標記，然後用10kD的超濾管，PBS離心超濾脫鹽3-4次，Nanodrop測定生物素標記後抗原CD47-hFc-Biotin的實際濃度。將CD47-hFc-Biotin用SD緩衝液(0.02%Tween20+0.1%BSA溶液)稀釋到濃度5ug/ml，所述人源化抗CD47抗體用SD緩衝液4倍濃度梯度稀釋，使其濃度為10ug/ml、2.5ug/ml、0.625ug/ml、0ug/ml，選用SA感測器固化該抗原，按fortebio Octet RED96的操作規程進行親和力測定，具體參數及實驗結果如表8所示。
表8  與人CD47蛋白的親和力測定
抗體 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
Hu26T-31-PE 5.87E-11** 1.04E+06 6.13E-05
Hu34-39-PE 1.13E-10 6.69E+06 7.58E-04
Hu58A-14-PE 9.46E-11 1.78E+06 1.68E-04
AB06.12-4P 1.01E-10 4.80E+06 4.85E-04
實驗結果顯示，與陽性對照抗體相比，Hu26T-31-PE與人CD47蛋白結合具有更高的親和力。
實施例10、紅血球凝集實驗：
取5mL血液加入40mL PBS，2000rpm輕柔離心5min，棄上清液，用PBS洗滌三次，然後用PBS重懸紅血球，按紅血球積壓，配製2%的紅血球懸浮液。待分析抗體起始濃度為1-20uM之間，2倍梯度稀釋，共24個濃度梯度。圓底96孔盤中加入上述50µL不同濃度抗體，然後加入50ul上述2%的紅血球懸浮液，混勻，室溫放置。2h後觀察是否有凝集現象。兔多株抗體RBC抗體(Rockland，109-4139)作為紅血球凝集發生的陽性對照，結果如圖4所示。如圖4所示，96孔盤從左至右加入的抗體(兔多株抗體RBC抗體、AB06.12-4P抗體及本發明待測抗體)濃度從20uM起始2倍梯度依次稀釋，其中RBC表示陽性對照組(使用兔多株抗體RBC抗體，顯著引起紅血球凝集)，PBS表示空白對照組。孔中紅血球小圓點狀，邊緣整齊表示不引起細胞凝集；邊緣略不整齊表示少量紅血球凝集；片狀，佈滿孔底表示大部分紅血球凝集。
經測定，專利申請WO2011/143624中公開的抗CD47抗體Hu5F9-G4在相同濃度範圍內能引起顯著的大部分紅血球凝集，此為抗CD47抗體的普遍不良現象。而在相同的條件下，如實驗結果顯示，本發明的Hu26T-31-PE、Hu34-39-PE、Hu58A-14-PE均不會引起紅血球凝集現象，本發明的抗體在此方面明顯優於抗體Hu5F9-G4。
實施例11、FACS檢測CD47阻斷活性實驗：
採用FACS檢測本發明提供的抗CD47抗體阻斷SIRPa結合到細胞表面CD47的能力。
CHO-K1-E5陽性細胞株作為CD47提供者，在梯度稀釋的抗CD47抗體存在的情況下，觀察CD47與SIRPa的結合能力。二抗使用PE Streptavidin (Biolegend，405203，1:200)來監測SIRPa-Biotin的變化。AB06.12-4P作為阻斷SIRPa結合到細胞表面CD47的陽性對照。流式細胞儀(BD，FACSJazz)讀取585nm波長下mean值，使用GraphPad生成IC50，結果如圖5所示。
實驗結果顯示，阻斷活性依次排序為Hu26T-31-PE≧Hu34-39-PE≧AB06.12-P﹥Hu58A-14-PE。
實施例12、人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗腫瘤試驗：
1、實驗材料：
(1)實驗細胞及動物： NUGC-4人胃癌細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)； NOD-Scid小鼠，雌性，5-8周齡，體重18-20克，購自上海靈暢生物科技有限公司；
(2)實驗組及對照組： 對照組Isotype IgG4(貨號AB170091)購自中美冠科生物技術有限公司，用來作為陰性對照組； 試驗前，將本發明的人源化抗CD47抗體用PBS配製為0.6mg/mL和0.3mg/mL兩個濃度，Isotype IgG4和AB 06.12-4P配製為0.6mg/mL。
(3)實驗方法： 用含有10%胎牛血清，100 U/mL的青黴素和100 µg/mL的鏈黴素的RMPI1640培養基在37ºC、5% CO2 的培養箱中培養NUGC-4人胃癌細胞。一週一次用2mL 1×EDTA溶液消化處理繼代。當細胞飽和度為80%-90%時，收取細胞，計數，接種。將含有5×106 細胞PBS同100 uL的Matrigel混合(終體積200 μL)接種於小鼠的右後邊，接種細胞數目為5×106 /隻。待腫瘤生長至體積達150-200 mm3 時開始分組，腹腔給藥每週3次，每週三次用遊標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式為：V= 0.5a×b2 ，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。抗體的抑瘤療效用相對腫瘤增殖率T/C (%)評價。相對腫瘤增殖率 T/C(%)：計算公式如下：T/C % = TRTV / CRTV × 100 %(TRTV：治療組RTV；CRTV：陰性對照組RTV)。RTV = V21 / V0，其中V0是分組給藥時(即d0)測量所得腫瘤體積，V21為給藥21天測量時的腫瘤體積。將給藥組與溶媒組最後一天(day21)瘤體積用T-test進行分析，用GraphPad Prism進行。結果如表9所示。
表9 人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗腫瘤試驗結果
抗體 劑量( mg/kg) T/C (%) p ( vs. Isotype IgG4)
Isotype IgG4 6 86.61 -
AB06.12-4P 6 18.82 **
Hu26T-31-PE 3 12.24 ***
Hu26T-31-PE 6 2.96 ***
Hu34-39-PE 3 15.29 ***
Hu34-39-PE 6 3.45 ***
***p ＜0.001 vs. Isotype IgG4; **p ＜0.005 vs. Isotype IgG4
實驗結果顯示，本發明提供的抗體在人胃癌NUGC-4細胞接種NOD-SCID小鼠移植瘤模型中具有較顯著的抗腫瘤作用。3mg/kg劑量的Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE與6mg/kg的參照抗體AB06.12-4P抑瘤作用相當，而6mg/kg劑量Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE抑瘤作用優於6mg/kg參照抗體AB06.12-4P。停藥一周後，6mg/kg的參照抗體組出現腫瘤復發現象，而Hu26T-31-PE和Hu34-39-PE組無復發現象(圖6、圖7)。提示本發明提供的抗CD47抗體出乎意料的具有更加顯著抑制腫瘤生長的作用。
以上實施例證明本發明提供的抗CD47抗體具有顯著的抗腫瘤作用，可明顯抑制腫瘤增長，提示該抗體可在製備抗腫瘤藥物中的應用，具有可預期的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的權利範圍並不限於上文所作的詳細描述，而應歸屬於申請專利範圍。
無
圖1是抗CD47人源化抗體與猴CD47結合活性測定(ELISA)結果。 圖2是抗CD47人源化抗體與人CD47結合活性測定(ELISA)結果。 圖3是抗CD47人源化抗體與細胞表面CD47結合活性測定(ELISA)結果。 圖4是紅血球凝集實驗結果，其中RBC：陽性對照；PBS：空白對照。 圖5是FACS檢測抗CD47人源化抗體阻斷活性實驗結果。 圖6是抗CD47人源化抗體Hu34-39-PE人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗腫瘤試驗結果。 圖7是抗CD47人源化抗體Hu26T-31-PE人胃癌NUGC-4移植瘤模型抗腫瘤試驗結果。
無
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Figure 108131432-A0305-02-0039-2
Figure 108131432-A0305-02-0040-3
Figure 108131432-A0305-02-0041-4
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Claims (14)

  1. 一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：(1)所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，(2)所述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO：10、2和11，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO：12、13和14；或者所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別為SEQ ID NO：4、5和6，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別為SEQ ID NO：15、16和17。
  2. 如請求項1所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是鼠源單株抗體、人鼠嵌合抗體或人源化抗體。
  3. 如請求項2所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體還含有鼠源的IgG1、IgG2或其變體的重鏈恆定區，鼠源的k鏈或其變體的輕鏈恆定區。
  4. 如請求項1-3之任一項所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO：22，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO：25。
  5. 如請求項1-3中任一項所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CD47抗體為人源化抗體，其中：所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO：29，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO：32；或者 所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO：30，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO：33。
  6. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-5之任一項所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段。
  7. 如請求項6所述的核酸，其中：(1)編碼所述重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，且編碼所述輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示；或者(2)編碼所述重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示，且編碼所述輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示。
  8. 一種表現載體，其包含如請求項6或7所述的核酸。
  9. 一種宿主細胞，其轉化如請求項8所述的表現載體，所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
  10. 如請求項9所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞為哺乳動物細胞。
  11. 一種製備如請求項1-5任一項所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段的方法，包括在如請求項9或10所述的宿主細胞中表現抗體，以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
  12. 一種藥物組合物，其包含請求項1-5之任一項所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。
  13. 一種如請求項1-5之任一項所述的抗CD47抗體或其抗原結合片段或如請求項12的藥物組合物在製備用於抑制CD47活性的藥物中的應用。
  14. 如請求項13所述的應用，所述抑制CD47活性的藥物用於治療白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、子宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和/或黑色素瘤。
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