CN103509830A - 一种通过联合调节生产不同分子量聚苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产不同分子量的聚苹果酸的方法。包括以下步骤：出芽短梗霉种子液接种到发酵培养基，发酵生产聚苹果酸；发酵培养基中天门冬氨酸的含量控制在0.25～0.45g/L。发酵过程中调控发酵液pH为6.0～7.0。生产不同分子量的聚苹果酸。优点：本发明通过对发酵过程的调控，获得不同分子量的聚苹果酸，从而根据聚苹果酸聚合度的不同，使其在食品、医药、化工和石油领域得到更广泛合理的应用；通过天门冬氨酸与pH协同作用，对发酵培养基的进一步优化，生产的聚苹果酸分子量能够更准确地定向在一个较小的范围，以满足人们对不同聚合度的聚苹果酸的需求。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种出芽短梗霉发酵生产不同分子量聚苹果酸的方法。
背景技术
现在，大部分合成高分子是石油化学产品，对环境产生了深远的影响。而随着人们环境保护知识的积累，引起了传统的不可降解高分子生产的改变。目前，人们关注的重点是环境友好型的生物可降解高分子，这些高分子聚合物的生产有利于节约能源和资源，从而减缓温室效应，发展生态协调的工艺过程和产品。
聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯，Poly malic acid或Poly malate,简称为PMLA）是以苹果酸为唯一单体合成的高分子聚合物。苹果酸是一种含有羟基的二羧酸，它是一种很好的食品添加剂，其水溶解性很强,在体内主要参与三羧酸(TCA)循环。聚合时通过其羟基和羧基酯化连接而成为高分子化合物。苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有三种，即α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人体内的只有β型PMLA（结构如下）。
聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯）属于聚酯类聚合物，是完全生物降解高分子。生物降解性材料是指通过自然界微生物（细菌、真菌等）作用而发生降解的高分子物质。该种材料降解的产物无毒无害,不会对环境产生二次污染,近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。在国外，有关聚苹果酸的研究开始于上世纪60年代，对于其性质、用途、合成方法都有一定的研究和报道，聚苹果酸主要应用于药物载体和微胶囊材料，其合成方法主要集中于化学合成，β型聚苹果酸已有商业产品。而国内还刚刚起步，对聚苹果酸的研究非常少，几乎为空白。因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究的平台，具有重要的理论价值和应用价值。
目前国际上有关利用微生物发酵生产聚苹果酸的专利非常少，我国有关聚苹果酸的专利中，万印华等申请专利CN102154389A中公开了流加碳源和无机盐实现聚苹果酸的高产，其发酵液pH维持在4.0～4.5，培养基中未添加天门冬氨酸；乔长晟等申请专利CN101979499A中公开了多组复合诱变技术选育出的高产β-聚苹果酸的诱变菌株，然后对发酵培养基进行优化发酵生产β-聚苹果酸，该专利中未提及发酵过程中pH控制情况，培养基中也未添加天门冬氨酸；乔长晟等申请专利CN101560528公开了一种利用普鲁兰酶有效降解去除出芽短梗霉发酵液中普鲁兰多糖，以利于提取获得β-聚苹果酸的方法，其发酵液pH稳定在4.5，培养基中没有添加天门冬氨酸；乔长晟等申请专利CN103045662A公开了一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，该专利中未提及发酵过程中pH控制情况，虽然培养基 中添加了天门冬氨酸，但只是作为氨基酸的一种，用来替代原半合成培养基中的蛋白胨，并没有提到与聚苹果酸分子量的关系。
在目前公开专利中主要集中在β-聚苹果酸的生产菌种和发酵工艺中，没有研究天冬氨酸联合pH对聚苹果酸分子量的影响，与本专利存在本质区别。
利用微生物发酵生产β-聚苹果酸的方法中，大多需要加入部分有机氮源（如蛋白胨）以保证菌体的正常生长和β-聚苹果酸的合成。但利用有机氮源存在原料成本较高，后期提取困难，得到的β-聚苹果酸纯度不高等问题。因此，寻求更廉价、更简单的培养基成为必然之路。
发明内容
本发明的目的是通过对发酵过程的调控，提供了一种生产不同分子量的聚苹果酸的方法，以满足人们对不同聚合度的聚苹果酸的需求。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种调节生产不同分子量聚苹果酸的方法，包括如下步骤：出芽短梗霉种子液接种到发酵培养基，发酵生产聚苹果酸；发酵培养基中天门冬氨酸的含量控制在0.25～0.45g/L。发酵过程中调控发酵液pH为6.0～7.0。生产不同分子量的聚苹果酸。
所述发酵方法如下：以10%的体积比将出芽短梗霉种子液接种到5L的发酵罐中，培养基装液量3L，通风量1.0V/V,转速400r/min，25℃培养120h，每隔2h取样，使用氨基柱采用高效液相色谱法检测天门冬氨酸含量，当其浓度低于0.25g/L时，计算其添加量，通过流加10g/L天门冬氨酸溶液，控制发酵液中天门冬氨酸浓度维持在0.25～0.45g/L；在60～120h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH分别稳定在6.0或6.5或7.0，发酵结束后离心除去菌体。
优选的发酵培养基组成为：蔗糖120g/L、NaNO32g/L、KH2PO40.1g/L、KCl0.4g/L、MnSO40.05g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、CaCO320g/L、NH4NO314.5g/L、天门冬氨酸0.25～0.45g/L、亮氨酸0.58g/L、苏氨酸0.25g/L、缬氨酸0.5g/L、组氨酸0.35g/L、胞嘧啶0.001g/L、腺嘌呤0.0015g/L、胆碱0.1g/L，其余为水，初始pH7.0。
所述种子液的制备方法可以如下：将出芽短梗霉菌株进行活化，转接到500ml的挡板瓶中，培养基装液量50ml，恒温25℃,200r/min摇床培养72h制得种子液。
优选的种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
天门冬氨酸的调节作用：变化范围0.25～0.45g/L,随着天门冬氨酸含量增加聚苹果酸分子量变大，但天门冬氨酸增加到一定量之后，聚苹果酸分子量反而下降，聚苹果酸分子量 在4000～50000道尔顿之间波动。
天门冬氨酸与pH协同作用：天门冬氨酸0.25～0.30g/L，发酵中后期调控pH稳定在6.0，可控制聚苹果酸分子量在4000-5000道尔顿；天门冬氨酸0.30～0.35g/L，发酵中后期调控pH稳定在6.5，可控制聚苹果酸分子量在8000-10000道尔顿；天门冬氨酸0.35～0.40g/L，发酵中后期调控pH稳定在7.0，可控制聚苹果酸分子量在40000-50000道尔顿，天门冬氨酸0.40～0.45g/L，发酵中后期调控pH稳定在7.0，可控制聚苹果酸分子量在20000-30000道尔顿。
有益效果：
本发明采用改变发酵培养基中天门冬氨酸的含量，结合发酵过程中对pH的调控，影响聚苹果酸合成及降解过程中酶的活性，进而获得不同分子量的聚苹果酸，从而根据聚苹果酸聚合度的不同，使其在食品、医药、化工和石油领域得到更广泛合理的应用，进一步满足人们的需求。
不同的pH条件下，TCA循环中的延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、聚苹果酸聚合酶以及聚苹果酸降解酶的活性不同，从而影响聚苹果酸的聚合度，进而改变聚苹果酸的分子量。天门冬氨酸与pH协同作用，能够进一步调控生产聚苹果酸的分子量。通过对发酵培养基的进一步优化，生产的聚苹果酸分子量能够更准确地定向在一个较小的范围。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，
本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种生产不同分子量聚苹果酸的发酵方法，步骤如下：
1、发酵培养基成分：蔗糖120g/L、NaNO32g/L、KH2PO40.1g/L、KCl0.4g/L、MnSO40.05g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、CaCO320g/L、NH4NO314.5g/L、天门冬氨酸0.25～0.30g/L、亮氨酸0.58g/L、苏氨酸0.25g/L、缬氨酸0.5g/L、组氨酸0.35g/L、胞嘧啶0.001g/L、腺嘌呤0.0015g/L、胆碱0.1g/L，其余为水，初始pH7.0。
2、将出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC3336菌株进行活化6～8h，即将其从蔗糖斜面培养基转接到500ml的挡板瓶中，装液量为50ml，恒温25℃,200r/min培养72h 制得种子液；种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
3、以10%的体积比将步骤2所得的种子液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V),400r/min，25℃培养120h，每隔2h取样，使用氨基柱采用高效液相色谱法检测天门冬氨酸含量，当其浓度低于0.25g/L时，计算其添加量，通过流加10g/L天门冬氨酸溶液，以保证发酵液中天门冬氨酸浓度维持在0.25～0.30g/L；每隔2h取样，使用紫外分光光度计在波长600nm处检测发酵液OD，看菌体的生长情况，发酵液稀释相当倍数使测量数值落在分光光度计测量范围内，当OD在0.7～0.8（一般情况下是60h左右）这个范围内时，菌体浓度大概在15g/L，此时用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到6.0，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至聚苹果酸浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在4000-5000道尔顿。
实施例2
一种生产不同分子量聚苹果酸的发酵方法，步骤如下：
1、发酵培养基成分：蔗糖120g/L、NaNO32g/L、KH2PO40.1g/L、KCl0.4g/L、MnSO40.05g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、CaCO320g/L、NH4NO314.5g/L、天门冬氨酸0.30～0.35g/L、亮氨酸0.58g/L、苏氨酸0.25g/L、缬氨酸0.5g/L、组氨酸0.35g/L、胞嘧啶0.001g/L、腺嘌呤0.0015g/L、胆碱0.1g/L，其余为水，初始pH7.0。
2、种子液的制备和所用菌种基本同实施例1；种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
3、以10%的体积比将步骤2所得的种子液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V),400r/min，25℃培养120h，每隔2h取样，使用氨基柱采用高效液相色谱法检测天门冬氨酸含量，当其浓度低于0.30g/L时，计算其添加量，通过流加10g/L天门冬氨酸溶液，以保证发酵液中天门冬氨酸浓度维持在0.30～0.35g/L；每隔2h取样，使用紫外分光光度计在波长600nm处检测发酵液OD，看菌体的生长情况，发酵液稀释相当倍数使测量数值落在分光光度计测量范围内，当OD在0.7～0.8（一般情况下是60h左右）这个范围内时，菌体浓度大概在15g/L，此时用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到6.5，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至聚苹果酸浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在8000-10000道尔顿。
实施例3
一种生产不同分子量聚苹果酸的发酵方法，步骤如下：
1、发酵培养基成分：蔗糖120g/L、NaNO32g/L、KH2PO40.1g/L、KCl0.4g/L、MnSO40.05g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、CaCO320g/L、NH4NO314.5g/L、天门冬氨酸0.35～0.4g/L、亮氨酸0.58g/L、苏氨酸0.25g/L、缬氨酸0.5g/L、组氨酸0.35g/L、胞嘧啶0.001g/L、腺嘌呤0.0015g/L、胆碱0.1g/L，其余为水，初始pH7.0。
2、种子液的制备和所用菌种基本同实施例1；种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
3、以10%的体积比将步骤2所得的种子液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V),400r/min，25℃培养120h，每隔2h取样，使用氨基柱采用高效液相色谱法检测天门冬氨酸含量，当其浓度低于0.35g/L时，计算其添加量，通过流加10g/L天门冬氨酸溶液，以保证发酵液中天门冬氨酸浓度维持在0.35～0.40g/L；每隔2h取样，使用紫外分光光度计在波长600nm处检测发酵液OD，看菌体的生长情况，发酵液稀释相当倍数使测量数值落在分光光度计测量范围内，当OD在0.7～0.8（一般情况下是60h左右）这个范围内时，菌体浓度大概在15g/L，此时用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到7.0，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至聚苹果酸浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在40000-50000道尔顿。
实施例4
一种生产不同分子量聚苹果酸的发酵方法，步骤如下：
1、发酵培养基成分：蔗糖120g/L、NaNO32g/L、KH2PO40.1g/L、KCl0.4g/L、MnSO40.05g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、CaCO320g/L、NH4NO314.5g/L、天门冬氨酸0.4～0.45g/L、亮氨酸0.58g/L、苏氨酸0.25g/L、缬氨酸0.5g/L、组氨酸0.35g/L、胞嘧啶0.001g/L、腺嘌呤0.0015g/L、胆碱0.1g/L，其余为水，初始pH7.0。
2、种子液的制备和所用菌种基本同实施例1；种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
3、以10%的体积比将步骤2所得的种子液接到5L（装液量为3L）的发酵罐中，通风量1.0(V/V),400r/min，25℃培养120h，每隔2h取样，使用氨基柱采用高效液相色谱法检测天门冬氨酸含量，当其浓度低于0.40g/L时，计算其添加量，通过流加10g/L天门冬氨酸溶液，以保证发酵液中天门冬氨酸浓度维持在0.40～0.45g/L；每隔2h取样，使用紫外分光光度计在波长600nm处检测发酵液OD，看菌体的生长情况，发酵液稀释相当倍数使测量数值落在分光光度计测量范围内，当OD在0.7～0.8（一般情况下是60h左右）这个范围内时，菌体浓度大概在15g/L，此时用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到7.0，直至发酵结束。结束后离心除去菌体。
4、取上清用流动相稀释相当倍数，至聚苹果酸浓度在1～3g/L，通过示差检测器对其分子量进行检测，分子量在20000-30000道尔顿。
Claims (4)
1.一种调节生产不同分子量聚苹果酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：出芽短梗霉种子液接种到发酵培养基，发酵生产聚苹果酸；发酵培养基中天门冬氨酸的含量控制在0.25～0.45g/L，发酵过程中调控发酵液pH为6.0～7.0；生产不同分子量的聚苹果酸。
2.根据权利要求1所述的调节生产不同分子量聚苹果酸的方法，其特征在于，通过流加10g/L天门冬氨酸溶液，控制发酵液中天门冬氨酸浓度维持在0.25～0.45g/L；在60～120h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH分别稳定在6.0或6.5或7.0。
3.根据权利要求1所述的调节生产不同分子量聚苹果酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：以10%的体积比将出芽短梗霉种子液接种到5L的发酵罐中，通风量1.0V/V,400r/min，25℃培养120h，流加10g/L天门冬氨酸溶液，以保证发酵液中天门冬氨酸浓度维持在0.25～0.30g/L；当OD在0.7～0.8这个范围内时，用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH稳定到6.0，直至发酵结束;结束后离心除去菌体。
4.根据权利要求1-2任一所述的调节生产不同分子量聚苹果酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：蔗糖120g/L、NaNO32g/L、KH2PO40.1g/L、KCl0.4g/L、MnSO40.05g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、CaCO320g/L、NH4NO314.5g/L、天门冬氨酸0.25～0.45g/L、亮氨酸0.58g/L、苏氨酸0.25g/L、缬氨酸0.5g/L、组氨酸0.35g/L、胞嘧啶0.001g/L、腺嘌呤0.0015g/L、胆碱0.1g/L，其余为水,初始pH7.0。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140115 |