CN117701483A - 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5‑戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌KA30为出发菌株,通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB,并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG,构建得到重组大肠杆菌NT1003‑△PtsG‑xylAB‑cadA。本发明以发酵培养基中葡萄糖与木糖碳摩尔量比2:1与1:1为例,该重组大肠杆菌与出发菌株相比,可实现对葡萄糖与木糖的同步消耗。以混合碳源为底物发酵36h,至少可生产4.2g/L的1,5‑戊二胺。现阶段,资源枯竭和环境污染问题日益严重,木质纤维素原料中含有大量的葡萄糖和木糖,该方法有利于木质纤维素生物炼制且具有一定经济效益,为能源紧缺提供了一条可持续发展道路。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
1,5-戊二胺(简称戊二胺,Diaminopentane),又被称为尸胺,是一种五碳二胺,可用作合成聚酰胺、聚氨酯或螯合剂的单体。作为重要的化学中间体,戊二胺在材料领域中可用作多种新型材料及高聚物的制备,在尼龙、涂料、粘合剂等方面具有广泛的应用前景。同时,由于戊二胺的生物特性,戊二胺在食品、农业及医药领域也有着重要的应用价值。
目前生物法生产戊二胺主要有两条途径:一种是酶法生产戊二胺,即用赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞来催化L赖氨酸生成戊二胺;另一种是选择合适的微生物,以葡萄糖为原料,直接发酵生产戊二胺。酶法生产戊二胺条件复杂,需要添加多种辅因子,而利用微生物直接发酵生产戊二胺成本低廉,有利于大规模生产。利用生物法转化可再生资源或废弃资源来生产戊二胺具有污染小、环境友好、可持续发展等优点。木质纤维素原料充足而廉价,如果能将之利用,不仅减少了农作物废物燃烧对大气的环境污染,也提高了农作物废弃物的经济价值,同时为能源紧缺提供一条可持续发展道路。
目前,微生物发酵生产戊二胺都以通过单一碳源为原料实现,葡萄糖与木糖的共利用技术还未发展全面。木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖。常见的木糖代谢途径主要是XR/XI/WBG以及Dahms四种。EMP作为基因工程菌株构建葡萄糖代谢模块的常用途径,常常与以上木糖代谢途径组合,构建木糖-葡萄糖共利用工程菌株。高效共利用木糖及葡萄糖的天然菌株较少,且其底物偏好性会影响共利用发酵性能,因此构建底物谱更广、混合糖利用率更高的木糖-葡萄糖共利用工程菌株,是实现以木质纤维素为原料产业化制备二元胺的必要条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌,以解决葡萄糖分解代谢阻遏的问题,实现大肠杆菌对葡萄糖与木糖的同步利用发酵生产戊二胺,降低发酵成本,具有经济环保效益。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌,以大肠杆菌KA30为出发菌株,通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB,并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG,构建得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
其中,所述的出发菌株——大肠杆菌KA30即为分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株,菌株号:NT1003△Met△Thr,已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号:CCTCC NO:M 2013239。该菌株的详细信息已公开在专利CN103361289B中。
其中,所述的赖氨酸脱羧酶基因CadA来源于大肠杆菌MG1655,其Gene ID:948643,对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述的木糖异构酶基因XylA来源于大肠杆菌MG1655,其Gene ID:948141,对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述的木酮糖激酶基因XylB来源于大肠杆菌MG1655,其Gene ID:948133,对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法,包括如下步骤:
(1)将赖氨酸脱羧酶基因CadA通过同源重组的方式,以NcoI和HindIII为酶切位点,克隆到表达载体pCDFtrc中,并验证,得到重组质粒pCDFtrc-cadA;
(2)将木糖异构酶基因XylA通过同源重组的方式,以EcoRI和BamHI为酶切位点,克隆到表达载体pTrc99a中,并验证,得到重组质粒pTrc99a-xylA;然后将木酮糖激酶基因XylB通过同源重组的方式,以BamHI为酶切位点,克隆到重组质粒pTrc99a-xylA中,并验证,得到重组质粒pTrc99a-xylA-xylB;
(3)敲除大肠杆菌KA30的葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG,获得表达宿主即敲除PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG;
(4)将步骤(1)获得的重组质粒pCDFtrc-cadA和步骤(2)获得的重组质粒pTrc99a-xylA-xylB共同转化至步骤(3)获得的大肠杆菌NT1003-△PtsG中,得到重组大肠杆菌,即1,5-戊二胺生产菌株NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
其中,步骤(1)中,所述的表达载体pCDFtrc为利用环化PCR将表达载体pCDFduet上的T7启动子更换为trc启动子,同时删除T7启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
其中,步骤(2)中,所述的表达载体pTrc99a为利用环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
其中,所述的步骤(3)具体操作为:将Cas9质粒导入目的菌株大肠杆菌KA30中,构建含有待敲除基因PtsG的N20序列的突变SgRNA质粒、取待敲除基因PtsG两端序列作为基因敲除上下同源臂构建Donor DNA。然后将突变SgRNA质粒、Donor DNA加至含有Cas9质粒的目的菌株大肠杆菌KA30感受态细胞中,利用CRISPR-Cas9基因编辑***敲除基因PtsG,选取阳性转化子进行PCR验证成功后,将阳性菌株送测,再将测序正确的菌株于LB固体培养基连续传代培养直至其无法在有KanR以及SmR抗性的固体LB培养基上生长,则敲除质粒脱除成功,最终获得敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG;
上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中,所述的应用,包括如下步骤:
(Ⅰ)将活化后的重组大肠杆菌接种到种子培养基中进行种子培养,获得种子液;
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)将种子液直接接种于发酵培养基进行发酵培养。
其中,步骤(Ⅰ)中,所述的种子培养,其培养条件为:37℃,180~250rpm培养至OD600=1.5~2,优选的其培养条件为:37℃,200rpm培养至OD600=1.5。
其中,步骤(Ⅱ),所述的接种,其接种量为2~5%v/v,优选的接种量为3%v/v;所述的发酵培养,其培养条件为:控制初始OD600=0.05~1,37℃下发酵30~36h,优选的培养条件为:控制初始OD600=0.05,37℃下发酵30~36h。
其中,步骤(Ⅱ),所述的发酵培养基,其碳源为葡萄糖和木糖的组合。
其中,步骤(Ⅱ),所述的发酵培养基,其配方为:碳源22~23g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa 100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。
具体的,所述的葡萄糖和木糖,其碳摩尔量比例为1~2:1,优选的比例为2:1或1:1。当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时,发酵培养基中葡萄糖浓度为16g/L、木糖浓度为6.7g/L;当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时,发酵培养基中葡萄糖浓度为12g/L、木糖浓度为10g/L。其中,碳源的总碳摩尔浓度为0.053mol/L。
有益效果:
(1)本发明解决了葡萄糖分解代谢阻遏的问题,实现了大肠杆菌对葡萄糖与木糖的同步利用。
(2)本发明以混合碳源为原料发酵生产1,5-戊二胺,无需添加诱导剂,降低了发酵成本具有环境效益。
(3)现阶段资源枯竭和环境污染问题日益严重,本发明以葡萄糖与木糖为碳源,而木质纤维素原料中含有大量的葡萄糖和木糖,该方法有利于木质纤维素生物炼制且具有一定经济效益,为能源紧缺提供了一条可持续发展道路。
(4)本发明直接以葡萄糖与木糖为混合碳源,至少可生产4.2g/L的1,5-戊二胺。
(5)本发明发酵反应过程较为温和,对环境、设备及操作人员均无害。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为重组大肠杆菌在葡萄糖与木糖碳摩尔量比例为2:1的培养基中对碳源的消耗情况。
图2为重组大肠杆菌在葡萄糖与木糖碳摩尔量比为例1:1的培养基中对碳源的消耗情况。
图3为碳代谢阻遏解除后的混糖发酵生产1,5-戊二胺的产量。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明,但这并非是对本发明的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以做出各种修改或改进,但是只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的范围之内。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得,实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术。
下述实施例中,所述的大肠杆菌KA30即为分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株,菌株号:NT1003△Met△Thr,已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号:CCTCC NO:M 2013239。该菌株的详细信息已公开在专利CN103361289B中。
实施例1:构建重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA
1、pCDFtrc-cadA重组质粒的构建
合成赖氨酸脱羧酶基因cadA,核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示:
ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA
所用上游引物带有同源臂,序列如SEQ ID NO.2所示:
AGGAGATATACCATGATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGG
下游引物带有同源臂,序列如SEQ ID NO.3所示:
ATGCGGCCGCAAGCTTTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAACGG
反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃90s,共30个循环;72℃5min;反应体系为(50μL):2×Phanta max master mix 25μL,上游引物2μL,下游引物2μL,扩增模板2μL,ddH2O 19μL。其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组,可按照细菌基因组提取试剂盒的(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后通过胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)回收目的基因片段cadA。
通过环化PCR将载体pCDFduet上的T7启动子更换为大肠杆菌KA30可识别的trc启动子,同时删除操纵基因lacO,所用引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示:
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAAC TTTAATAAGGAGAT(SEQ ID NO.4)
CATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATTTCCTAATGCAGGAGTCGCA
(SEQ ID NO.5)
反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃90s,共30个循环;72℃5min,反应体系为:2×Phanta max master mix 10μL,上游引物1μL,下游引物1μL,pCDFDuet 0.5μL,ddH2O 7.5μL。PCR结束后,对产物进行消化(37℃、2h),消化体系为:PCR产物16μL,DpnI 2μL,10×Q.Cut Buffer 2μL。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基,于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测,获得改造载体pCDFtrc。
将改造载体pCDFtrc用Takara公司的NcoI和HindIII酶切,酶切反应体系为:10×Q.Cut Buffer 5μL,NcoI 2μL,HindIII 2μL,改造载体pCDFtrc 25μL,ddH2O 11μL,反应条件为:37℃,1h。随后将酶切后的改造载体与目的片段cadA进行同源重组,同源重组反应体系为(20μL):5×CE II Bufer 4μL,Exnase 2μL,改造载体4μL,基因片段cadA10μL;反应条件为:37℃,30min。得到重组质粒pCDFtrc-cadA。然后再将连接产物转化至大肠杆菌E.coliTrans1-T1中。PCR筛选阳性菌株E.coli Trans1-T1-pCDFtrc-cadA并进行DNA测序,验证重组质粒构建正确。重组质粒的抗性为链霉,cadA的启动子为Trc,终止密码子为rrnB。
将阳性菌株E.coli Trans1-T1-pCDFtrc-cadA接种至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基,LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L,于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取重组质粒pCDFtrc-cadA。
2、pTRC99a-xylA-xylB重组质粒的构建
合成木糖异构酶基因xylA,核苷酸编码序列如SEQ ID NO.6所示:
ATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTCGATCGCGTTCGTTATGAAGGCTCAAAATCCTCAAACCCGTTAGCATTCCGTCACTACAATCCCGACGAACTGGTGTTGGGTAAGCGTATGGAAGAGCACTTGCGTTTTGCCGCCTGCTACTGGCACACCTTCTGCTGGAACGGGGCGGATATGTTTGGTGTGGGGGCGTTTAATCGTCCGTGGCAGCAGCCTGGTGAGGCACTGGCGTTGGCGAAGCGTAAAGCAGATGTCGCATTTGAGTTTTTCCACAAGTTACATGTGCCATTTTATTGCTTCCACGATGTGGATGTTTCCCCTGAGGGCGCGTCGTTAAAAGAGTACATCAATAATTTTGCGCAAATGGTTGATGTCCTGGCAGGCAAGCAAGAAGAGAGCGGCGTGAAGCTGCTGTGGGGAACGGCCAACTGCTTTACAAACCCTCGCTACGGCGCGGGTGCGGCGACGAACCCAGATCCTGAAGTCTTCAGCTGGGCGGCAACGCAAGTTGTTACAGCGATGGAAGCAACCCATAAATTGGGCGGTGAAAACTATGTCCTGTGGGGCGGTCGTGAAGGTTACGAAACGCTGTTAAATACCGACTTGCGTCAGGAGCGTGAACAACTGGGCCGCTTTATGCAGATGGTGGTTGAGCATAAACATAAAATCGGTTTCCAGGGCACGTTGCTTATCGAACCGAAACCGCAAGAACCGACCAAACATCAATATGATTACGATGCCGCGACGGTCTATGGCTTCCTGAAACAGTTTGGTCTGGAAAAAGAGATTAAACTGAACATTGAAGCTAACCACGCGACGCTGGCAGGTCACTCTTTCCATCATGAAATAGCCACCGCCATTGCGCTTGGCCTGTTCGGTTCTGTCGACGCCAACCGTGGCGATGCGCAACTGGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCGAACAGTGTGGAAGAGAATGCGCTGGTGATGTATGAAATTCTCAAAGCAGGCGGTTTCACCACCGGTGGTCTGAACTTCGATGCCAAAGTACGTCGTCAAAGTACTGATAAATATGATCTGTTTTACGGTCATATCGGCGCGATGGATACGATGGCACTGGCGCTGAAAATTGCAGCGCGCATGATTGAAGATGGCGAGCTGGATAAACGCATCGCGCAGCGTTATTCCGGCTGGAATAGCGAATTGGGCCAGCAAATCCTGAAAGGCCAAATGTCACTGGCAGATTTAGCCAAATATGCTCAGGAACATCATTTGTCTCCGGTGCATCAGAGTGGTCGCCAGGAACAACTGGAAAATCTGGTAAACCATTATCTGTTCGACAAATAA
所用上游引物带有同源臂,序列如SEQ ID NO.7所示:
GAAACAGACCATGGAATTCATGGAGTTCAATATGCAAGCCTATTTTGAC
下游引物带有同源臂,序列如SEQ ID NO.8所示:
GGTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTGTCGAACAGATAATGGTTTACCAGATTT TCC
反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃60s,共30个循环;72℃5min,反应体系为(50μL):2×Phanta max master mix 25μL,上游引物2μL,下游引物2μL,扩增模板2μL,ddH2O 19μL。其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组,可按照细菌基因组提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)的操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后按照胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明回收目的基因片段xylA。
通过环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO以获得改造载体,所用引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示:
CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTTCACACAGGAAACA(SEQ ID NO.9)
CCCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTCCACACATTATACGA(SEQ ID NO.10)
反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃120s,共30个循环;72℃5min,反应体系为:2×Phanta max master mix 10μL,上游引物1μL,下游引物1μL,pTrc99a 0.5μL,ddH2O 7.5μL。PCR结束后,对产物进行消化(37℃、2h),消化体系为:PCR产物16μl,DpnI 2μl,10×Q.Cut Buffer 2μl。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含50μg/ml Amp的5ml LB液体培养基,于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测,获得改造载体。
将改造载体用Takara公司的EcoRI和BamHI酶切,酶切反应体系为:10×Q.CutBuffer5μL,EcoRI 2μL,BamHI 2μL,改造载体pTrc99a 25μL,ddH2O 16μL,反应条件为:37℃,1h。随后将酶切后的改造载体与目的片段xylA进行同源重组,同源重组反应体系为(20μL):5×CE II Bufer 4μL,Exnase 2μL,改造载体4μL,基因片段xylA 10μL;反应条件为:37℃,30min,得到重组质粒pTrc99a-xylA。
合成木酮糖激酶基因xylB,核苷酸编码序列如SEQ ID NO.11所示:
ATGTATATCGGGATAGATCTTGGCACCTCGGGCGTAAAAGTTATTTTGCTCAACGAGCAGGGTGAGGTGGTTGCTGCGCAAACGGAAAAGCTGACCGTTTCGCGCCCGCATCCACTCTGGTCGGAACAAGACCCGGAACAGTGGTGGCAGGCAACTGATCGCGCAATGAAAGCTCTGGGCGATCAGCATTCTCTGCAGGACGTTAAAGCATTGGGTATTGCCGGCCAGATGCACGGAGCAACCTTGCTGGATGCTCAGCAACGGGTGTTACGCCCTGCCATTTTGTGGAACGACGGGCGCTGTGCGCAAGAGTGCACTTTGCTGGAAGCGCGAGTTCCGCAATCGCGGGTGATTACCGGCAACCTGATGATGCCCGGATTTACTGCGCCTAAATTGCTATGGGTTCAGCGGCATGAGCCGGAGATATTCCGTCAAATCGACAAAGTATTATTACCGAAAGATTACTTGCGTCTGCGTATGACGGGGGAGTTTGCCAGCGATATGTCTGACGCAGCTGGCACCATGTGGCTGGATGTCGCAAAGCGTGACTGGAGTGACGTCATGCTGCAGGCTTGCGACTTATCTCGTGACCAGATGCCCGCATTATACGAAGGCAGCGAAATTACTGGTGCTTTGTTACCTGAAGTTGCGAAAGCGTGGGGTATGGCGACGGTGCCAGTTGTCGCAGGCGGTGGCGACAATGCAGCTGGTGCAGTTGGTGTGGGAATGGTTGATGCTAATCAGGCAATGTTATCGCTGGGGACGTCGGGGGTCTATTTTGCTGTCAGCGAAGGGTTCTTAAGCAAGCCAGAAAGCGCCGTACATAGCTTTTGCCATGCGCTACCGCAACGTTGGCATTTAATGTCTGTGATGCTGAGTGCAGCGTCGTGTCTGGATTGGGCCGCGAAATTAACCGGCCTGAGCAATGTCCCAGCTTTAATCGCTGCAGCTCAACAGGCTGATGAAAGTGCCGAGCCAGTTTGGTTTCTGCCTTATCTTTCCGGCGAGCGTACGCCACACAATAATCCCCAGGCGAAGGGGGTTTTCTTTGGTTTGACTCATCAACATGGCCCCAATGAACTGGCGCGAGCAGTGCTGGAAGGCGTGGGTTATGCGCTGGCAGATGGCATGGATGTCGTGCATGCCTGCGGTATTAAACCGCAAAGTGTTACGTTGATTGGGGGCGGGGCGCGTAGTGAGTACTGGCGTCAGATGCTGGCGGATATCAGCGGTCAGCAGCTCGATTACCGTACGGGGGGGGATGTGGGGCCAGCACTGGGCGCAGCAAGGCTGGCGCAGATCGCGGCGAATCCAGAGAAATCGCTCATTGAATTGTTGCCGCAACTACCGTTAGAACAGTCGCATCTACCAGATGCGCAGCGTTATGCCGCTTATCAGCCACGACGAGAAACGTTCCGTCGCCTCTATCAGCAACTTCTGCCATTAATGGCGTAA
所用上游引物带有RBS序列与同源臂,序列如SEQ ID NO.12所示:
CGACAAATAAGGATCTTCACACAGGAAACAGACCATTGGAATTATG
下游引物带有同源臂,序列如SEQ ID NO.13所示:
CGACTCTAGAGGATCTTACGCCATTAA
反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃60s,共30个循环;72℃5min,反应体系为(50μL):2×Phanta max master mix 25μL,上游引物2μL,下游引物2μL,扩增模板2μL,ddH2O 19μL,其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组,可按照细菌基因组提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后按照胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明回收目的基因片段xylB。
以重组质粒pTrc99a-xylA为载体,用Takara公司的BamHI单酶切,酶切反应体系为:10×Q.Cut Buffer 5μL,BamHI 2μL,质粒pTrc99a-xylA 25μL,ddH2O 18μL,反应条件为:37℃,1h。随后与目的片段xylB进行同源重组,同源重组反应体系为(20μL):5×CE IIBufer 4μL,Exnase 2μL,质粒pTrc99a-xylA 4μL,基因片段xylB 10μL;反应条件为:37℃,30min,得到重组质粒pTRC99a-xylA-xylB。将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株E.coli Trans1-T1-pTRC99a-xylA-xylB并进行DNA测序,验证重组质粒构建正确。重组质粒的抗性为氨苄,xylA、xylB的启动子为Trc,终止密码子为rrnB。
将阳性菌株E.coli Trans1-T1-pTRC99a-xylA-xylB接种至含50μg/ml Amp的5mlLB液体培养基,LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L,于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取重组质粒pTRC99a-xylA-xylB。
3、PtsG基因的敲除
(1)制备含有Cas9质粒目的菌株的感受态。将Cas9质粒通过化学法导入到目的菌株KA30中,并涂布在含25μg/ml Kan的LB固体培养基上。挑取单菌落富集后接种于5mL含25μg/ml Kan的LB液体培养基,30℃,200rpm培养18h后,按5%v/v接种量接种于50mL含25μg/mlKan的LB液体培养基,30℃,200rpm培养至OD600约为0.2后,加入终浓度为30mM/L L-***糖(115℃,15min高温灭菌),继续培养至OD600至0.4~0.6后,将培养液转移至50ml离心管中,冰上预冷20min。4℃下4000rpm离心10min,收集细胞;弃上清,用40ml预冷的无菌水重悬细胞;重复上述步骤;弃上清,用20ml预冷的10%(v/v)甘油重悬细胞;4℃下4000rpm离心10min;弃上清,用初始菌液体积的3‰预冷10%(v/v)甘油重悬,以每管50μl分装于预冷的1.5ml离心管中,-80℃保存。
(2)构建突变SgRNA质粒。找出待敲除基因PtsG的N20序列,合成含有N20序列的引物,对SgRNA(购买于淼灵生物公司)进行环化PCR,所用引物序列如SEQ ID NO.14、15所示。
GGGCGGTATTATGATCTCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC(SEQ ID NO.14)
CGGAGATCATAATACCGCCCACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTC(SEQ ID NO.15)
反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃90s,共30个循环;72℃5min,反应体系为:2×Phanta max master mix 10μL,上游引物1μL,下游引物1μL,sgRNA0.5μL,ddH2O7.5μL。PCR结束后,对产物进行消化(37℃、2h),消化体系为:PCR产物16μL,DpnI 2μL,10×Q.Cut Buffer 2μL。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基,于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测,获得构建成功的突变SgRNA质粒。
(3)构建Donor DNA。选取待敲除基因PtsG两端序列作为基因敲除上下同源臂(不少于500bp,中间剩余的部分即为待敲除的基因),先合成上下游同源臂,核苷酸编码序列如SEQ ID NO.16、17所示。合成上下游同源臂所用引物序列如SEQ ID NO.18~21所示。
基因敲除上游同源臂,序列如SEQ ID NO.16所示:
TGCGGAGCAACTGCGCGATGCTGCGCGTTATGTCCCCCTGGATCGGTTACTGGTGGAAACTGACTCACCTTACCTTGCGCCGGTACCGCATCGAGGAAAAGAGAATCAACCTGCGATGGTTCGTGACGTTGCAGAATACATGGCTGTGTTGAAAGGTGTTGCCGTTGAAGAACTGGCGCAGGTAACCACCGATAACTTCGCCCGTCTGTTTCACATCGACGCTTCCCGCCTTCAATCCATCCGTTGAATGAGTTTTTTTAAAGCTCGTAATTAATGGCTAAAACGAGTAAAGTTCACCGCCGAAAATTGGGCGGTGAATAACCACGTTTGAAATATTGTGACATATGTTTTGTCAAAATGTGCAACTTCTCCAATGATCTGAAGTTGAAACGTGATAGCCGTCAAACAAATTGGCACTGAATTATTTTACTCTGTGTAATAAATAAAGGGCGCTTAGATGCCCTGTACACGGCGAGGCTCTCCCCCCTTGCCACGCGTGAGAACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTGATGCTGCCGGTATCCGTACTGCC
基因敲除下游同源臂,序列如SEQ ID NO.17所示:
AAACCGAGATGGATGAGTACATCCGTAACCACTAATCCGTAAGACGTTGGGGAGACTAAGGCAGCCAGATGGCTGCCTTTTTTACAGGTGTTATTCAGAATTGATACGTGCCGGTAATGCTGAAATTACGCGGTGTGCCGTAGACGATAGAACCTTCCACGTTGGTATCGTAGGTTTTGTCGAACAGGTTATTGACGTTCCCCTGTAACGAGAAGTTTTTCGTCACCTGGTAGCGGGTGAAGAGATCCACCAGCGCGTAGCTACCTTGCTCGGCGCGGAAGGTGCCATACGGCGTCACGGTGTCGGTATACACGCGATTTTGCCAGTTAACACCACCGCCGACCGTCAACTCTGGCATGACAGGCAACCGATAGCTGGTGAACATTTTAACCGTGGTGCGTGGCAGATTAGGATTAACGGCGTTTCCTTCGTTATCCTCTGCAATATAGCGCGTTGCGCCAAATGTCAGCTGCCAGTTGTCGGTAATTGCGCCGTTGAGTTCAAATTCCACCCCTTTACTGACTGTCCCATCCACCGCTTTATAGGCGGTTTCGCCGTTGCTGCCGGGGATAGGTGTACCGGTGGACTGAGCGACATTA
合成上下游同源臂所用引物序列:
上游同源臂引物:
TGCGGAGCAACTGCGC(SEQ ID NO.18)
CATCTCGGTTTGGCAGTACGGATACCGGCA(SEQ ID NO.19)
下游同源臂引物:
TCCGTACTGCCAAACCGAGATGGATGAGTACATCCG(SEQ ID NO.20)
TAATGTCGCTCAGTCCACCGG(SEQ ID NO.21)
PCR反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃45s,共30个循环;72℃5min,PCR反应体系为(50μL):2×Phanta max master mix 25μL,上游引物2μL,下游引物2μL,扩增模板2μL,ddH2O 19μL。核酸胶验证为目的条带后通过胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)回收基因敲除上、下游同源臂基因片段,然后利用重叠PCR将上下同源臂重叠拼接即为Donor DNA。反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测产物,并用试剂盒回收目的DNA片段。其中,重叠PCR反应条件为:95℃3min,95℃15s,55℃15s,72℃60s,共30个循环;72℃5min,重叠PCR反应体系为:2×Phanta max master mix 25μL,上同源臂2μL,下同源臂2μL,引物(SEQ ID NO.18、21)各2μL,ddH2O 17μL。
(4)PtsG基因敲除。取一管步骤(1)制备的含有Cas9质粒目的菌株KA30的感受态细胞,置于冰上融化;取10~15μL质粒(Donor DNA:SgRNA=5:1,SgRNA=100ng/μL)加至上述感受态细胞中,轻轻混匀,置于冰上1min;将上述样品放到预冷的2mm电转杯中,置于冰上5min;将电转仪电压设定为2500V,电击5~6ms,迅速加入1ml LB培养基,在30℃、200rpm条件下培养2h后,涂布至含25μg/ml Kan和40μg/ml SmR抗性的固体LB培养基并于30℃过夜培养。
(5)敲除验证。从平板上挑取单菌落,进行菌落PCR验证,验证上下引物序列如SEQID NO.22、23所示。
上游引物:AGTGACGGATTGCGGTGG(SEQ ID NO.22)
下游引物:GCTACGCGCTGGTGGAT(SEQ ID NO.23)
显示PtsG基因敲除成功,出现大小正确的条带,再将阳性菌株送测。
(6)敲除质粒的脱除。将测序正确的菌株于LB固体培养基连续传代培养直至其无法在有KanR以及SmR抗性的固体LB培养基上生长则敲除质粒脱除成功,最终获得敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG。
4、重组大肠杆菌的构建
将重组质粒pCDFtrc-cadA和pTRC99a-xylA-xylB通过电穿孔法转化入表达宿主敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG中。具体步骤如下:将步骤1构建的重组质粒pCDFtrc-cadA(2μL)、步骤2构建的重组质粒pTRC99a-xylA-xylB(2μL)与步骤3中敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG的感受态细胞(50μL)混合并置于冰上2min。将上述样品放到预冷的2mm电转杯中,置于冰上5min;将电转仪电压设定为2500V,电击5~6ms,迅速加入1ml LB培养基,在37℃、200rpm条件下培养2h后,离心机4000rpm离心4min后吸去上清(800μL),将菌泥重悬后涂布至氨苄、链霉双抗LB平板。置于37℃的培养箱中培养36h,得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
实施例2重组大肠杆菌共利用五碳糖和六碳糖一步发酵生产1,5-戊二胺
挑取实施例1中构建的重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA的阳性菌落,接入5mL种子培养基(配方:硫酸铵10g/L、谷氨酸钠5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、蔗糖5g/L、七水合硫酸镁1g/L、一水合硫酸锰0.077g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、丙酮酸钠0.55g/L)中,37℃,200rpm培养至OD600至1~1.5时即为种子液。再按照3%体积比的接种量转接至发酵培养基中。控制初始OD600为0.05,37℃下发酵30~36h获得发酵产物,同时观察发酵对碳源的消耗情况。
其中,发酵培养基的碳源为葡萄糖和木糖的组合,其配方为:碳源22~23g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。以葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1与1:1为例,当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时,发酵培养基中葡萄糖浓度为16g/L、木糖浓度为6.7g/L;当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时,发酵培养基中葡萄糖浓度为12g/L、木糖浓度为10g/L。其中,碳源总碳摩尔浓度为0.053mol/L。
检测方法:葡萄糖检测方法为采用SBA生物传感分析仪,进样量:25μL。
木糖检测方法为DNS(3,5-二硝基水杨酸)还原法检测:取200μL DNS溶液与200μL超纯水混合,煮沸5min,冷却后加水定容至2mL,作为空白对照。取待测样品200μL与200μLDNS混合,煮沸5min,冷却后加水定容至2mL。以空白对照为参照,于540nm处测定吸光值,根据还原糖标准曲线计算还原糖浓度。木糖浓度即为还原糖总浓度减去葡萄糖浓度的差值。
1,5-戊二胺检测方法为高效液相色谱(HPLC),检测条件为:Agilgent1260Infinity System;示差检测器;色谱柱:YMC Carotenoid色谱柱,250×4.6mmL.D.-5μm(产品货号:CT99S05-2546WT);流动相成分:50mL乙腈+5mL三氟乙酸加水定容到1L;流速:0.6mL/min;进样量:10μL,柱温:35℃。
将实施例2的发酵产物按照上述方法进行检测,实验结果如图1-3所示。其中,葡萄糖与木糖的消耗情况如图1和图2所示,结果发现,该两种碳源比例下,重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA均可同步消耗葡萄糖与木糖,解决了葡萄糖碳分解代谢阻遏的问题。1,5-戊二胺产量如图3所示,从图3可以看出,本发明实现了直接以葡萄糖与木糖为混合碳源发酵生产1,5戊二胺,当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时,产量为4.49g/L产率为0.198g/g;当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时,产量为4.28g/L产率为0.195g/g。
本发明提供了一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用的思路及方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌,其特征在于,以大肠杆菌KA30为出发菌株,通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB,并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG,构建得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述的赖氨酸脱羧酶基因CadA来源于大肠杆菌MG1655,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述的木糖异构酶基因XylA来源于大肠杆菌MG1655,其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述的木酮糖激酶基因XylB来源于大肠杆菌MG1655,其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将赖氨酸脱羧酶基因CadA通过同源重组的方式,以NcoI和HindIII为酶切位点,克隆到表达载体pCDFtrc中,并验证,得到重组质粒pCDFtrc-cadA;
(2)将木糖异构酶基因XylA通过同源重组的方式,以EcoRI和BamHI为酶切位点,克隆到表达载体pTrc99a中,并验证,得到重组质粒pTrc99a-xylA;然后将木酮糖激酶基因XylB通过同源重组的方式,以BamHI为酶切位点,克隆到重组质粒pTrc99a-xylA中,并验证,得到重组质粒pTrc99a-xylA-xylB;
(3)敲除大肠杆菌KA30的葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG,获得表达宿主即敲除PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG;
(4)将步骤(1)获得的重组质粒pCDFtrc-cadA和步骤(2)获得的重组质粒pTrc99a-xylA-xylB共同转化至步骤(3)获得的大肠杆菌NT1003-△PtsG中,得到重组大肠杆菌,即1,5-戊二胺生产菌株NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的表达载体pCDFtrc为利用环化PCR将表达载体pCDFduet上的T7启动子更换为trc启动子,同时删除T7启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体;步骤(2)中,所述的表达载体pTrc99a为利用环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
5.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(Ⅰ)将活化后的重组大肠杆菌接种到种子培养基中进行种子培养,获得种子液;
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)将种子液直接接种于发酵培养基进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤(Ⅰ)中,所述的种子培养,其培养条件为:37℃,180~250rpm培养至OD600=1.5~2。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤(Ⅱ),所述的接种,其接种量为2~5%v/v;所述的发酵培养,其培养条件为:控制初始OD600=0.05~0.1,37℃下发酵30~36h。
9.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,步骤(Ⅱ),所述的发酵培养基,其碳源为葡萄糖和木糖的组合;其中,所述的葡萄糖和木糖,其碳摩尔量比例为1~2:1。
10.根据权利要求6或9所述的应用,其特征在于,步骤(Ⅱ),所述的发酵培养基,其配方为:碳源22~23g/L,硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa 100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。
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