CN114657276B - 检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法。所述引物对组合的核苷酸序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.26所示；所述引物对组合的扩增产物可以进行一次高通量测序和分析，得到多个检测结果，避免了现有技术在进行多重PCR时，出现较多的假阳性或假阴性结果；同时利用本申请的引物在进行样品检测时可以实现一个样品9个以上靶标分子的多重PCR扩增或者多个样品中多个靶标的多重PCR扩增，然后通过一次高通量测序和分析，获得一种转基因作物中多个靶标或多种转基因作物中多个靶标分子的检测结果，大大提高了检测的效率和灵敏度，便于应用推广。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
水稻是我国最重要的口粮作物，在保证我国粮食安全方面具有重要意义。转基因技术在水稻不同品系中的应用，提高了水稻品种的产量、抗性、适应性等综合性状。
随着大量转基因产品流入市场，因此开发鉴定转基因品系的方法提上日程，转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。Western印迹法、酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫试纸条和蛋白质芯片等方法是目前主要的基于蛋白的检测方法。
目前基于核酸的PCR检测方法主要是多重PCR 方法，可以在一个反应中同时检测多个基因，但常规的电泳检测结果很难判断，容易出现假阳性或假阴性结果；而常用的Real-time方法检测一次PCR反应中检测的外源基因数量也有限且成本高昂，需要专门的仪器设备，要求操作人员具有较高的专业素质，这些因素限制了该技术在检测中的广泛应用。
因此研发一种高效、灵敏和通量高的转基因品系的产品和检测方法，成为亟待解决的关键问题。
发明内容
本申请提供了一种检测水稻转基因品系的引物对组合物、试剂盒及检测方法，以解决现有常用的基于多重PCR反应的检测水稻的试剂盒无法实现8重以上的PCR引物扩增的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种检测水稻转基因品系的引物对组合物，所述引物对组合物中：
特异性扩增Bt63的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2、和SEQID NO.3至SEQ ID NO.4所示；
特异性扩增G6H1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示；
特异性扩增LLRICE62的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.8所示；
特异性扩增LLRICE601的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.10所示；
特异性扩增KF2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.12所示；
特异性扩增KF8的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.14所示；
特异性扩增KMDF1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.16所示；
特异性扩增T1C-9的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.18所示；
特异性扩增M12的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.20所示；
特异性扩增T2A-1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.22所示；和，
特异性扩增Kefeng6的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23至SEQ ID NO.24、和SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.26所示。
可选的，所述引物对组合物还包括特异性扩增选自下组的水稻转基因品系特异性序列的引物对：Bt63、G6H1、LLRICE62、LLRICE601、KF2、KF8、KMDF1、T1C-9、M12、T2A-1和Kefeng6；所述引物对组合物还包括特异性扩增内参基因PLD的引物对。
可选的，所述特异性扩增内参基因PLD的引物对包括：第一对，其核苷酸序列如SEQID NO.27至SEQ ID NO.28所示；第二对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.30所示。
第二方面，本申请提供了一种检测水稻转基因品系的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物对组合物。
可选的，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
可选的，所述引物对组合物的对数范围为1-13对。
可选的，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述引物对组合物。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的引物对组合物用于检测水稻转基因品系的方法，所述方法包括以下步骤：
得到待测水稻的DNA和引物对组合物；
以所述DNA为模板，将所述引物对组合物加入反应体系中，进行扩增反应，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库；
将所述高通量文库中的基因序列进行分析，得到检测水稻转基因品系的结果。
可选的，所述高通量文库的浓度≥2ng/ul。
第四方面，本申请提供了引物对组合物的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测水稻转基因的品系；
所述引物对组合物包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.26所示的引物。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的引物，所述试剂盒包括引物对组合物，所述引物对组合物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.26所示；所述引物对组合物的增产物可以进行一次高通量测序和分析，得到多个检测结果，包括转基因品系、判断待测样品中是否含有转基因品系、确定待测样品中内参基因与转基因品系的拷贝数目，以确定转基因品系的含量；避免了传统Real-time PCR技术一次只能实现一个目的，需要进行多次扩增和检测才能覆盖样本中的多个靶标转分子，避免了现有技术在进行多重PCR时出现的假阳性或假阴性结果。利用本申请的引物在进行检测时，可以进行9个以上的多重PCR反应，通过一次高通量测序和分析，得到一种转基因作物中多个靶标分子或同时多种转基因作物的多个靶标分子的检测结果，大大提高了检测的效率和灵敏度，便于应用推广。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一种水稻转基因品系的检测方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的Bt63样品的基因结构示意图；
图3为本申请实施例提供的LLRICE62样品的基因结构示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
第一方面，本申请提供了一种检测水稻转基因品系的引物对组合物，所述引物对组合物中：
特异性扩增Bt63的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2、和SEQID NO.3至SEQ ID NO.4所示；
特异性扩增G6H1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.8所示；
特异性扩增LLRICE62的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.8所示；
特异性扩增LLRICE601的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.10所示；
特异性扩增KF2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.12所示；
特异性扩增KF8的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.14所示；
特异性扩增KMDF1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.16所示；
特异性扩增T1C-9的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.18所示；
特异性扩增M12的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.20所示；
特异性扩增T2A-1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.22所示；和/或，
特异性扩增Kefeng6的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23至SEQ ID NO.24、和SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.26所示。
为了增强引物对水稻品系检测的适用性，选取至少9组引物进行检测，所设引物长度介于在18-30bp之间，引物间互不干扰，且所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物均可在一个扩增反应中正常扩增目标分子，经实验证实，灵敏度高和适用性强。同时，引物对组合物由正向引物和反向引物组成，一个为上游引物，一个为下游引物。
在一些实施方式中，所述引物对组合物还包括特异性扩增选自下组的水稻转基因品系特异性序列的引物对：Bt63、G6H1、LLRICE62、LLRICE601、KF2、KF8、KMDF1、T1C-9、M12、T2A-1和Kefeng6；所述引物对组合物还包括特异性扩增内参基因PLD的引物对。
为了实现多组引物在一次PCR反应中得到有效扩增与检测，我们首先利用Primer设计引物时，对引物二聚体、GC含量、Tm值、发夹结构等进行了评估，然后对多重PCR引物的扩增产物进行高通量测序，可以得到高通量测序文库，最后实现对高通量测序数据的全面分析。在现有引物对组合物的基础上，还可以包括特异性扩增其它靶标分子的引物对，引物对的组合经验证可达3000对。
另外，靶标转基因品系即以及靶标内参基因的核苷酸序列，包括但不限于从转基因数据库、国家标准、行业标准或者现有文献中进行全面收集，以保证检测的特异性和准确性。
在一些实施方式中，所述特异性扩增内参基因PLD的引物对包括：第一对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27至SEQ ID NO.28所示；第二对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.29至SEQID NO.30所示。
为了实现水稻转基因品系的定量检测目的，引入了水稻内参基因PLD。针对内参基因PLD，用2对引物对的原因在于避免1对内参基因由于扩增效率的影响存在检不出的情况。
第二方面，本申请提供了一种检测水稻转基因品系的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物对组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
具体的，多重PCR预混液的组分包括所述油菜的转基因元件和内参基因的各引物组合。的。组合时，每条引物按照1:1的比例进行预混，根据不同的实验目的进行各引物的混合，具体实施实例中，每条引物浓度是2 nM。
在一些实施方式中，所述引物对组合物的对数范围为1-13对。
所述多重PCR引物的对数范围包括但不限于：11-13对，优选的为13对，其中，转基因元件13对，内参基因1对，后期可根据新收集的转基因元件进行定期增加多重PCR引物的对数组合经验证可达3000对，扩增效果优异；相比常规的8对特异性的多重PCR，具有检测通量和灵敏度高的优势。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述引物对组合物。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的试剂盒的检测方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：
S1.得到待测水稻的DNA和引物对组合物；
S2.以所述DNA为模板，将所述引物对组合物加入反应体系中，进行扩增反应，得到扩增产物；
S3.将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库；
S4.将所述高通量文库中的基因序列进行分析，得到检测水稻转基因品系的结果。
具体地，高通量测序可以是二代测序，也可以是3代测序，得到的高通量文库可以从多个维度分析转基因的成分，包括但不限于我们实施案例中的转基因品系。应用于水稻及其制品的转基因品系的定性与定量检测。
本申请实施例的方法中，所述扩增反应包括普通PCR扩增反应或实时荧光PCR扩增反应；所述扩增反应的环境/程序包括：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，（每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃）；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环；另外，所述反应体系包括但不限于：总体系30μl，引物对：2 μl、2×buffer：15ul，多重扩增酶：0.5 μl；剩余的用水补充。
在一些实施方式中，所述高通量文库的浓度≥2ng/ul。
控制高通量文库的浓度，避免了克隆而引起的***偏差，简化了实验操作，提高了测序效率。
第四方面，本申请提供了引物对组合物的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测水稻转基因的品系；
所述引物对组合物包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.26所示的引物。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。
实施例1 靶标转基因的筛选和多重PCR扩增引物的设计
本申请实施例中，靶标分子即所用的主要转基因品系和内参基因的特异性核苷酸序列主要收集于常用的转基因数据库、国家标准、行业标准或者现有的文献中，我们收集的较全，以保证我们检测的特异性和准确性。其中筛选的转基因品系和内参基因的名称及序列如表1所示。
表1 本发明所筛选的靶标分子及其引物序列。
S2、多重PCR扩增引物的设计
本申请实施例中，利用Primer3Plus设计多重PCR引物，所设引物长度介于在18-30bp之间，引物间互不干扰，这个主要评估引物之间的二聚体，或者引物内部的发夹结构，以及非靶标序列的非特异扩增，评估后的所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增。
实施例1应用本发明的方法检测水稻样品是否含有特异性序列
1. 实验材料：抗虫水稻品种（Bt63或叫TT51-1）和抗除草剂水稻LLRICE62，转基因材料Bt63的示意图如图2所示。实验材料转入了自身启动子、含有Bt63品系特异性序列转基因含量为10%；抗除草剂水稻LLRICE62的结构示意图为图3所示，含有品系特异性序列；用其作为我们的研究材料。
2. DNA模板的准备：植物基因组的提取采用的是CTAB或天根生化科技（北京）有限公司的高效植物基因组DNA 提取试剂盒（DP350）。本实施例是用天根DNA提取试剂盒提取的待测样品DNA，每个样品做了三个生物重复，并得到了DNA的浓度和纯度。
3．PCR扩增、文库构建与测序
利用30对多重PCR扩增引物扩增样本的基因组DNA；其中每个样本进行PCR扩增时已把测序接头和特异样本的DNA条形码连接上，构成高通量测序文库；利用高通量测序平台检测高通量测序文库，并对高通量测序数据进行质量控制。本步骤需要根据检测的准确性、灵敏性等要求，研究调整扩增循环数、引物浓度、测序深度等关键参数；本步骤也可连接三代测序相关的步骤，以实现二代测序与三代测序间优势互补。
扩增反应的环境/程序包括：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个Touch Down循环，（每个循环退火及延伸的温度降低0 .8℃）；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环；另外，所述反应体系包括但不限于：总体系30μl，引物对：2 μl、2×buffer：15ul，多重扩增酶：0.5 μl；剩余的用水补充。
4.结果的判定
1）据测试样品中的特异性序列的信号指数S和空白对照中特异性序列的信号指数P判定污染是否可接受，其中：
空白对照噪音指数P=nc/Nc，其中nc和Nc分别代表空白对照中，特异性序列的测序片段的数量和总测序片段数量。
测试样品的信号指数S=nt/Nt，其中nt和Nt分别代表测试样品中，特异性序列的测序片段的数量和总测序片段数量。
信噪比=S/P，
2）转基因结果的判断
利用待测样本DNA条形码和同源比对，将每个测序片段分配到每个目标物种的每个靶标位置上，所述的靶标包括转基因品系和内参基因。根据每个靶标位置上的测序序列数目，以实现特异性序列的绝对定量。当比对内参基因和品系上的测序序列超过指定阈值时，定性判定样品中含有特异的转基因品系序列；当样品中含有特异性的转基因品系序列时，根据转基因品系的特异性序列与内参基因的测序序列的比值，定量判定样品中的转基因的含量。本实施例中转基因含量的计算公式如（A）所示：
| CtestDNA | —— 测试样品的转基因含量 |
| tTi | —— 测试样品中的每种或品系的测序序列数目 |
| tRi | —— 测试样品中检出的每种内参基因片段的测序序列数目 |
| m | —— 测试样品中检出的内参基因片段的总数 |
| n | —— 标准品中检出的转基因品系片段的总数 |
根据本实例，我们共检测了2个样品，每个样品做了三个生物重复，本实例中我们要求测序reads数目小于5条的序列过滤掉。结果如表2：阴性样品中未检测出任何转基因品系的序列，本发明规定当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可接受的。当样品中特异性序列的信噪比大于10，判定样本中检出特异性序列的核酸。
表2 本实施例2待测样品的转基因检测结果。
由上表可知，Bt63样品中的2个品系特异性序列均被检测到，三个重复均检测出目标序列，而且含量接近于10%；同样的样品LLRICE62样品中的品系特异性序列也均被检测到，而且含量也接近于1%，说明我们发明的这个水稻转基因试剂盒可以用来检测转基因产品。
实施例3本发明方法的准确性与灵敏度评估
利用水稻Bt63和LLRICE62转基因标准品制备不同质量百分比的转基因样本来评估所开发技术的准确度和灵敏度。具体地，各样本的转基因含量采用质量百分进行稀释，具体地把转基因水稻Bt63和LLRICE62用阴性水稻分别稀释成10%，1%，0.1%，0.05%，0.025%和0.01%的样本，分别对应于转基因品系Bt63的稀释样本编号（A1，A2，A3，A4，A5，A6）和转基因品系LLRICE62的稀释样本编号（B1，B2，B3，B4，B5，B6）。定性检测的准确度指真阳性与真阴性所占的比例，定量准确度是指多次测定的平均值与真值相符合的程度，以误差来表示。灵敏度指在95%置信度下，能够检出的特异性序列的最低含量，即检测下限。按照实施例2的方法进行检测，每个样本三个生物重复，结果如表3所示。
表3本发明方法的准确性与灵敏度评估。
注：+代表检出，－代表未检出，A1和B1代表转基因含量为10%，A2和B2代表转基因含量为1%，A3和B3代表转基因含量为0.1%，A4和B4代表转基因含量为0.05%，A5和B5代表转基因含量为0.025%，A6和B6代表转基因含量为0.01%。
由上表可知，所述试剂盒能在转基因含量为0.05%的样本中稳定地检出各转基因品系，而在阴性的样本中未检出特异性序列，所述试剂盒能够明显区分转基因含量为0.05%的样本和阴性样本，具有技术稳定性和转基因含量为0.05%的检测灵敏度。
实施例
特异性分析
特异性、一致性及稳定性一直是判断一个检测体系是否可行的重要标准。本实施例4中我们对外源基因不同的转基因水稻品系测试品进行交叉扩增来验证其特异性、一致性及稳定性。
本实施例利用我们试剂盒中的12对转基因水稻品系特异性引物11个转基因水稻品系杂模板中检测目标微生物的高特异性Bt63（A1）、6H1（A2）、LLRICE62（A3）、LLRICE601（A4）、KF2（A5）、KF8（A6）、KMDF1（A7）、T1C-9（A8）、M12（A9）、T2A-1（A10）和kefeng6（A11）按照等比例混合，混合后并稀释10倍，每次转基因检测时，都带有阴性样品作为对照。检测方法按照实施例2进行，结果如表4所示：每个我们虽然用了13对引物，对每个测试的转基因品系均进行了扩增，但是我们只扩增出了目标特异性序列，并未把非靶标分子扩增出来，而且每个测试样品的三次重复，结果一致，因此说明了我们方法的特异性、一致性与稳定性。
表4本发明方法的特异性分析
实施例5 本发明在批量转基因产品检测中的应用
为了验证本发明的准确性及批量样品转基因检测中的作用，实验室选取了某公司2864份未知基因型的水稻叶片样本进行检测，检测结果并与该公司的保存类型进行比较，并统计结果的一致性。分析结果表明在2864份测试样品中，只有17份样品的结果不一致，检测结果的一致性高达99.4％，因此较好地证明了我们所发明方法的准确性及良好的应用前景。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctttgagtga gctgataccg ctc 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttctgggtta ctcaagcagt tgtat 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcattctga gaatagtgta tgcgg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccagaagga aaaggaatat gttcg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatacatcca tcgatccatc atctt 25
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatcttaaga aatatgtcgc atatgtatgt 30
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atctttgact ccatgggaat tcact 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcaccgaga tctgagatca cg 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggggtaaaa ggtaggagta ctagt 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcttggatca gattgtttgc tctag 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttgtgatgt tagagcaaac aaacc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
attctagagt caagcagatc gttca 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgatgctgt tctgccattt cttag 25
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgaaacaga cggggctcc 19
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taagcgtcaa tttgtttaca ccaca 25
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggcagagtg gggagagaag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tttgcttgct tgcttggacc 20
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tacttgttga tgggacctca ttgat 25
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atcagatctt gatcccctgc g 21
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atatcatttg cctgtaaccg gtttc 25
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
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<400> 22
gatgaggcta cccaccttct tc 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgctggttg ttgataccga tattg 25
<210> 24
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<212> DNA
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ggttgcaaca taactatcta caccg 25
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatccccct ttcgccag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagcatatg caaagtcaga taaact 26
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgcgattgc gattgcgatg 20
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<212> DNA
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acaatcaaga taaggatttg ataccact 28
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttaaccgacg agtatctact gatgg 25
Claims (9)
1.一种检测水稻转基因品系的引物对组合物，其特征在于，所述引物对组合物中：
特异性扩增Bt63的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2、和SEQ IDNO.3至SEQ ID NO.4所示；
特异性扩增G6H1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示；
特异性扩增LLRICE62的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.8所示；
特异性扩增LLRICE601的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9至SEQIDNO.10所示；
特异性扩增KF2的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.12所示；
特异性扩增KF8的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.14所示；
特异性扩增KMDF1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.16所示；
特异性扩增T1C-9的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17至SEQ ID NO.18所示；
特异性扩增M12的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.20所示；
特异性扩增T2A-1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.22所示；和，
特异性扩增Kefeng6的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23至SEQ ID NO.24、和SEQID NO.25至SEQ ID NO.26所示。
2.根据权利要求1所述的引物对组合物，其特征在于，所述引物对组合物还包括特异性扩增内参基因PLD的引物对。
3.根据权利要求2所述的引物对组合物，其特征在于，所述特异性扩增内参基因PLD的引物对包括：第一对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.27至SEQ ID NO.28所示；第二对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.30所示。
4.一种检测水稻转基因品系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任意一项所述的引物对组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内含有所述引物对组合物。
7.一种如权利要求1-3任一项所述的引物对组合物用于检测水稻转基因品系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
得到待测水稻的DNA和引物对组合物；
以所述DNA为模板，将所述引物对组合物加入反应体系中进行扩增反应，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行高通量测序，得到高通量文库；
将所述高通量文库中的基因序列进行分析，得到检测水稻转基因品系的结果。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高通量文库的浓度≥2ng/ul。
9.引物对组合物的用途，其特征在于，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测水稻转基因的品系；
所述引物对组合物包括序列如SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.26所示的引物。
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|---|---|---|---|---|
| CN103333957A (zh) * | 2013-06-06 | 2013-10-02 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 转基因水稻kf8品系的pcr-dhplc检测引物及检测方法 |
| CN103923999A (zh) * | 2014-04-25 | 2014-07-16 | 浙江省农业科学院 | 转基因抗虫耐除草剂水稻g6h1及其衍生品种的定性pcr检测方法 |
| CN104031982A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-09-10 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量pcr检测引物、检测方法和试剂盒 |
| CN112126706A (zh) * | 2020-10-26 | 2020-12-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法 |
| CN112877460A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-01 | 大连海关技术中心 | 转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用 |
| CN114107552A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-03-01 | 江汉大学 | 一种检测油菜转基因品系的引物对组合、试剂盒、检测方法及应用 |
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-
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103333957A (zh) * | 2013-06-06 | 2013-10-02 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 转基因水稻kf8品系的pcr-dhplc检测引物及检测方法 |
| CN104031982A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-09-10 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量pcr检测引物、检测方法和试剂盒 |
| CN103923999A (zh) * | 2014-04-25 | 2014-07-16 | 浙江省农业科学院 | 转基因抗虫耐除草剂水稻g6h1及其衍生品种的定性pcr检测方法 |
| CN112126706A (zh) * | 2020-10-26 | 2020-12-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种抗虫转基因水稻mfb-MH3301品系特异性定性PCR检测引物、检测方法 |
| CN112877460A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-01 | 大连海关技术中心 | 转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用 |
| CN114107552A (zh) * | 2022-01-04 | 2022-03-01 | 江汉大学 | 一种检测油菜转基因品系的引物对组合、试剂盒、检测方法及应用 |
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