发明内容
本发明目的在于提供一株高产油脂酵母-皮状丝孢酵母突变株B3。
本发明所述的菌株皮状丝孢酵母B3,Trichosporon cutaneum B3,保藏于中国典型培养物保 藏中心,保藏单位地址为:中国武汉武汉大学,中国保藏号为CCTCC NO.M 2010076,保藏日期为2010年4月9日,摇瓶培养其油脂含量达53.52%,是野生菌株的1.78倍。
所述的皮状丝胞酵母有以下微生物学特征:
1.形态学上特征为:
①细胞形态呈圆形、椭圆形或者柱形的,对数生长期主要以长丝状存在;②大小为3~6×4~30μm;③菌落为白色,呈奶酪状,光滑;
2.该菌株的生理生化特征为:
①本菌株可以利用合成培养基生长;②培养时间:5~7天;③对氧气的需求:好气;
④生长pH范围:5.5~6.5;⑤生长最适宜温度:28~30℃;⑥生成生物油脂主要成份:C16、C18系饱和和不饱和脂肪酸,为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、棕搁油酸中的一种或几种。
本发明还提供皮该状丝孢酵母菌种B3的选育方法,即利用甲基磺酸乙酯和紫外线诱变方法进行复合诱变、结合磷酸香草醛法进行初筛以及索氏抽提法进行复筛和验证、选育出一株产油脂率高且遗传稳定的突变菌株。
本发明所述选育方法包括如下步骤:
①菌悬液的制备
将保存的菌种转接到马铃薯斜面培养基上,28℃培养3天后,在装有玻璃珠的三角瓶内无菌水洗活化菌种,尽可能洗下菌体,将少量菌丝打碎制成菌悬液,浓度控制在约100-1000cfu/mL。
②甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变
③初筛:通过磷酸香草醛法对高产油脂皮状丝孢酵母进行初筛。
④复筛:用索氏抽提法抽提出油脂,通过比较单位菌体油脂量的多少来进行复筛。
⑤验证高产菌株
将复筛后得到的高产菌株传代培养4次,每次都用与复筛一样的方法——索氏抽提法,对菌株产油率稳定性进行验证。
⑥高产菌株的保藏
将筛选出的一株高产油脂和遗传性稳定的皮状丝孢酵母B3采用甘油管法和冷冻干燥法进行保藏。
本发明所述方法的具体步骤为:
①取马铃薯培养基(PDA)上培养3~4天的皮状丝孢酵母出发菌株,用pH 6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液,经10~15倍系列稀释达到浓度100~1000cfu/mL备用;
②用EMS溶液诱变处理①中培养的皮状丝孢酵母出发菌株0.5~5小时后,加入1~10mL25%硫代硫酸纳终止剂,5~30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变;
③取0.1mL经②步骤处理的培养液均匀涂布于PDA平板上,黑暗培养6~24小时,然后置于28~30℃培养箱中正常培养3~4天;
④将步骤③中培养出的菌落挑出,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,收集菌体,稀释到660nm下相同的OD值;
⑤用硫酸-磷酸香草醛反应分析经④步骤培养及稀释的菌体中油脂含量,并挑出含油 量高的菌株进行复筛;
⑥将初筛中挑选出来的菌株,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,离心收集菌体用蒸馏水洗三次,再将菌体在60±5℃下干燥24小时,待其恒重后,用索氏抽提法进行油脂的提取,计算单个细胞的含油率,挑选出高产产油的菌株;
⑦将复筛后得到的高产菌株扩大培养5~8次,每次采用⑥的方法对菌株的稳定性进行验证,筛选得到高产、稳定的突变菌株。
本发明EMS和紫外线复合诱变处理的出发菌株培养物处于对数生长期。
本发明所述化学诱变剂EMS的诱变浓度为1%~8%。
本发明紫外照射诱变采用15W或30W紫外灯,提前预热20~30分钟后,将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射60~120秒。
本发明所述的液体培养基为改良后的合成培养基:葡萄糖30~100g/L,NH4NO30.2~0.6g/L,酵母浸粉0.5~4.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,KH2PO40.75g/L,CaCl2·2H2O 0.4g/L,pH为5.5~6.5,余量为水。
本发明所述诱变后菌株B3的摇瓶培养条件为温度28~30℃、摇床转速200~300转/分钟。
本发明利用皮状丝孢酵母对化学和物理诱变比较敏感,生命力比较顽强,有较大的产油脂潜力,提出了利用EMS和紫外线复合诱变手段,结合磷酸香草醛反应初筛技术和细胞油脂索氏抽提法复筛技术,选育出产油脂率高且遗传稳定的皮状丝孢酵母突变株B3,利用这种方法可以有效的提高皮状丝孢酵母的产油脂能力,为利用其发酵生产单细胞油脂和转化生物柴油提供了优良菌种。突变菌株皮状丝孢酵母B3可用于单细胞油脂及生物柴油的生产。
具体实施方式:
以下结合实施实例对本发明进行详细说明。
实施例1:
皮状丝孢酵母的甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变:
①取马铃薯固体培养基上培养3天的皮状丝孢酵母CYPJ06,用pH为6.0的无菌磷酸缓冲液制成菌悬液,经10倍系列稀释达到浓度为100-1000cfu/mL备用。
②取2mL化学诱变剂EMS与3mL无水乙醇和15mL pH为6.0的磷酸缓冲液配成10%的浓度,在每支装有5mL皮状丝孢酵母菌悬液的试管中加入2mL浓度为10%的化学诱变剂稀释液,最终配成3%的诱变溶液。
③诱变混合液放在振荡仪中振荡1小时,使菌与诱变试剂充分的混合,取出后加入1mL终止剂(25%硫代硫酸纳溶液)。
④硫代硫酸钠溶液终止反应5分钟之后,将反应液置于无菌培养皿中,使之成为1mm厚的薄层,培养皿放于磁力搅拌器上,再置于紫外灯下(预先已经灭过菌)进行紫外照射, 用15W紫外灯(提前预热30分钟),距离30cm进行紫外照射90s。
⑤在装有马铃薯固体培养基的平板中加入0.1mL的上述诱变过的菌悬液,进行涂布处理,使菌能够均匀分布在平板上,黑暗处理6小时后,放入28℃培养箱内培养3天。凡碰到EMS试剂的器具放浓度为2%硫代硫酸钠溶液中浸泡1天去毒后使用。
皮状丝孢酵母诱变后的初步筛选:
①将诱变后在马铃薯培养基中生长起来的菌落挑出,另取野生出发菌作为对照,接入150mL三角瓶中,每瓶装液量为50mL,液体培养基成分(葡萄糖40g/L、酵母粉1g/L、KH2PO40.75g/L、NH4NO30.5g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、余量为水,pH自然),在摇床上控制相同的培养条件,条件为28℃、200转/分钟,培养6天。
②离心收集菌体,用蒸馏水洗三次,再统一稀释到660nm下相同的OD值,以便控制相同浓度。
③取10mL菌悬液,于4000转/分钟的条件下,离心10分钟,去上清液,用蒸馏水定容至2mL,充分振荡使之成为悬浮液。
④取100μL菌悬液(对照去蒸馏水),加入一带塞试管中,加入2mL的浓度为18mol/L的浓H2SO4,置于沸水浴中孵化10min。
⑤取出试管,置于常温条件下水浴5min,加入5mL磷酸-香草醛试剂(0.12g香草醛溶解于20mL蒸馏水中,用85%的磷酸定容至100mL),37℃条件下保温15分钟。
⑥取出置于常温条件下水浴10分钟,于530nm的波长下测反应液的OD值。通过比较OD的大小来判别含油量多少,OD越大,表明油脂量越多。对照野生出发菌,计算产率的提高,将含油量高的挑出进行保藏。
皮状丝孢酵母诱变后的复筛:
①菌体的收集
a.将初筛中挑选出来的菌株,另取野生出发菌作为对照,接入马铃薯固体培养基上扩大培养3天。
b.将扩大培养的菌株接入150mL三角瓶中,每瓶装液量为50mL,液体培养基成分(葡萄糖40g/L、酵母粉1g/L、KH2PO40.75g/L、NH4NO30.5g/L、CaCl2·2H2O 0.4g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、余量为水,pH自然),在摇床上控制相同的培养条件,条件为28℃、200转/分钟,培养6天。
c.离心收集菌体,用蒸馏水洗三次,再将菌体在60℃下干燥24小时,待其恒重后,用索氏抽提法进行油脂的提取。
②油脂的抽提:用索氏抽提法抽提油脂
a.将干燥好的菌体用研钵研磨,使细胞尽可能破碎。
b.将取磨碎后的干菌体全部移入重为M1的滤纸包内,称滤纸和菌体的总重记为M2。
c.将滤纸包放入索氏提取器的抽提管内,连接干净的接收瓶,加入石油醚,于75℃水浴加热回流6h。
d.6小时后,将抽提好的接收瓶接于旋转蒸发仪上,回收溶剂。
e.待接收瓶蒸完溶剂后,用少量石油醚试剂将留在瓶底的油脂洗下,重复洗五次,以尽可能全部的洗下,清洗液装于衡重为M3的EP管中。
f.将装有油脂的EP管开口放于干燥箱中60℃烘干,使石油醚挥发,24小时后取出,置于60℃烘箱中烘至恒重称量。称得油脂和EP管的总重量记为M4,计算油脂得率。
菌体量=M2-M1
产油率=[(M4-M3)/(M2-M1)]×100
g.对照野生出发菌,计算产率的提高,将含油量高的挑出进行保藏。
筛选所得高产、稳定的突变菌株B3经摇瓶培养,其油脂含量达53.52%,是野生菌株的1.78倍,具体见图2和3。
实施例2:
①取马铃薯培养基(PDA)上培养3~4天的皮状丝孢酵母出发菌株,用pH 6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液,经10~15倍系列稀释达到浓度500cfu/mL备用;
②用浓度为5%的EMS溶液诱变处理①中培养的处于对数生长期的皮状丝孢酵母出发菌株0.5~5小时后,加入5mL25%硫代硫酸纳终止剂,5~30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变;用15W紫外灯,提前预热20~30分钟后,将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射60~120秒。
③取0.1mL经②步骤处理的培养液均匀涂布于PDA平板上,黑暗培养6~24小时,然后置于28~30℃培养箱中正常培养3~4天;
④将步骤③中培养出的菌落挑出,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,收集菌体,稀释到660nm下相同的OD值,所述的液体培养基为改良后的合成培养基:葡萄糖60g/L,NH4NO30.5g/L,酵母浸粉3g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,KH2PO40.75g/L,CaCl2·2H2O 0.4g/L,pH为5.5~6.5,余量为水。
⑤用硫酸-磷酸香草醛反应分析经④步骤培养及稀释的菌体中油脂含量,并挑出含油量高的菌株进行复筛;
⑥将初筛中挑选出来的菌株,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,离心收集菌体用蒸馏水洗三次,再将菌体在60±5℃下干燥24小时,待其恒重后,用索氏抽提法进行油脂的提取,计算单个细胞的含油率,挑选出高产产油的菌株;
⑦将复筛后得到的高产菌株摇瓶培养5~8次,每次采用⑥的方法对菌株的稳定性进行验证,筛选得到高产、稳定的突变菌株B3。诱变后菌株B3的摇瓶培养条件为温度28~30℃、摇床转速200~300转/分钟。
筛选得到突变菌株B3形态学上特征为:细胞形态呈圆形、椭圆形或者柱形的,对数生长期主要以长丝状存在;大小为3~6×4~30μm;菌落为白色,呈奶酪状,光滑;生理生化特征为:本菌株可以利用合成培养基生长;培养时间:5~7天;对氧气的需求:好气;生长pH范围:5.5~6.5;生长最适宜温度:28~30℃;菌体生成生物油脂主要成份:C16、C18系饱和和不饱和脂肪酸,为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、棕搁油酸中的一种或几种。
实施例3:
①取马铃薯培养基(PDA)上培养3~4天的皮状丝孢酵母出发菌株,用pH 6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液,经10~15倍系列稀释达到浓度100cfu/mL备用;
②用浓度为5%的EMS溶液诱变处理①中培养的处于对数生长期的皮状丝孢酵母出发菌株0.5~5小时后,加入10mL25%硫代硫酸纳终止剂,5~30分钟后将培养液置于无菌培养 皿进行紫外照射诱变;用15W紫外灯,提前预热20~30分钟后,将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射60~120秒。
③取0.1mL经②步骤处理的培养液均匀涂布于PDA平板上,黑暗培养6~24小时,然后置于28~30℃培养箱中正常培养3~4天;
④将步骤③中培养出的菌落挑出,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,收集菌体,稀释到660nm下相同的OD值,所述的液体培养基为改良后的合成培养基:葡萄糖30g/L,NH4NO30.6g/L,酵母浸粉0.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,KH2PO40.75g/L,CaCl2·2H2O 0.4g/L,pH为5.5~6.5,余量为水。
⑤用硫酸-磷酸香草醛反应分析经④步骤培养及稀释的菌体中油脂含量,并挑出含油量高的菌株进行复筛;
⑥将初筛中挑选出来的菌株,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,离心收集菌体用蒸馏水洗三次,再将菌体在60±5℃下干燥24小时,待其恒重后,用索氏抽提法进行油脂的提取,计算单个细胞的含油率,挑选出高产产油的菌株;
⑦将复筛后得到的高产菌株摇瓶培养5~8次,每次采用⑥的方法对菌株的稳定性进行验证,筛选得到高产、稳定的突变菌株B3。诱变后菌株B3的摇瓶培养条件为温度28~30℃、摇床转速200~300转/分钟。
经显微形态观察和油脂成分分析,突变菌株B3形态学特征和菌体生物油脂成分同于实施例2。
实施例4:
①取马铃薯培养基(PDA)上培养3~4天的皮状丝孢酵母出发菌株,用pH 6.0的无菌磷酸缓冲液配制菌悬液,经10~15倍系列稀释达到浓度1000cfu/mL备用;
②用浓度为5%的EMS溶液诱变处理①中培养的处于对数生长期的皮状丝孢酵母出发菌株0.5~5小时后,加入10mL25%硫代硫酸纳终止剂,5~30分钟后将培养液置于无菌培养皿进行紫外照射诱变;用30W紫外灯,提前预热20~30分钟后,将菌液置于距离紫外灯20~30cm处进行紫外照射60~120秒。
③取0.1mL经②步骤处理的培养液均匀涂布于PDA平板上,黑暗培养6~24小时,然后置于28~30℃培养箱中正常培养3~4天;
④将步骤③中培养出的菌落挑出,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,收集菌体,稀释到660nm下相同的OD值,所述的液体培养基为改良后的合成培养基:葡萄糖100g/L,NH4NO30.2g/L,酵母浸粉4.5g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,KH2PO40.75g/L,CaCl2·2H2O 0.4g/L,pH为5.5~6.5,余量为水。
⑤用硫酸-磷酸香草醛反应分析经④步骤培养及稀释的菌体中油脂含量,并挑出含油量高的菌株进行复筛;
⑥将初筛中挑选出来的菌株,接入液体培养基中培养5~7天,控制相同的培养条件,离心收集菌体用蒸馏水洗三次,再将菌体在60±5℃下干燥24小时,待其恒重后,用索氏抽提法进行油脂的提取,计算单个细胞的含油率,挑选出高产产油的菌株;
⑦将复筛后得到的高产菌株摇瓶培养5~8次,每次采用⑥的方法对菌株的稳定性进行验证,筛选得到高产、稳定的突变菌株B3。诱变后菌株B3的摇瓶培养条件为温度28~30℃、 摇床转速200~300转/分钟。
经显微形态观察和油脂成分分析,突变菌株B3形态学特征和菌体生物油脂成分同于实施例3。