CN117701483A - 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117701483A
CN117701483A CN202311721403.0A CN202311721403A CN117701483A CN 117701483 A CN117701483 A CN 117701483A CN 202311721403 A CN202311721403 A CN 202311721403A CN 117701483 A CN117701483 A CN 117701483A
Authority
CN
China
Prior art keywords
escherichia coli
gene
cada
glucose
xylose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311721403.0A
Other languages
English (en)
Inventor
陈可泉
韩烨
王昕�
冯佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Tech University filed Critical Nanjing Tech University
Priority to CN202311721403.0A priority Critical patent/CN117701483A/zh
Publication of CN117701483A publication Critical patent/CN117701483A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01017—Xylulokinase (2.7.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01018—Lysine decarboxylase (4.1.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5‑戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌KA30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，构建得到重组大肠杆菌NT1003‑△PtsG‑xylAB‑cadA。本发明以发酵培养基中葡萄糖与木糖碳摩尔量比2:1与1:1为例，该重组大肠杆菌与出发菌株相比，可实现对葡萄糖与木糖的同步消耗。以混合碳源为底物发酵36h，至少可生产4.2g/L的1,5‑戊二胺。现阶段，资源枯竭和环境污染问题日益严重，木质纤维素原料中含有大量的葡萄糖和木糖，该方法有利于木质纤维素生物炼制且具有一定经济效益，为能源紧缺提供了一条可持续发展道路。

Description

一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌 及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
1,5-戊二胺(简称戊二胺，Diaminopentane)，又被称为尸胺，是一种五碳二胺，可用作合成聚酰胺、聚氨酯或螯合剂的单体。作为重要的化学中间体，戊二胺在材料领域中可用作多种新型材料及高聚物的制备，在尼龙、涂料、粘合剂等方面具有广泛的应用前景。同时，由于戊二胺的生物特性，戊二胺在食品、农业及医药领域也有着重要的应用价值。
目前生物法生产戊二胺主要有两条途径：一种是酶法生产戊二胺，即用赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞来催化L赖氨酸生成戊二胺；另一种是选择合适的微生物，以葡萄糖为原料，直接发酵生产戊二胺。酶法生产戊二胺条件复杂，需要添加多种辅因子，而利用微生物直接发酵生产戊二胺成本低廉，有利于大规模生产。利用生物法转化可再生资源或废弃资源来生产戊二胺具有污染小、环境友好、可持续发展等优点。木质纤维素原料充足而廉价，如果能将之利用，不仅减少了农作物废物燃烧对大气的环境污染，也提高了农作物废弃物的经济价值，同时为能源紧缺提供一条可持续发展道路。
目前，微生物发酵生产戊二胺都以通过单一碳源为原料实现，葡萄糖与木糖的共利用技术还未发展全面。木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖。常见的木糖代谢途径主要是XR/XI/WBG以及Dahms四种。EMP作为基因工程菌株构建葡萄糖代谢模块的常用途径，常常与以上木糖代谢途径组合，构建木糖-葡萄糖共利用工程菌株。高效共利用木糖及葡萄糖的天然菌株较少，且其底物偏好性会影响共利用发酵性能，因此构建底物谱更广、混合糖利用率更高的木糖-葡萄糖共利用工程菌株，是实现以木质纤维素为原料产业化制备二元胺的必要条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，以解决葡萄糖分解代谢阻遏的问题，实现大肠杆菌对葡萄糖与木糖的同步利用发酵生产戊二胺，降低发酵成本，具有经济环保效益。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，以大肠杆菌KA30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，构建得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
其中，所述的出发菌株——大肠杆菌KA30即为分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株，菌株号：NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。该菌株的详细信息已公开在专利CN103361289B中。
其中，所述的赖氨酸脱羧酶基因CadA来源于大肠杆菌MG1655，其Gene ID：948643，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的木糖异构酶基因XylA来源于大肠杆菌MG1655，其Gene ID：948141，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的木酮糖激酶基因XylB来源于大肠杆菌MG1655，其Gene ID：948133，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将赖氨酸脱羧酶基因CadA通过同源重组的方式，以NcoI和HindIII为酶切位点，克隆到表达载体pCDFtrc中，并验证，得到重组质粒pCDFtrc-cadA；
(2)将木糖异构酶基因XylA通过同源重组的方式，以EcoRI和BamHI为酶切位点，克隆到表达载体pTrc99a中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA；然后将木酮糖激酶基因XylB通过同源重组的方式，以BamHI为酶切位点，克隆到重组质粒pTrc99a-xylA中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA-xylB；
(3)敲除大肠杆菌KA30的葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，获得表达宿主即敲除PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG；
(4)将步骤(1)获得的重组质粒pCDFtrc-cadA和步骤(2)获得的重组质粒pTrc99a-xylA-xylB共同转化至步骤(3)获得的大肠杆菌NT1003-△PtsG中，得到重组大肠杆菌，即1,5-戊二胺生产菌株NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
其中，步骤(1)中，所述的表达载体pCDFtrc为利用环化PCR将表达载体pCDFduet上的T7启动子更换为trc启动子，同时删除T7启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
其中，步骤(2)中，所述的表达载体pTrc99a为利用环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
其中，所述的步骤(3)具体操作为：将Cas9质粒导入目的菌株大肠杆菌KA30中，构建含有待敲除基因PtsG的N20序列的突变SgRNA质粒、取待敲除基因PtsG两端序列作为基因敲除上下同源臂构建Donor DNA。然后将突变SgRNA质粒、Donor DNA加至含有Cas9质粒的目的菌株大肠杆菌KA30感受态细胞中，利用CRISPR-Cas9基因编辑***敲除基因PtsG，选取阳性转化子进行PCR验证成功后，将阳性菌株送测，再将测序正确的菌株于LB固体培养基连续传代培养直至其无法在有KanR以及SmR抗性的固体LB培养基上生长，则敲除质粒脱除成功，最终获得敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG；
上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的应用，包括如下步骤：
(Ⅰ)将活化后的重组大肠杆菌接种到种子培养基中进行种子培养，获得种子液；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)将种子液直接接种于发酵培养基进行发酵培养。
其中，步骤(Ⅰ)中，所述的种子培养，其培养条件为：37℃，180～250rpm培养至OD600＝1.5～2，优选的其培养条件为：37℃，200rpm培养至OD600＝1.5。
其中，步骤(Ⅱ)，所述的接种，其接种量为2～5％v/v，优选的接种量为3％v/v；所述的发酵培养，其培养条件为：控制初始OD600＝0.05～1，37℃下发酵30～36h，优选的培养条件为：控制初始OD600＝0.05，37℃下发酵30～36h。
其中，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其碳源为葡萄糖和木糖的组合。
其中，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其配方为：碳源22～23g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa 100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。
具体的，所述的葡萄糖和木糖，其碳摩尔量比例为1～2:1，优选的比例为2:1或1:1。当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为16g/L、木糖浓度为6.7g/L；当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为12g/L、木糖浓度为10g/L。其中，碳源的总碳摩尔浓度为0.053mol/L。
有益效果：
(1)本发明解决了葡萄糖分解代谢阻遏的问题，实现了大肠杆菌对葡萄糖与木糖的同步利用。
(2)本发明以混合碳源为原料发酵生产1,5-戊二胺，无需添加诱导剂，降低了发酵成本具有环境效益。
(3)现阶段资源枯竭和环境污染问题日益严重，本发明以葡萄糖与木糖为碳源，而木质纤维素原料中含有大量的葡萄糖和木糖，该方法有利于木质纤维素生物炼制且具有一定经济效益，为能源紧缺提供了一条可持续发展道路。
(4)本发明直接以葡萄糖与木糖为混合碳源，至少可生产4.2g/L的1,5-戊二胺。
(5)本发明发酵反应过程较为温和，对环境、设备及操作人员均无害。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为重组大肠杆菌在葡萄糖与木糖碳摩尔量比例为2:1的培养基中对碳源的消耗情况。
图2为重组大肠杆菌在葡萄糖与木糖碳摩尔量比为例1:1的培养基中对碳源的消耗情况。
图3为碳代谢阻遏解除后的混糖发酵生产1,5-戊二胺的产量。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术。
下述实施例中，所述的大肠杆菌KA30即为分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株，菌株号：NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。该菌株的详细信息已公开在专利CN103361289B中。
实施例1：构建重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA
1、pCDFtrc-cadA重组质粒的构建
合成赖氨酸脱羧酶基因cadA，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA
所用上游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.2所示：
AGGAGATATACCATGATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGG
下游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.3所示：
ATGCGGCCGCAAGCTTTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAACGG
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃90s，共30个循环；72℃5min；反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL。其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组，可按照细菌基因组提取试剂盒的(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后通过胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)回收目的基因片段cadA。
通过环化PCR将载体pCDFduet上的T7启动子更换为大肠杆菌KA30可识别的trc启动子，同时删除操纵基因lacO，所用引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示：
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAAC TTTAATAAGGAGAT(SEQ ID NO.4)
CATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATTTCCTAATGCAGGAGTCGCA
(SEQ ID NO.5)
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃90s，共30个循环；72℃5min，反应体系为：2×Phanta max master mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，pCDFDuet 0.5μL，ddH2O 7.5μL。PCR结束后，对产物进行消化(37℃、2h)，消化体系为：PCR产物16μL，DpnI 2μL，10×Q.Cut Buffer 2μL。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测，获得改造载体pCDFtrc。
将改造载体pCDFtrc用Takara公司的NcoI和HindIII酶切，酶切反应体系为：10×Q.Cut Buffer 5μL，NcoI 2μL，HindIII 2μL，改造载体pCDFtrc 25μL，ddH2O 11μL，反应条件为：37℃，1h。随后将酶切后的改造载体与目的片段cadA进行同源重组，同源重组反应体系为(20μL)：5×CE II Bufer 4μL，Exnase 2μL，改造载体4μL，基因片段cadA10μL；反应条件为：37℃，30min。得到重组质粒pCDFtrc-cadA。然后再将连接产物转化至大肠杆菌E.coliTrans1-T1中。PCR筛选阳性菌株E.coli Trans1-T1-pCDFtrc-cadA并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。重组质粒的抗性为链霉，cadA的启动子为Trc，终止密码子为rrnB。
将阳性菌株E.coli Trans1-T1-pCDFtrc-cadA接种至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取重组质粒pCDFtrc-cadA。
2、pTRC99a-xylA-xylB重组质粒的构建
合成木糖异构酶基因xylA，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.6所示：
ATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTCGATCGCGTTCGTTATGAAGGCTCAAAATCCTCAAACCCGTTAGCATTCCGTCACTACAATCCCGACGAACTGGTGTTGGGTAAGCGTATGGAAGAGCACTTGCGTTTTGCCGCCTGCTACTGGCACACCTTCTGCTGGAACGGGGCGGATATGTTTGGTGTGGGGGCGTTTAATCGTCCGTGGCAGCAGCCTGGTGAGGCACTGGCGTTGGCGAAGCGTAAAGCAGATGTCGCATTTGAGTTTTTCCACAAGTTACATGTGCCATTTTATTGCTTCCACGATGTGGATGTTTCCCCTGAGGGCGCGTCGTTAAAAGAGTACATCAATAATTTTGCGCAAATGGTTGATGTCCTGGCAGGCAAGCAAGAAGAGAGCGGCGTGAAGCTGCTGTGGGGAACGGCCAACTGCTTTACAAACCCTCGCTACGGCGCGGGTGCGGCGACGAACCCAGATCCTGAAGTCTTCAGCTGGGCGGCAACGCAAGTTGTTACAGCGATGGAAGCAACCCATAAATTGGGCGGTGAAAACTATGTCCTGTGGGGCGGTCGTGAAGGTTACGAAACGCTGTTAAATACCGACTTGCGTCAGGAGCGTGAACAACTGGGCCGCTTTATGCAGATGGTGGTTGAGCATAAACATAAAATCGGTTTCCAGGGCACGTTGCTTATCGAACCGAAACCGCAAGAACCGACCAAACATCAATATGATTACGATGCCGCGACGGTCTATGGCTTCCTGAAACAGTTTGGTCTGGAAAAAGAGATTAAACTGAACATTGAAGCTAACCACGCGACGCTGGCAGGTCACTCTTTCCATCATGAAATAGCCACCGCCATTGCGCTTGGCCTGTTCGGTTCTGTCGACGCCAACCGTGGCGATGCGCAACTGGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCGAACAGTGTGGAAGAGAATGCGCTGGTGATGTATGAAATTCTCAAAGCAGGCGGTTTCACCACCGGTGGTCTGAACTTCGATGCCAAAGTACGTCGTCAAAGTACTGATAAATATGATCTGTTTTACGGTCATATCGGCGCGATGGATACGATGGCACTGGCGCTGAAAATTGCAGCGCGCATGATTGAAGATGGCGAGCTGGATAAACGCATCGCGCAGCGTTATTCCGGCTGGAATAGCGAATTGGGCCAGCAAATCCTGAAAGGCCAAATGTCACTGGCAGATTTAGCCAAATATGCTCAGGAACATCATTTGTCTCCGGTGCATCAGAGTGGTCGCCAGGAACAACTGGAAAATCTGGTAAACCATTATCTGTTCGACAAATAA
所用上游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.7所示：
GAAACAGACCATGGAATTCATGGAGTTCAATATGCAAGCCTATTTTGAC
下游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.8所示：
GGTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTGTCGAACAGATAATGGTTTACCAGATTT TCC
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃60s，共30个循环；72℃5min，反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL。其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组，可按照细菌基因组提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)的操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后按照胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明回收目的基因片段xylA。
通过环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO以获得改造载体，所用引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示：
CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTTCACACAGGAAACA(SEQ ID NO.9)
CCCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTCCACACATTATACGA(SEQ ID NO.10)
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃120s，共30个循环；72℃5min，反应体系为：2×Phanta max master mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，pTrc99a 0.5μL，ddH2O 7.5μL。PCR结束后，对产物进行消化(37℃、2h)，消化体系为：PCR产物16μl，DpnI 2μl，10×Q.Cut Buffer 2μl。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含50μg/ml Amp的5ml LB液体培养基，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测，获得改造载体。
将改造载体用Takara公司的EcoRI和BamHI酶切，酶切反应体系为：10×Q.CutBuffer5μL，EcoRI 2μL，BamHI 2μL，改造载体pTrc99a 25μL，ddH2O 16μL，反应条件为：37℃，1h。随后将酶切后的改造载体与目的片段xylA进行同源重组，同源重组反应体系为(20μL)：5×CE II Bufer 4μL，Exnase 2μL，改造载体4μL，基因片段xylA 10μL；反应条件为：37℃，30min，得到重组质粒pTrc99a-xylA。
合成木酮糖激酶基因xylB，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.11所示：
ATGTATATCGGGATAGATCTTGGCACCTCGGGCGTAAAAGTTATTTTGCTCAACGAGCAGGGTGAGGTGGTTGCTGCGCAAACGGAAAAGCTGACCGTTTCGCGCCCGCATCCACTCTGGTCGGAACAAGACCCGGAACAGTGGTGGCAGGCAACTGATCGCGCAATGAAAGCTCTGGGCGATCAGCATTCTCTGCAGGACGTTAAAGCATTGGGTATTGCCGGCCAGATGCACGGAGCAACCTTGCTGGATGCTCAGCAACGGGTGTTACGCCCTGCCATTTTGTGGAACGACGGGCGCTGTGCGCAAGAGTGCACTTTGCTGGAAGCGCGAGTTCCGCAATCGCGGGTGATTACCGGCAACCTGATGATGCCCGGATTTACTGCGCCTAAATTGCTATGGGTTCAGCGGCATGAGCCGGAGATATTCCGTCAAATCGACAAAGTATTATTACCGAAAGATTACTTGCGTCTGCGTATGACGGGGGAGTTTGCCAGCGATATGTCTGACGCAGCTGGCACCATGTGGCTGGATGTCGCAAAGCGTGACTGGAGTGACGTCATGCTGCAGGCTTGCGACTTATCTCGTGACCAGATGCCCGCATTATACGAAGGCAGCGAAATTACTGGTGCTTTGTTACCTGAAGTTGCGAAAGCGTGGGGTATGGCGACGGTGCCAGTTGTCGCAGGCGGTGGCGACAATGCAGCTGGTGCAGTTGGTGTGGGAATGGTTGATGCTAATCAGGCAATGTTATCGCTGGGGACGTCGGGGGTCTATTTTGCTGTCAGCGAAGGGTTCTTAAGCAAGCCAGAAAGCGCCGTACATAGCTTTTGCCATGCGCTACCGCAACGTTGGCATTTAATGTCTGTGATGCTGAGTGCAGCGTCGTGTCTGGATTGGGCCGCGAAATTAACCGGCCTGAGCAATGTCCCAGCTTTAATCGCTGCAGCTCAACAGGCTGATGAAAGTGCCGAGCCAGTTTGGTTTCTGCCTTATCTTTCCGGCGAGCGTACGCCACACAATAATCCCCAGGCGAAGGGGGTTTTCTTTGGTTTGACTCATCAACATGGCCCCAATGAACTGGCGCGAGCAGTGCTGGAAGGCGTGGGTTATGCGCTGGCAGATGGCATGGATGTCGTGCATGCCTGCGGTATTAAACCGCAAAGTGTTACGTTGATTGGGGGCGGGGCGCGTAGTGAGTACTGGCGTCAGATGCTGGCGGATATCAGCGGTCAGCAGCTCGATTACCGTACGGGGGGGGATGTGGGGCCAGCACTGGGCGCAGCAAGGCTGGCGCAGATCGCGGCGAATCCAGAGAAATCGCTCATTGAATTGTTGCCGCAACTACCGTTAGAACAGTCGCATCTACCAGATGCGCAGCGTTATGCCGCTTATCAGCCACGACGAGAAACGTTCCGTCGCCTCTATCAGCAACTTCTGCCATTAATGGCGTAA
所用上游引物带有RBS序列与同源臂，序列如SEQ ID NO.12所示：
CGACAAATAAGGATCTTCACACAGGAAACAGACCATTGGAATTATG
下游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.13所示：
CGACTCTAGAGGATCTTACGCCATTAA
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃60s，共30个循环；72℃5min，反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL，其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组，可按照细菌基因组提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后按照胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明回收目的基因片段xylB。
以重组质粒pTrc99a-xylA为载体，用Takara公司的BamHI单酶切，酶切反应体系为：10×Q.Cut Buffer 5μL，BamHI 2μL，质粒pTrc99a-xylA 25μL，ddH2O 18μL，反应条件为：37℃，1h。随后与目的片段xylB进行同源重组，同源重组反应体系为(20μL)：5×CE IIBufer 4μL，Exnase 2μL，质粒pTrc99a-xylA 4μL，基因片段xylB 10μL；反应条件为：37℃，30min，得到重组质粒pTRC99a-xylA-xylB。将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株E.coli Trans1-T1-pTRC99a-xylA-xylB并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。重组质粒的抗性为氨苄，xylA、xylB的启动子为Trc，终止密码子为rrnB。
将阳性菌株E.coli Trans1-T1-pTRC99a-xylA-xylB接种至含50μg/ml Amp的5mlLB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取重组质粒pTRC99a-xylA-xylB。
3、PtsG基因的敲除
(1)制备含有Cas9质粒目的菌株的感受态。将Cas9质粒通过化学法导入到目的菌株KA30中，并涂布在含25μg/ml Kan的LB固体培养基上。挑取单菌落富集后接种于5mL含25μg/ml Kan的LB液体培养基，30℃，200rpm培养18h后，按5％v/v接种量接种于50mL含25μg/mlKan的LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600约为0.2后，加入终浓度为30mM/L L-***糖(115℃，15min高温灭菌)，继续培养至OD600至0.4～0.6后，将培养液转移至50ml离心管中，冰上预冷20min。4℃下4000rpm离心10min，收集细胞；弃上清，用40ml预冷的无菌水重悬细胞；重复上述步骤；弃上清，用20ml预冷的10％(v/v)甘油重悬细胞；4℃下4000rpm离心10min；弃上清，用初始菌液体积的3‰预冷10％(v/v)甘油重悬，以每管50μl分装于预冷的1.5ml离心管中，-80℃保存。
(2)构建突变SgRNA质粒。找出待敲除基因PtsG的N20序列，合成含有N20序列的引物，对SgRNA(购买于淼灵生物公司)进行环化PCR，所用引物序列如SEQ ID NO.14、15所示。
GGGCGGTATTATGATCTCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC(SEQ ID NO.14)
CGGAGATCATAATACCGCCCACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTC(SEQ ID NO.15)
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃90s，共30个循环；72℃5min，反应体系为：2×Phanta max master mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，sgRNA0.5μL，ddH2O7.5μL。PCR结束后，对产物进行消化(37℃、2h)，消化体系为：PCR产物16μL，DpnI 2μL，10×Q.Cut Buffer 2μL。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测，获得构建成功的突变SgRNA质粒。
(3)构建Donor DNA。选取待敲除基因PtsG两端序列作为基因敲除上下同源臂(不少于500bp，中间剩余的部分即为待敲除的基因)，先合成上下游同源臂，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.16、17所示。合成上下游同源臂所用引物序列如SEQ ID NO.18～21所示。
基因敲除上游同源臂，序列如SEQ ID NO.16所示：
TGCGGAGCAACTGCGCGATGCTGCGCGTTATGTCCCCCTGGATCGGTTACTGGTGGAAACTGACTCACCTTACCTTGCGCCGGTACCGCATCGAGGAAAAGAGAATCAACCTGCGATGGTTCGTGACGTTGCAGAATACATGGCTGTGTTGAAAGGTGTTGCCGTTGAAGAACTGGCGCAGGTAACCACCGATAACTTCGCCCGTCTGTTTCACATCGACGCTTCCCGCCTTCAATCCATCCGTTGAATGAGTTTTTTTAAAGCTCGTAATTAATGGCTAAAACGAGTAAAGTTCACCGCCGAAAATTGGGCGGTGAATAACCACGTTTGAAATATTGTGACATATGTTTTGTCAAAATGTGCAACTTCTCCAATGATCTGAAGTTGAAACGTGATAGCCGTCAAACAAATTGGCACTGAATTATTTTACTCTGTGTAATAAATAAAGGGCGCTTAGATGCCCTGTACACGGCGAGGCTCTCCCCCCTTGCCACGCGTGAGAACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTGATGCTGCCGGTATCCGTACTGCC
基因敲除下游同源臂，序列如SEQ ID NO.17所示：
AAACCGAGATGGATGAGTACATCCGTAACCACTAATCCGTAAGACGTTGGGGAGACTAAGGCAGCCAGATGGCTGCCTTTTTTACAGGTGTTATTCAGAATTGATACGTGCCGGTAATGCTGAAATTACGCGGTGTGCCGTAGACGATAGAACCTTCCACGTTGGTATCGTAGGTTTTGTCGAACAGGTTATTGACGTTCCCCTGTAACGAGAAGTTTTTCGTCACCTGGTAGCGGGTGAAGAGATCCACCAGCGCGTAGCTACCTTGCTCGGCGCGGAAGGTGCCATACGGCGTCACGGTGTCGGTATACACGCGATTTTGCCAGTTAACACCACCGCCGACCGTCAACTCTGGCATGACAGGCAACCGATAGCTGGTGAACATTTTAACCGTGGTGCGTGGCAGATTAGGATTAACGGCGTTTCCTTCGTTATCCTCTGCAATATAGCGCGTTGCGCCAAATGTCAGCTGCCAGTTGTCGGTAATTGCGCCGTTGAGTTCAAATTCCACCCCTTTACTGACTGTCCCATCCACCGCTTTATAGGCGGTTTCGCCGTTGCTGCCGGGGATAGGTGTACCGGTGGACTGAGCGACATTA
合成上下游同源臂所用引物序列：
上游同源臂引物：
TGCGGAGCAACTGCGC(SEQ ID NO.18)
CATCTCGGTTTGGCAGTACGGATACCGGCA(SEQ ID NO.19)
下游同源臂引物：
TCCGTACTGCCAAACCGAGATGGATGAGTACATCCG(SEQ ID NO.20)
TAATGTCGCTCAGTCCACCGG(SEQ ID NO.21)
PCR反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃45s，共30个循环；72℃5min，PCR反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL。核酸胶验证为目的条带后通过胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)回收基因敲除上、下游同源臂基因片段，然后利用重叠PCR将上下同源臂重叠拼接即为Donor DNA。反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测产物，并用试剂盒回收目的DNA片段。其中，重叠PCR反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃60s，共30个循环；72℃5min，重叠PCR反应体系为：2×Phanta max master mix 25μL，上同源臂2μL，下同源臂2μL，引物(SEQ ID NO.18、21)各2μL，ddH2O 17μL。
(4)PtsG基因敲除。取一管步骤(1)制备的含有Cas9质粒目的菌株KA30的感受态细胞，置于冰上融化；取10～15μL质粒(Donor DNA：SgRNA＝5:1，SgRNA＝100ng/μL)加至上述感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上1min；将上述样品放到预冷的2mm电转杯中，置于冰上5min；将电转仪电压设定为2500V，电击5～6ms，迅速加入1ml LB培养基，在30℃、200rpm条件下培养2h后，涂布至含25μg/ml Kan和40μg/ml SmR抗性的固体LB培养基并于30℃过夜培养。
(5)敲除验证。从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR验证，验证上下引物序列如SEQID NO.22、23所示。
上游引物：AGTGACGGATTGCGGTGG(SEQ ID NO.22)
下游引物：GCTACGCGCTGGTGGAT(SEQ ID NO.23)
显示PtsG基因敲除成功，出现大小正确的条带，再将阳性菌株送测。
(6)敲除质粒的脱除。将测序正确的菌株于LB固体培养基连续传代培养直至其无法在有KanR以及SmR抗性的固体LB培养基上生长则敲除质粒脱除成功，最终获得敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG。
4、重组大肠杆菌的构建
将重组质粒pCDFtrc-cadA和pTRC99a-xylA-xylB通过电穿孔法转化入表达宿主敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG中。具体步骤如下：将步骤1构建的重组质粒pCDFtrc-cadA(2μL)、步骤2构建的重组质粒pTRC99a-xylA-xylB(2μL)与步骤3中敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG的感受态细胞(50μL)混合并置于冰上2min。将上述样品放到预冷的2mm电转杯中，置于冰上5min；将电转仪电压设定为2500V，电击5～6ms，迅速加入1ml LB培养基，在37℃、200rpm条件下培养2h后，离心机4000rpm离心4min后吸去上清(800μL)，将菌泥重悬后涂布至氨苄、链霉双抗LB平板。置于37℃的培养箱中培养36h，得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
实施例2重组大肠杆菌共利用五碳糖和六碳糖一步发酵生产1,5-戊二胺
挑取实施例1中构建的重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA的阳性菌落，接入5mL种子培养基(配方：硫酸铵10g/L、谷氨酸钠5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、蔗糖5g/L、七水合硫酸镁1g/L、一水合硫酸锰0.077g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、丙酮酸钠0.55g/L)中，37℃，200rpm培养至OD600至1～1.5时即为种子液。再按照3％体积比的接种量转接至发酵培养基中。控制初始OD600为0.05，37℃下发酵30～36h获得发酵产物，同时观察发酵对碳源的消耗情况。
其中，发酵培养基的碳源为葡萄糖和木糖的组合，其配方为：碳源22～23g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。以葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1与1:1为例，当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为16g/L、木糖浓度为6.7g/L；当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为12g/L、木糖浓度为10g/L。其中，碳源总碳摩尔浓度为0.053mol/L。
检测方法：葡萄糖检测方法为采用SBA生物传感分析仪，进样量：25μL。
木糖检测方法为DNS(3,5-二硝基水杨酸)还原法检测：取200μL DNS溶液与200μL超纯水混合，煮沸5min，冷却后加水定容至2mL，作为空白对照。取待测样品200μL与200μLDNS混合，煮沸5min，冷却后加水定容至2mL。以空白对照为参照，于540nm处测定吸光值，根据还原糖标准曲线计算还原糖浓度。木糖浓度即为还原糖总浓度减去葡萄糖浓度的差值。
1,5-戊二胺检测方法为高效液相色谱(HPLC)，检测条件为：Agilgent1260Infinity System；示差检测器；色谱柱：YMC Carotenoid色谱柱，250×4.6mmL.D.-5μm(产品货号：CT99S05-2546WT)；流动相成分：50mL乙腈+5mL三氟乙酸加水定容到1L；流速：0.6mL/min；进样量：10μL，柱温：35℃。
将实施例2的发酵产物按照上述方法进行检测，实验结果如图1-3所示。其中，葡萄糖与木糖的消耗情况如图1和图2所示，结果发现，该两种碳源比例下，重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA均可同步消耗葡萄糖与木糖，解决了葡萄糖碳分解代谢阻遏的问题。1,5-戊二胺产量如图3所示，从图3可以看出，本发明实现了直接以葡萄糖与木糖为混合碳源发酵生产1,5戊二胺，当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时，产量为4.49g/L产率为0.198g/g；当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时，产量为4.28g/L产率为0.195g/g。
本发明提供了一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌KA30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，构建得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的赖氨酸脱羧酶基因CadA来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的木糖异构酶基因XylA来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的木酮糖激酶基因XylB来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将赖氨酸脱羧酶基因CadA通过同源重组的方式，以NcoI和HindIII为酶切位点，克隆到表达载体pCDFtrc中，并验证，得到重组质粒pCDFtrc-cadA；
(2)将木糖异构酶基因XylA通过同源重组的方式，以EcoRI和BamHI为酶切位点，克隆到表达载体pTrc99a中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA；然后将木酮糖激酶基因XylB通过同源重组的方式，以BamHI为酶切位点，克隆到重组质粒pTrc99a-xylA中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA-xylB；
(3)敲除大肠杆菌KA30的葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，获得表达宿主即敲除PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG；
(4)将步骤(1)获得的重组质粒pCDFtrc-cadA和步骤(2)获得的重组质粒pTrc99a-xylA-xylB共同转化至步骤(3)获得的大肠杆菌NT1003-△PtsG中，得到重组大肠杆菌，即1,5-戊二胺生产菌株NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的表达载体pCDFtrc为利用环化PCR将表达载体pCDFduet上的T7启动子更换为trc启动子，同时删除T7启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体；步骤(2)中，所述的表达载体pTrc99a为利用环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
5.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(Ⅰ)将活化后的重组大肠杆菌接种到种子培养基中进行种子培养，获得种子液；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)将种子液直接接种于发酵培养基进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，所述的种子培养，其培养条件为：37℃，180～250rpm培养至OD600＝1.5～2。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的接种，其接种量为2～5％v/v；所述的发酵培养，其培养条件为：控制初始OD600＝0.05～0.1，37℃下发酵30～36h。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其碳源为葡萄糖和木糖的组合；其中，所述的葡萄糖和木糖，其碳摩尔量比例为1～2:1。
10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其配方为：碳源22～23g/L，硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa 100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。
CN202311721403.0A 2023-12-14 2023-12-14 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 Pending CN117701483A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311721403.0A CN117701483A (zh) 2023-12-14 2023-12-14 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311721403.0A CN117701483A (zh) 2023-12-14 2023-12-14 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117701483A true CN117701483A (zh) 2024-03-15

Family

ID=90143802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311721403.0A Pending CN117701483A (zh) 2023-12-14 2023-12-14 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117701483A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100392075C (zh) 谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与应用
CN111690586A (zh) 一种加强胞内丙酰辅酶a代谢提高甾药前体生产的方法
CN108504616B (zh) 一种高效发酵蔗糖的重组拜氏梭菌以及提高拜氏梭菌蔗糖发酵性能的方法
CN114107356B (zh) 一种改造恶臭假单胞菌使其同化d-半乳糖的方法
CN115725484A (zh) 合成d-阿洛酮糖的酶突变表达工程菌及应用
CN117701483A (zh) 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN111172143B (zh) D-木糖酸脱水酶及其应用
CN111826372B (zh) 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用
CN110591997A (zh) 一种提高木糖酸脱水酶活性的基因工程菌及其构建方法与应用
CN115851563B (zh) 固定二氧化碳电合成3-羟基丁酸的工程菌及构建方法
CN107815461A (zh) 瘤胃真菌木糖异构酶基因及其应用
CN117187206B (zh) 肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用
CN114015634B (zh) 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN116716321B (zh) Hmx1及其编码基因在提高酿酒酵母木糖发酵性能和乙酸耐受性上的应用
CN116814514B (zh) 提高大肠杆菌l-赖氨酸发酵产量的方法
CN110343653B (zh) 一种敲除大肠杆菌醛脱氢酶基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法
CN114456964B (zh) 一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆甾醇的发酵培养基及应用
CN117802139A (zh) 构建高效利用甲酸的重组需钠弧菌的方法
CN107338263B (zh) 一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法
CN118048378A (zh) 一种合成β-胡萝卜素的工程菌及其构建方法和应用
CN117025497A (zh) 催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌及其应用
CN117343922A (zh) 用于提高d-阿洛酮糖-3-差向异构酶分泌表达的信号肽和突变型rbs
CN118325929A (zh) 一种利用甘露糖生产岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其应用
CN101633691B (zh) 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用
CN117625665A (zh) 一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产l-赖氨酸工程菌的方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination