CN117723534A - 组合物、检测试剂、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及组合物、检测试剂、检测试剂盒及其应用。本发明提供了组合物，包括：蛋白C激活剂0.2～0.5U/mL、聚乙烯基吡咯烷酮0.1～1.0w/v％和L‑赖氨酸盐酸盐0.1～0.5w/v％。本发明提供了一种蛋白C活性测定试剂盒及其制备方法，通过对反应体系的优化和筛选特定添加剂，提供了一种基于活化蛋白C与显色基质相互作用的蛋白C活性测定试剂盒，此试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、抗干扰性强、相关性高和使用方便等诸多优点，当然也改善了现有专利文献中提到的测定方法的速度慢、价格昂贵的弊病。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及组合物、检测试剂、检测试剂盒及其应用。
背景技术
作为蛋白C***的主要成分和人体内最重要的抗凝物质之一，蛋白C(以下简称PC)是由肝脏合成的一种依赖维生素糖蛋白，以无活性酶原形式循环于血液中。在凝血酶-血栓调节蛋白复合物的激活下，蛋白C在蛋白S介导下快速转化为具有活性蛋白C，灭活凝血因子Va和VIIIa，从而控制着血液凝固和纤维蛋白溶解的过程，维持机体的凝血平衡。因此蛋白C***对凝血和纤溶有重要的调节作用。
研究表明蛋白C的含量或者活性低既有遗传性的也有获得性的。先天性遗传蛋白C缺乏分为I型和II型，I型患者的蛋白C含量和活性均降低；II型患者蛋白C含量正常，但部分PC活性功能丧失，活性降低；获得性PC缺乏的原因有多种，例如肝病引起的PC合成减少；肾病引起的PC流失；口服抗凝药物华法林、外科术后和维生素K缺乏等引起的PC损失，以及弥散性血管内凝血引起的PC消耗。无论遗传性PC缺乏还是获得性PC缺乏均能导致血栓的形成，所以临床中进行血浆PC测定或动态观察其变化很有必要，对临床诊断、估计预后和疗效观察具有一定的参考价值。
目前检测蛋白C的方法有两种，一种为定量检测PC抗原的含量，如免疫分析法，此法方法比较特异和灵敏，但是操作繁琐、耗时，而且无法测定II型PC缺乏；另一种为定量检测PC的活性，如APTT凝固法和发色底物法。PC活性测定必须用发色底物法，因为APTT凝固法测定样本中PC活性的影响因素较多，因此特异性，准确度较差，而且操作繁琐。目前，市场销售的同类产品试剂盒均采用发色底物法测定血浆PC活性，此法具有灵敏度高、准确性好、检测时间短等特点，且能够适用于多种自动化分析仪器，被WHO认可的检测蛋白C活性首选筛查实验。但此类产品试剂盒均为进口产品，且价格昂贵，临床上难以广泛应用。
发色底物法的原理：蛋白C以无活性的酶原形式存在于血浆，在蛋白C激活剂激活下，血浆中的蛋白C被激活，转化为活化蛋白C(APC)，APC作用于特异的发色底物，将底物裂解产生4-硝基苯胺(4-nitroaniline，pNA)显色基团，4-硝基苯胺的量和405nm处吸光度的变化呈正相关，所以产生的4-硝基苯胺的量和蛋白C活性成正相关。因此，利用测量405nm处吸光度的变化，可计算出血浆中蛋白C的活性水平。
目前，国内外的专利相继公开了检测蛋白C活性的试剂盒，其中有专利开发了一种新的蛋白C激活剂，即自中国秦岭蝮蛇蛇毒中提取的，但是目前，此类激活剂没有被量化生产和广泛使用；也有专利公布一种检测蛋白C活性的方法，主要阐述将“激活”和“显色”两个单独过程合并为一个“激活和显色”步骤，缩短试验时间。此外，还有专利公布了一种蛋白C活性的测定方法、测定用试剂及制备方法，本专利基于发色底物法，优化了蛋白C激活剂的浓度、缓冲液、稳定剂和无机盐。
基于发色底物法，蛋白C活性测定方法的反应时间较长，限制检测速度，且测定试剂用量较大，价格昂贵，不利于临床广泛应用。
目前，发色底物法检测蛋白C活性的手段仍有待改进。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了组合物、检测试剂、检测试剂盒及其应用。本发明提供了一种蛋白C活性测定试剂盒及其制备方法，通过对反应体系的优化和筛选特定添加剂，提供了一种基于活化蛋白C与显色基质相互作用的蛋白C活性测定试剂盒，此试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、抗干扰性强、相关性高和使用方便等诸多优点，当然也改善了现有专利文献中提到的测定方法的速度慢、价格昂贵的弊病。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了组合物，包括：
蛋白C激活剂 0.2～0.5U/mL
聚乙烯基吡咯烷酮 0.1～1.0w/v％
L-赖氨酸盐酸盐 0.1～0.5w/v％。
在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述蛋白C激活剂包括：蛋白C激活剂Protac。
在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，还包括：
山梨醇 1.0～5.0w/v％
海藻糖 5.0～10.0w/v％
缓冲液 30～100mmol/L。
在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，还包括：
在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述缓冲液包括：pH 7.2～8.4的Tris-HCl缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，包括：
本发明还提供了检测试剂，包括：上述组合物、发色底物试剂和稀释液。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述发色底物试剂包括：1.0～4.0mg/L发色底物。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述发色底物试剂包括：1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L或4.0mg/L发色底物。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述发色底物包括：发色底物S2366。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述发色底物试剂还包括：
山梨醇 0.5～5.0w/v％
海藻糖 5.0～10.0w/v％
缓冲液 30～100mmol/L。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述发色底物试剂还包括：
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述缓冲液包括：pH7.2～8.4的Tris-HCl缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述稀释液包括：0.05～0.50w/v％
本发明还提供了上述组合物和/或上述检测试剂在制备检测蛋白C活性的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述检测包括如下步骤：取待测样本与所述稀释液混合后，再与所述组合物和所述发色底物试剂混合，显色反应后，根据OD值，获得所述蛋白C的活性。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述待测样本与所述稀释液的体积比为1:4。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述组合物和所述发色底物试剂的体积比为1:1。
本发明提供了上述组合物和/或上述检测试剂在制备检测蛋白C***的试剂盒中的应用。
本发明还提供了检测试剂盒，包括：上述组合物和/或上述检测试剂以及可接受的助剂或载体。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂盒中，所述助剂包括：
山梨醇 1.0～5.0w/v％
海藻糖 5.0～10.0w/v％
缓冲液 30～100mmol/L。
在本发明的一些实施方案中，上述检测试剂中，所述缓冲液包括：pH7.2～8.4的Tris-HCl缓冲液。
本发明还提供了上述检测试剂盒的制备方法，分别获得所述组合物、所述发色底物试剂和所述稀释液，冷冻干燥所述组合物和所述发色底物试剂，获得所述检测试剂盒。
本发明提供了组合物，包括：
蛋白C激活剂 0.2～0.5U/mL
聚乙烯基吡咯烷酮 0.1～1.0w/v％
L-赖氨酸盐酸盐 0.1～0.5w/v％。
本发明提供的试剂盒包括稀释液、激活试剂和发色底物试剂；稀释液为含有表面活性剂的生理盐水；激活试剂包括蛋白C激活剂Protac、聚乙烯基吡咯烷酮、L-赖氨酸盐酸盐、山梨醇、海藻糖和缓冲液；发色底物试剂包括发色底物、山梨醇、海藻糖和缓冲液。本发明中稀释缓冲液添加表面活性剂，能中和血浆中血红蛋白，避免血红蛋白干扰活化蛋白C裂解底物的反应速率，提高检测蛋白C活性的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同浓度表面活性剂和激活剂对定标曲线的影响；
图2示实施例6、实施例7和市售同类试剂盒的定标曲线；
图3示实施例6与市售同类试剂盒的相关性及相对偏差；其中上图为相关性，下图为相对偏差；
图4示实施例1和实施例6试剂盒的线性；其中上图为实施例1试剂盒的线性，下图为实施例6试剂盒的线性；
图5示实施例6试剂盒在ACL TOP CTS、ZK-600和CS 5100仪器上的机型差，其中上图为实施例6试剂盒在ACL TOP CTS和CS 5100仪器上的机型差；下图为实施例6试剂盒在ZK-600和CS 5100仪器上的机型差。
具体实施方式
本发明公开了组合物、检测试剂、检测试剂盒及其应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种蛋白C活性测定试剂盒，包括稀释液、激活试剂和发色底物试剂。
所述稀释液为含有表面活性剂的生理盐水；
所述激活试剂包含蛋白C激活剂(DMS)、山梨醇、聚乙烯基吡咯烷酮、L-赖氨酸盐酸盐、海藻糖和缓冲液；
所述发色底物试剂包含发色底物、山梨醇、海藻糖和缓冲液；
血浆样本中凝血过程产生凝血酶，凝血酶可与其受体血栓调节蛋白结合，从而活化激活蛋白C，转化为活化蛋白C，活化蛋白C在蛋白S协助下，可灭活凝血因子Va和VIIIa，从而抑制凝血过程的过度作用，维持着凝血和抗凝血的平衡。基于发色底物法，蛋白C激活剂能快速高效地激活血浆样本中的蛋白C，使其转化为具有活性的蛋白C，活化蛋白C作用于特性底物，解离出显色基团。相比于凝血酶-血栓调节蛋白复合物，蛋白C激活剂更能迅速充分激活蛋白C，而且对凝血***和抗凝血***无影响，缩短反应时间，从而提高样本检测速率和检测蛋白C活性的准确度。
为了避免血浆样本中血红蛋白和胆红素干扰蛋白C激活作用，本发明的稀释液，一方面能够稀释样本，降低样本中能影响活化蛋白C活性检测的其他凝血因子(如Va和VIIIa)的干扰，降低对活化蛋白C的消耗，并且减少试剂盒中蛋白C激活剂和底物的用量，节约生产成本；另一方面，稀释液包含表面活性剂和/>L23(优选一种或多种)，能中和血红蛋白和胆红素，使其构象发生变化，消除干扰蛋白C活性检测的影响。
作为优选，稀释液中的浓度为0.05w/v％～0.50w/v％。
作为优选，激活试剂中各组分浓度为：蛋白C激活剂Protac 0.2U/mL～0.5U/mL、聚乙烯基吡咯烷酮0.1w/v％～1.0w/v％、L-赖氨酸盐酸盐0.1％～0.5％(w/v)、山梨醇1.0w/v％～5.0w/v％、海藻糖5w/v％～10.0w/v％、缓冲液余量。
作为优选，蛋白C激活剂Protac选DSM公司生产的。
作为优选，发色底物试剂各组分浓度为：发色底物1.0mg/L～4.0mg/mL、山梨醇0.5w/v％～5.0w/v％、海藻糖5.0w/v％～10.0w/v％、缓冲液余量。
作为优选，缓冲液为30mmol/L～100mmol/L、pH 7.2-8.4三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液。
本发明还提供了该试剂盒的制备方法，分别配制稀释液、激活试剂和发色底物试剂，将激活试剂和发色底物试剂冷冻干燥。
本发明提供了一种蛋白C活性测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒的制备原料包括稀释液、激活试剂和发色底物试剂；稀释液为含有的生理盐水；
激活试剂包括蛋白C激活剂Protac、聚乙烯基吡咯烷酮、L-赖氨酸盐酸盐、山梨醇、海藻糖和缓冲液；发色底物试剂包括发色底物、山梨醇、海藻糖和缓冲液。本发明的优点如下：
本发明中稀释液添加能中和血浆中干扰物胆红素和血红蛋白，避免此干扰物干扰蛋白C的激活反应，提高检测蛋白C活性的准确性；
本发明中，在激活试剂中还可以进一步优化添加剂聚乙烯基吡咯烷酮、L-赖氨酸盐酸盐和山梨醇，不仅可提高蛋白C激活剂Protac水溶液的稳定性，还可以增强用于检测蛋白C活性的精密度；
针对激活剂Protac和发色底物在水溶液中通常不稳定，不能长时间保存的问题，采用特定的添加剂，能够有效地提高激活剂Protac和发色底物在水溶液中的稳定性，并且以干粉型外观形态存在，将更有利于增强其稳定性；
试验表明，本发明蛋白C活性测定试剂盒具有优异的性能，在2～8℃下稳定24个月，相对偏差不超过±10％；精密度CV值：不超过8％；瓶间差CV值：不超过5％；线性范围为[5，160]％，其拟合度R2﹥0.99；试剂盒复溶后置于37℃下能稳定维持3天，在2～8℃下能至少稳定60天；稳定性高。
本发明实施例1～实施例12中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
稀释液的制备：称取0.05g 溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为：0.1U/mL蛋白C激活剂Protac、0.5w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、0.1w/v％L-赖氨酸盐酸盐、0.5w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/L pH8.1Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为：2mg/L发色底物S2366、2w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。实施例1作为对比例。
实施例2
稀释液的制备：称取0.05g溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为0.2U/mL蛋白C激活剂Protac、0.2w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、0.3w/v％L-赖氨酸盐酸盐、2.0w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/L pH8.1Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为2mg/L发色底物S2366、2w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。
实施例3
稀释液的制备：称取0.20g 溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为0.2U/mL蛋白C激活剂Protac、0.5w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2w/v％L-赖氨酸盐酸盐、3.0w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为1.0mg/L发色底物S2366、2w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/LpH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。
实施例4
稀释液的制备：称取0.30g 溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为0.3U/mL蛋白C激活剂Protac、0.1w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、0.1w/v％L-赖氨酸盐酸盐、1.0w/v％山梨醇、5w/v％海藻糖、60mmol/L pH8.4Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为3mg/L发色底物S2366、0.5w/v％山梨醇、5w/v％海藻糖、30mmol/LpH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。
实施例5
稀释液的制备：称取0.50g 溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为0.5U/mL蛋白C激活剂Protac、1.0w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、0.5w/v％L-赖氨酸盐酸盐、5.0w/v％山梨醇、10w/v％海藻糖、100mmol/LpH8.4Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为4mg/L发色底物S2366、5w/v％山梨醇、10w/v％海藻糖、30mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。
实施例6
稀释液的制备：称取0.25g 溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为0.3U/mL蛋白C激活剂Protac、0.3w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、0.1w/v％L-赖氨酸盐酸盐、1.0w/v％山梨醇、5w/v％海藻糖、60mmol/L pH8.2Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为1mg/L发色底物S2366、1.0w/v％山梨醇、5w/v％海藻糖、30mmol/LpH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。
实施例7
稀释液的制备：称取0.25g 溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为0.6U/mL蛋白C激活剂Protac、1.0w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、1.0w/v％L-赖氨酸盐酸盐、5.0w/v％山梨醇、12w/v％海藻糖、60mmol/L pH8.4Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为4mg/L发色底物S2366、4.0w/v％山梨醇、9w/v％海藻糖、30mmol/LpH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。实施例7作为对比例。
实施例8
稀释液的制备：称取0.20g曲拉通X-100，溶于100mL生理盐水。
激活试剂的制备：其各组分配比为0.2U/mL蛋白C激活剂Protac、0.5w/v％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2w/v％L-赖氨酸盐酸盐、3.0w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液。
底物试剂的制备：其各组分配比为1.0mg/L发色底物S2366、2w/v％山梨醇、7w/v％海藻糖、30mmol/LpH7.2 Tris-HCl缓冲液。
上述的激活试剂和发色底物试剂配制完成后，经过分装、冷冻干燥，制成冻干粉。
实施例9蛋白C活性测定的操作
本发明所述的蛋白C活性检测试剂盒，复溶后静置10min，采用Sysmex5100全自动凝血分析仪，按照制造商所提供的说明书进行参数设置：样本(校准品、质控品或血浆)与稀释液按1:4混合，并取出50μL混合液，加入等体积的激活试剂混合并孵育4min，再加入等体积发色底物试剂混合，在405nm波长照射下反应90s，读取待测样品中15s～75s信号强度(吸光度OD值)；最后通过计算信号强度并和已知浓度标准品的标准曲线比对得到血浆中蛋白C的活性。
图1和图2为本发明所述的蛋白C活性测定试剂盒的标准曲线性能评价。
实施例10干扰物胆红素和血红蛋白的影响
将已知蛋白C活性为98％西门子通用校准品复溶，按照仪器操作手册中的自动校准程序操作，采用多点校准定标方式，设置一系列浓度(1/1、1/2、1/4、1/8、0/1)进行校准定标。配置一系列浓度表面活性剂或激活剂如实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例8的试剂盒和市售同类试剂盒(德国西门子医学诊断产品有限公司，蛋白C活性测定试剂盒(发色底物法)，批号：01619)检测上述通用校准品蛋白C活性所对应的吸光值OD值，每个样本重复测试2次求平均值，绘制各实施例的定标曲线，结果见附图1。
由图1所示，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5定标曲线的线性R2均大于0.9985，优于实施例8定标曲线的线性R2，并且随着表面活性剂或激活剂的增加，检测标准品蛋白C活性的吸光度OD值增大，且实施例2、实施例3、实施例4和实施例5的吸光度OD值高度吻合一致并大于实施例1的，提高蛋白C的活化效率。
收集新鲜混合血浆样本(PC活性近似110％混合样本)，分别与胆红素溶液(800mg/mL)和血红蛋白溶液(2000mg/mL)进行混合，得到4个梯度(10、20、40、80mg/dL)胆红素混合血浆和4个梯度(25、50、100、200mg/dL)血红蛋白混合血浆，以及去离子水空白对照血浆。选择实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和实施例8试剂盒以及市售同类试剂盒检测上述血浆样本蛋白C活性，每个样本重复检测2次取平均值，计算出添加干扰物质的蛋白C活性检测结果与未添加干扰物质的蛋白C检测结果的相对偏差，结果如表1～表5所示：
表1实施例1、实施例2、实施例3试剂盒对胆红素的抗干扰性
表2实施例4、实施例5和实施例8试剂盒对胆红素的抗干扰性
表3实施例1、实施例2和实施例3试剂盒对血红蛋白的抗干扰性
表4实施例4、实施例5和实施例8试剂盒对血红蛋白的抗干扰性
表5市售同类试剂盒对胆红素和血红蛋白的抗干扰性
由表1～表5可看出，实施例2、实施例3、实施例4和实施例5检测添加干扰物质(80mg/dL胆红素、200mg/dL血红蛋白)血浆的蛋白C活性结果与未添加干扰物质血浆的蛋白C结果的相对偏差均在±8.5％以内，且明显优于实施例1、实施例8和市售同类试剂盒，即表面活性剂对干扰物胆红素和血红蛋白的抗干扰性明显优于表面活性剂曲拉通X-100和市售同类试剂盒。由此表明，该表面活性剂能使本发明试剂盒检测血浆蛋白C活性时对干扰物胆红素和血红蛋白具有较强的抗干扰性。
实施例11稳定剂组合物对蛋白C活性检测试剂盒稳定性的影响
将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5实施例6、实施例7和市售同类试剂盒的试剂盒复溶，按照仪器操作手册中的自动校准程序操作，完成定标如图1和图2。实施例2、实施例3、实施例4和实施例5实施例6、实施例7的吸光度OD值基本一致，且明显大于实施例1和市售同类试剂盒。
实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5实施例6、实施例7和市售同类试剂盒盒复溶后分别分成三组分别放置在2℃～8℃、25℃和37℃条件下，间隔一定时间，按照蛋白C活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，对正常质控血浆和异常质控血浆进行检测，记录检测结果蛋白C活性的变化，判断试剂盒的蛋白C激活剂的活化作用是否降低，如表6～表8所示：
表6蛋白C活性检测试剂盒在2℃～8℃的稳定性
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表7蛋白C活性检测试剂盒在25℃的稳定性
/>
表8蛋白C活性检测试剂盒在37℃的稳定性
/>
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表6～表8结果说明，实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6和实施例7试剂复溶后在2℃～8℃、25℃和37℃下蛋白C活性检测值与0天相比相对偏差均在±3.6％以内，明显优于实施例1和市售同类试剂，故实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6和实施例7试剂复溶后在2℃～8℃下蛋白C活性检测试剂至少能稳定60天；在25℃下蛋白C活性检测试剂能够稳定保存30天；在37℃下蛋白C活性检测试剂能稳定维持活性3天，且稳定性一致，说明本发明所提供的的组合物(L-赖氨酸盐酸盐、聚乙烯基吡咯烷酮和山梨醇)能较长时间地维持蛋白C激活剂的稳定性，进而维持蛋白C活性检测试剂的稳定性。
实施例12本发明试剂盒的分析性能评估
1、实施例6、实施例7和市售同类试剂定标标准曲线的绘制
将已知蛋白C活性为98％西门子通用校准品复溶，按照仪器操作手册中的自动校准程序操作，采用多点校准定标方式，设置一系列浓度(1/1、1/2、1/4、1/8、0/1)对本发明试剂盒和市售同类试剂盒分别进行校准定标，在Sysmex5100凝血分析仪上检测校准品OD值，以OD值为纵坐标，以相应的蛋白C活性值为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示。
由图2所示，基于发色底物法，本发明试剂盒和市售同类试剂盒检测校准品的吸光度OD值与相应的蛋白C活性的线性关系函数定义分别为Y＝0.0011X+0.0003，R2＝0.9994、Y＝0.0011X-0.0001，R2＝0.9995和Y＝0.0009X-0.0003，R2＝0.9990。由此可见，实施例6和实施例7线性关系高度一致，相比于市售同类试剂盒，呈现良好的线性关系，且灵敏度高。此外，实施例7试剂的组成成分含量过高，导致冻干工艺时间长，原料成本高。
2、实施例1、实施例6和实施例7精密度的检测
按照蛋白C活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，实施例1、实施例6和实施例7对正常质控血浆和异常质控血浆重复侧定10次，计算测定值的均值、标准差和变异系数CV，如下：
表9蛋白C活性检测试剂盒的精密度
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。表9结果所示，实施例6和实施例7试剂检测正常质控血浆的蛋白C活性时，其CV值分别为1.02％和1.00％；检测异常质控血浆的蛋白C活性时，其CV值分别为2.81％和2.00％，明显优于实施例1的。此表明实施例6和实施例7试剂的精密度性能优于实施例1的。
3、实施例6准确度的检测
按照蛋白C活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，对国际标准物NIBSC 02/342重复侧定3次，计算测定的平均值，并与此国际标准物靶值对比，计算其相对偏差，如下：
表10蛋白C活性测定试剂盒的准确度
由表10结果显示，本发明试剂盒检测国际标准物NIBSC 02/342蛋白C活性均值为85.7％，相对偏差为0.82％，在±10％范围以内，故本发明试剂盒的准确度高。
4、实施例6批间差的检测
取出三个批号的本发明试剂盒，复溶，按照蛋白C活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，分别对正常质控血浆和异常质控血浆进行10次检测，计算测定值的均数、标准差和变异系数CV，如下：
表11蛋白C活性测定试剂盒检测正常质控血浆的批间差
表12蛋白C活性测定试剂盒检测异常质控血浆的批间差
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。表11和表12结果所示本发明试剂盒检测正常质控血浆和异常质控血浆的蛋白C活性(％)的精密度(CV)值分别为0.97％和2.26％，表明本发明试剂盒具有优良的批间差。
5、实施例6批内差的检测
用同一批次10个不同编号的本发明试剂盒，复溶，按照蛋白C活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，分别对正常质控血浆和异常质控血浆进行一瓶测10次和10瓶每瓶检测1次，计算蛋白C活性测定值的均数、标准差和变异系数CV，如下：
表13蛋白C活性测定试剂盒检测正常质控血浆的批内差
表14蛋白C活性测定试剂盒检测异常质控血浆的批内差
表13和表14结果所示，本发明试剂盒检测正常质控血浆和异常质控血浆的精密度(CV)值分别为0.79％和2.98％，表明本发明试剂盒具有优良的批内差。
6、实施例6与市售同类试剂盒的相关性的检测
本发明试剂盒与市售同类试剂盒分别在Sysmex 5100全自动血凝分析仪上，对32份新鲜血浆样本(包含正常和异常样本)进行蛋白C活性的检测，并对测定值进行相关分析(结果见图3，X轴表示市售试剂盒的测定值，Y轴表示本发明试剂盒的测定值或与市售同类试剂测值的相对偏差)。
图3表明，本发明试剂盒与市售同类试剂盒相关线性方程为：y＝0.9913x+1.1608，相关系数：R2＝0.9954，相对偏差均在±10％以内，检测结果基本一致，结果表明本发明试剂盒与市售同类试剂盒相关性良好。线性方程为：结果表明本发明试剂盒与市售同类试剂盒相关性良好。
7、实施例1和实施例6线性范围的检测
将蛋白C活性近似为170％血浆样本稀释倍数为1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.2、0.1和0.05等梯度血浆样本，实施例1和实施例6分别对每个血浆样本重复测试2次，计算出每个样本测定结果的均值。以稀释倍数为自变量，测定结果均值为因变量求出线性回归方程和相关系数R如图4，将稀释浓度代入线性回归方程，计算估计值及测定结果均值与估计值的相对偏差或绝对偏差，如下表：
表15实施例1的蛋白C活性测定试剂盒的线性
表16实施例6的蛋白C活性测定试剂盒的线性
由图4和表15和表16所示，实施例1的线性回归方程y＝153.89x+6.2729，R2＝0.9828，相对偏差在-33.77％～7.25％之间；实施例6的线性回归方程y＝170.57x+0.9975，R2＝0.9996，相对偏差在-7.10％～2.57％之间。实施例6的线性优于实施例1，故本发明试剂盒的线性范围：9％～170％。
8、实施例6机型差的检测
用实施例6试剂盒分别在Sysmex 5100、ACL TOP CTS和ZK-6000全自动血凝分析仪上完成定标，并以各自仪器上的定标曲线为依据，检测40例血浆样本的蛋白C活性，并且该血浆样本蛋白C活性范围在[10，160]％内，其检测的结果如表17。为了分析本发明试剂盒在上述三种仪器上检测血浆样本蛋白C活性的机型差，以Sysmex 5100仪器检测蛋白C活性的结果为横坐标，ACL TOP CTS和ZK-6000仪器检测的结果为纵坐标，绘制机型差曲线图5。
表17蛋白C活性测定试剂盒的机型差
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表17表明，本发明试剂盒分别在Sysmex 5100、ACL TOP CTS和ZK-6000全自动血凝分析仪上检测血浆样本蛋白C活性结果相对比，其相对偏差基本上均在±10％之内，而且图5反映出本发明试剂盒在此三种仪器上检测血浆样本蛋白C活性的相关性R2均大于0.99，故本发明试剂盒的机型差较小。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.组合物，其特征在于，包括：
蛋白C激活剂 0.2～0.5U/mL
聚乙烯基吡咯烷酮 0.1～1.0w/v％
L-赖氨酸盐酸盐 0.1～0.5w/v％。
2.检测试剂，其特征在于，包括：如权利要求1所述的组合物、发色底物试剂和稀释液。
3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述发色底物试剂包括：1.0～4.0mg/L发色底物。
4.如权利要求2或3所述的检测试剂，其特征在于，所述稀释液包括：0.05～0.50w/v％
5.如权利要求1所述的组合物和/或如权利要求2至4任一项所述的检测试剂在制备检测蛋白C活性的试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测包括如下步骤：取待测样本与所述稀释液混合后，再与所述组合物和所述发色底物试剂混合，显色反应后，根据OD值，获得所述蛋白C的活性。
7.如权利要求1所述的组合物和/或如权利要求2至4任一项所述的检测试剂在制备检测蛋白C***的试剂盒中的应用。
8.检测试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的组合物和/或如权利要求2至4任一项所述的检测试剂以及可接受的助剂或载体。
9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述助剂包括：
山梨醇 1.0～5.0w/v％
海藻糖 5.0～10.0w/v％
缓冲液 30～100mmol/L。
10.如权利要求8或9所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，分别获得所述组合物、所述发色底物试剂和所述稀释液，冷冻干燥所述组合物和所述发色底物试剂，获得所述检测试剂盒。
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