CN115838752A

CN115838752A - 一种基因改造里氏木霉工程菌株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115838752A
Application number: CN202211367938.8A
Authority: CN
Inventors: 相金悦; 荷迪朵兰
Original assignee: Shanghai Hanhe Biological New Material Technology Co ltd; Institute of Botany of CAS
Current assignee: Shanghai Hanhe Biological New Material Technology Co ltd; Institute of Botany of CAS
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明涉及一种基因改造里氏木霉工程菌株及其制备方法和应用，以产酶能力较强的里氏木霉RUT C30为出发菌株，通过CRISPR/Cas9***介导，对stp1基因进行了敲除，在微晶纤维素诱导条件下将酶活提升60％，在木质纤维素‑汽爆玉米秸秆的诱导条件下将酶活提升30％，为工业生产纤维素酶提供了优异的工程菌株。

Description

一种基因改造里氏木霉工程菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及微生物的遗传物质的改造，具体为真菌里氏木霉的基因工程改造。

背景技术

在气候变化和环境污染问题日益严重的今天，对环保新材料的市场需求变得愈加迫切。作为地球上储量最丰富的可再生生物质，木质纤维素材料如废弃农作物秸秆是生产绿色环保新材料的可靠原料来源。木质纤维素经过预处理及纤维素酶降解，可以进一步发酵生成小分子产物如乳酸，而这些小分子可以合成新材料产品，如可降解塑料聚乳酸。秸秆聚乳酸不仅能帮助我们摆脱对于石化资源的依赖，而且“变废为宝”，在不影响粮食安全的情况下，减少石化塑料产生的碳排放和环境污染。但是，木质纤维素材料的利用首先需要纤维素酶对其进行有效降解，而目前高成本的纤维素酶已经成为制约生物炼制生产新材料的一大障碍。

工业上常用来生产纤维素酶的菌株为里氏木霉，其纤维素酶基因的表达需要诱导物的存在才能够启动。在受到诱导的同时，里氏木霉产纤维素酶过程还受到碳代谢阻遏的影响。碳代谢阻遏是指在体系中葡萄糖浓度大于0.5％时，菌株不产生纤维素酶，当体系中的过量葡萄糖消耗完毕时，又重新在诱导物诱导下产生纤维素酶的现象。

发明内容

为克服现有技术存在的上述的缺陷，本申请的发明人基于Stp1是一种MFS超家族糖转运蛋白，可转运多种寡糖到细胞内，是造成碳代谢阻遏的重要转运因子_，提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种基因改造的里氏木霉的方法，所述的方法是敲除内源性基因stp1的表达。在一个具体的实施例中，所述的里氏木霉为RUT-C30；在另外一个具体的实施例中，所述的敲除内源性基因stp1的表达的方法包括但不限于同源重组、RNA干扰、基因编辑等；优选的，所述的基因编辑的工具包括但不限于ZFN、TALENs、CRISPR/Cas9；在另外一个具体的实施例中，所述的基因编辑采用的是CRISPR/Cas9***，其中sgRNA的序列为SEQ ID NO:1所示；优选的，所述的CRISPR/Cas9***是将Cas9表达框与sgRNA克隆进同一个表达质粒中转化宿主细胞；更优选的，所述的质粒还包括了启动子、抗性基因片段、终止子元件；在另外一个具体的实施例中，所述的方法中还包括检测基因改造的里氏木霉相关基因，其中所述的相关基因包括内源性的stp1，将stp1基因敲除成功作为候选的菌株进行酶活检测；优选的，所述的方法还包括使用RT-QPCR方法测定相关基因：cbh1、xyr1、sar1，最终获得滤纸酶活最高且酶基因表达量最高的工程菌株。

本发明的第二个方面是提供一种基因工程菌株，其特在于，所述的菌株是根据本发明的第一个方面所述的方法产生的基因工程菌。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的方法制备获得的菌株在发酵生产纤维素酶应用；在一个具体的实施例中，所述的发酵生产纤维素酶以微晶纤维素或汽爆玉米秸秆等木质纤维素作为诱导物进行诱导发酵，优选的，以培养基的总重量为基准，所述的诱导剂添加量为3％～5％，最优选的，诱导剂的添加量为4％；在另外一个具体的实施例中，所述的发酵为中试发酵，发酵罐容积为5L～20L。

本发明的有益效果为：以产酶能力较强的里氏木霉RUT C30为出发菌株，通过CRISPR/Cas9***介导，对stp1基因进行了敲除，在微晶纤维素诱导条件下将酶活提升60％，在木质纤维素-汽爆玉米秸秆的诱导条件下将酶活提升30％，为工业生产纤维素酶提供了优异的工程菌株。

附图说明

图1实施例1中pCRISPR-stp1质粒图谱；

图2实施例3中pCRISPR-stp1质粒转化PCR验证结果；

图3实施例3中pCRISPR-stp1阳性转化子测序验证结果；

图4实施例3中stp1基因敲除PCR验证结果；

图5实施例4中微晶纤维素作为诱导剂碳源，滤纸酶活性结果：Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-23、Δstp1-27四个敲除菌株的滤纸纤维素酶酶活均显著高于原始菌株RUT C3；

图6实施例4中汽爆玉米秸秆为诱导剂碳源的滤纸酶活；

图7A实施例5中测试得到的基因相对表达量:Δstp1-8、Δstp1-23、Δstp1-27中，cbh1基因表达量相对RUT C30具有极显著提升；

图7B实施例5中测试得到的基因相对表达量:Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-27中xyr1表达量显著提升，其中Δstp1-27表达量提升极显著；

图8实施例6中Δstp1-8中试产酶测定结果。

具体实施方式

以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

实施例1CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

根据目标基因stp1序列，在其CDS区利用在线工具http://grna.ctegd.uga.edu/设计sgRNA序列5‘-3’：ccaggatgtcgagcacatcgagg(SEQ ID NO:1)，将其***Cas9表达质粒中，完成基因stp1敲除质粒的构建(质粒图谱图如图1)。

实施例2CRISPR/Cas9基因编辑载体的转化

1)相关培养基及溶液配制

完全培养基(CM)配方如下(1L)：

注：用NaOH调节pH至6.8，配制完成后高压蒸汽灭菌，冷却后添加0.22μm滤膜过滤除菌的维生素溶液。

再生培养基(TMM)配方如下(1L)：

用NaOH调节pH至5.8，配制完成后高压蒸汽灭菌，稍微冷却后添加氨苄青霉素(100μg/mL)和潮霉素(175μg/mL)。

产酶诱导培养基如下(1L)：

/>

用NaOH调节pH至4.9-5.0，配制完成后高压蒸汽灭菌，稍微冷却后添加氨苄青霉素(100μg/mL)

2)原生质体的提取

(1)在CM培养基中接种里氏木霉RUT C30孢子，过夜培养；

(2)次日将CM培养基过滤掉，留菌丝，并用0.6M的MgSO₄溶液洗涤菌丝；

(3)将菌丝转移至酶解液(1.2M MgSO4，10Mm磷酸缓冲液，10mg/mL裂解酶，PH5.8)中进行酶解2-3h；

(4)酶解结束，过滤收集原生质体，并用STC溶液(1M山梨醇，10mM CaCl，10mMTris，pH7.5)洗涤两次；

(5)离心，使原生质体沉淀，继续加入少量STC，使原生质体重悬，待转化。

3)原生质体的转化

(1)向原生质体溶液中加入适量质粒和50uL 25％的PEG 6000，转动离心管使三者混合均匀；

(2)离心管冰浴25min；

(3)继续加入2mL 25％的PEG 6000，25℃水浴5min，再42℃水浴3min。

(4)加入4mL STC，混匀。

(5)离心，倒掉上清，加入少量STC试剂，溶解原生质体沉淀。

(6)将以上沉淀转移到含有潮霉素的再生培养基(TMM)上，30℃培养5-7天。

4)转化子的筛选与扩繁

挑取TMM培养基上长出的单克隆，转移到产酶诱导培养基上，30℃培养5-7天。待绿色孢子布满整个平板之后，用灭菌水洗孢子，并将孢子悬浮液置于4℃冰箱中保存备用。

实施例3CRISPR/Cas9基因编辑载体转化与敲除成功率鉴定

1)鉴定质粒是否转化成功

本发明鉴定转化株转化及敲除是否成功所用的引物如表1所示。

表1所用引物序列

本发明所用的PCR反应体系(20μL)如下：

本发明所使用的PCR扩增程序如下：

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析电泳结果(图2)，泳道M为marker DL2000，泳道1、2、3、4、5、6、7分别为pCRISPR-stp1阳性转化子Δstp1-6、Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-20、Δstp1-23、Δstp1-27、Δstp1-29基因组扩增条带，泳道W为原始菌株RUT C30，泳道P为转化质粒pCRISPR-stp1。

将显示出目的条带的PCR产物进行测序，经序列比对，与质粒对应片段序列一致(图3)，确认质粒转化成功。

2)鉴定基因是否敲除成功

以敲除基因stp1上跨sgRNA的区域为目标片段，引物对得到的阳性转化子DNA进行扩增，并以原始菌株RUT C30作为阳性对照，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(图4)。图中泳道M为marker，泳道1、2、3、4、5、6、7分别为Δstp1-6、Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-20、Δstp1-23、Δstp1-27、Δstp1-29基因组扩增条带，泳道W为原始菌株RUT C30扩增条带，其中Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-23、Δstp1-27无目的条带，其余转化菌株与原始菌株有条带，可认为在转化菌株Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-23、Δstp1-27中目的基因片段缺失，基因stp1已成功敲除，敲除成功率约为57％。

实施例4敲除菌株的发酵产酶验证

1)转化菌株发酵验证

(1)于种子培养基中培养转化菌株，接种量为10^9cell/L。

种子培养基配方如下(1L)

/>

(2)测定转化菌株种子培养体系的OD值，当OD值达到6-8时,移种到发酵培养基，移种量10％。

产酶发酵培养基配方如下(1L)

(3)发酵液体培养基体系为100mL，培养条件为：30℃、200rpm。

(4)取样测定酶活。

2)酶活测定与计算

滤纸酶活(FPA)、羧甲基纤维素酶活(CMCA)的测定方法根据国际理论与应用化学联合会(IUPAC)的标准来测定及计算。

发酵共进行9天，于第五日连续取样测定酶活。结果显示(图5)，在以微晶纤维素为诱导物碳源时，Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-23、Δstp1-27四个敲除菌株的酶活均显著高于原始菌株RUT C30，其中Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-23的酶活提升表现为极显著，Δstp1-8获得了5.92U/mL的酶活，相较原始菌株的3.69U/mL，具有约60％的提升。

由于微晶纤维素纯度高，价格昂贵，在工业生产中不具有大规模应用的价值，故在工业发酵中常以预处理后的农作物秸秆作为纤维素来源。本发明又以汽爆玉米秸秆作为诱导物进行了发酵产酶实验。

以Δstp1-8为实验菌株，对最佳的诱导剂的浓度进行梯度验证，结果显示，在相同的诱导培养条件下，在4％的质量体积比时，基因工程菌的酶活提升比例最高。

表2

诱导剂用量	2％	3％	4％	5％	6％
						Δstp1-8(U/mL)	3.54	4.24	7.02	6.27	5.69
RUT C30(U/mL)	2.89	3.18	5.12	4.41	3.97

以4％汽爆玉米秸秆作为诱导物进行发酵产酶实验，发酵共进行9天，于第五日其连续取样测定酶活。结果显示(图6)，Δstp1-8得到了7.02U/mL的总酶活，显著高于RUT C30的5.12U/mL，得到了约30％的提升。

实施例5敲除菌株的RT-qPCR分析

提取前一天用种子培养基接种转化株进行菌丝培养，接种至不同诱导底物中继续诱导培养，24h后取出离心，用滤纸吸去水分得到菌丝，进行后续操作。

RNA的提取按照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒说明书进行。

提取得到的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测提取效果。将转化子RNA反转录为cDNA，实验按照TAKARA试剂盒说明书进行。

设计cbh1、xyr1、sar1扩增引物(表3)。

表3所用引物序列

RT-QPCR反应结束后得到融解曲线和扩增曲线。根据融解曲线判断引物特异性，由扩增曲线得到Ct值，并用内参基因sar1进行矫正，通过相对定量法获得目标基因的相对表达量，分析目标基因的表达水平。

检测结果如图7所示：以RUT C30中各基因的表达量为1，对各敲除菌株中的基因进行相对定量，并进行多重比较，结果显示，Δstp1-8、Δstp1-23、Δstp1-27中，cbh1基因表达量相对RUT C30具有极显著提升(图7A)；Δstp1-8、Δstp1-19、Δstp1-27中xyr1表达量显著提升，其中Δstp1-27表达量提升极显著(图7B)

实施例6敲除菌株的中试发酵

将摇瓶产酶效果良好的Δstp1-8进行10L中试产酶发酵验证，并设置重复以RUTC30作为对照。

于第8日取样测定酶活。由Δstp1-8的中试产酶测定结果(图8)可知，Δstp1-8相较RUT C30均有提升，得到了5.6-5.9U/mL的酶活结果，均高于RUT C30的4.29U/mL，酶活提升30.5-37.5％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种基因改造里氏木霉工程菌株的制备方法，所述方法是敲除内源性基因stp1的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的里氏木霉为RUT-C30。

3.根据权利要求2所述的方法，所述的敲除内源性基因stp1的表达的方法包括但不限于同源重组、RNA干扰、基因编辑，其中，基因编辑的工具选自ZFN、TALENs、CRISPR/Cas9。

4.根据权利要求3所述的方法，其特在于，所述基因编辑采用的是CRISPR/Cas9***，其中sgRNA的序列为SEQ ID NO:1所示；优选的，所述CRISPR-Cas9***是将Cas9表达框与sgRNA克隆进同一个表达质粒中转化宿主细胞；更优选的，所述质粒还包括了启动子、抗性基因片段、终止子元件。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中还包括检测基因改造的里氏木霉相关基因，其中所述的相关基因包括内源性的stp1，将stp1基因敲除成功作为候选的菌株进行酶活检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用RT-QPCR方法测定相关基因：cbh1、xyr1、sar1，最终获得滤纸酶活最高且酶基因表达量最高的工程菌株。

7.一种基因工程菌株，其特在于，所述菌株是根据权利要求1-6任一项所述方法产生的基因工程菌。

8.权利要求7所述的基因工程菌在发酵生产纤维素酶中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的发酵生产纤维素酶以微晶纤维素或汽爆玉米秸秆作为诱导物进行诱导发酵，优选的，以培养基的总重量为基准，所述的诱导剂添加量为3％～5％，最优选的，诱导剂的添加量为4％。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的发酵为中试发酵，发酵罐容积为5L～20L。