CN117757990A - 一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合、试剂盒及检测方法，针对人腺病毒B亚属和E亚属的相关腺病毒包括HAdV‑3型、HAdV‑4型、HAdV‑7型、HAdV‑14型、HAdV‑16型、HAdV‑21型和HAdV‑55型的分型进行设计引物，并配合合适的探针进行检测，同时建立多重实时荧光PCR检测试剂盒，实现呼吸道腺病毒多个主要的分型的快速精准鉴别，可用于呼吸道腺病毒分型的快速鉴定、呼吸道病毒感染的流行病学研究，具有良好的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及病毒检测，具体涉及一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)是一种具有高度传播能力的DNA病毒，其结构为无包膜，病毒衣壳呈现二十面体对称形态。自1953年，Rowe等从健康人萎缩的扁桃体腺样组织中首次提取出HadV以来，其一直受到传染病和流行病学界的关注。据报道，现被发现的人腺病毒分为A-G七个亚属，根据它们自身的生物学结构性质、生物分子和遗传及生化的特征，被划分为113个型别。在七个类别不同的亚属中，致病性腺病毒以呼吸道腺病毒最为常见，其中与呼吸道腺病毒有关的是B(HAdV-3、7、11、14、16、21、50、55)、C(HAdV-1、2、5、6、57)和E(HAdV-4)三个亚属，这些病毒都会引起上呼吸道感染、下呼吸道感染、支气管炎等呼吸道疾病，有些病例还会伴随胃肠道症状如腹泻、呕吐、腹痛等，多数患者为轻微的自限性感染，但严重者也会导致肺炎。
目前我国共报道了17种涉及呼吸道腺病毒感染的病毒类型，其中HAdV-55、HAdV-7和HAdV-3是暴发事件中的主要致病基因分型，另外还有HAdV-4、HAdV-14、HAdV-16型、HAdV-21型等也在多次的大规模感染中被检测到。
当前呼吸道腺病毒检测方法主要为基于PCR技术，其以灵敏、快捷等优势得到极大的发展。其中多重实时荧光PCR技术因具有高度的特异性和敏感性，并且具有全封闭扩增、简便快捷、重复性好、实时检测等优势，成为腺病毒分型诊断有效手段。然而，目前我国的呼吸道腺病毒分子诊断产品仍然以腺病毒通用型检测为主，而对该病毒做进一步分型检测的试剂盒较少，且涉及到的腺病毒分型指标覆盖不全面。此外，HAdV-55型是基于HAdV-14型基因组骨架嵌合HAdV-11型Hexon部分片段的重组病毒，因此HAdV-55型与HAdV-14型两者之间存在一定的交叉，现有的检测方法难以精准鉴别其分型。
因此，如何快速检测和鉴别呼吸道腺病毒多个主要的分型，仍是亟需解决的问题。
发明内容
针对上述提出的如何快速检测和鉴别呼吸道腺病毒多个主要的分型，本发明提供一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合、试剂盒及检测方法，针对人腺病毒B亚属和E亚属的相关腺病毒分型进行设计引物，并配合合适的探针进行检测，同时建立多重实时荧光PCR检测试剂盒，实现呼吸道腺病毒多个主要的分型的快速精准鉴别。具体技术方案如下：
首先，本发明提供一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合，包括八组引物对和八个探针，各引物及探针的核苷酸序列如SEQ NO.1～SEQ NO.24所示。
前述的呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合，其中，
SEQ NO.1～SEQ NO.3所示的引物对和探针用于检测HAdV-3型；
SEQ NO.4～SEQ NO.6所示的引物对和探针用于检测HAdV-4型；
SEQ NO.7～SEQ NO.9所示的引物对和探针用于检测HAdV-7型；
SEQ NO.10～SEQ NO.12所示的引物对和探针用于检测HAdV-16型；
SEQ NO.13～SEQ NO.15所示的引物对和探针用于检测HAdV-21型；
SEQ NO.16～SEQ NO.18所示的引物对和探针用于检测HAdV-14型；
SEQ NO.19～SEQ NO.21所示的引物对和探针用于检测HAdV-55型的靶点1；
SEQ NO.22～SEQ NO.24所示的引物对和探针用于检测HAdV-55型的靶点2。
前述的呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合，所述HAdV-55型的靶点1和靶点2分别为其penton基因何和poly基因。
其次，本发明提供一种呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒，包括反应混合液A，反应混合液B，反应混合液C，热启动DNA聚合酶，HAdV阳性质控品以及阴性质控品；
所述反应混合液A，反应混合液B，反应混合液C中均含有反应缓冲液、Mg2+以及三磷酸脱氧核苷酸混合物；
并且各反应混合液中还含有不同的权利要求1-3任意一项所述的引物和探针中的一组或多组。
前述的呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒中，
所述反应混合液A含有用于检测HAdV-3型、HAdV-4型和HAdV-7型的引物和探针；
反应混合液B含有用于检测HAdV-16型、HAdV-21型和HAdV-14型的引物和探针；
反应混合液C含有用于检测HAdV-55型的靶点1和靶点2的引物和探针。
前述的呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒，所述HAdV阳性质控品为含腺病毒各分型检测靶序列的重组质粒；其浓度分别为：
HAdV-3：2.42E+06copies/mL，
HAdV-4：1.91E+06copies/mL，
HAdV-7：2.07E+06copies/mL，
HAdV-16：1.88E+06copies/mL，
HAdV-21：1.59E+06copies/mL，
HAdV-14：2.77E+06copies/mL，
HAdV-55：1.38E+06copies/mL；
所述阴性质控品为不含RNase和DNase的纯化水；
该试剂盒对腺病毒各分型的检测下限为500copies/ml。
前述的呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒，该试剂盒存储条件为-20℃，且反复冻融次数不超过5次。
再次，本发明提供一种呼吸道腺病毒分型核酸检测方法，使用前所述的试剂盒进行检测；使用该试剂盒检测选用的PCR反应体系为25μl，包括20μl的反应混合液A或反应混合液B或反应混合液C和5μl的待检测的核酸样品。
前述的呼吸道腺病毒分型核酸检测方法，所述反应混合液A、反应混合液B、反应混合液C的组分具体包括：2×One Step RT-qPCR Probe Buffer IV 12.5μl；各引物和探针0.37～0.58μl；DNA聚合酶0.5μl；余量为灭菌水。
前述的呼吸道腺病毒分型核酸检测方法，该检测的反应条件为：预变性阶段：预变性阶段：94℃，2min；扩增阶段：变性94℃，10sec；退火56℃，50sec；共40个循环；在退火步骤检测荧光信号。
本发明具备的有益效果如下：
1)本发明结合呼吸道腺病毒流行病学研究，针对人腺病毒B亚属和E亚属的腺病毒分型设计了特异性引物和荧光标记探针，同时检测呼吸道腺病毒的多个主要分型核酸，实现呼吸道腺病毒多个主要的分型的快速精准鉴别。
2)本发明研制了用于呼吸道腺病毒的多个主要分型核酸(HAdV-3型、HAdV-4型、HAdV-7型、HAdV-16型、HAdV-21型、HAdV-14型及HAdV-55型)的多重实时荧光PCR检测试剂盒；便于实现呼吸道腺病毒多个主要的分型的快速精准鉴别。
3)基于HAdV-55型是HAdV-14型基因组骨架嵌合HAdV-11型Hexon部分片段的重组病毒，HAdV-55型与HAdV-14型两者之间存在一定的交叉的问题，本发明针对呼吸道腺病毒HAdV-55型，独创了双靶点检测方式，提高腺病毒HAdV-55型与腺病毒HAdV-14型的鉴别精准性；
4)本发明检测方法可同时对呼吸道腺病毒多个主要分型进行定性检测和鉴别，具有良好的实用价值。
5)本发明检测方法比单重荧光PCR方法更便捷高效，可用于呼吸道腺病毒分型的快速鉴定、呼吸道病毒感染的流行病学研究。
附图说明
图1为本发明实时荧光PCR检测腺病毒分型组分A(HAdV-3、HAdV-4、HAdV-7)阳性标准品的扩增曲线图；
图2为本发明实时荧光PCR检测腺病毒分型组分B(HAdV-16、HAdV-21、HAdV-14)阳性标准品的扩增曲线图；
图3为本发明实时荧光PCR检测腺病毒分型组分C(HAdV-55靶点1、HAdV-55靶点2)阳性标准品的扩增曲线图；
图4为本发明腺病毒分型3型灵敏度验证扩增曲线图；
图5为本发明腺病毒分型4型灵敏度验证扩增曲线图；
图6为本发明腺病毒分型7型灵敏度验证扩增曲线图；
图7为本发明腺病毒分型16型灵敏度验证扩增曲线图；
图8为本发明腺病毒分型21型灵敏度验证扩增曲线图；
图9为本发明腺病毒分型14型灵敏度验证扩增曲线图；
图10为本发明腺病毒分型55型(靶点1)灵敏度验证扩增曲线图；
图11为本发明腺病毒分型55型(靶点2)灵敏度验证扩增曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明较佳实施例，而不是全部的实施例，亦并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用所揭示的技术内容加以变更或改型等同变化。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
实施例1
本实施例为针对人腺病毒B亚属和E亚属的多个主要的分型腺病毒包括HAdV-3型、HAdV-4型、HAdV-7型、HAdV-14型、HAdV-16型、HAdV-21型和HAdV-55型的快速检测和鉴定所提出的一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合、试剂盒及检测方法。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
其中，因HAdV-55型是基于HAdV-14型基因组骨架嵌合HAdV-11型Hexon部分片段的重组病毒，故HAdV-55型与HAdV-14型两者之间存在一定的交叉。故针对呼吸道腺病毒HAdV-55型，本实施例独创了双靶点检测方式，选择其penton基因作为靶点1，选择其poly基因作为靶点2，分别设计引物进行检测，以提高腺病毒HAdV-55型与腺病毒HAdV-14型的鉴别精准性。本实施例中，设计的各组上游引物和下游引物及相应的不同荧光标记的探针序列见序列表1。
表1.引物和探针序列
如表1所示，本实施例中，腺病毒HAdV-3型、HAdV-16型和HAdV-55型靶点1的特异性探针序列5’端采用FAM荧光基团标记；腺病毒HAdV-4型、HAdV-21型和HAdV-55型靶点2的特异性探针序列5’端采用VIC荧光基团标记；腺病毒HAdV-7型的特异性探针序列5’端采用CY5荧光基团标记；腺病毒HAdV-14型的特异性探针序列5’端采用ROX荧光基团标记，以便于区分检测结果。
本实施例中，针对这几个腺病毒分型检测，还设计了一种多重实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含HAdV分型检测3个反应混合液A、B、C，热启动DNA聚合酶及HAdV阳性质控品、阴性质控品。所述反应混合液内含有反应缓冲液、Mg2+和三磷酸脱氧核苷酸混合物(dNTP)、不同腺病毒分型基因特异性引物和TaqMan荧光探针等。3个反应混合液内不同的引物探针分别为：反应混合液A含HAdV-3型、HAdV-4型和HAdV-7型；反应混合液B含HAdV-16型、HAdV-21型和HAdV-14型；反应混合液C含HAdV-55型的两个基因检测靶点。阳性质控品为含腺病毒各分型检测靶序列的重组质粒(无生物危害)；阴性质控品为无RNase和DNase的水。
使用该试剂盒进行检测时，选用的PCR反应体系为25μl，包括20μl的包括20μl的反应混合液A或反应混合液B或反应混合液C和5μl的待检测的核酸样品。所述反应混合液A、反应混合液B、反应混合液C的组分具体包括：2×One Step RT-qPCR Probe Buffer IV 12.5μl；各引物和探针0.37～0.58μl；DNA聚合酶0.5μl；余量为灭菌水。
所述反应混合液A、反应混合液B、反应混合液C中包含的引物和探针具体用量为：
试剂盒的PCR反应程序为：预变性阶段：94℃，2min；扩增阶段：变性94℃，10sec；退火56℃，50sec；共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。
质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值(或Ct值为0)，阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。
结果判读：
阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
本实施例所述的呼吸道腺病毒分型检测试剂盒应置于-20℃条件下存储，尽量减少反复冻融且冻融次数不超过5次。
样本要求：临床样本类型包括咽拭子、痰液和支气管肺泡灌洗液；临床样本采集后应带冰运输，-20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取核酸，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的核酸应立即检测，否则，应将核酸分装后置于-80℃～-20℃保存。
本实施例所述的试剂盒为多重实时荧光PCR检测试剂盒，包含针对人腺病毒B亚属和E亚属的腺病毒分型的特异性引物和荧光标记探针，可用于呼吸道腺病毒的多个主要分型核酸(HAdV-3型、HAdV-4型、HAdV-7型、HAdV-16型、HAdV-21型、HAdV-14型及HAdV-55型)同时定性检测和鉴别；且针对呼吸道腺病毒HAdV-55型，本发明独创了双靶点检测方式，提高腺病毒HAdV-55型与腺病毒HAdV-14型的鉴别精准性。与单重荧光PCR方法相比，更便捷高效，实现呼吸道腺病毒多个主要的分型的快速精准鉴别，有利于呼吸道病毒感染的流行病学研究。
实施例2
本实施例为实施例1中所的多重实时荧光PCR检测试剂盒的构建及验证过程。具体如下：
1、引物和TaqMan探针的设计与合成
利用NCBI Blast工具对Genbank和国内外文献中的腺病毒HAdV-3型、HAdV-4型、HAdV-7型、HAdV-16型、HAdV-21型、HAdV-14型及HAdV-55型基因序列进行下载，并利用BioEditor软件对序列进行比对分析，分别选择确定其稳定的保守区域作为检测靶序列，再使用Primer Express3.0软件对序列保守区序列设计引物和探针。特异性探针的5’端荧光基团可选用FAM/VIC(或HEX)ROX/CY5等不同的荧光标记，3’端可对应选择相应的淬灭基团。其中腺病毒HAdV-3型、HAdV-16型和HAdV-55型靶点1的特异性探针序列5’端采用FAM荧光基团标记；腺病毒HAdV-4型、HAdV-21型和HAdV-55型靶点2的特异性探针序列5’端采用VIC荧光基团标记；腺病毒HAdV-7型的特异性探针序列5’端采用CY5荧光基团标记；腺病毒HAdV-14型的特异性探针序列5’端采用ROX荧光基团标记。
对设计的引物和探针序列再进行NCBI Blast验证，选择特异性较高的设计，最后筛选出如表1所示的引物探针序列，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成这些引物和探针。
2、检测临床样本及病毒核酸的准备
本实施例中的阳性临床样本来源于第三方检验机构呼吸道感染患者及疑似患者的咽拭子样本；采用的阳性标准品即病毒培养物(包含HAdV-3型、HAdV-4型、HAdV-7型、HAdV-14型、HAdV-16型、HAdV-21型和HAdV-55型的检测靶序列)采购于广州邦德盛生物；采用的阴性对照品包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、人偏肺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠状病毒、肠道病毒等核酸；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等细菌核酸均由本实验室提供。选用江苏和创生物技术有限公司生产的核酸提取或纯化试剂提取各赝品的核酸，备用；具体提取步骤参考试剂盒操作说明书。
3、反应条件优化
本实施例中，采用20μl反应体系和25μl反应体系进行对比，最终优化确定采用25μl的反应体系，即采用20μl的腺病毒分型反应混合液，5μl的模板加样量。
同时根据扩增片段长短、引物和探针的退火温度以及酶的特性进行优化，主要对反应的退火温度和反应时间进行了优化，确定快速扩增程序。最终确定循环参数为预变性阶段：预变性阶段：94℃，2min；扩增阶段：变性94℃，10sec；退火56℃，50sec；共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。在扩增结束后按同一条件进行数据分析，样本检出呈典型“S”型扩增曲线，确定各样本的Ct值。
4、检测限的评价
本实施例采用以上述的阳性标准品评价实施例1所述的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度分别为：HAdV-3：2.42E+06copies/mL，HAdV-4：1.91E+06copies/mL，HAdV-7：2.07E+06copies/mL，HAdV-16：1.88E+06copies/mL，HAdV-21：1.59E+06copies/mL，HAdV-14：2.77E+06copies/mL，HAdV-55：1.38E+06copies/mL。最终确定，实施例1所述的试剂盒对腺病毒各分型的检测下限为500copies/mL。
5、检测特异性的评价
如图1至图11所示，本实施例采用上述腺病毒各分型阳性标准品核酸为模板评价了实施例1所述的试剂盒的特异性，对各腺病毒分型进行检测时均可见明确扩增曲线。采用上述的阴性对照品中8种常见呼吸道病毒核酸检测时，未产生阳性扩增曲线，说明实施例1所述的试剂盒使用的探针和引物与选定的其他毒株之间不存在交叉反应。
尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光报告基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、TAMRA、ROX、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列、引物配比，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而同一反应体系快速、特异性地检测新冠亚基因组sgRNA-E和ORF1ab基因的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。
Claims (10)
1.一种呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合，其特征在于：包括八组引物对和八个探针，各引物及探针的核苷酸序列如SEQ NO.1～SEQ NO.24所示。
2.根据权利要求1所述的呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合，其特征在于：其中，
SEQ NO.1～SEQ NO.3所示的引物对和探针用于检测HAdV-3型；
SEQ NO.4～SEQ NO.6所示的引物对和探针用于检测HAdV-4型；
SEQ NO.7～SEQ NO.9所示的引物对和探针用于检测HAdV-7型；
SEQ NO.10～SEQ NO.12所示的引物对和探针用于检测HAdV-16型；
SEQ NO.13～SEQ NO.15所示的引物对和探针用于检测HAdV-21型；
SEQ NO.16～SEQ NO.18所示的引物对和探针用于检测HAdV-14型；
SEQ NO.19～SEQ NO.21所示的引物对和探针用于检测HAdV-55型的靶点1；
SEQ NO.22～SEQ NO.24所示的引物对和探针用于检测HAdV-55型的靶点2。
3.根据权利要求2所述的呼吸道腺病毒分型核酸检测引物组合，其特征在于：所述HAdV-55型的靶点1和靶点2分别为其penton基因和poly基因。
4.一种呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒，其特征在于：包括反应混合液A，反应混合液B，反应混合液C，热启动DNA聚合酶，HAdV阳性质控品以及阴性质控品；
所述反应混合液A，反应混合液B，反应混合液C中均含有反应缓冲液、Mg2+以及三磷酸脱氧核苷酸混合物；
并且各反应混合液中还含有不同的权利要求1-3任意一项所述的引物和探针中的一组或多组。
5.根据权利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒，其特征在于：
所述反应混合液A含有用于检测HAdV-3型、HAdV-4型和HAdV-7型的引物和探针；
反应混合液B含有用于检测HAdV-16型、HAdV-21型和HAdV-14型的引物和探针；
反应混合液C含有用于检测HAdV-55型的靶点1和靶点2的引物和探针。
6.根据权利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒，其特征在于：所述HAdV阳性质控品为含腺病毒各分型检测靶序列的重组质粒；其浓度分别为：
HAdV-3：2.42E+06copies/mL，
HAdV-4：1.91E+06copies/mL，
HAdV-7：2.07E+06copies/mL，
HAdV-16：1.88E+06copies/mL，
HAdV-21：1.59E+06copies/mL，
HAdV-14：2.77E+06copies/mL，
HAdV-55：1.38E+06copies/mL；
所述阴性质控品为不含RNase和DNase的纯化水；
该试剂盒对腺病毒各分型的检测下限为500copies/ml。
7.根据权利要求4所述的呼吸道腺病毒分型核酸检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒存储条件为-20℃，且反复冻融次数不超过5次。
8.一种呼吸道腺病毒分型核酸检测方法，其特征在于：使用权利要求4-7任意一项所述的试剂盒进行检测；使用该试剂盒检测选用的PCR反应体系为25µl，包括20µl的反应混合液A或反应混合液B或反应混合液C和5µl的待检测的核酸样品。
9.根据权利要求8所述的呼吸道腺病毒分型核酸检测方法，其特征在于：所述反应混合液A、反应混合液B、反应混合液C的组分具体包括：
2×One Step RT-qPCR Probe Buffer IV 12.5µl；
各引物和探针0.37～0.58µl；
DNA聚合酶0.5µl；
余量为灭菌水。
10.根据权利要求8所述的呼吸道腺病毒分型核酸检测方法，其特征在于：该检测的反应条件为：预变性阶段：预变性阶段：94℃，2min；扩增阶段：变性94℃，10sec；退火56℃，50sec共40个循环；在退火步骤检测荧光信号。
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