CN117683855B - 基因突变参考品的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因突变参考品的制备方法及其应用，涉及基因检测技术领域。所述制备方法首先制备得到具有目标突变频率的参考品母液；随后将参考品母液中的DNA进行片段化处理后，在片段化DNA两端加上通用接头序列进行PCR扩增，进而得到放大制备的基因突变参考品。上述方法制备得到的基因突变参考品在生产的批间差异控制上具有良好的稳定性以及准确性，而且制备过程中具有混合比例固定、与预期突变频率一致、生产周期快和成本低等优势，有效克服了目前参考品制备过程中存在的多轮配制、生产工艺流程复杂、制备周期长和成本高等问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种基因突变参考品的制备方法及其应用。
背景技术
随着高通量测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)的广泛应用，越来越多基于NGS方法学的体外诊断试剂获得NMPA的批准，并应用于肿瘤基因突变的检测中。在这些试剂盒的开发中，需要对产品的各项性能指标进行评估，比如准确性、精密度和最低检出限等。要想合理并准确地对这些分析性能指标进行评估，就需要选择合适的参考品。此外，主要原材料的质量评价、生产工艺和反应体系的确定也主要依赖于企业参考品。如果参考品不合理或者存在缺陷，就会造成整个产品的原材料选择、生产工艺的确定和反应体系的组成均存在较大的质量问题，从而可能导致产品在临床检测过程中出现错误结果而影响临床的诊断。因此，合理的企业参考品对肿瘤基因突变检测试剂盒的开发和验证是非常重要的。
通常，在肿瘤基因突变检测试剂盒的开发中，需要设置不同突变频率水平的阳性参考品和检测限参考品。当制备的参考品突变频率与预期值偏差较大时，会影响精密度和最低检测限等分析性能指标的评估。目前，在这些参考品的制备方法中，主要采用将含有肿瘤基因突变型的DNA与野生型DNA按一定比例混合的方式来制备。其中，获取肿瘤基因突变型DNA的方法主要有以下几种：（1）人工合成含有肿瘤基因突变序列的质粒或阳性DNA序列片段；（2）从培养的突变型肿瘤细胞系中提取DNA；（3）基于CRISPR/Cas9等基因编辑技术改造出突变型细胞系DNA；（4）从肿瘤基因突变型的临床样本中提取DNA；（5）通过构建人工重组慢病毒载体制备携带肿瘤基因突变的DNA。
在获得突变型和野生型的DNA样本后，需要先对样本中目标基因的基因型、突变频率或拷贝数浓度进行Sanger、NGS或ddPCR检测确认。然后，再根据DNA的浓度、突变频率和拷贝数浓度等，计算需要混合的比例，接着加入对应体积的DNA，从而配制成目标突变频率的参考品。最后，对制备的参考品进行NGS或ddPCR的突变频率定值检测，并确定其均匀性和稳定性等。
虽然这些制备参考品的方法，最终能够实现制备出目标突变频率的参考品，但是在实际工作中，在参考品的性能表现和生产工艺等方面，仍然存在诸多复杂的问题。
（一）、从性能表现方面来看，目前的参考品配制常出现实际结果与预期目标突变频率偏差较大或批间配制差异较大等问题。要想获得符合目标突变频率的参考品，往往需要经过对突变型DNA和野生型DNA进行多次调整比例来混合，以及随之而来的多次NGS或ddPCR的反复检测，才能获得较为接近预期目标突变频率的参考品。
如果预混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率不一致，则根据检测结果进一步细化混合比例，直到得到的混合物的目标突变位点基因突变频率与目标突变频率一致。或者需要对初始突变型基因组DNA与野生型基因组DNA至少进行两组混合比例，而这种参考品制备方法存在实际突变频率与预期偏差较大，仍需要多次对配制的参考品的突变频率进行验证和调试。造成这方面问题的因素主要有以下几种：
其一，突变型临床样本或肿瘤细胞系存在异质性，或者靶基因存在拷贝数变异；其二，样本的DNA片段完整性不同而造成的质量差异；其三，由配制过程中Qubit定量、移液器量取、细胞计数或天平称量等带来的实验误差；其四，不同批次配制带来的批间差异等。
（二）、从生产工艺方面来看，目前的参考品制备大多存在生产工艺流程复杂、制备周期长、检测设备要求高、批间混合比例不固定和生产费用高等问题。
比如，有的方法需要通过CRISPR/Cas9基因编辑或人工重组慢病毒载体等改造转细胞系，再经过单克隆细胞株筛选和细胞放大培养等复杂的细胞生物学实验过程；有的需要采用流式细胞仪对细胞进行计数来获得需要混合的细胞精确比例；还有的需要采用高精度的6位分析天平对DNA的含量进行称量，需要DNA达到mg，甚至g的重量级别；此外，还有的需要采用Agilent 4200TapeStation自动化电泳***评估DNA的完整性或人工设计并合成阳性片段等等。这些复杂的生产工艺及高要求的设备条件都制约着参考品的放大制备。
因此，为了克服目前参考品制备存在的多轮配制、生产工艺流程复杂、制备周期长和成本高等问题，亟需开发一种混合比例固定、批间差异小、突变频率稳定、生产工艺简单且能够稳定长期供应的参考品制备方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种基因突变参考品制备方法，所述制备方法具有混合比例固定、与预期突变频率一致、生产周期快和成本低等优势，有效克服了目前参考品制备过程中存在的多轮配制、生产工艺流程复杂、制备周期长和成本高等问题。
本发明的第二目的在于提供一种基因突变参考品制备方法的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
根据本发明的一个方面，一种基因突变参考品制备方法，所述制备方法包括：
（A）、提供含有目标基因突变的样本，利用高通量测序或数字PCR技术确认得到样本的阳性突变频率；随后采用阴性细胞系将含有目标基因突变样本的DNA稀释至目标突变频率，得到参考品母液；
（B）、将参考品母液中的DNA进行片段化处理；随后在片段化的DNA两端加上通用接头序列，得到扩增DNA片段；然后进行PCR扩增富集，对PCR产物进行磁珠纯化后，得到基因突变参考品。
本发明提供的基因突变参考品制备方法，所述制备方法首先制备得到具有目标突变频率的参考品母液；随后将参考品母液中的DNA进行片段化处理后，在片段化DNA两端加上通用接头序列进行PCR扩增，进而得到放大制备的基因突变参考品。上述方法制备得到的基因突变参考品在参考品生产的批间差异控制上具有良好的稳定性以及准确性（再次制备时利用参考品母液制备即可）；而且制备过程中具有混合比例固定、与预期突变频率一致、生产周期快和成本低等优势，有效克服了目前参考品制备过程中存在的多轮配制、生产工艺流程复杂、制备周期长和成本高等问题。
需要说明的是，当需要再次制备参考品时，使用上述参考品母液，重复步骤（B）制备即可，这将大大缩短常规参考品再次制备的周期。同时，由于使用的是同一来源的参考品母液，再次制备参考品时，可以得到混合比例固定且与预期突变频率保存一致的参考品。此外，参考品母液在经过本发明的生产工艺PCR放大后，DNA可以由原来的投入量放大到30倍以上，这将进一步地降低常规参考品再次制备的原料成本。因此，基因突变参考品制备方法可以有效克服目前参考品制备存在的多轮配制、生产工艺流程复杂、制备周期长和成本高等问题，具有混合比例固定、批间差异小、突变频率稳定、生产工艺简单且能够稳定长期供应的优势。
在本发明的一种优选实施方式中，所述含有目标基因突变的样本包括：含有目标基因突变的突变型细胞系，或市售含有目标基因突变的企业参考品。
作为一种优选的实施方式，上述含有目标基因突变的样本可以为商业化的企业参考品或突变型的细胞系。
在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤（B）片段化处理后，片段化DNA的长度为150bp~3k bp，优选为300bp~3k bp。
作为一种优选的实施方式，本申请通过实验得到对参考品母液的DNA片段大小进行处理后，当DNA片段大小主峰在300bp~3k bp时，可以获得较优的文库产量。
在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤（B）中通用接头序列选自公共引物，作用是通过PCR使DNA片段得到扩增；
片段化DNA的5’端的通用接头序列如SEQ ID No：1所示，具体为：
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC-3’；
片段化DNA的3’端的通用接头序列如SEQ ID No：2所示，具体为：
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤（B）中PCR扩增富集的扩增引物序列包括：
PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID No：3所示，具体为：
5’-CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
PCR扩增的下游引物序列如SEQ ID No：4所示，具体为：
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’。
在上述优选实施方式中，所述PCR扩增的反应程序依次包括：
第一阶段：98℃，5min；第二阶段：5～15个循环扩增，每个循环：98℃，10～30s；65℃，30～60s；72℃，30～45s；第三阶段：72℃，3～5min；第四阶段：4～16℃，保持。
在本发明的一种优选实施方式中，所述基因突变参考品制备方法还包括：
在步骤（B）得到的基因突变参考品中加入DNA保护剂，防止DNA降解的步骤。
在上述优选实施方式中，所述DNA保护剂主要由Tris缓冲液、Tween20和核酸酶抑制剂组成。
优选地，所述基因突变参考品制备的方法，包括步骤如下：
1：购买含有目标基因突变的参考品原料，根据性质确认得到的突变频率结果，采用阴性细胞系或阴性临床样本的DNA对企业参考品或突变型细胞系的DNA进行突变频率稀释至目标突变频率，得到参考品母液。
2：取200ng的上述参考品母液DNA进行片段化处理，获得片段大小主峰为150 bp~3k bp的DNA片段，然后对获得的DNA片段进行末端修复和3’端加A碱基处理，接着使用T4DNA连接酶将通用序列连接到处理后的DNA片段两端。
片段大小优选为150bp~3k bp；进一步地片段大小优选为300bp~3k bp。
3：用20ng上述两端连接有通用序列的DNA片段作为模板，进行PCR扩增。对PCR产物进行AMPure XP磁珠纯化，得到放大制备的参考品。
所述PCR的循环数优选为5～15个循环；进一步地，较优的为5~10个循环数。
4：在上述纯化产物中加入商品化的DNA保护剂，防止DNA降解。最后，将制备的参考品稀释到不低于10ng/ul的浓度，短期在-20℃下冷冻保存，长期在-80℃下冷冻保存。
根据本发明的一个方面，一种上述基因突变参考品制备方法在制备非诊断目的的基因突变检测产品中的应用。
本发明提供的基因突变参考品可以广泛应用于非诊断目的的基因突变检测产品的制备过程中。
具体的，本申请基因突变参考品制备方法可用于制备SNV、CNV、MSI和融合基因等不同的肿瘤基因变异类型的参考品。因此，本申请基因突变参考品制备方法可用于制备多种肿瘤基因变异类型的参考品以及多种方法学检测产品的开发，对于分子生物学检测试剂的开发具有重要的意义。
在上述优选实施方式中，所述非诊断目的的基因突变检测产品包括：用于肿瘤基因突变的高通量测序技术NGS检测产品、一代测序检测产品和荧光PCR检测产品。
优选地，所述检测产品为肿瘤基因突变检测试剂盒。
优选地，本申请基因突变参考品制备方法适用于扩增片段大小在本发明的DNA片段大小主峰范围以下的PCR产品。
进一步地，当本申请基因突变参考品制备方法中的DNA片段大小主峰在300bp~3kbp时，适用于扩增片段长度范围为150bp~250bp的PCR产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的基因突变参考品制备方法，所述制备方法：首先制备得到具有目标突变频率的含有目标基因突变的参考品母液；随后将参考品母液中的DNA进行片段化处理后，在片段化DNA两端加上通用接头序列进行PCR扩增，进而得到放大制备的基因突变参考品。上述方法制备得到的基因突变参考品在生产的批间差异控制上具有良好的稳定性以及准确性（再次制备时利用参考品母液制备即可）；而且制备过程中具有混合比例固定、与预期突变频率一致、生产周期快和成本低等优势，有效克服了目前参考品制备过程中存在的多轮配制、生产工艺流程复杂、制备周期长和成本高等问题。
本发明提供的基因突变参考品可以广泛应用于非诊断目的的基因突变检测产品的制备过程中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的肿瘤基因突变参考品的检测结果与预期结果的一致性比较图；
图2A为本发明实施例3提供的5min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2B为本发明实施例3提供的10min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2C为本发明实施例3提供的20min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2D为本发明实施例3提供的25min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2E为本发明实施例3提供的30min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2F为本发明实施例3提供的60min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图3为本发明实施例3提供的不同DNA片段大小主峰范围下的多重PCR文库产物浓度图；
图4A为本发明实施例4提供的0次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4B为本发明实施例4提供的5次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4C为本发明实施例4提供的10次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4D为本发明实施例4提供的15次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4E为本发明实施例4提供的20次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4F为本发明实施例4提供的25次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4G为本发明实施例4提供的35次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4H为本发明实施例4提供的45次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图5为本发明实施例4提供的不同PCR循环数下的PCR产物浓度图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1肿瘤基因突变参考品的制备
本实施例采用本申请的基因突变参考品制备方法，制备肿瘤BRAF基因V600E突变的参考品。具体过程如下：
（1）、1.1购买含有BRAF基因V600E突变的参考品原料，对参考品原料的性质进行NGS或ddPCR确认。具体方法如下：
所述含有BRAF基因V600E突变的参考品原料可以为SK-MEL-28、B-CPAP或8305C细胞系等。本实施例选择突变型为纯合突变的SK-MEL-28细胞系，当进行突变频率稀释时可以获得更多的稀释产物。
所述阴性细胞系为293T细胞系。
本实施例分别对SK-MEL-28和293T细胞系DNA进行检测，使用商品化的BRAF基因V600E突变的ddPCR检测试剂盒，各重复3次，得到拷贝数结果如下：
从结果可知，SK-MEL-28细胞系为接近100%突变频率的BRAF基因V600E纯合突变，293T细胞系为BRAF基因V600E突变频率为0的阴性样本。
1.2、根据性质确认得到的突变频率结果，采用阴性细胞系或阴性临床样本的DNA对企业参考品或突变型细胞系的DNA进行突变频率稀释至10%、5%和2.5%的目标突变频率，得到参考品母液。具体为：
使用以下目标突变频率计算公式，计算SK-MEL-28和293T细胞系DNA需要混合的比例X和Y：
目标突变频率值= mMU*CMU/（mMU*CMU+mWT*CWT）*100%；
其中，mMU为含目标突变位点的细胞系DNA质量，CMU为含目标突变位点DNA的拷贝数浓度，mWT为野生型基因组DNA的总质量，CWT为野生型基因组DNA的总拷贝数浓度。
假设需要配制100ng的10% BRAF基因V600E突变，则可通过求解以下方程组得到X和Y。
方程一：X+Y=100；
方程二：10215.33X/(10215.33X+3.47X+19893.63Y)*100%=10%；
通过合并同类项得到，X为17.79，Y为82.21，即SK-MEL-28细胞系和293T细胞系DNA的分别为17.79ng和82.21ng。
对混合后的参考品母液进行BRAF基因V600E突变ddPCR检测，突变频率结果为10%左右。当配制的参考品母液与预期突变频率结果偏差较大时，需要进一步调整两种细胞系DNA的加入量，使之接近10%的预期突变频率。按上述步骤分别配制5%和2.5%的目标突变频率的参考品母液。
（2）使用商品化的DNA快速片段化/末端修复/A尾添加模块试剂（翌圣生物，12619ES96），对200ng的上述参考品母液DNA进行片段化、末端修复和3’端加A碱基处理，获得片段大小主峰为150 bp~3k bp的DNA片段。
然后使用T4 DNA连接酶将通用序列连接到处理后的DNA片段两端。所述的通用序列选自公共引物，作用是通过PCR使DNA片段得到扩增，
DNA片段5’端的公共引物Uni-A的序列为：
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC-3’，
DNA片段3’端的公共引物Uni-B的序列为：
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
（3）用20ng上述两端连接有通用序列的DNA片段作为模板，进行PCR扩增。对PCR产物进行AMPure XP磁珠纯化，得到放大制备的参考品。
所述PCR的上游引物RM-F的序列为：
5’-CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，
下游引物RM-R的序列为：
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’。
所述PCR的反应体系为50ul，包括KOD酶预混液26ul、引物混合液1ul、DNA模板含量20ng、无核酸酶水补足至50ul。
其中：所述KOD酶预混液为KOD -Multi&Epi-®和2× PCR buffer for KOD -Multi&Epi-®的混合液，所述引物混合液为上游引物RM-F和下游引物RM-R的混合液。
所述PCR的反应程序为：第一阶段：98℃，5min；第二阶段：5～15个循环扩增，每个循环：98℃，10～30s；65℃，30～60s；72℃，30～45s；第三阶段：72℃，3～5min；第四阶段：4～16℃，保持。
（4）在上述纯化产物中加入商品化的DNA保护剂，防止DNA降解。最后，将制备的参考品稀释到不低于10ng/ul的浓度，短期在-20℃下冷冻保存，长期在-80℃下冷冻保存。
所述DNA保护剂可以为Tris缓冲液、Tween20和核酸酶抑制剂等组成的混合液。所述参考品稀释液为1xTE缓冲液。
通过上述操作步骤，可以得到与预期突变频率保存一致的参考品。当需要再次制备参考品时，使用从步骤（1）制备的参考品母液，重复步骤（2）~（4）即可。
通过以上生产工艺，可以克服常规的使用突变型和野生型的DNA或细胞系进行多次调整比例来混合，以及细胞培养和计数等繁琐过程。此外，该生产工艺还具有参考品原料混合比例固定、与预期突变频率一致、生产周期快和成本低等优势。
实施例2参考品的性能验证
本实施例分别采用NGS和ddPCR方法对制备的参考品进行检测验证，来考察生产的参考品性能准确性和精密度。
具体的：利用实施例1的肿瘤基因突变参考品制备方法，由两位实验员，各生产三批10%、5%和2.5%突变频率的BRAF基因V600E突变参考品。然后，分别用NGS和ddPCR这两种方法对制备的BRAF基因V600E突变参考品进行检测。
第一种方法采用多重PCR建库进行NGS验证。具体为：
首先，设计扩增BRAF基因V600E目标区域片段长度为125bp~150bp的特异性引物，使得扩增子的产物长度小于DNA片段化产物中主峰150bp~3k bp的范围；然后，通过多重PCR制备含有测序接头和标签序列的文库，并用AMPure XP磁珠对文库产物进行纯化；接着，用Qubit dsDNA Hs Assay Kit试剂对制备的文库进行浓度测量以及用Agilent2100生物分析仪或Qsep 100对文库峰图进行质控；再接着，用illumina MiseqDx测序仪对质检合格的文库进行测序；最后，对测序数据进行生物信息分析，统计BRAF基因V600E突变频率。
第二种方法采用ddPCR检测进行验证。具体为：
通过商品化的BRAF基因V600E数字PCR检测试剂盒，检测BRAF基因V600E突变频率。所述的ddPCR扩增片段小于参考品母液中主峰150bp~3k bp的范围。
对BRAF基因V600E突变频率检测的结果进行统计，结果如下：
把NGS和ddPCR检测的结果做平均值，与预期的10%、5%和2.5%突变频率做散点图比较，进行一致性分析，具体如图1所示；
图1为本实施例肿瘤基因突变参考品的检测结果与预期结果的一致性比较图。
由图1可知，由不同实验员在不同批次生产的参考品，用NGS和ddPCR得到的突变频率变异系数（CV%）均低于10%，而且本方法制备的参考品与预期的结果有良好的一致性（R2=0.9897＞0.8）。这说明本发明的生产工艺能够在参考品生产的批间差异控制上具有良好的稳定性，并且能够与预期结果保存较好的一致性和准确性。
实施例3 DNA片段长度范围的研究
本实施例对参考品制备时的DNA片段大小进行研究，筛选较优的DNA片段大小范围。在基于PCR方法学的分子检测试剂盒中，通过设计目标区域的扩增引物可以扩增得到特定大小的扩增产物，通常为100bp~300bp。为了使通过该发明制备的参考品能够用于大部分的试剂盒，需要对片段化产物中的DNA片段大小范围进行研究，筛选出DNA片段主峰大于常见的扩增产物大小的DNA片段大小范围，从而保证使用本发明制备参考品时，能够有效扩增出PCR产物。
为了筛选出较为合适的DNA片段大小范围，使用实施例1的肿瘤基因突变参考品制备方法，对参考品母液分别进行不同时间的片段化处理。然后，分别使用以上产物进行参考品制备，将处理后的产物进行Qsep 100检测，观察片段分布情况。接着，用扩增子长度范围为150bp~250bp的多重PCR建库试剂，对获得的不同DNA片段长度的参考品分别进行建库，各3个重复，对文库产物进行纯化和Qubit测浓度，比较浓度差异。
具体的：本实施例分别通过三次实验，依次进行DNA片段大小范围的筛选。
首先，用实验一设置片段化处理时间为5min和60min的实验筛选出DNA片段大小的初步范围。
随后，在实验一的基础上进行实验二，分别设置片段化处理时间为10min和30min，进一步筛选出较优的DNA片段化大小范围。
然后，在实验二的基础上进行实验三，分别设置片段化处理时间为20min和25min，进一步筛选出较优的DNA片段化大小范围。最后，通过结果比较，得到较优的DNA片段大小范围。
图2A为本实施例提供的5min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2B为本实施例提供的10min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2C为本实施例提供的20min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2D为本实施例提供的25min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2E为本实施例提供的30min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
图2F为本实施例提供的60min片段化处理后的Qsep 100检测结果图；
根据上述不同时间片段化处理后的Qsep 100检测结果图可以看出，在对参考品原料分别进行片段化5min、10min、20min、25min、30min和60min后，得到的DNA片段主峰范围分别为：＞1k bp（最多的为4433bp）、300bp~3k bp（最多的为1000bp）、150bp~300bp（最多的为231bp）、100bp~300bp（最多的为188bp）、100bp~200bp（最多的为142bp）和50bp~120bp（最多的为83bp）。
图3为不同DNA片段大小主峰范围下的多重PCR文库产物浓度图；
由图3多重PCR文库产物浓度结果可以看出，在分别进行不同片段化处理时间后，对应的多重PCR文库浓度最高和最低的分别为：116.59ng/ul和17.81ng/ul。其中，文库产量较优的为片段化处理时间为5min、10min、和20min的文库产物，对应的DNA片段大小主峰分别为：＞1k bp（最多的为4433bp）、300bp~3k bp（最多的为1000bp）和150bp~300bp（最多的为231bp）。进一步地，文库产量较优的为片段化处理时间为10min的文库产物，对应的DNA片段大小主峰为：300bp~3k bp（最多的为1000bp）。
因此，通过本实施例可以得出，对参考品母液的DNA片段大小进行处理后，当DNA片段大小主峰在300bp~3k bp时，可以获得较优的文库产量。
实施例4PCR循环数的研究
本实施例对参考品制备时的PCR循环数进行研究，筛选较优的PCR循环数范围。在PCR扩增反应中，由于反应体系中聚合酶、引物和dNTP等组分的含量是有限的，当扩增反应进入平台期后，循环数的增加不会再使产物接着增加。另外，当循环次数过多时，产物间可能会形成多聚体等较为复杂的非特异性产物，这些副产物的累积和反应组分的消耗会大大降低PCR效率。相反，较少的循环数更适合于无偏倚扩增以及目标DNA的准确复制。因此，筛选出合适的PCR循环次数，可以使本发明制备的参考品保持较高准确性。
为了筛选出较为合适的PCR循环数范围，本实施例使用实施例1的肿瘤基因突变参考品制备方法分别进行不同循环数的扩增，取20ng两端连接有通用序列的DNA片段作为模板，分别进行扩增，各3个重复。然后，对扩增后的产物进行纯化和Qubit测浓度，Qsep 100检测不同循环数扩增后的峰图，并取未扩增的模板作为0个循环数的对照组进行峰图检测。分析DNA片段的大小分布，通过察看是否有二聚体、多聚体等非特异性产物，以及PCR的产物浓度比较，来确定合适的PCR循环数。
具体的，本实施例分别通过三次实验，依次进行PCR循环数范围的筛选。
首先，用实验一设置PCR循环数为5个、35个和40个的实验筛选出PCR循环数的初步范围。
随后，在实验一的基础上进行实验二，分别设置PCR循环数为10个和25个，进一步筛选出较优的DNA片段化大小范围。
然后，在实验二的基础上进行实验三，分别设置PCR循环数为15个和20个，进一步筛选出较优的PCR循环数范围。最后，通过结果比较，得到较优的PCR循环数范围。
图4A为0次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4B为5次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4C为10次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4D为15次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4E为20次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4F为25次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4G为35次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
图4H为45次PCR循环后产物的Qsep 100检测结果图；
根据上述不同PCR循环数后产物的Qsep 100检测结果图可以看出，与PCR循环数0个的对照相比，PCR在5个和10个循环数后的峰图与未扩增的模板的峰图基本一致，均有特征明显的单一主峰。当PCR循环数增加到15个循环数时，已经出现了少量超过3k bp的多聚体等非特异性产物主峰；当PCR循环数继续增大到20个、25个、35个和45个时，均有大量的超过3k bp的多聚体等非特异性产物主峰，这说明合适的PCR循环数的初步范围应在0~15个之间。其中，较优的为5~15个之间。进一步地，较优的为5~10个循环数。
图5为本实施例提供的不同PCR循环数下的PCR产物浓度图。
从图5的PCR产物浓度结果可以看出，对两端连接有通用序列的DNA片段分别进行不同循环数的扩增后，对应的PCR产物浓度最低和最高的分别为7.52ng/ul和106.75ng/ul。其中，产量较优的循环数为10~45个循环数的产物，浓度为45.73ng/ul~92.63ng/ul。结合不同循环数下的PCR产物片段大小分布峰图来看，虽然15~45个循环数的产物浓度较高，但存在多聚体等非特异性产物；0~5个循环数没有多聚体等非特异性产物，但产物浓度不高，不利于参考品的生产放大。
因此，通过本实施例可以得出，在对两端连接有通用序列的DNA片段进行扩增时，较优的PCR反应循环数为5~15个之间。进一步地，较优的为5~10个循环数，可以获得较优的参考品制备效果。
实施例5均匀性评估
本实施例对制备的BRAF基因V600E突变位点参考品的均匀性进行评估。
为了评估参考品的均匀性，参照《JJF 1343-2012 标准物质定值的通用原则及统计学原理》和《CNAS-GL003：2018 能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》的要求，从实施例1生产的10%突变频率的参考品中随机抽取10份，采用多重PCR建库试剂盒重复3次检测，每次按不同的顺序进行检测。根据检测的结果，进行单因素方差分析，根据F检验值与F（α=0.05）临界值的大小关系判断参考品的均匀性。
实验结果表明，在95%置信水平下，计算的F值为0.569小于F临界值F0.05（9,20）=2.39。这表明在0.05显著性水平时，样品中的BRAF c.1799T>A p.V600E位点突变频率的均匀性良好，符合均匀性检验合格要求。
实施例6稳定性评估
本实施例对制备的BRAF基因V600E突变位点参考品的稳定性进行评估。由于本发明制备的参考品为片段化的DNA，其保存时间受DNA浓度的影响。因此，本发明控制参考品的完成品的浓度不低于10ng/ul，并加入了商品化的DNA保护剂。
为了评估参考品的稳定性，参照《JJF 1343-2012 标准物质定值的通用原则及统计学原理》和《CNAS-GL003：2018 能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》的要求，取实施例1制备得到的正常储存且首次开封和热稳定期末的质检合格的20例10%突变频率的参考品进行检测，用来考察参考品的加速稳定性。
将参考品分别在37℃条件下存放0小时、120 小时（5天）与168小时（7天）后，用多重PCR建库试剂盒进行检测，每例随机重复3次检测。对各组检测结果进行数据处理，计算稳定期末和初次检测结果的相对偏差。
实验结果表明，参考品分别在37℃条件下存放120小时（5天）与168小时（7天）后，与正常储存的参考品检测结果的相对偏差符合≤10%的范围要求。
利用阿伦尼乌斯公式推算出温度和时间的关系，得出参考品在37℃放置6.5天相当于在-20℃放置365天。因此，推测参考品在-20℃的冷冻条件下，可以稳定保存12个月。
实施例7参考品的应用
本实施例采用本申请的基因突变参考品的制备方法，验证在制备不同变异类型的参考品上的应用，并验证在不同分子检测技术平台上的应用。
获取来自膀胱癌细胞系RT4和林奇综合症MSI-H的临床样本的DNA，其中RT4细胞系包括CNV （CDKN2A基因缺失）、基因融合（FGFR3-TACC3融合）和SNV（TERT基因C228T突变）等多种变异类型；林奇综合症临床样本含有微卫星不稳定MSI-H变异类型。
使用本申请实施例1的基因突变参考品制备方法（将含有BRAF基因V600E突变的参考品原料替换为膀胱癌细胞系RT4的DNA，或替换为林奇综合症MSI-H的临床样本的DNA），对上述来源的样本进行参考品制备，用杂交捕获法NGS测序检测结果。用Sanger测序对CNV 和SNV变异位点进行验证；用荧光PCR-毛细管电泳法对微卫星不稳定进行验证。
结果发现，对于CNV、基因融合、SNV和MSI等变异类型的参考品，均能有效检出。这说明本发明制备的参考品可以应用在多种变异类型参考品的制备上；同时，也表明了通过本发明制备的参考品可以应用在NGS、一代测序和荧光PCR等多种方法学检测产品的开发中。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种基因突变参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
（A）提供含有目标基因突变的样本，确认样本的阳性突变频率；随后采用阴性细胞系将样本的DNA稀释至目标突变频率，得到参考品母液；
（B）将参考品母液中的DNA进行片段化处理；随后在片段化的DNA两端加上通用接头序列，得到扩增DNA片段；然后进行PCR扩增富集，对PCR产物进行磁珠纯化后，得到放大制备的基因突变参考品；
所述步骤（B）片段化处理后，片段化DNA的长度为300bp~3k bp。
2.根据权利要求1所述的基因突变参考品的制备方法，其特征在于，所述含有目标基因突变的样本包括：
含有目标基因突变的突变型细胞系，或市售含有目标基因突变的企业参考品。
3.根据权利要求1所述的基因突变参考品的制备方法，其特征在于，所述步骤（B）中通用接头序列包括：
片段化DNA的5’端的通用接头序列如SEQ ID No：1所示；
片段化DNA的3’端的通用接头序列如SEQ ID No：2所示。
4.根据权利要求1所述的基因突变参考品的制备方法，其特征在于，所述步骤（B）中PCR扩增富集的扩增引物序列包括：
PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID No：3所示；
PCR扩增的下游引物序列如SEQ ID No：4所示。
5.根据权利要求4所述的基因突变参考品的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序依次包括：
第一阶段：98℃，5min；
第二阶段：5～15个循环扩增，每个循环：98℃，10～30s；65℃，30～60s；72℃，30～45s；
第三阶段：72℃，3～5min；
第四阶段：4～16℃，保持。
6.根据权利要求1所述的基因突变参考品的制备方法，其特征在于，所述基因突变参考品制备方法还包括：
在步骤（B）得到的基因突变参考品中加入DNA保护剂，防止DNA降解的步骤。
7.一种根据权利要求1~6任一项所述的基因突变参考品的制备方法在制备非诊断目的的基因突变检测产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述非诊断目的的基因突变检测产品包括：
用于肿瘤基因突变的高通量测序技术NGS检测产品、一代测序检测产品和荧光PCR检测产品。
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| "肺癌相关基因突变二代测序检测试剂参考品的建立";刘东来等;《中国新药杂志》;20181231;第27卷(第21期);第2490-2497页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117683855A (zh) | 2024-03-12 |
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