CN117701409A - 一种耐酸酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐酸酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用。该耐酸酿酒酵母工程菌株是对酿酒酵母出发菌株进行以下操作后得到：过表达SSK2基因、敲除NUP145基因和敲除KTR6基因中的至少一种操作。本发明提供的耐酸酿酒酵母工程菌株能在pH 3.0以下的酸性环境中有效地进行发酵，这将提升菌株低pH的发酵性能、简化处理流程，有效降低成本。这些酵母工程菌在低pH酸性环境中的发酵生产潜力巨大，在工业应用中有着较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐酸酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术
丁二酸，因最初在琥珀中被发现，故又称琥珀酸(Succinic acid，SA)。它是一种四碳二羧酸，是三羧酸循环的中间代谢产物，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。其分子式为C4H6O4，分子量为118.09。琥珀酸在医药、农业、食品等行业中有着广泛应用，特别是作为表面活性剂、增稠剂、电镀离子螯合剂、食品酸化剂及医药关键原料。更为关键的是，作为一种平台化学品，生物基琥珀酸在可持续生物化工中具有重要地位。它是合成1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯和四氢呋喃等重要化学品的基础。目前，琥珀酸的合成方式有化学合成和生物合成。尽管化学合成的琥珀酸在市场上占据了主导地位，但生物基琥珀酸正展现出快速增长的趋势。这种增长部分原因是由于传统石油基生产成本在攀升；而全球对气候及环境问题的关注加深，也促使社会和产业界寻求更优方案。其中，利用细胞工厂进行生物基琥珀酸生产，从而对传统石化琥珀酸进行补充或替代，便是一种可持续发展的方式。
酿酒酵母可用于琥珀酸的生物合成。但在酵母合成琥珀酸时，琥珀酸的持续生成和排放至胞外会导致培养基的pH降低，给细胞带来酸胁迫压力，影响其性能。因此，挖掘关键基因靶点，采用基因工程手段，对酿酒酵母进行代谢改造，增强其对低pH环境的耐受能力，有助于其在发酵合成琥珀酸等酸类物质的应用。从而避免使用中和剂和在发酵结束后加酸回收产品，对降低生产成本、提高经济效益具有重要意义。
发明内容
在本研究中，我们旨在构建一种能够耐受低pH的酿酒酵母菌株，在酸性环境下发酵时(例如生产琥珀酸)，无需添加中和剂调节pH，简化生产流程，降低成本并提高整体生产效率。为此，我们深入研究了酿酒酵母的酸耐受机制，确定SSK2、NUP145和KTR6三个基因为关键基因。经过对这三个基因进行过表达或敲除，成功增强了酿酒酵母对低pH环境(高浓度琥珀酸)的耐受性。这一发现为琥珀酸生产提供了优化策略。具体而言，通过在酿酒酵母染色体上过表达SSK2基因，或敲除NUP145和KTR6两个基因，成功地提升了酵母耐受高浓度琥珀酸带来的低pH(pH<3.0)酸性胁迫，为酵母生产琥珀酸创造了更大的应用潜力。
本发明的首要目的在于提供一种耐酸酿酒酵母工程菌株。
本发明的另一目的在于提供上述耐酸酿酒酵母工程菌株的构建方法。
本发明的再一目的在于提供上述耐酸酿酒酵母工程菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种耐酸酿酒酵母工程菌株，是对酿酒酵母出发菌株进行以下操作后得到：过表达SSK2基因、敲除NUP145基因和敲除KTR6基因中的至少一种操作。
所述的酿酒酵母出发菌株优选为具有CEN.PK背景的菌株，该菌株是常用的酵母菌株，在工业界和学术界的代谢工程和***生物学研究广泛应用(Microb Cell Fact,2012,11,36)，代表性及普适性较好；更优选为酿酒酵母IMX581。
所述的操作优选为过表达SSK2基因、敲除NUP145基因、敲除KTR6基因或敲除NUP145基因和KTR6基因。
所述的基因过表达优选通过同源重组的方法进行染色体整合过表达基因。
所述的敲除优选通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术进行无痕敲除。
所述的酸包括但不限于琥珀酸。
所述的耐酸指的是可以耐受pH＜3的环境；更优选可以耐受pH＝2.65的环境。
上述耐酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，优选包括如下步骤：
(1)构建pROS10-X3敲除质粒，以及扩增获取带有pGPD启动子的SSK2修复片段；
(2)构建pROS10-NUP145敲除质粒，以及扩增获得NUP145修复片段；
(3)构建pROS10-KTR6敲除质粒，以及扩增获得KTR6修复片段；
(4)构建pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒，以及扩增获得NUP145修复片段和KTR6修复片段；
(5)将步骤(1)得到的pROS10-X3敲除质粒以及带有pGPD启动子的SSK2修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S1；
(6)将步骤(2)得到的pROS10-NUP145敲除质粒以及NUP145修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S2；
(7)将步骤(3)得到的pROS10-KTR6敲除质粒以及KTR6修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S3；
(8)将步骤(4)得到的pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒以及NUP145和KTR6修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S4。
步骤(1)中所述的pROS10-X3敲除质粒优选通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/X3-N20扩增得到带有20bp靶X3的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有20bp靶X3的gRNA和带有筛选标记URA3的质粒框架拼接起来，得到pROS10-X3敲除质粒。
步骤(1)中所述的带有pGPD启动子的SSK2修复片段优选通过如下步骤得到：将核酸序列如SEQ ID No.1所示的SSK2基因片段和带有pGPD启动子的质粒框架拼接起来，得到质粒p416-GPD-SSK2；再以质粒p416-GPD-SSK2为模板，由OE-SSK2-F/OE-SSK2-R扩增得到带有pGPD启动子的SSK2修复片段；其中，带有pGPD启动子的质粒框架是通过使用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ酶切质粒p416GPD得到。
步骤(2)中所述的pROS10-NUP145敲除质粒优选通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/NUP145-N20扩增得到带有20bp靶向NUP145的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有筛选标记URA3的质粒框架和带有20bp靶向NUP145的gRNA拼接起来，得到pROS10-NUP145敲除质粒。
步骤(2)中所述的扩增获得NUP145修复片段优选通过如下步骤得到：通过引物对NUP145-RF-F/NUP145-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到NUP145修复片段。
步骤(3)中所述的pROS10-KTR6敲除质粒优选通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/KTR6-N20扩增得到带有20bp靶向KTR6的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有筛选标记URA3的质粒框架和带有20bp靶向KTR6的gRNA拼接起来，得到pROS10-KTR6敲除质粒。
步骤(3)中所述的KTR6修复片段优选通过如下步骤得到：通过引物对KTR6-RF-F/KTR6-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到KTR6修复片段。
步骤(4)中所述的pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒优选通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物pROS10DK-Frame扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/NUP145-N20扩增得到带有20bp靶向NUP145的gRNA，由引物对pROS10-Gibson/KTR6-N20扩增得到带有20bp靶向KTR6的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有筛选标记URA3的质粒框架和带有20bp靶向NUP145的gRNA、以及带有20bp靶向KTR6的gRNA拼接起来，得到pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒。
步骤(4)中所述的扩增获得NUP145修复片段优选通过如下步骤得到：通过引物对NUP145-RF-F/NUP145-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到NUP145修复片段。
步骤(4)中所述的KTR6修复片段优选通过如下步骤得到：通过引物对KTR6-RF-F/KTR6-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到KTR6修复片段。
步骤(5)、步骤(6)、步骤(7)和步骤(8)中所述的酿酒酵母出发菌株优选为具有CEN.PK背景的菌株；更优选为IMX581。
上述耐酸酿酒酵母工程菌株在低pH酸性环境中发酵生产中的应用。
所述的低pH酸性环境指的是pH＜3的环境；优选为低至pH2.65的环境。
所述的酸优选为琥珀酸。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明成功构建了能够耐受酸性胁迫(高浓度琥珀酸)的酵母工程菌，提升了菌株在pH值低于3.0的酸性环境中的生长能力。本发明聚焦与琥珀酸耐受性相关的三个关键靶点，通过过表达SSK2基因或敲除NUP145、KTR6基因的方式，突破了酿酒酵母在极酸性环境下的发酵限制。这一创新因菌株耐酸性得到提升，无需在发酵过程中添加中和剂维持pH，简化了生产流程，降低了生产成本。
这些酵母工程菌株可在酸性环境中生长发酵(如琥珀酸的发酵生产)，展现出较好的工业应用潜力。
附图说明
图1是实施例1涉及的质粒示意图；其中，(A)为携带URA3筛选标记的p416-GPD***过表达基因SSK2的质粒示意图；(B)为携带URA3筛选标记以及NUP145基因相应N20片段的pROS10单敲质粒示意图；(C)为携带URA3筛选标记以及KTR6基因相应N20片段的pROS10单敲质粒示意图；(D)为携带URA3筛选标记以及NUP145基因和KTR6基因相应N20片段的pROS10双敲质粒示意图。
图2是pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6中两个N20部位的测序结果示意图。
图3是p416-GPD使用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ酶切验证后琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA分子量marker。
图4是实施例1构建得到的质粒鉴定结果图；其中，(A)是菌株成功整合过表达SSK2基因的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；(B)是菌株成功单敲NUP145、KTR6基因的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；(C)是菌株IMX581成功同时敲除了NUP145和KTR6基因的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为DNA分子量marker。
图5是酵母工程菌株S1、S2、S3、S4在含高浓度琥珀酸培养基中培养的耐酸性能测试结果图；其中S0(即IMX581)作为对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，则通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2017)、《酵母遗传学方法实验指南》(北京：科学出版社，2016)中所述的条件进行。
下述实施例中应用到的CRISPR技术参见现有技术(FEMS Yeast Research，2015，15(2):fov004.)。此外，下列实施例中所使用的质粒p416GPD已在文献“Yeast vectors forthe controlled expression of heterologous proteins in different geneticbackgrounds.Gene 1995,156:119-122.”中公开；质粒pROS10和菌株IMX581已在文献“CRISPR/Cas9:a molecular Swiss army knife for simultaneous introduction ofmultiple genetic modifications in Saccharomyces cerevisiae.FEMS YeastResearch,2015,15,fov004”中公开，并可由EUROSCARF获取。
为更好地理解本发明的内容，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK背景菌株为出发菌株，具体以IMX581为具体实施例作进一步说明。
下列实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl；溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
含氨苄抗性的LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl；固体培养基添加2％琼脂粉，以上灭菌后冷却至40℃左右，加入100μg/mL氨苄青霉素(过滤除菌)。
YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖(注：单独灭菌后再加入)；溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
SC+30g/L SA培养基：0.77g/L CSM-Ura，1.7g/L YNB w/o aa and(NH4)2SO4，5.0g/L(NH4)2SO4，0.02g/L尿嘧啶(Uracil)，30g/L琥珀酸(SA)，20g/L葡萄糖(注：单独灭菌后再加入)；溶剂为去离子水。
SC-Ura营养缺陷培养基：0.77g/L CSM-Ura，1.7g/L YNB w/o aa and(NH4)2SO4，5.0g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖(注：单独灭菌后再加入)，调节pH值至5.5-6.0，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
5-FOA固体筛选培养基：0.77g/L CSM-Ura，1.7g/L YNB w/o aa and(NH4)2SO4，5.0g/L(NH4)2SO4，0.05g/L尿嘧啶(Uracil)，0.75g/L 5-FOA，20g/L葡萄糖(用22μm滤膜过滤除菌)，溶剂为去离子水；2％琼脂(注：单独灭菌后与上述液体加入)。
下述实施例中所涉及的方法如下：
1、质粒构建：
(1)通过PCR手段，扩增Gibson组装需要的相应片段与框架；
(2)Gibson组装方法，具体操作依照NEB Gibson Assembly Cloning kit(货号E2611，NEB)说明书操作；
(3)将5μL组装体系转化至50μL大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布至含氨苄抗性的LB固体培养基过夜培养；
(4)筛选获得阳性克隆，扩增培养后提取质粒，具体提取过程依照HiPure PlasmidMicro Kit(货号P1001-03，Magen)说明书操作。
2、酵母菌株转化：
如无特殊说明，均采用醋酸锂转化法，具体操作见相关标准规范。
3、工程酿酒酵母菌株OD600nm的检测方法：
接种酿酒酵母单菌落于3mL发酵培养基，置于30℃、200rpm摇床培养。取发酵液按适当比例稀释后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1：引物序列(5’-3’)
实施例1耐受高浓度琥珀酸酿酒酵母工程菌株的构建
1.1过表达SSK2以提高酿酒酵母对琥珀酸的耐受性能
过表达SSK2过程如下：
(1)构建质粒pROS10-X3
A、以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；
PCR反应体系：2×Master Mix 20μL、pROS10SK-K-F(10μM)1.6μL、pROS10SK-K-R(10μM)1.6μL、pROS10 0.4μL、ddH2O 16.4μL，总体积为40μL。
PCR反应条件：95℃3min；95℃15Sec、56℃15Sec、72℃3min，34个循环；72℃5min。
B、以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/X3-N20扩增得到带有20bp靶X3的gRNA；PCR反应体系基本同A，区别在于：使用此处引物；
PCR反应条件：95℃3min；95℃15Sec、56℃15Sec、72℃30Sec，34个循环；72℃5min。
C、利用Gibson组装技术，将以上的片段和带有筛选标记URA3的质粒框架拼接起来，构建所得质粒命名为pROS10-X3。
(2)构建质粒p416-GPD-SSK2及修复片段pGPD-SSK2
以质粒p416GPD为模板，使用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ酶切质粒，得到带有pGPD启动子的质粒框架，酶切电泳结果如图3所示；
以酵母菌株基因组为模板，由引物P416-SSK2-F/P416-SSK2-R扩增得到4804bp的SSK2基因片段；其中，SSK2的编码核酸序列见SEQ ID No.1；PCR反应体系基本同(1)，区别在于：使用此处引物以及模板酵母基因组为0.1μL，ddH2O为16.7μL；PCR反应条件同(1)A；
利用Gibson组装技术，将以上的片段和带有pGPD启动子的质粒框架拼接起来，构建所得质粒命名为p416-GPD-SSK2，其结构如图1中的(A)所示。
以构建所得质粒p416-GPD-SSK2为模板，由OE-SSK2-F/OE-SSK2-R扩增得到5747bp修复片段pGPD-SSK2。PCR反应体系基本同(1)，区别在于：使用此处引物以及模板；PCR反应条件同(1)A。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pROS10-X3连同修复片段pGPD-SSK2按摩尔比为1:1配比一并转化至菌株IMX581，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物X3-P1/GPD-P2和CYC1-P1/X3-P2对进行单菌落PCR验证(结果如图4中的(A)所示)，筛选得到阳性转化子，将阳性转化子划线至5-FOA固体培养基上脱质粒。
(4)挑选5-FOA固体培养基上得到的单克隆转板于SC-Ura和YPD固体培养基上验证其是否脱质粒成功于30℃培养2-3天。
(5)将YPD固体培养基上生长得到脱质粒的菌株命名为酿酒酵母S1。
1.2敲除NUP145以提高酿酒酵母的耐酸性能
NUP145基因敲除过程如下：
NUP145的编码核酸序列见SEQ ID No.2。
(1)构建质粒pROS10-N20-NUP145
以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；PCR反应体系同1.1(1)，PCR反应条件同1.1(1)A。
以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/NUP145-N20扩增得到带有20bp靶向NUP145的gRNA；PCR反应体系同1.1(1)，PCR反应条件同1.1(1)B。
利用Gibson组装技术，将以上的片段和带有筛选标记URA3的质粒框架拼接起来，构建所得质粒命名为pROS10-NUP145。
(2)PCR扩增NUP145修复片段
合成与NUP145上下游完全匹配的59bp引物对NUP145-RF-F/NUP145-RF-R，经PCR扩增、凝胶回收获得与NUP145上下游有50bp同源臂的靶向修复片段。
PCR反应体系：2×Master Mix 20μL、NUP145-RF-F(10μM)2μL、NUP145-RF-R(10μM)2μL、ddH2O 16μL，总体积40μL。
PCR反应条件：95℃3min；95℃15Sec、56℃15Sec、72℃15Sec，34个循环；72℃5min。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pROS10-NUP145连同修复片段按摩尔比为1:1一并转化至菌株IMX581，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物NUP145-VER-F/NUP145-VER-R对进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果如图4中的(B)所示)，将阳性转化子划线于5-FOA固体培养基于30℃培养2-3天。
(4)挑选5-FOA固体培养基上得到的单克隆转板于SC-Ura和YPD固体培养基上验证其是否脱质粒成功。
(5)将YPD固体培养基上生长得到脱质粒的菌株命名为酿酒酵母S2。
1.3敲除KTR6以提高酿酒酵母的耐酸性能
KTR6基因敲除过程如下：
KTR6的编码核酸序列见SEQ ID No.3。
(1)构建质粒pROS10-N20-KTR6
以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；PCR反应体系同1.1(1)，PCR反应条件同1.1(1)A。
以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/KTR6-N20扩增得到带有20bp靶向KTR6的gRNA；PCR反应体系同1.1(1)，PCR反应条件同1.1(1)B。
利用Gibson组装技术，将以上的片段和带有筛选标记URA3的质粒框架拼接起来，构建所得质粒命名为pROS10-KTR6。
(2)PCR扩增KTR6修复片段
合成与KTR6上下游完全匹配的59bp引物对KTR6-RF-F/KTR6-RF-R，经PCR扩增、凝胶回收获得与KTR6上下游有50bp同源臂的靶向修复片段。PCR反应体系同1.2(2)，PCR反应条件同1.2(2)。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pROS10-KTR6连同修复片段按摩尔比为1:1一并转化至菌株IMX581，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物KTR6-VER-F/KTR6-VER-R对进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果如图4中的(B)所示)，将阳性转化子划线于5-FOA固体培养基于30℃培养2-3天。
(4)挑选5-FOA固体培养基上得到的单克隆转板于SC-Ura和YPD固体培养基上验证其是否脱质粒成功。
(5)将YPD固体培养基上生长得到脱质粒的菌株命名为酿酒酵母S3。
1.4叠加敲除NUP145+KTR6以提高酿酒酵母的耐酸性能
NUP145+KTR6叠加敲除过程如下：
(1)构建质粒pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6
以质粒pROS10为模板，由引物pROS10DK-Frame(该引物作为上游引物和下游引物)扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；PCR反应体系同1.1(1)，PCR反应条件同1.1(1)A。
以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-2N20-1/NUP145-N20-1扩增得到带有20bp靶向NUP145的gRNA；PCR反应体系同1.1(1)；PCR反应条件基本同1.1(1)B，区别在于退火后延伸时间为72℃1min。
以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-2N20-2/KTR6-N20-2扩增得到带有20bp靶向KTR6的gRNA。PCR反应体系同1.1(1)；PCR反应条件基本同1.1(1)B，区别在于退火后延伸时间为72℃1min。
利用Gibson组装技术，将以上的片段和带有筛选标记URA3的质粒框架拼接起来，构建所得质粒命名为pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6的质粒，并对质粒进行测序得到的两个N20的测序结果如图2所示。
(2)PCR扩增NUP145和KTR6修复片段
合成与NUP145上下游完全匹配的59bp引物对NUP145-RF-F/NUP145-RF-R，经PCR扩增、凝胶回收获得与NUP145上下游有50bp同源臂的靶向修复片段；PCR反应体系同1.2(2)，PCR反应条件同1.2(2)。
合成与KTR6上下游完全匹配的59bp引物对KTR6-VF-F/KTR6-VF-R，经PCR扩增、凝胶回收获得与KTR6上下游有50bp同源臂的靶向修复片段。PCR反应体系同1.2(2)，PCR反应条件同1.2(2)。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6连同两个修复片段按摩尔比为2:1:1一并转化至菌株IMX581，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物对NUP145-VER-F/NUP145-VER-R和KTR6-VER-F/KTR6-VER-R对进行单菌落PCR验证(结果如图4中的(C)所示)，筛选得到阳性转化子，将阳性转化子划线于5-FOA固体培养基于30℃培养2-3天。
(4)挑选5-FOA固体培养基上得到的单克隆转板于SC-Ura和YPD固体培养基上验证其是否脱质粒成功。
(5)将YPD固体培养基上生长得到脱质粒的菌株命名为酿酒酵母S4。
实施例2工程菌株可耐受低pH酸性胁迫
(1)将上述酿酒酵母菌株IMX581、S1、S2、S3、S4从平板接种至3mL YPD发酵培养基，在30℃、200rpm条件下培养12h后，以OD600nm＝0.1接种到SC+30g/L SA的培养基中生长，其中IMX581是对照菌，在图中以S0为示。
(2)生长96h后菌液根据其浓度稀释不同的倍数后用紫外分光光度计测量OD600nm。
由结果可知(图5)，S1、S2、S3、S4具有较好的酸耐受性。在30g/L的琥珀酸SC培养基中(pH＝2.65)，S1、S2、S3、S4相比S0(IMX581)的酸耐受性(以菌体生长密度体现)分别提升54％、148％、300％、359％。这些工程化的酵母菌株为pH 3.0以下酸性环境中的琥珀酸发酵生产展现出巨大的工业应用潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种耐酸酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述的耐酸酿酒酵母工程菌株是对酿酒酵母出发菌株进行以下操作后得到：过表达SSK2基因、敲除NUP145基因和敲除KTR6基因中的至少一种操作。
2.根据权利要求1所述的耐酸酿酒酵母工程菌株，其特征在于：
所述的基因过表达为通过同源重组的方法进行染色体整合过表达基因；
所述的敲除是通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术进行无痕敲除；
所述的酸为琥珀酸。
3.根据权利要求1所述的耐酸酿酒酵母工程菌株，其特征在于：
所述的酿酒酵母出发菌株为具有CEN.PK背景的菌株；
所述的操作为过表达SSK2基因、敲除NUP145基因、敲除KTR6基因或敲除NUP145基因和KTR6基因；
所述的酸为琥珀酸。
4.权利要求1～3任一项所述的耐酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建pROS10-X3敲除质粒，以及扩增获取带有pGPD启动子的SSK2修复片段；
(2)构建pROS10-NUP145敲除质粒，以及扩增获得NUP145修复片段；
(3)构建pROS10-KTR6敲除质粒，以及扩增获得KTR6修复片段；
(4)构建pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒，以及扩增获得NUP145修复片段和KTR6修复片段；
(5)将步骤(1)得到的pROS10-X3敲除质粒以及带有pGPD启动子的SSK2修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S1；
(6)将步骤(2)得到的pROS10-NUP145敲除质粒以及NUP145修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S2；
(7)将pROS10-KTR6敲除质粒以及KTR6修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S3；
(8)将pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒以及NUP145和KTR6修复片段转化酿酒酵母出发菌株，构建得到菌株S4。
5.根据权利要求4所述的耐酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的pROS10-X3敲除质粒通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/X3-N20扩增得到带有20bp靶X3的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有20bp靶X3的gRNA和带有筛选标记URA3的质粒框架拼接起来，得到pROS10-X3敲除质粒；
步骤(1)中所述的带有pGPD启动子的SSK2修复片段通过如下步骤得到：将核酸序列如SEQ ID No.1所示的SSK2基因片段和带有pGPD启动子的质粒框架拼接起来，得到质粒p416-GPD-SSK2；再以质粒p416-GPD-SSK2为模板，由OE-SSK2-F/OE-SSK2-R扩增得到带有pGPD启动子的SSK2修复片段；其中，带有pGPD启动子的质粒框架是通过使用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ酶切质粒p416GPD得到；
步骤(2)中所述的pROS10-NUP145敲除质通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/NUP145-N20扩增得到带有20bp靶向NUP145的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有筛选标记URA3的质粒框架和带有20bp靶向NUP145的gRNA拼接起来，得到pROS10-NUP145敲除质粒；
步骤(2)中所述的扩增获得NUP145修复片段通过如下步骤得到：通过引物对NUP145-RF-F/NUP145-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到NUP145修复片段；
步骤(3)中所述的pROS10-KTR6敲除质粒通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10SK-K-F/pROS10SK-K-R扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/KTR6-N20扩增得到带有20bp靶向KTR6的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有筛选标记URA3的质粒框架和带有20bp靶向KTR6的gRNA拼接起来，得到pROS10-KTR6敲除质粒；
步骤(3)中所述的KTR6修复片段通过如下步骤得到：通过引物对KTR6-RF-F/KTR6-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到KTR6修复片段；
步骤(4)中所述的pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒通过如下步骤得到：以质粒pROS10为模板，由引物pROS10DK-Frame扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架；以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10-Gibson/NUP145-N20扩增得到带有20bp靶向NUP145的gRNA，由引物对pROS10-Gibson/KTR6-N20扩增得到带有20bp靶向KTR6的gRNA；利用Gibson组装技术，将带有筛选标记URA3的质粒框架和带有20bp靶向NUP145的gRNA、以及带有20bp靶向KTR6的gRNA拼接起来，得到pROS10-N20_1-NUP145-N20_2-KTR6双敲质粒；
步骤(4)中所述的扩增获得NUP145修复片段通过如下步骤得到：通过引物对NUP145-RF-F/NUP145-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到NUP145修复片段；
步骤(4)中所述的KTR6修复片段通过如下步骤得到：通过引物对KTR6-RF-F/KTR6-RF-R对自身退火得到的模板进行PCR扩增，得到KTR6修复片段。
6.权利要求1～3任一项所述的耐酸酿酒酵母工程菌株在低pH酸性环境中发酵生产中的应用。
7.根据权利要求6所述的耐酸酿酒酵母工程菌株在低pH酸性环境中发酵生产中的应用，其特征在于：
所述的低pH酸性环境指的是pH＜3的环境。
8.根据权利要求7所述的耐酸酿酒酵母工程菌株在低pH酸性环境中发酵生产中的应用，其特征在于：
所述的酸为琥珀酸。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202311589286.7A CN117701409A (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | 一种耐酸酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用 |
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| CN202311589286.7A CN117701409A (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | 一种耐酸酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用 |
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2023
- 2023-11-27 CN CN202311589286.7A patent/CN117701409A/zh active Pending
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