CN117660554A - 一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，包括以下步骤：（1）诱变；（2）菌种活化：将菌种转接到斜面培养基上，25℃恒温培养4‑5d；（3）种子培养：用无菌水将斜面上的孢子制成孢子悬液，将孢子悬液接种到种子培养基中进行培养，得到种子培养液；（4）发酵培养：将种子培养液接种到基础发酵培养基中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养6‑8d，得到聚苹果酸发酵液。本发明采用生物发酵法减少了化学法对环境的污染，降低生产成本，同时通过优化碳源、氮源的种类，添加适量的亮氨酸也有助于提高出芽短梗霉发酵法生产聚苹果酸的产量及分子量，为后续工业化生产提供有利条件。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法。
背景技术
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一种具有酵母型和菌丝形态的的多型真菌，其形态较黏菌相对稳定，合成PMLA的能力也相对较强。出芽短梗霉合成的PMLA分为两部分，其中一部分以β-PMLA-葡聚糖结合体的形式分泌，另一部分被分解为自由β-PMLA分泌到细胞外。
聚苹果酸又名聚羟基丁二酸酯，是一种具有良好生物相容性及生物降解性的水溶性脂肪族聚酯类化合物，PMLA是以重复的L-苹果酸为单体，通过-OH和α-或β-COOH形成的酯键聚合而成，主要有三种构型：α型、β型、γ型。
目前，聚苹果酸的合成方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法主要有开环聚合法和直接聚合法，可以得到3种构型的PMLA，其中开环聚合法技术较为成熟。但与生物合成法相比，化学法合成的PMLA分子量较小，合成步骤长，提纯工艺复杂，严重制约了其规模化发展。微生物合成法是由微生物体内通过三羧酸循环代谢仅存有β-型，能得到相对分子量较大的PMLA，且具有较高的化学纯度和光学纯度，性能优异。
PMLA发酵培养基的主要成分有碳源、氮源、无机盐和有机酸，碳源和氮源是微生物生长代谢得主要营养物质，低浓度的无机盐能够促进细胞的生长和产物合成。
目前对出芽短梗霉发酵产聚苹果酸的研究主要集中在发酵菌株的筛选和产量的提高上，公开号CN105624218A的发明专利通过改善细胞膜通透性，添加CTTE和DMSO组成的活性剂，结合阶段控温的方法使聚苹果酸产量提高40%。公开号CN103045662B的发明专利通过优化氨基酸、胆碱和嘌呤嘧啶生长因子复配代替传统培养基中的蛋白胨，使聚苹果酸产量达到33-40g/L，并且降低了后续提取过程的脱色难度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，以复合诱变后的出芽短梗霉发酵生产β-PMLA的基础工艺上进行深入研究，实现β-聚苹果酸产量和分子量的最大化和工艺的最优化。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种诱变：以出芽短梗霉菌为出发菌种，采用甲基磺酸乙酯+紫外照射复合诱变，获得正向突变的稳定菌株；
（2）菌种活化：将（1）中诱变得到的菌种用接种环转接到新鲜PDA斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天；
（3）种子培养：用无菌水将斜面上的孢子制成孢子悬液，将孢子悬液按10%v/v接种量接种到种子培养基中进行培养，得到种子培养液；
（4）发酵培养：将（3）中种子培养液按10%v/v接种量接种到基础发酵培养基中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养6-8d，得到聚苹果酸发酵液。
进一步的，步骤（3）中种子培养基的培养条件为摇床转速220-250rpm，25℃培养48h。
进一步的，步骤（3）中种子培养基的组成g/L为：蔗糖60.0，酵母膏3.0，丁二酸2.0，硫酸铵1.0，K2CO30.4，KH2PO40.1，MgSO4•7H2O 0.1，ZnSO4•7H2O 0.005，玉米浆0.1%，CaCO320.0。
进一步的，步骤（4）中基础培养基的组成g/L为：蔗糖100.0，蛋白胨35.0，KH2PO40.1，NaNO32.0，MgSO4·7H2O 0.3，KCl 0.5，MgSO40.05，CaCO320.0。
进一步的，步骤（4）中发酵培养基碳源为蔗糖、葡萄糖、木糖中的一种，氮源为硝酸钠、尿素、硫酸铵和丁二酸铵中的一种。
进一步的，步骤（4）中发酵培养基的组成为：100 g/L葡萄糖，35 g/L蛋白胨，2 g/L丁二酸铵，0.1 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCI，0.05 g/L MgSO4。
进一步的，步骤（4）中发酵培养基中还添加有0.5~0.8g/L亮氨酸。
进一步的，所述聚苹果酸分子量在8000~9200，产量在28~41g/L。
进一步的，所述 EMS浓度0.4mol/L，作用时间35min；所述紫外为30W紫外灯照射时间120s，照射距离30cm。
进一步的，步骤（3）中发酵培养基中还添加有0.5~0.8g/L亮氨酸。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
（1）本发明提供的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，采用生物发酵法减少了化学法对环境的污染，降低生产成本，同时通过优化碳源、氮源的种类，添加适量的亮氨酸也有助于提高出芽短梗霉发酵法生产聚苹果酸的产量及分子量，为后续工业化生产提供有利条件。
（2）本发明提供的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，聚苹果酸产量在28~41g/L，分子量在8000~9200Da。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1是本发明实施例的工艺流程图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明以一株出芽短梗霉菌CICC 2696为出发菌种，采用“甲基磺酸乙酯(EMS)+紫外(UV)”复合诱变。EMS浓度0.4mol/L，作用时间35min；30W紫外灯照射时间120s，照射距离30cm。获得正向突变的稳定菌株，命名为jp-316。
实施例1
（1）菌种活化：将斜面保藏的菌种jp-316取出用接种环转接到新鲜PDA斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天。活化培养基：PDA培养基。
（2）种子培养：取活化好的斜面菌种，用无菌水将斜面上的孢子洗下，制成孢子悬液。将该孢子悬液按照10%（V/V）接种量，即取10mL接种到90mL种子培养中培养，摇床转速220-250rpm，25℃培养48h得到种子培养液。种子培养基组成（g/L）：蔗糖60.0，酵母膏3.0，丁二酸2.0，硫酸铵1.0，K2CO30.4，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.005，玉米浆0.1%，CaCO320.0（单独灭菌）。
（3）发酵培养：将培养好的种子培养液按10%（V/V）接种量，即取10mL接种到90mL基础发酵培养中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养192h，即可获得聚苹果酸发酵液。发酵培养基组成（g/L）：蔗糖100.0，蛋白胨35.0，KH2PO40.1，NaNO32.0，MgSO4·7H2O 0.3，KCl 0.5，MgSO40.05，CaCO320.0（单独灭菌），pH自然。
（4）β-PMLA的测定方法：取10mL发酵液，经转速12000 r/min离心10 min除去菌体，取5 mL上清液加入等体积1 mol/L的H2SO4溶液，调节温度90℃，水解12 h，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法（HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，两者之差即为聚苹果酸的产量（g/L）。
（5）β-PMLA分子量的测定方法：采用凝胶渗透色谱法进行分子量的测定。GPC检测β-PMLA分子量的条件：色谱柱为凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm）；柱温25℃；参比池温度30℃；流动相为5 mmol/L Na2SO4溶液；进样量20 μL；pH自然；流速0.5 mL/min。
（6）经检测，聚苹果产量28.6g/L，分子量8031Da。
实施例2
（1）菌种活化：将斜面保藏的菌种jp-316取出用接种环转接到新鲜PDA斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天。活化培养基：PDA培养基。
（2）种子培养：同实施例1。
（3）发酵培养：将培养好的种子培养液按10%（V/V）接种量，即取10mL接种到90mL发酵培养中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养180h，即可获得聚苹果酸发酵液。发酵培养基组成（g/L）：葡萄糖100.0，蛋白胨35.0，KH2PO40.1，丁二酸胺 2.0，MgSO4·7H2O0.3，KCl 0.5，MgSO40.05，CaCO320.0（单独灭菌），pH自然。
（4）β-PMLA产生量的测定方法：取10mL发酵液，经转速12000 r/min离心10 min除去菌体，取5 mL上清液加入等体积1 mol/L的H2SO4溶液，调节温度90℃，水解12 h，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法（HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，两者之差即为聚苹果酸的产量（g/L）。
（5）β-PMLA分子量的测定方法：采用凝胶渗透色谱法进行分子量的测定。GPC检测β-PMLA分子量的条件：色谱柱为凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm）；柱温25℃；参比池温度30℃；流动相为5 mmol/L Na2SO4溶液；进样量20 μL；pH自然；流速0.5 mL/min。
（6）经检测，聚苹果产量34.04g/L，分子量8207Da。
实施例3
以实施例2为基础，添加氨基酸，优化pH；250mL摇瓶发酵，装量100mL。
（1）菌种活化：将斜面保藏的菌种jp-316取出用接种环转接到新鲜PDA斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天。活化培养基：PDA培养基。
（2）种子培养：同实施例1。
（3）发酵培养：将培养好的种子培养液按10%（V/V）接种量，即取10mL接种到90mL发酵培养中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养发酵180h，即可获得聚苹果酸发酵液。发酵培养基组成（g/L）：葡萄糖100.0，蛋白胨35.0，KH2PO40.1，丁二酸胺 2.0，MgSO4·7H2O 0.3，KCl 0.5，MgSO40.05，亮氨酸0.5，CaCO320.0（单独灭菌），pH4.0。
（4）β-PMLA产生量的测定方法：取10mL发酵液，经转速12000 r/min离心10 min除去菌体，取5 mL上清液加入等体积1 mol/L的H2SO4溶液，调节温度90℃，水解12 h，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法（HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，两者之差即为聚苹果酸的产量（g/L）。
（5）β-PMLA分子量的测定方法：采用凝胶渗透色谱法进行分子量的测定。GPC检测β-PMLA分子量的条件：色谱柱为凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm）；柱温25℃；参比池温度30℃；流动相为5 mmol/L Na2SO4溶液；进样量20 μL；pH自然；流速0.5 mL/min。
（6）经检测，聚苹果产量32.8g/L，分子量9172Da。
实施例4
以实例3为基础，采用5L发酵罐，装量3L，优化通风量、搅拌速度。
（1）菌种活化：将斜面保藏的菌种取出用接种环转接到新鲜PDA斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天。活化培养基：PDA培养基。
（2）种子培养：取活化好的斜面菌种，用无菌水将斜面上的孢子洗下，制成孢子悬液。将该孢子悬液按照10%（V/V）接种量，摇床转速220-250rpm，25℃培养48h得到种子培养液。种子培养基组成（g/L）：蔗糖60.0，酵母膏3.0，丁二酸2.0，硫酸铵1.0，K2CO30.4，KH2PO40.1，MgSO4•7H2O 0.1，ZnSO4•7H2O 0.005，玉米浆0.1%，CaCO320.0（单独灭菌）。
（3）发酵罐培养：将培养好的种子培养液按10%（V/V）接种量，即取300mL接种到5mL发酵罐中培养发酵，初始装液量3L，25℃培养发酵172h，通风量3.0vvm，搅拌转速400r/min，即可获得聚苹果酸发酵液。发酵培养基组成（g/L）：葡萄糖100.0，蛋白胨35.0，KH2PO40.1，丁二酸胺 2.0，MgSO4•7H2O 0.3，KCl 0.5，MgSO40.05，亮氨酸0.5，CaCO320.0（单独灭菌），pH4.0。
（4）β-PMLA产生量的测定方法：取10mL发酵液，经转速12000 r/min离心10 min除去菌体，取5 mL上清液加入等体积1 mol/L的H2SO4溶液，调节温度90℃，水解12 h，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法（HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，两者之差即为聚苹果酸的产量（g/L）。
（5）β-PMLA分子量的测定方法：采用凝胶渗透色谱法进行分子量的测定。GPC检测β-PMLA分子量的条件：色谱柱为凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm）；柱温25℃；参比池温度30℃；流动相为5 mmol/L Na2SO4溶液；进样量20 μL；pH自然；流速0.5 mL/min。
（6）经检测，聚苹果产量36.37g/L，分子量9281Da。
实施例5
以实施例4为基础，30L发酵罐，装量20L，调整补料方式。
（1）菌种活化：将斜面保藏的菌种取出用接种环转接到新鲜PDA斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天。活化培养基：PDA培养基。
（2）种子培养：同实施例4。
（3）发酵罐培养：将培养好的种子培养液按10%（V/V）接种量，即取1.8L接种到30L发酵罐中培养，初始装液量20L（发酵培养基配料，以葡萄糖为65g/L计加入），通风量3.0vvm，搅拌转速400r/min，当残糖浓度接近25g/L时加入735g/L葡萄糖的发酵培养基1L，25℃条件下培养发酵共168h，即可获得聚苹果酸发酵液。发酵培养基组成与实施例4相同。
（4）β-PMLA产生量的测定方法：取10mL发酵液，经转速12000 r/min离心10 min除去菌体，取5 mL上清液加入等体积1 mol/L的H2SO4溶液，调节温度90℃，水解12 h，将聚苹果酸完全水解为单体苹果酸。高效液相色谱法（HPLC）检测水解前后的苹果酸的含量，两者之差即为聚苹果酸的产量（g/L）。
（5）β-PMLA分子量的测定方法：采用凝胶渗透色谱法进行分子量的测定。GPC检测β-PMLA分子量的条件：色谱柱为凝胶色谱柱（8.0 mm×300 mm）；柱温25℃；参比池温度30℃；流动相为5 mmol/L Na2SO4溶液；进样量20 μL；pH自然；流速0.5 mL/min。
（6）经检测，聚苹果产量43.02g/L，分子量9214Da。
最后应说明的是：
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种诱变：以出芽短梗霉菌为出发菌种，采用甲基磺酸乙酯+紫外照射复合诱变，获得正向突变的稳定菌株；
（2）菌种活化：将（1）中诱变得到的菌种用接种环转接到新鲜PDA斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天；
（3）种子培养：用无菌水将斜面上的孢子制成孢子悬液，将孢子悬液按10%v/v接种量接种到种子培养基中进行培养，得到种子培养液；
（4）发酵培养：将（3）中种子培养液按10%v/v接种量接种到基础发酵培养基中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养6-8d，得到聚苹果酸发酵液。
2.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（3）中种子培养基的培养条件为摇床转速220-250rpm，25℃培养48h。
3. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（3）中种子培养基的组成g/L为：蔗糖60.0，酵母膏3.0，丁二酸2.0，硫酸铵1.0，K2CO3 0.4，KH2PO4 0.1，MgSO4•7H2O 0.1，ZnSO4•7H2O 0.005，玉米浆0.1%，CaCO3 20.0。
4. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中基础培养基的组成g/L为：蔗糖100.0，蛋白胨35.0，KH2PO4 0.1，NaNO3 2.0，MgSO4·7H2O 0.3，KCl 0.5，MgSO4 0.05，CaCO3 20.0。
5.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵培养基碳源为蔗糖、葡萄糖、木糖中的一种，氮源为硝酸钠、尿素、硫酸铵和丁二酸铵中的一种。
6. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵培养基的组成为：100 g/L葡萄糖，35 g/L蛋白胨，2 g/L丁二酸铵，0.1g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCI，0.05 g/L MgSO4。
7.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵培养基中还添加有0.5~0.8g/L亮氨酸。
8.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，所述聚苹果酸分子量在8000~9200，产量在28~41g/L。
9. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，所述 EMS浓度0.4mol/L，作用时间35min；所述紫外为30W紫外灯照射时间120s，照射距离30cm。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101955888A (zh) * | 2010-06-25 | 2011-01-26 | 朱笃 | 高产油脂皮状丝孢酵母突变株b3及其ems和紫外线复合诱变选育方法 |
| CN101979499A (zh) * | 2009-10-29 | 2011-02-23 | 天津科技大学 | 一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法 |
| CN102876590A (zh) * | 2012-10-17 | 2013-01-16 | 广西大学 | 一株青霉突变株及其在制备纤维素酶中的应用 |
| CN103509830A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-01-15 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种通过联合调节生产不同分子量聚苹果酸的方法 |
| CN107653272A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-02-02 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法 |
| CN108841879A (zh) * | 2018-07-11 | 2018-11-20 | 天津慧智百川生物工程有限公司 | 一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法 |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101979499A (zh) * | 2009-10-29 | 2011-02-23 | 天津科技大学 | 一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法 |
| CN101955888A (zh) * | 2010-06-25 | 2011-01-26 | 朱笃 | 高产油脂皮状丝孢酵母突变株b3及其ems和紫外线复合诱变选育方法 |
| CN102876590A (zh) * | 2012-10-17 | 2013-01-16 | 广西大学 | 一株青霉突变株及其在制备纤维素酶中的应用 |
| CN103509830A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-01-15 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种通过联合调节生产不同分子量聚苹果酸的方法 |
| CN107653272A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-02-02 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法 |
| CN108841879A (zh) * | 2018-07-11 | 2018-11-20 | 天津慧智百川生物工程有限公司 | 一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 乔长晟;郝华旋;姜少丽;敖爱华;王坤;: "紫外氦氖诱变选育高产聚苹果酸菌株", 现代食品科技, vol. 27, no. 11, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 1325 - 1327 * |
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