CN117820479A

CN117820479A - 抗il-17a的新型纳米抗体

Info

Publication number: CN117820479A
Application number: CN202311865727.1A
Authority: CN
Inventors: 刘广洋; 刘拥军; 徐晓丹; 米一; 苗丽; 王道辉
Original assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明提供一种抗IL‑17A的新型纳米抗体。所述的新型纳米抗体包含两个单域抗体，第一单域抗体氨基酸序列包含如SEQ ID NO.1‑3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和/或；与SEQ ID NO.1‑3所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；第二单域抗体氨基酸序列包含：如SEQ ID NO.4‑6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6；和/或；与SEQ ID NO.4‑6所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。本发明的抗体具有IL‑17A特异性，与靶蛋白结合的EC50为2.425μg/mL；抗体阻断功能实验IC50为0.7587μg/mL，优于对照抗体。

Description

抗IL-17A的新型纳米抗体

技术领域

本发明属于抗体领域，具体涉及抗IL-17A的新型纳米抗体。

背景技术

白细胞介素17(interleukin 17，IL17)是已发现的30余种白细胞介素之一，按序号排在第17位。IL17由CD4+T细胞分泌，能够诱导上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞合成分泌IL-6、IL-8、G-CSF、PGE2，促进ICAM-1的表达。

IL-17A蛋白最早在啮齿类激活的杂交瘤T细胞中克隆得到，最初也叫做CTLA-8，是最早被发现的IL-17家族蛋白。IL-17A蛋白共包含177个氨基酸，形成两对反向平行的β-折叠，并通过多个二硫键稳定结构。IL-17A在CD4+T细胞中表达，并且该蛋白可在成纤维细胞中诱导IL-6。IL-17A还是T细胞与造血***交流的主要载体，体内过表达也会导致髓外粒细胞生成。研究发现Th17细胞谱系定型独立于STAT4、STAT6等传统激活通路，即IL-17A和IL-6等炎症因子并不相同。IL-17A在宿主防御各种微生物病原体以及组织炎症中起关键作用，因此，IL-17A已成为治疗各种形式的自身免疫和炎性疾病的药物发现的重要靶标。

抗体作为能与抗原发生特异性结合的蛋白，可以参与中和目标抗原，当以IL-17A蛋白作为目标抗原时，本领域往往通过开发IL-17A抗体以实现IL-17A蛋白的检测，或通过IL-17A抗体治疗以IL-17A为靶标的疾病，如前所述的自身免疫病或炎症等等。示例如申请号为CN201910935046.5的中国专利中公开了一种人源化抗人IL-17A单克隆抗体的药物组合物。具体地-提供一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(a)抗人IL-17A单克隆抗体；和(b)药学上可接受的载体，所述的药学上可接受的载体包括缓冲液、稳定剂和表面活性剂。该发明所述的药物组合物能有效提高抗人IL-17A单克隆抗体在加压(高温、冻融和震荡等)、加速和长期冷藏条件下的稳定性，可提高临床使用的安全性。再如申请号为CN202111031745.0的中国专利中公开了特异性结合IL-17A的抗体或其抗原结合片段、制备方法及其用途，相比于常规抗体，该发明的抗IL-17A抗体或其抗原结合片段(特别是纳米抗体和重链抗体)具有分子量小、渗透性强等显著优点，使得其能够识别常规抗体不可及的隐蔽抗原表位，易于生产并且适合与其他抗体组装成多特异性和多价抗体。不断开发新的IL-17A抗体类型是本领域持续发展的一个重要条件。

在羊驼外周血液中存在一种天然重链抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位，也被称作纳米抗体。通过纳米抗体的思路可以制备分子量更小的IL-17A抗体，不同单域抗体串联后获得的串联抗体仍能保证较小分子量，有进一步研究的空间。

基于抗IL-17A抗体开发筛选出的9个单域抗体(已另案申请)，进行进一步的技术开发，获得了12个亲和力、阻断效果和稳定性相对提升的单域抗体组合，基于专利法单一性的相关规定，对12个不同单域抗体组合分别请求保护。

本发明是针对上述12个单域抗体组合抗体之一所进行的专利申请。

基于以上，还开发了基因修饰干细胞技术以及后续的应用技术，基于专利法单一性的相关规定，对不同的基因修饰干细胞以及不同的应用分别请求保护。

为便于理解本发明技术方案，可选地参阅本项目其他专利申请文件。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种抗IL-17A的新型纳米抗体。

需要说明的是，本发明通过制备IL-17A重组抗原免疫羊驼获得了一系列单域抗体(纳米抗体)，对这一系列的单域抗体进行性能研究后，为了提高单域抗体性能，对其中的部分抗体尝试进行串联，以获得具有更高性能的串联抗体，并由此得到了一系列发明构思。

基于以上成果，本发明选择性地提供了包括两种纳米抗体可变区的IL-17A特异性(抗IL-17A、IL-17A抗性)串联抗体。

本文所用的术语“高变区”、“超变区”、“互补决定区”、“HVR”或“CDR”，是指在抗体可变结构域区域中序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR或CDR：三个存在于VH中(H1、H2、H3)，三个存在于VL中(L1、L2、L3)。基于Chothia定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L26-L32(L1)、L50-L52(L2)、L91-L96(L3)、H26-H32(H1)、H52-H56(H2)和H96-H101(H3)处(Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。基于Kabat定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L24-L34(L1)、L50-L56(L2)、L89-L97(L3)、H31-H35(H1)、H50-H65(H2)和H95-H102(H3)处(Kabat等人，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,the fifth edtion,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991))。基于IMGT定义规则，示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)位于氨基酸残基L27-L32(L1)、L50-L51(L2)、L89-L97(L3)、H26-H33(H1)、H51-H56(H2)和H93-H102(H3)处(Honjo,T.和Alt,F.W.(1995)Immunoglobulin genes.Academic Press pp.3-443)。本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于CDR移植的抗体人源化设计的参考工具(参见J MolBiol.273:927-48,1997)。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明保护的范围是基于IMGT定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。

本发明所涉及的范围是多方面的，包括但不限于以下：

第一方面：一种抗体，其包含：

(1)第一单域抗体：

氨基酸序列包含：如SEQ ID NO.1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和/或；与SEQ IDNO.1-3所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；

(2)第二单域抗体：

氨基酸序列包含如SEQ ID NO.4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6；和/或；与SEQ IDNO.4-6所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列。

SEQ ID NO.1：GFSFSIYS；

SEQ ID NO.2：ITKGGLK；

SEQ ID NO.3：NAGRENGY；

SEQ ID NO.4：GFSIHIYA；

SEQ ID NO.5：ITRGGVT；

SEQ ID NO.6：AGGTNGGY。

或者，所述的抗体的氨基酸序列包含：通过在SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

具体地，所述抗体的氨基酸序列包含：与SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸差异的氨基酸序列。

在一些实施方式中，一个或多个氨基酸的取代可以是一个或多个氨基酸的保守性取代。这种保守性取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、He、Val和Cys；以及(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

在一些具体的实施方式中，保守性取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

在一些表述中，所述的一致性的氨基酸序列也可以称为功能变体或突变体；在一些实施方式中，所述功能变体为与所述的第一单域抗体或第二单域抗体具有相同或相近的亲和力或功能的单域抗体变体(突变体)，例如可以特异性结合IL-17A并阻断IL-17A与其受体结合的变体(突变体)。

根据本领域一般认知，所述第一单域抗体或第二单域抗体还可以包括用于连接重链可变区的重链框架区。

所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

优选地，包含部分或全部选自骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

更优选地，包含部分或全部选自羊驼源的抗体重链框架区或其变体。

或者，本发明可以提供一种抗体，其包括：

(ⅰ)第一单域抗体，结构为：

FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

(ⅱ)第二单域抗体，所述的第二单域抗体的结构为：

FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8；

其中HCDR1、HCDR2和HCDR3选自：

如SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO.1-3相比具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；

HCDR4、HCDR5和HCDR6选自：

如SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO.4-6相比具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；

FR1、FR2、FR3和FR4选自：如SEQ ID NO.7-10所示的氨基酸序列；或；与SEQ IDNO.7-10相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

SEQ ID NO.7：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVAW；

SEQ ID NO.8：VNWYRQAPGKERELVAG；

SEQ ID NO.9：DYADSVKGRFTISRDNAKNAVYLRMNMLKPEDTAVYYC；

SEQ ID NO.10：WGQGTQVAVST；

FR5、FR6、FR7和FR8选自：如SEQ ID NO.11-14所示的氨基酸序列；或；与SEQ IDNO.11-14相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

SEQ ID NO.11：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS；

SEQ ID NO.12：MGWYRQAPGKQRELVAT；

SEQ ID NO.13：

NNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCN；

SEQ ID NO.14：WGQGTQVTVSS。

所述的氨基酸序列的差异通过在SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式实现。

在一些具体的实施例中，所述HCDR1具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述HCDR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述HCDR3具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述HCDR4具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述HCDR5具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述HCDR6具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列的连接方式可以是直接连接；或；通过连接子间接连接。

作为本领域的一个优选，所述连接子为(GGGGS)n，其中n选自1、2、3、4、5或6；较佳地，所述连接子为(GGGGS)₃。

具体地，所述的第一单域抗体和第二单域抗体可以以任选的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从N端到C端的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从C端到N端的顺序连接。

在一些具体的作用中，所述的抗体为抗IL-17A抗体。

作为优选，所述的第一单域抗体包括如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；

所述的第二单域抗体包括如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO.15：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVAWGFSFSIYSVNWYRQAPGKERELVAGITKGGLKDYADSVKGRFTISRDNAKNAVYLRMNMLKPEDTAVYYCNAGRENGYWGQGTQVAVST。

SEQ ID NO.16：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIHIYAMGWYRQAPGKQRELVATITRGGVTNNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGTNGGYWGQGTQVTVSS。

在实际应用中，所述的串联纳米抗体上可以根据需要选择性包括hinge区和CH区。

优选地，所述的hinge区的序列为SEQ ID NO.17，所述的CH区的序列为SEQ IDNO.18。

SEQ ID NO.17：DKTHTCP；

SEQ ID NO.18：

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

第二方面：本发明提供了前述抗体的下游产品。

所述下游产品可以是：

包含前述抗体的重组蛋白；所述重组蛋白还包含协助表达和/或分泌，或延长体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段；所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种；所述免疫球蛋白Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体；较佳地，所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG抗体，例如IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc或IgG4 Fc，优选IgG1 Fc。

在一些具体的实施例中，所述的IgG1 Fc具有如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，其编码基因为SEQ ID NO.20。

SEQ ID NO.19：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

SEQ ID NO.20

GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

在一些实施方案中，所述重组蛋白可以为单聚体、二聚体或多聚体。

所述下游产品还可以是：一种抗体制剂，其包括：

A1：前述的任意抗体或重组蛋白；和

A2：药学上可接受的载剂。

所述的药学上可接受的载剂可以是缓冲液、无菌水或表面活性剂，所述表面活性剂可以为离子活性剂或非离子型活性剂。

所述下游产品还可以是：一种试剂盒，其包括前述的任意抗体、任意重组蛋白或抗体制剂；

任选地，所述试剂盒还包括装载所述抗体制剂的容器。

所述下游产品可以是：一种药物偶联物，其包括：

B1：任意所述的抗体或重组蛋白；和

B2：与B1偶联的偶联部分。

在一些实施方式中，所述偶联部分包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。

所述下游产品可以是：一种分离的核酸分子，其编码任意所述的抗体或重组蛋白。

事实上，如本领域技术人员所公知，由于密码子简并性问题，在明确氨基酸序列的情况下，其对应的核酸序列是有无数可能性的，上述优选的核酸序列仅作为一个较优的示例，而非唯一可能性。

作为优选，所述的核酸具有如SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列：

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTGGGGATTTAGCTTCAGTATCTATTCGGTGAACTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAGGTATTACGAAAGGTGGTCTAAAAGACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACGCGGTGTATCTGCGAATGAACATGTTGAAACCTGAAGACACGGCCGTCTACTACTGTAATGCAGGCCGGGAGAATGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCGCCGTCTCTACCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTAGTATCCACATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGCTGGTCGCAACTATTACTAGAGGTGGTGTAACAAATAATGCAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAGGTGGGACGAACGGGGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA。

所述下游产品可以是：包含所述核酸分子的表达载体。

优选地，所述的载体的类型包括但不限于：病毒性载体或非病毒性载体。

进一步优选地，所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种。

进一步优选地，所述的非病毒性载体包括但不限于真核载体或原核载体。

所述下游产品可以是：一种药物组合物，其包含任意所述的抗体、重组蛋白、抗体制剂、药物偶联物、核酸分子或表达载体；

任选地，所述药物组合物还包括至少一种药学上可接受的辅料。

在一些实施方案中，所述辅料选自溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂。

第三方面：本发明提供了前述抗体或下游产品的用途。

所述用途选自以下用途中的至少一种：

C1：制备检测试剂或试剂盒；

C2：制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物；

C3：制备预防和/或治疗癌症的药物。

所述自身免疫性疾病包括但不限于***、***性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、***性硬皮病、进行性***性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性***病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无***症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、***性肥大细胞增多症或包涵体肌炎；

优选地，所述自身免疫性疾病为斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎或狼疮性肾炎。

所述癌症包括但不限于基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、***、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、***癌、消化***癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸***癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿***癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。

第四方面：本发明提供了基于前述抗体或下游产品的检测方法或治疗方法。

具体提供了：一种用于非诊断目的的体外检测样品中的IL-17A的方法，其包括以下步骤：

D1：如前任意所述的抗体、重组蛋白、抗体制剂或药物偶联物与待测样品相接触；

D2：检测抗原-抗体复合物；

D3：判读结果。

具体提供了：一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，其包括：

向有需要的受试者施用治疗有效量的任意所述的抗体、重组蛋白、抗体制剂或药物偶联物。

具体提供了：一种预防和/或治疗癌症的方法，其包括：

所述的施用的方式可以由本领域技术人员根据实际情况进行选择和调整，如给药频次、单词给药量、持续时长等。

本发明的有益效果：

本发明基于一个研发思路，通过对免疫羊驼获得的纳米抗体进行筛选获得单域抗体1-G12和1-F8，并在这两个基础上得到串联抗体。本发明的串联抗体具有IL-17A特异性，亲和力实验中与靶蛋白结合的EC50为2.425μg/mL，表明具有很好的结合能力；抗体阻断功能实验中能够阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，IC50为0.7587μg/mL，优于对照抗体Ixekizumab(1.356μg/mL)。

附图说明

图1为串联抗体的SDS-PAGE结果。

图2为对照抗体Ixekizumab亲和力检测结果。

图3为串联抗体亲和力检测结果。

图4为对照抗体Ixekizumab抗体阻断功能实验结果。

图5为串联抗体阻断功能实验结果。

图6为对照抗体Ixekizumab稳定性实验结果。

图7为串联抗体稳定性实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中，“1-G12+1-F8”、“G12-1-F8”、“1-G12/1-F8”、“1-G12/1-F8”具有相同的含义，表示串联抗体。

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。

本文所用的术语“包括(comprises)”或“包含(comprising)”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，以指定任何所述特征、要素、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、要素，整数、步骤、组件或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更具限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方式中，在整个申请中特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。

本文所用的术语“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

本文所用的术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。

本文所用的术语“单域抗体”(sdAb)或“纳米抗体”，具有其在本领域中的一般含义，且是指具有仅12-15kDa分子量的抗体片段，其由来源于重链的单个单体可变抗体结构域组成。这种单域抗体(命名为VHH)可以在骆驼科哺乳动物中发现，且天然缺失轻链。对于(单)域抗体的一般描述，还参考上述现有技术以及EP 0368684,Ward等(Nature 1989Oct12；341(6242):544-6)，Holt et al,Trends Biotechnol,2003,21(11):484-490；和WO 06/030220，WO 06/003388。单域抗体的氨基酸序列和结构可以被认为由四个框架区或“FR”组成，其在本领域中被分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；为“框架区3”或“FR3”；以及“框架区4”或“FR4”；框架区被三个互补决定区或“CDR”间隔，在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”，以及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，单域抗体可定义为具有以下一般结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1-FR4分别指框架区1-4，且其中CDR1-CDR3指互补决定区1-3。在本公开的上下文中，单域抗体的氨基酸残基根据International ImMunoGeneTics information system氨基酸编号(http://imgt.cmes.fr/)给出的VH结构域的通用编号方式进行编号。

本文所用的术语“氨基酸”，是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，碳结合至氢、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍类。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

本文所用的术语“活性”、“功能活性”或“生物活性”，或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用，包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗IL-17A活性的能力、IC50、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性(即通常与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性)，和保持哺乳动物细胞中蛋白质高表达水平的能力。使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于ELISA、FACS或BIACORE等离子体共振分析、不受限制的体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源(包括人类、灵长类或任何其它来源)的组织切片的免疫组织化学。

本文所用的术语“Fc”或“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc片段”，是指由IgA、IgD及IgG的CH2和CH3结构域，或者由IgE及IgM的CH2、CH3和CH4结构域通过铰链区的组成的多肽。尽管Fc片段的分解是可变的，但是人IgG的重链Fc片段通常指从A231到其羧基末端这一段多肽。

本文所用的术语“表位”，是指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由表面簇集的分子，例如氨基酸或糖侧链组成，和通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的不同之处在于与前者而非后者的结合在存在变性溶剂的情况下丢失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效封闭或覆盖的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内)。

本文所用的术语“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。

本文所用的术语“抗体药物偶联物”是指生物活性化合物片段与抗体或其抗原结合片段部分连接得到的物质。生物活性化合物片段与靶向部分可以通过连接子相连。所述连接子在特定环境(例如胞内低pH值环境)中或特定作用(例如溶酶体蛋白酶的作用)下能够断裂，从而使生物活性化合物片段与靶向部分或抗体或其抗原结合片段分离。所述连接子包含可裂解或不可裂解的单元，例如肽或二硫键。生物活性化合物片段与靶向部分或抗体或其抗原结合片段直接通过共价键相连，所述共价键在特定环境或作用下能够断裂，从而使生物活性化合物片段与抗体或其抗原结合片段部分分离。

本文所用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语包括具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢的含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸(参见，属于Kariko等人的美国专利No.8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

本文所用的术语“分离的核酸”是一种已被鉴定并从其自然环境的组成部分中分离出来的核酸。分离的核酸包括包含在通常包含核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其自然染色***置的染色***置。

本文所用的术语“构建体”是指任何重组多核苷酸分子(诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子)，衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，构成如下多核苷酸分子，其中已经以功能操作的方式连接(即，可操作地连接)一或多个多核苷酸分子。重组构建体通常会包含可操作地连接至转录起始调节序列的本发明的多核苷酸，这些序列会导引多核苷酸在宿主细胞中的转录。可使用异源及非异源(即，内源)启动子两者导引本发明的核酸的表达。

本文所用的术语“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。在引入到宿主细胞中后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，且因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够导引***作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。

本文所用的术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点，以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。

本文所用的术语“细胞”、“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

本文所用的术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited byGennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂或溶剂包封材料，其涉及维持本公开的抗体或其抗原结合片段的稳定性、溶解度或活性，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。

本文所用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

本文所用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”，是指本发明的抗IL-17A抗体或其抗原结合片段当单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的抗体或其抗原结合片段的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。当对个体施用单独给予的活性成分时，治疗有效剂量仅是指该成分。当组合施用时，治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的综合量，不论是组合、依次给予还是同时给予。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。

本文所用的术语“EC50”是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，即能引起50％最大效应(在本文中为：结合IL-17A能力)的浓度。

本文所用的术语“IC50”是指半抑制浓度(half maximal inhibitoryconcentration)，即能引起50％最大抑制效应(在本文中为：抑制IL-17A和其受体IL-17RA结合的能力)的浓度。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

本发明可能涉及的部分试剂、材料和设备见表1。

表1本发明涉及的主要试剂、材料和设备

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本发明筛选、克隆VHH片段、构建纳米抗体所使用的引物均参照以下文献设计：

Maass DR,Sepulveda J,Pernthaner A,Shoemaker CB.Alpaca(Lama pacos)as aconvenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies(VHHs).JImmunol Methods.2007；324(1-2):13-25.

Lin,J,Gu,Y,Xu,Y et al.Characterization and applications of nanobodiesagainst Pseudomonas aeruginosa exotoxin a selected from single alpaca Bcells.Biotechnol Biotechnol Equip 2020；34:1028-37.

Studies on design of singledomain antibodies by AlpacaVHH phagelibrary and high throughput sequencing toconstruct Fab antibody purificationsystem(http://hdl.handle.net/10232/00030916).

基础实验例IL-17纳米抗体筛选

如本发明同申请日的发明专利所体现，本发明通过抗原免疫动物进行抗体的筛选获得了多个方案，筛选包括步骤如下：

(1)重组抗原的制备

在IL-17抗原C端添加6×His标签，按照原核密码子优化后进行基因合成并亚克隆至pET28a载体中；经Sanger测序验证无误后，进行质粒抽提；将重组质粒转化BL21感受态，使用0.5mM IPTG诱导过夜，收集菌液裂解；使用镍柱纯化重组蛋白；通过SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度。

采用BL21表达IL-17A重组蛋白并使用镍柱纯化，SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度，IL-17A抗原蛋白经精纯后，纯度大于90％。

(2)阳性对照抗体Ixekizumab制备

Ixekizumab重链可变区：SEQ ID NO.22；轻链可变区SEQ ID NO.23。

SEQ ID NO.22：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO.23：

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIK。

SDS-PAGE检测阳性对照抗体蛋白的纯度，纯度>95％。

(3)通过阳性对照抗体检测重组抗原结合能力，结果显示阳性抗体与IL-17A抗原蛋白结合良好，可以用于后续免疫。

(4)Human IL-17A重组蛋白活性检测

采用IL-17A蛋白激活NIH-3T3细胞实验进行检测。分别使用制备的重组IL-17A(TEST)和采购的IL-17A(Acro)处理NIH-3T3细胞，72h后收集上清检测mIL-6的分泌，根据检测结果，IL-17A抗原蛋白具有激活NIH-3T3细胞表达mIL-6的活性，且IL-17A(TEST，下称IL-17A重组蛋白)活性与其浓度正相关，可以用于免疫。

(5)IL-17A报告基因细胞株构建及验证

根据IL-17RA(UniProtKB：Q96F46)及IL-17RC(UniProtKB：Q8NAC3)的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体并包装慢病毒，共同感染293细胞，筛选同时过表达这两个受体的重组293细胞，进一步稳转NFKB-Luciferase(SEQ ID NO.24)和ACT1基因(SEQ IDNO.25)，构建IL-17A报告基因细胞株293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。

SEQ ID NO.24：

ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGC

TACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGT

GGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAG

CTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGC

GAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGT

GTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAA

CAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGC

TGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATC

ATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACAC

CTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCC

CGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTG

GCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGT

GTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCC

GACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTC

ACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGC

TTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATC

TGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCAT

CGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCG

CCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACC

AGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGA

TCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCC

CTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTG

TGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGC

TACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTG

GCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCA

TCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCC

CCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGC

CGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAG

TCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGA

CTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTG

TGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGC

AAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTG；

SEQ ID NO.25：

ATGCCACCTCAGTTGCAGGAAACTCGGATGAATAGAAGCATCCCCGTGGAAGTGGACGAGAGCGAGCCGTACCCTAGTCAGCTGCTGAAGCCGATCCCTGAGTACTCCCCGGAAGAGGAATCCGAACCACCAGCCCCCAACATTCGCAATATGGCCCCCAATAGCTTGTCCGCACCAACAATGCTGCACAACTCTTCTGGCGACTTCTCTCAGGCCCACTCCACCCTGAAACTGGCGAATCACCAGCGGCCTGTATCCCGGCAGGTGACCTGTCTGAGAACTCAGGTGCTTGAAGACTCCGAGGACTCTTTCTGTAGGCGGCATCCAGGTTTGGGCAAGGCGTTTCCGTCCGGCTGTTCCGCGGTTTCAGAGCCCGCTTCCGAAAGTGTCGTGGGCGCCCTGCCAGCCGAGCACCAGTTCTCCTTCATGGAAAAGCGGAACCAGTGGCTGGTCAGTCAGCTGAGCGCCGCGTCACCTGATACAGGTCACGATTCCGACAAGTCTGACCAGTCTCTGCCCAATGCGTCAGCCGATAGTCTCGGGGGCTCCCAGGAGATGGTGCAGAGACCACAGCCGCACAGAAACCGGGCCGGGCTTGATCTGCCCACCATTGATACAGGCTACGATTCCCAGCCCCAGGACGTCCTTGGCATTCGCCAGCTGGAAAGGCCTCTGCCCTTGACCTCCGTGTGTTACCCCCAGGACCTGCCCCGCCCTTTGAGAAGCCGGGAGTTTCCCCAGTTTGAGCCCCAACGATACCCTGCCTGTGCTCAGATGCTGCCTCCGAACCTGAGCCCACACGCTCCCTGGAACTACCACTATCACTGTCCCGGCAGCCCCGATCACCAGGTGCCTTATGGACACGACTACCCGCGGGCTGCATACCAGCAGGTCATACAGCCTGCCTTGCCGGGTCAGCCGCTGCCCGGAGCTTCTGTGCGCGGCCTGCACCCCGTTCAGAAAGTGATCCTGAACTATCCAAGCCCATGGGACCATGAAGAGAGACCAGCCCAAAGAGATTGCTCTTTTCCTGGGTTGCCTAGACACCAAGACCAGCCTCACCACCAGCCTCCCAATCGGGCAGGCGCCCCAGGCGAAAGTCTCGAGTGCCCCGCCGAACTCAGACCACAGGTCCCTCAGCCCCCTTCCCCCGCGGCAGTACCCAGACCCCCCTCTAACCCACCCGCCCGGGGAACGCTCAAGACTTCAAATCTCCCAGAAGAGCTGCGCAAAGTGTTCATAACCTACAGCATGGACACCGCTATGGAGGTGGTTAAGTTCGTCAACTTCCTGCTGGTCAATGGGTTCCAGACTGCAATCGACATTTTTGAGGATAGAATTCGGGGAATCGACATCATCAAGTGGATGGAGAGATACCTGCGGGATAAGACAGTGATGATTATCGTGGCCATTAGTCCCAAGTACAAGCAAGATGTGGAGGGCGCAGAATCACAGTTGGACGAAGACGAGCACGGACTCCATACAAAATATATCCACAGGATGATGCAGATCGAGTTCATTAAACAAGGCTCCATGAATTTCCGCTTCATACCGGTCCTGTTTCCAAACGCAAAAAAAGAGCATGTACCCACTTGGCTCCAGAATACCCATGTCTACTCCTGGCCCAAGAACAAGAAGAATATCCTGCTGCGCTTGCTCAGAGAAGAAGAGTATGTCGCCCCTCCAAGGGGGCCCCTCCCCACACTCCAAGTAGTGCCACTT。

加入重组抗原进行激活，同时加入阳性对照抗体Ixekizumab进行阻断实验的检测，并计算其EC50值，建立靶向IL-17A的候选抗体体外药效学评价细胞株。FACS结果发现：构建的IL-17A受体过表达细胞株可以和IL-17A结合，阳性率大于90％。

采用IL-17A重组蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，IL17A重组蛋白可有效激活293F-IL17RA-IL17Rc-NFκB-Luc报告基因细胞株中荧光素酶表达。

将阳性对照抗体Ixekizumab与IL-17A重组蛋白一起加入293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞，阳性对照抗体Ixekizumab可抑制IL17A蛋白与其膜受体结合，并抑制胞内NFκB的信号，呈现剂量效应。

(6)羊驼免疫

使用上述制备的重组抗原蛋白对羊驼(Alpaca)进行免疫，免疫间隔时间21天，最后一次免疫10天后，采集部分外周血，分离血清采用ELISA检测免疫效果。

(7)免疫效价的检测

经6轮免疫，羊驼的免疫效价均达到要求(见下表2-表3)。

表2免疫效价检测结果

表3免疫效价检测结果

(8)PBMC分离及VHH抗体片段克隆

分离PBMC，提取RNA反转录后进行两轮PCR，胶回收产物，测定浓度。

(9)单域抗体酵母展示库的构建及淘选

线性载体与PCR产物共同电转化酵母感受态菌株。

(10)单域抗体酵母展示库淘选；

(11)淘选后酵母单克隆进行流式检测。

(12)Overlap PCR产物的扩增，瞬时转染和检测，回收产物，转染。

(13)ELISA挑选阳性克隆，获得VHH抗体序列并进行基因合成，基因工程表达后Protein A纯化。

富集阳性克隆；挑选富集后的单克隆，进行Phage ELISA鉴定，并对克隆进行测序分析，获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息。随机挑取20个单克隆，进行测序分析，序列差异大，库多样性较好。针对候选的单域抗体CDR区域氨基酸序列信息，采用In silico方法对可能的翻译后修饰位点进行分析。

根据酵母单克隆流式检测结果，选择与IL-17A-His结合的阳性克隆提取基因组DNA，PCR获得抗体序列。根据PCR产物测序结果，挑选差异克隆进行overlap PCR扩增，在VHH的N端加上信号肽，C端加上IgG1-Fc，PCR产物瞬时转染HEK293细胞；取表达的抗体上清进行ELISA检测：100μL转染上清加入IL-17A重组抗体预包被的96孔板中孵育，采用HRP-ProteinA作为二抗进行ELISA检测，筛选与IL-17A-His抗原结合的差异克隆进行构建真核表达载体。

将构建的单域抗体表达载体瞬时转染293F细胞，采用Protein A亲和纯化重组抗体，并进行SDS-PAGE实验检测候选抗体的纯度。结果表明，候选抗体分子量大小和纯度均符合预期，可以进行下一步的实验。

(14)ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合

(15)FACS检测IL17A与报告基因细胞株的结合

(16)单域抗体阻断功能实验

梯度稀释抗体，加入IL-17A蛋白、293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞，加入20μL Bright-GloTM检测试剂，使用Tecan M1000pro酶标仪检测孔内的荧光素酶活性数值。

(17)单域抗体表位检测(NTA)

ForteBio OCTET R2***进行动力学表征分析。

(18)单域抗体表位检测(HIS1K)

用ForteBio OCTET R2***进行动力学表征分析。

本发明在上述基础筛选方法的基础上进一步扩展。在抗体阻断活性检测中发现，部分单域抗体虽然能够阻断Human IL-17A蛋白激活下游靶标蛋白，但阻断效果均弱于阳性抗体Ixekizumab。因此，将其中两种抗IL-17A单域抗体串联组成二价抗体，以增强其阻断效果。具体地，本发明保护的是1-G12和1-F8构建的串联抗体。

实施例1IL-17A特异性串联抗体的制备和纯化

1-G12可变区的序列为SEQ ID NO.15，CDR区依次为SEQ ID NO.1-3；

1-F8可变区的序列为SEQ ID NO.16，CDR区依次为SEQ ID NO.4-6。

本实施例中，示例性地，串联抗体中还包括连接子(GGGGS)₃、hinge区(SEQ IDNO.17)和CH区(SEQ ID NO.18)。

本实施例中的串联抗体简写为G12-1-F8，其氨基酸序列为SEQ ID NO.15-(GGGGS)₃-SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18，其基因序列为SEQ ID NO.21。

可以参照现有技术中的抗体制备方法制备本实施例的串联抗体，具体如下：

(1)SEQ ID NO.21基因合成，与人IgG1 Fc段基因序列(SEQ ID NO.20)串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒(CAT#:DP117)制备去内毒素质粒备用。

(2)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL L VTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟得DNA/LVTransm复合物。

(3)将上述DNA/L VTransm复合物加入到30mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％ CO₂培养箱，130rpm培养6-8小时后，加入50mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A纯化抗体得纯化后的抗体。

Protein A纯化抗体的步骤如下所示：

1)将含有目标抗体的样品加入EP管中，轻轻倒置试管混合。

2)将EP管在室温下混合或在旋转器上孵育，(1-4小时或过夜)，可添加100mM PMSF以防止蛋白质降解。

3)使用磁分离架收集磁珠并弃去上清液。如有必要，保留上清液进行分析。

4)向EP管中加入1mL结合/洗涤缓冲液并充分混匀，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液，重复洗涤步骤三遍。

5)向EP管中加入500μL洗脱缓冲液，用移液器吹打或者涡旋震荡下迅速重悬，然后在室温下(约25℃)置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管孵育5分钟。

6)使用磁分离架收集磁珠，将含有洗脱抗体的上清液转移到干净的EP管中。

7)重复步骤1)和2)两次。

8)向每500μL洗脱液中加入1/10的中和缓冲液以中和pH，以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。如果需要，可以通过透析或脱盐进行缓冲液交换。

9)结合/洗涤缓冲液：1×PBS，pH 7.0。

洗脱缓冲液：(1)0.1M甘氨酸，pH 2-3；(2)0.1M NaAc-HAc，pH 3.6。

中和缓冲液：1M Tris，pH 8.5。

磁珠再生缓冲液：0.1M NaOH。

串联抗体G12-1-F8的SDS-PAGE结果如图1所示。

SDS-PAGE检测目标抗体蛋白的纯度，结果显示蛋白纯度>95％。

实施例2IL-17A特异性串联抗体亲和力检测

以Ixekizumab为阳性对照，基因合成Ixekizumab重链可变区(SEQ ID NO.22)及轻链可变区(SEQ ID NO.23)，将重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG4载体(hIgG4氨基酸序列为SEQ ID NO.26)中，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgKc载体(hIgKc氨基酸序列为SEQID NO.27)中；经Sanger测序验证无误后使用质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。其他步骤参照实施例1，制备对照抗体，纯度>95％。

SEQ ID NO.26：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；

SEQ ID NO.27：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC。

ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合：

采用纯化后的待测抗体(2ug/mL)包被酶标板，加入Biotin-IL-17A-His，起始浓度为10ug/mL，5倍梯度稀释7个点，采用HRP-Streptavdin进行ELISA检测，各浓度测得的OD450值绘制曲线读取EC50值。

结果表明，对照抗体Ixekizumab的EC50值为10.06μg/mL，见图2；串联抗体的EC50为2.425μg/mL，见图3。

实施例3抗体阻断功能实验

使用293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc报告基因细胞株进行阻断活性检测。本实施例检测实施例2所涉及串联抗体、对照抗体和单域抗体。

Ixekizumab结果如图4所示，可以阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，IC50值为1.356μg/mL。

串联抗体的结果如图5，能够阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，IC50为0.7587μg/mL。串联抗体的结果数据优于对照抗体Ixekizumab。

实施例4稳定性实验过程及结果分析：

实验过程：通过微量差示扫描荧光技术(nanoDSF)技术检测荧光变化，可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性，精确地确定蛋白50％处于去折叠状态时的温度(Tm)以及开始出现聚集时的温度(Tagg)；热变性Tm值和Tagg越高说明抗体蛋白越稳定。

取100μL检测对象抗体，4℃，12000×g，离心10min后，用毛细管吸取样品，每个样品准备两根毛细管，作为平行对照，按顺序放入对应的卡槽中，确保毛细管吸满样品，无气泡，进行检测分析。升温范围20℃-95℃，升温速率1℃/min，检测时间75min。

Tm定义为解链温度，Tonset定义为开始去折叠的温度，Tagg定义为聚集温度。

本实施例检测对象抗体为实施例2中涉及的串联抗体、对照抗体和单域抗体。

Lxekizumab结果见图6，其Tm1为56.10±0.02℃，Tm2为79.84±0.13℃，Tonset为47.50±0.08℃，Tagg为61.86±0.23℃；

串联抗体的结果见图7。其Tm1为59.15±0.08℃，Tm2为81.67±0.31℃，Tonset为52.61±0.33℃，Tagg为71.28±0.23℃；

串联抗体稳定性明显优于对照抗体。

应用实施例1一种抗体制剂

本实施例提供包括实施例1制备的串联抗体的抗体制剂。

所述的制剂的辅料中包括：

缓冲液选自：醋酸缓冲液、组氨酸缓冲液磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、碳酸缓冲液或Tris；缓冲液的浓度为3-60mM。

稳定剂选自：精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、甘氨酸和海藻糖；稳定剂的浓度为50-400mM。如选择蔗糖和精氨酸盐酸盐的组合，其中，蔗糖的浓度为50-200mM，精氨酸盐酸盐的浓度为10-100mM。

表面活性剂选自：聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188。

应用实施例2一种试剂盒

本实施例提供一种用于体外检测IL-17A的试剂盒。

所述的试剂盒为竞争法ELISA试剂盒，包括胶体金试剂条、样品稀释液。

胶体金试剂条中包括：样品垫、金标垫、层析膜、吸水纸。

金标垫上包被有胶体金标记的实施例1制备的串联抗体；

层析膜上上设置检测线和质控线，检测线上包被胶体金标记的IL-17A抗原；质控线包被串联抗体的验证抗体。

使用时取样品稀释液对样品进行稀释后，滴在样品垫上，当样品含一定量IL-17A，其与胶体金标记的抗体反应后，检测线不显示颜色，当样品中不含IL-17A，胶体金标记抗体与检测限上的包被抗原反应，显示颜色，从而达到检测目的。

所述的试剂盒也可以通过双抗体夹心法建立，实施例1制备的串联抗体可以作为酶标抗体，也可以作为固相抗体。

应用实施例3一种抗体偶联物

本实施例提供实施例1制备的串联抗体的抗体偶联物。

制备方法如下：

(1)串联抗体或其抗原结合片段与还原剂在缓冲液中反应；

(2)将接头-有效载荷与步骤(1)中得到的具有巯基的串联抗体或其抗原结合片段反应；

还原剂与串联抗体或其抗原结合片段的物质的量比为1:1-5:1；优选为1:1-4:1；进一步优选为1:1-3:1；更进一步优选为2:1-3:1。

所述的还原剂选自三(2-羧基乙基)膦(TCEP)或其盐、二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。在一些实施方案中所述还原剂为三(2-羧基乙基)膦或其盐，优选为三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)。

所述的缓冲液选自HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液；优选为为组氨酸缓冲液；进一步优选为组氨酸-盐酸缓冲液；所述缓冲液的浓度为1mM-30mM，如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM，优选为20mM。

所述的接头-有效载荷与串联抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为2:1-10:1；优选地，所述的接头-有效载荷与串联抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为3:1-9:1；进一步优选地，所述的接头-有效载荷与串联抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为4:1-7:1；更一步优选地，所述的接头-有效载荷与串联抗体或其抗原结合片段的物质的量之比为5:1-7:1。

用于溶解接头-有效载荷的溶剂可以选自丙酮水溶液(例如50％丙酮水溶液)、乙醇水溶液(例如80％乙醇水溶液)、甲醇水溶液(例如80％甲醇水溶液)、异丙醇水溶液(例如80％异丙醇水溶液)、二甲亚砜水溶液(例如80％二甲亚砜水溶液)、丙酮、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)；优选为丙酮水溶液或DMSO水溶液，优选为50％丙酮水溶液。

应用实施例4一种用于***的药物组合物

本实施例提供包括实施例制备的串联抗体的药物组合物。

所述的药物组合物中还包括选自以下药物中的任一或多：

氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、噻替哌、卡莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、白消安、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、卡培他滨、脱氧氟尿苷、优福啶、放线菌素D、丝裂霉素、博来霉素、平阳霉素、阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、光辉霉素、米托蒽醌、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、依托泊苷、替尼泊甙、羟基喜树碱、拓扑替康、紫杉醇、达卡巴嗪、顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、厄洛替尼、西妥昔单抗、贝伐珠单抗、安罗替尼、曲妥珠单抗、帕博利珠单抗、卡妥珠单抗、伊马替尼、度伐利尤单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、特瑞普利单抗。

所述的药物组合物可以是抗体组合：如串联抗体与帕博利珠单抗在一定用量比(如1：1)条件下治疗癌症。

所述的药物组合物也可以是不同类型的药物组合：如抗体与顺铂联合治疗癌症。

需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不限制本发明的保护范围，本领域技术人员在本发明提供的技术方案基础上，进行的简单手段的替代和改进都应当属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种抗体，包含第一单域抗体和第二单域抗体，其特征在于，

(1)第一单域抗体氨基酸序列包含：

如SEQ ID NO.1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和/或；与SEQ ID NO.1-3所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；

(2)第二单域抗体氨基酸序列包含：

如SEQ ID NO.4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6；和/或；与SEQ ID NO.4-6所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；

SEQ ID NO.1为GFSFSIYS；SEQ ID NO.2为ITKGGLK；SEQ ID NO.3为NAGRENGY；SEQ IDNO.4为GFSIHIYA；SEQ ID NO.5为ITRGGVT；SEQ ID NO.6为AGGTNGGY。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，氨基酸序列包含：通过在SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列上进行添加、缺失、修饰和/或取代中的至少一种方式所得到的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列包含：与SEQ IDNO.1-6所示的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸差异的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗体，其特征在于，所述第一单域抗体或第二单域抗体还包括用于连接重链可变区的至少4个FR区。

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述重链框架区包含部分或全部选自人源、鼠源、灵长目动物源或骆驼科动物源的抗体重链框架区或其变体；

6.一种抗体，其特征在于，包括：

(ⅰ)第一单域抗体，结构为：

FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4；

(ⅱ)第二单域抗体，所述的第二单域抗体的结构为：

FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8；

其中HCDR1、HCDR2和HCDR3选自：

HCDR4、HCDR5和HCDR6选自：

FR1、FR2、FR3和FR4选自：如SEQ ID NO.7-10所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO.7-10相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

FR5、FR6、FR7和FR8选自：如SEQ ID NO.11-14所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO.11-14相比具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；

7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述HCDR1具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述HCDR2具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述HCDR3具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述HCDR4具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述HCDR5具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述HCDR6具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的抗体，其特征在于，所述的第一单域抗体和第二单域抗体的氨基酸序列直接连接；或；通过连接子间接连接。

9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述连接子为(GGGGS)n，其中n选自1、2、3、4、5或6；较佳地，所述连接子为(GGGGS)₃。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的抗体，其特征在于，所述的第一单域抗体和第二单域抗体以任选的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从N端到C端的顺序连接；或；第一单域抗体和第二单域抗体按照从C端到N端的顺序连接。

11.根据权利要求1-10任意一项所述的抗体，其特征在于，为抗IL-17A抗体。

12.包含权利要求1-11中任意一项所述的抗体的重组蛋白。

13.根据权利要求12所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白还包含协助表达和/或分泌，或延长体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

14.根据权利要求13所述的重组蛋白，其特征在于，所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

15.根据权利要求14所述的重组蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体；

较佳地，所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG抗体，例如IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc或IgG4 Fc，优选IgG1 Fc。

16.一种抗体制剂，其特征在于，其包括：

A1：权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白；和

A2：药学上可接受的载剂。

17.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白或权利要求16所述的抗体制剂；

任选地，所述试剂盒还包括装载所述抗体制剂的容器。

18.一种药物偶联物，其特征在于，其包括：

B1：权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白；和

B2：与B1偶联的偶联部分。

19.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-11中任意一项所述的抗体或权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白。

20.包含权利要求19所述核酸分子的表达载体。

21.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的抗体制剂、权利要求18所述的药物偶联物、权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的表达载体；

22.权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的抗体制剂、权利要求18所述的药物偶联物或权利要求21所述的药物组合物在以下用途中的至少一种：

C1：制备检测试剂或试剂盒；

C2：制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物；

C3：制备预防和/或治疗癌症的药物。

23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括***、***性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、***性硬皮病、进行性***性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性***病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无***症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、***性肥大细胞增多症或包涵体肌炎；

24.根据权利要求22或23所述的用途，其特征在于，所述癌症包括基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、***、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、***癌、消化***癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸***癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿***癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。

25.一种用于非诊断目的的体外检测样品中的IL-17A的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

D1：权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的抗体制剂或权利要求18所述的药物偶联物与待测样品相接触；

D2：检测抗原-抗体复合物；

D3：判读结果。

26.一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：

向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-11中任意一项所述的抗体、权利要求12-15中任意一项所述的重组蛋白、权利要求16所述的抗体制剂或权利要求18所述的药物偶联物。

27.一种预防和/或治疗癌症的方法，其特征在于，所述方法包括：