CN116970052B - 一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因及其应用 - Google Patents

一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供了一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因，所述ThDREB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ThDREB2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明过表达ThDREB2基因提高了植物的耐旱性。本发明通过将中山杉118ThDREB2基因转入拟南芥中过量表达，自然环境干旱胁迫15天，转基因拟南芥依旧长势良好，而未转基因拟南芥叶片发黄，干枯，植株死亡。本发明ThDREB2基因的发现为基于遗传改良的强耐旱性落羽杉属树木分子育种奠定理论基础。

Description

一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因及其应用。
背景技术
地球上有三分之一以上的地区位于干旱和半干旱的地区。据报道，由于缺水所造成的干旱胁迫导致植物生产力减产，已经超过其他生物和非生物胁迫所造成的减产的总和。干旱是一个使植物产生水分亏缺的环境因子，通常当植物消耗的水分大于自身吸收的水分时，会出现水分亏缺现象，严重时便会导致旱害。干旱对植物的最明显的伤害就是器官萎蔫、枯死和脱落。萎蔫的实质是因为缺水导致植株内部组织、细胞等结构发生了物理或化学变化，如膜的结构和透性改变。由于结构变化导致代谢过程受阻，如光合作用抑制，呼吸作用减慢，蛋白质分解，脯氨酸积累，核酸代谢受阻和激素代谢途径改变等。植物体内水分分配出现异常，抑制植物生长，更为严重的是引起植株不可逆的机械性损伤，导致植株死亡。已有研究证实植物对干旱的响应涉及光合、激素信号转导、植物抗氧化防御、诱导蛋白、渗透调节及诸多因素的协同作用等方面。
一直以来多数干旱研究集中在农作物方面，重点在提高产量和品质，而关于高大速生乔木的耐旱性研究较少。关于中山杉如何发挥耐旱能力的报道尚无相关报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因，ThDREB2是影响中山杉118耐旱能力的重要基因，过表达ThDREB2提高了植株的耐干旱能力。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因，所述ThDREB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ThDREB2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明提供了一种扩增上述技术方案所述ThDREB2基因的引物对，包括ThDREB2ORF F和ThDREB2 ORF R；所述ThDREB2 ORF F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述ThDREB2 ORF R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述ThDREB2基因的重组载体。
优选的，所述重组载体为过表达ThDREB2基因的载体。
本发明提供了一种上述技术方案所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
将ThDREB2基因转移到入门载体，得到重组入门载体；
将所述重组入门载体的ThDREB2基因克隆到目的载体，得到重组载体。
优选的，所述入门载体包括pCRTM8/GW/TOPOTM vector；所述目的载体包括pCAMBIA 1305-eGFP。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述ThDREB2基因的重组菌株或重组细胞。
本发明提供了上述技术方案所述ThDREB2基因在调控植物耐旱性中的应用。
优选的，过表达ThDREB2基因能够增强植物的耐旱性。
优选的，所述植物包括拟南芥。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因，所述ThDREB2基因如SEQ ID NO.1所示，所述ThDREB2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过基因克隆技术获得中山杉118ThDREB2的完整序列，通过研究发现中山杉118DREB转录因子基因ThDREB2响应干旱胁迫，在自然干旱环境下表现为持续性高表达。本发明进一步利用遗传转化等分子生物学手段解析ThDREB2在干旱胁迫过程中的具体功能，得出过表达ThDREB2提高了植株的耐干旱能力，ThDREB2是影响中山杉118耐旱能力的重要基因。本发明通过将中山杉118ThDREB2基因转入拟南芥中过量表达，自然环境干旱胁迫15天，转基因拟南芥依旧长势良好，而未转基因拟南芥叶片发黄，干枯，植株死亡。本发明影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因的发现为基于遗传改良的强耐旱性落羽杉属树木分子育种奠定理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为植物过表达载体pCAMBIA 1305-eGFP示意图；
图2为激光共聚焦显微镜下转基因植株叶片的荧光图片；
图3为1305-eGFP-ThDREB2转基因拟南芥干旱胁迫16天的过程中基因表达变化图；
图4为1305-eGFP-ThDREB2转基因拟南芥与未转基因拟南芥干旱15天后的表型变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因，所述ThDREB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
5’-ATGGTTGTCAGAGGGAGGAAGGGGAAGAGGAGGATTAGTGTAGCC CTGAAGCTTGCCAAATGGGCTCACAGTGATGCTGAAACGGTGAAGAAAGCTCCTGCTAAGGGGTCAAAGAAGGGGTGTATGAAGGGGAAAGGGGGTCCGGATAATGCCCATTGTAATTACAGGGGGGTTAGACAAAGAACTTGGGGGAAATGGGTTGCAGAGATCAGACAGCCCAATAGAGGAGACAGGCTATGGCTTGGTACCTTTGTTACAGCTGAAGAAGCTGCCCTTGCTTATGACTCTGCTGCTAGGATGATTTATGGCCCCTGTGCTAGGCTCAACCATCCTGAGATTAATAAGGTCTGTACTACTACTGATTCTCTTCTTATGGGAACTTTACCCGATTCTGCTGTTATGTGTTCTGAGTTCTCTGAAGTTCCACAAATTGATCTTTGTTCTGAAAATCATGAGGACAATCTGACGAGTTTTGTATCTGTGATTGAAAAAAACATTGCCATGATTCCCCTGTCTACCCCTCTTCAAGCAACCCTCCTTGAAGATCCCCCGAATGCCCAGTGCTCTAATTACTCTGAATTCTCTGTAATTGGAGTGGAGGACATTGCTAGACAAAGTGGACCCTGTTCTTCATCTGGGTCCACTGCTAGAATCCAGAAAATTGAGTCTTGTTCTTCATCTGGGTCCTCTGCAATTGAATTGGGTTATGGTGAACTTGGAATGCCACATTCTATACCTCTTCGAGCACCAAGCCCCTTTGAAGATCTCCCTAATGCCCAGTGCTCTAATGTCCCTGAATTCTCTGTAATTGAAGGGGAGGACATTGCTAGACAAAGTGGACCCTGTTCTTCATCTGGGTCCACTGCTAGAATCCAGCAAATTGAACCTTGTTCTTCATCTGGGTCCTCTGCAATTGAATTGGGTCATGTTGAAATTGGAATGCCACATTCTATGTTGGAGCAATATGAAGATGTCATAGACAACCTGAGCTTTATTAAGATCGAAGAGGCCCCATATCCAGGTTTTGGGAAGATTTGTGATTGGTGTCGTATGGAAATGGGAAGTCCAAACATTGAGGAAATGATTGACGCCAATGCAAATGCTTTGTCTTGTGAAGACTTCTGGCTGCACCAAAATGATGATTTAGGTGGTCGAAGTCACTCACAGCCTTT ACAGGATATGGGAATTCTCGAGGCCTTATTCGATGAGTGCAATCAAGCATGCCAAAGGAATGAAGGTTTCTAA-3’。
在本发明中，所述ThDREB2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MVVRGRKGKRRISVALKLAKWAHSDAETVKKAPAKGSKKGCMKGKGGPDNAHCNYRGVRQRTWGKWVAEIRQPNRGDRLWLGTFVTAEEAALAYDSAARMIYGPCARLNHPEINKVCTTTDSLLMGTLPDSAVMCSEFSEVPQIDLCSENHEDNLTSFVSVIEKNIAMIPLSTPLQATLLEDPPNAQCSNYSEFSVIGVEDIARQSGPCSSSGSTARIQKIESCSSSGSSAIELGYGELGMPHSIPLRAPSPFEDLPNAQCSNVPEFSVIEGEDIARQSGPCSSSGSTARIQQIEPCSSSGSSAIELGHVEIGMPHSMLEQYEDVIDNLSFIKIEEAPYPGFGKICDWCRMEMGSPNIEEMIDANANALSCEDFWLHQNDDLGGRSHSQPLQDMGILEALFDECNQACQRNEGF。
本发明通过对中山杉118转录组数据结果进行挖掘，发现乙烯转录因子家族成员ThDREB2基因在干旱胁迫下持续性高表达，对其进行生物学功能的深入研究，对于落羽杉属树木基因资源的丰富以及木本植物耐旱分子育种都具有重要的意义。
本发明优选通过3’RACE和5’RACE巢式PCR获得ThDREB2基因完整编码阅读框，如SEQ ID NO.1所示。本发明将所述ThDREB2基因在NCBI中进行比对，得出所述ThDREB2基因与日本红豆杉的DREB2基因同源性为79.21％；所述ThDREB2基因与醉蝶花的DREB2基因同源性为81.1％。
本发明提供了一种扩增上述技术方案所述ThDREB2基因的引物对，包括ThDREB2ORF F和ThDREB2 ORF R。在本发明中，所述ThDREB2 ORF F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-ATGGTTGTCAGAGGGAGGAAG-3’；所述ThDREB2 ORF R的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，具体为：5’-TTAGAAACCTTCATTCCTTTGGCA-3’。本发明通过上述引物对可以扩增ThDREB2基因的完整编码阅读框，如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述的ThDREB2基因的重组载体。
本发明对构建重组载体时所用载体没有特殊限定，采用本领域常规载体能够使目的基因表达即可。在本发明中，所述重组载体优选包括ThDREB2基因的完整编码阅读框。在本发明中，所述重组载体优选能够实现ThDREB2基因在植物体内的过表达，更优选能够实现ThDREB2基因在拟南芥植株体内的过表达。在本发明中，所述重组载体优选包括过量表达载体1305-eGFP-ThDREB2。本发明所述过量表达载体1305-eGFP-ThDREB2中ThDREB2基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，ThDREB2在拟南芥中高效表达，且包含eGFP荧光标签。
本发明提供了一种上述技术方案所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
将ThDREB2基因转移到入门载体，得到重组入门载体；
将所述重组入门载体的ThDREB2基因克隆到目的载体，得到重组载体。
本发明将ThDREB2基因转移到入门载体，得到重组入门载体。在本发明中，所述ThDREB2基因优选包括ThDREB2基因的完整编码阅读框。在本发明中，ThDREB2基因的完整编码阅读框如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述ThDREB2基因优选通过将中山杉118组培苗的cDNA采用上述技术方案所述引物对进行PCR扩增得到。PCR反应完成后，本发明优选获得PCR产物。在本发明中，所述PCR产物也可称之为目的基因的编码阅读框。获得PCR产物后，本发明优选将所述PCR产物于-20℃储存。
在本发明中，所述入门载体优选包括pCRTM8/GW/TOPOTM vector。
本发明优选利用Gateway技术将ThDREB2基因转移到载体，得到重组载体。本发明优选采用pCR8/GW/TOPO TA克隆试剂盒(Thermofisher)将ThDREB2基因转移到载体，得到重组载体。本发明优选将上述技术方案所述PCR产物与入门载体进行BP反应，获得重组入门载体。在本发明中，所述BP反应的反应体系优选包括PCR产物10-20ng，Salt solution 1μL，pCRTM8/GW/TOPOTM vector1μL，加Nuclease-free Water至总体积6μL。在本发明中，所述BP反应的温度优选为22℃；所述BP反应的时间优选为60min。反应完成后，得到反应溶液，本发明优选将反应溶液转移至冰上进行后续反应。本发明优选将反应溶液转化TOP10感受态细胞，得到含有重组入门载体的感受态细胞。得到含有重组入门载体的感受态细胞后，本发明优选将含有重组入门载体的感受态细胞在含有壮观霉素的筛选培养基上进行培养获得单克隆菌落。本发明优选对单克隆菌落进行菌液PCR检测，筛选阳性克隆菌落。得到阳性克隆菌落后，本发明优选将得到的阳性克隆进行测序鉴定。在本发明中，所述筛选培养基优选以LB培养基为基础培养基；所述筛选培养基中壮观霉素的浓度优选为100mg/L。本发明所述培养的温度优选为37℃；所述培养的时间优选为12～14h。本发明所述培养优选培养至单克隆菌落形成。本发明进行菌液PCR的引物优选包括基因特异性上游引物ThDREB2 ORF F和载体上的T7引物；所述ThDREB2 ORF F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-ATGGTTGTCAGAGGGAGGAAG-3’；所述载体上的T7引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’。本发明优选通过菌液PCR检测确定得到的阳性克隆含有重组入门载体。
得到阳性克隆后，本发明优选通过质粒DNA小提试剂盒提取阳性克隆中的质粒，得到重组入门载体。
得到重组入门载体后，本发明将重组入门载体的ThDREB2基因克隆到目的载体，得到重组载体。
在本发明中，所述目的载体优选包括pCAMBIA 1305-eGFP。本发明优选将获得的重组入门载体与目的载体进行LR反应，获得重组载体。在本发明中，所述LR反应的反应体系优选为入门载体纯化后的质粒100ng，100ng/μL目的载体1.5μL，LR Clonase II enzyme mix2μL，加pH为8.0的1×TE至总体积8μL。本发明混合得到反应体系后，优选将反应体系涡旋后短暂离心，然后于25℃温浴1h。温浴完成后，本发明优选将添加1μLProteinase K solution至反应体系中，混匀，37℃温浴10min以终止反应。反应结束后，本发明优选将反应产物转化Top10感受态细胞，得到含有重组载体的感受态细胞。得到含有重组载体的感受态细胞后，本发明优选将含有重组载体的感受态细胞在含有氨苄西林的筛选培养基上进行培养获得单克隆菌落。得到单克隆菌落后，本发明优选对单克隆菌落进行菌液PCR检测，筛选阳性克隆。筛选得到阳性克隆后，本发明优选将得到的阳性克隆进行测序鉴定。在本发明中，所述筛选培养基优选以LB培养基为基础培养基；所述筛选培养基中氨苄西林的浓度优选为100mg/L。本发明所述培养的温度优选为37℃；所述培养的时间优选为12～14h。本发明所述培养优选培养至单克隆菌落形成。本发明进行菌液PCR的引物优选包括基因特异性上游引物ThDREB2 ORF F和载体上的35s引物；所述ThDREB2 ORF F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-ATGGTTGTCAGAGGGAGGAAG-3’；所述载体上的35s引物的核苷酸序列如如SEQ ID NO.14所示，具体为：5’-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3’。本发明优选通过菌液PCR检测确定得到的阳性克隆含有重组载体。测序验证获得阳性克隆后，本发明优选回收LR反应后的重组载体，获得目的基因的过表达载体。在本发明中，所述重组载体优选包括1305-eGFP-ThDREB2。得到重组载体后，本发明优选将重组载体在-20℃条件下进行保存待用。
本发明提供了一种含有上述技术方案所述ThDREB2基因的重组菌株或重组细胞。在本发明中，将上述技术方案所述重组载体转化细菌中，得到含有ThDREB2基因的重组菌株；将上述技术方案所述重组载体转化细胞中，得到重组细胞。在本发明中，所述细胞优选包括感受态细胞，更优选为Top10感受态细胞。在本发明中，所述细菌优选包括农杆菌。本发明优选通过液氮冻融法将重组载体转入农杆菌中，获得重组菌株。本发明对液氮冻融法的方法没有特殊限定，采用本领域常规液氮冻融方法进行转化均可。
本发明提供了上述技术方案所述ThDREB2基因在调控植物耐旱性中的应用。本发明过表达ThDREB2基因能够提高植物的耐旱性，更优选为能够提高拟南芥的耐旱性。本发明通过将中山杉118ThDREB2基因转入拟南芥中过量表达，自然环境干旱胁迫15天，转基因拟南芥依旧长势良好，而未转基因拟南芥叶片发黄，干枯，植株死亡。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
克隆ThDREB2基因全长
1)RNA的提取及cDNA的反转
以中山杉118组培苗为材料，使用RNeasy PlantMini Kit(QIAGEN公司)，对中山杉118总RNA进行提取，用NanoDrop 1000进行总RNA浓度和纯度的测定。采用Clontech公司的SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit，2PCR Kit进行反转录。
2)ThDREB2基因的3'RACE和5'RACE巢式PCR
将中山杉118植株在光照培养箱中22℃条件下培养，光照条件为长日照，即光照16小时/天，持续的不浇水处理，干旱处理7d。
将干旱处理后的中山杉118采用步骤1)所述方法获得干旱胁迫下中山杉的cDNA。提取得到的cDNA在诺禾致源公司进行转录组测序。根据干旱胁迫下中山杉118转录组数据筛选干旱胁迫下差异表达显著的基因，获得ThDREB2的Unigene序列。
利用Oligo 8软件设计引物，如表1所示，使用Takara公司的cDNA end rapidamplification试剂盒进行3'RACE PCR和5'RACE PCR扩增，具体操作流程按照试剂盒说明书完成，包括3'RACE巢式PCR：反转录反应，3'RACE OuterPCR，3'RACE InnerPCR；5'RACE巢式PCR：去磷酸化反应，去帽子反应，反转录反应，5'RACE Outer PCR，5'RACE InnerPCR，最终获得的PCR产物进行回收、连接、转化、测序。
表1 3'RACE，5'RACE引物序列
3)ThDREB2基因编码阅读框序列的获得
将测序获得的ThDREB2的3'RACE及5'RACE PCR测序产物利用Bioedit软件进行拼接，将获得目的基因序列在NCBI官网https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？ PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSea rch&LINK_LOC＝blasthome进行Blast比对，确认目的基因和日本红豆杉及醉蝶花的DREB2基因同源性较高，分别为79.21％和81.1％，因而将其命名为命名为Taxodium hybrid dehydration responsive element-bindingprotein2基因，简称为ThDREB2，其包含一个1245bp的完整编码阅读框，其编码阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
ThDREB2基因植物表达载体构建
以培养30天得到的中山杉118组培苗为材料，提取中山杉118组培苗的RNA，然后反转录得到cDNA，然后对cDNA进行PCR获得ThDREB2基因。
将获得ThDREB2的编码阅读框(ORF)序列用于载体构建，使用Oligo 8软件设计特异性的引物扩增ThDREB2基因的ORF序列，其中，引物为：ThDREB2ORF F如SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-ATGGTTGTCAGAGGGAGGAAG-3’，ThDREB2 ORF R如SEQ ID NO.12所示，具体为：5’-TTAGAAACCTTCATTCCTTTGGCA-3’。PCR反应体系：TakaRa LA Taq(5Μ/μL)0.5μL，10×LAPCR Bμffer(Mg2+Free)5.0μL，MgCl2(25mM)5.0μL，dNTP Mixtμre(2.5mM each)8.0μL，Forward Primer(10μM)2.0μL，Reverse Primer(10μM)2.0μL，cDNAtemplate 1.0μL，Milli-Q Water 26.5μL。反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃6min；4℃Forever。
PCR反应完成后，得到PCR产物。对PCR产物进行测序验证扩增得到的目的基因为ThDREB2。
利用Gateway定向克隆技术，将ThDREB2基因的ORF片段转移到目的表达载体pCAMBIA 1305-eGFP(简称为目的载体)上，包含BP反应和LR反应两部分。本实施例所用的目的表达载体pCAMBIA 1305-eGFP模式图如图1所示。
1)BP反应的目的是将基因片段转移到入门载体上，反应体系：vector ThDREB2ORF片段(上述PCR产物)10～20ng，Salt solution 1μL，pCRTM8/GW/TOPOTM vector(入门载体)1μL，加Nuclease-free Water至总体积6μL，轻轻混匀，22℃反应60min后转移至冰上；将前步6μL反应产物转化到TOP10感受态细胞中，涂于含100mg/L壮观霉素的LB筛选培养平板上，于37℃条件下暗培养12h，挑取单克隆进行菌液PCR检测，菌液PCR所用引物为基因特异性上游引物ThDREB2 ORF forward primer如SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-ATGGTTGTCAGAGGGAGGAAG-3’和载体上的T7引物，如SEQ ID NO.13所示，具体为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，检测后的阳性克隆进一步测序验证。使用质粒DNA小提试剂盒(Invitrogen)对阳性克隆进行质粒的提取纯化，获得入门载体纯化后的质粒，即重组入门载体。
2)LR反应的目的在于将已经重组入门载体的目标基因再克隆到目的载体中，反应体系：入门载体纯化后的质粒100ng，目的载体即目的表达载体pCAMBIA 1305-eGFP(100ng/μL)1.5μL，LR Clonase II enzyme mix 2μL，加1×TE(pH为8.0)至总体积8μL，涡旋后短暂离心，25℃温浴1h，加入1μLProteinase K solution，混匀，37℃温浴10min以终止反应；取2μLLR反应产物转化Top10感受态细胞，涂于含100mg/L氨苄西林的LB筛选培养平板，挑取单克隆进行菌液PCR检测，菌液PCR所用引物为ThDREB2 ORF forwardprimer如SEQ ID NO.11所示，具体为：5’-ATGGTTGTCAGAGGGAGGAAG-3’和载体上的35s引物，如SEQ ID NO.14所示，具体为：5’-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3’，检测后的阳性克隆进一步测序验证。验证后，使用质粒DNA小提试剂盒(Invitrogen)进行质粒的提取纯化，得到LR反应后的重组载体，即得到目的基因的表达载体1305-eGFP-ThDREB2，-20℃保存备用，用于拟南芥的遗传转化。
实施例3
ThDREB2基因的拟南芥遗传转化
1)采用液氮冻融法将1305-eGFP-ThDREB2表达载体转入农杆菌中，步骤如下：
(1)取-80℃保存的农杆菌感受态GV3101，于冰上融化；
(2)向50μL感受态细胞中加入200ng回收纯化的表达载体，用手轻轻拨打管底混匀，依次于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min；
(3)加入800μL无抗生素的LB培养基，28℃，100rmp温和震荡，复苏3h；
(4)6000rmp离心1min，留取100μL左右上清液轻轻吹打重悬菌块，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上；
(5)28℃倒置培养30～48h，PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。
2)拟南芥种植及花序浸染
拟南芥种植前先进行种子的消毒，具体如下：将拟南芥种子用无菌水浸泡1h；乙醇体积百分含量为75％的酒精消毒30s，无菌水清洗2次；次氯酸钠质量百分含量为5％次氯酸钠水溶液消毒20min，无菌水清洗5次。然后种植在MS固体培养基上，4℃，黑暗条件下春化48h，接着转移到光照培养箱中22℃条件下培养，光照条件为长日照，即光照时间为16h，黑暗时间为8h。培养基平板发芽生长至4片叶(约一周至两周)后，移栽至小花盆，花盆内基质为泥炭、蛭石、珍珠岩的体积比为1：1：1混合而成，花盆内培养的温度为22℃。在花盆培养的过程中，使用1/4MS浇水。
待拟南芥长出花序后，在农杆菌介导下进行拟南芥花序侵染，步骤如下：
(1)准备含有1305-eGFP-ThDREB2表达载体的农杆菌，在含有50mg/mL卡那霉素和25mg/mL潮霉素的LB平板上28℃倒置培养30～48h，挑取单克隆，在含有50mg/mL卡那霉素和25mg/mL潮霉素的LB液体培养基中，28℃生长24h；
(2)1:100或1:200扩大培养具体为：取1mL步骤(1)中的培养菌液于100mL或者200mL含50mg/mL卡那霉素和25mg/mL潮霉素的LB培养基中，28℃生长16～24h，细胞生长到静止状态(OD600为1.5～2.0)；
(3)4000rmp，室温离心10min，收集菌体，使用200mL新鲜配制的质量百分含量为5％的蔗糖水溶液重悬菌体。离心和重悬在50mL管中完成；
(4)在步骤(3)中的溶液中加入40μL Silwet L-77，立即混匀；
(5)每一个花序在步骤(4)中获得的溶液浸泡30s，包括生长在莲座叶基部的花序，浸泡完的植株侧倒放置在托盘中，然后使用保鲜膜包裹托盘。黑暗，室温，保持湿度放置24h；
(6)去掉保鲜膜，将拟南芥放回培养箱，按照前述花盆内培养的方法继续使其正常生长1个月，等待长角果成熟；
(7)使用筛子收集种子，称为T0代种子，4℃存放。
3)转基因植株筛选
将T0代种子灭菌后种植在含有25mg/mL潮霉素的MS固体培养基上，把正常生长植株转移到花盆中培养至种子成熟，种子处理的方法和具体的培养方法同步骤2)中的种子处理方法和培养方法。种子成熟后，取植物的叶片，提取叶片总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR鉴定确认是否获得ThDREB2基因表达的阳性植株，对于阳性植株收获T1代种子。
将T1代种子采用上述方法进行种植，收获T2代种子；将T2代种子采用上述方法进行种植，收获T3代种子。将T3代种子种植即获得转基因拟南芥植株。将转基因拟南芥植株培养至28天左右，得到长出完整的莲座叶的植株后，使用蔡司LSM900激光共聚焦对转基因拟南芥植株叶片进行拍照，激发波长为488nm。使用蔡司配套图像处理软件ZEN软件处理照片。转基因拟南芥植株叶片观察结果如图2所示。图2中的A为明场，B为暗场，C是明场暗场叠加。
由图2可得，由于载体带有eGFP标签，在激发光的作用下，细胞膜和细胞核都可以观察到明显的绿色荧光，证明植株为阳性。
实施例4
转1305-eGFP-ThDREB2基因拟南芥的干旱胁迫处理及分子检测
将生长2周的T3代转基因拟南芥10株以及对照拟南芥10株，转移到光照培养箱中培养，光照条件为长日照，即光照16h，黑暗8h，培养温度为22℃。持续不浇水，自然干旱处理，每2天取一次拟南芥的叶片，液氮速冻，-80℃储存，用于实时定量分子检测。
实时定量引物采用Oligo8软件设计，扩增产物长度108bp，引物Tm值在60℃，引物序列：q ThDREB2 F的序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：5'-GCCCAATAGAGGAGACAG-3'，qThDREB2R的序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：5'-AGCCTAGCACAGGGGCCA-3'。实时定量PCR的内参基因采用18s基因(GenBank accession number：Z28335)，18s-F引物的序列如SEQID NO.17所示，具体为：5'-TCAACTTTCGATGGTAGGATAGTG-3'，18s-R引物的序列如SEQ IDNO.18所示，具体为：5'-CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT-3'。利用Analitik Jena qTOWER2.2(德国)***进行qRT-PCR。
按照SYBR Green试剂盒(Rox)说明书操作，扩增程序为：55℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，进行40个循环。随后设置60℃至95℃，生成融解曲线。每个样品进行3个技术性重复。
20μL的反应体系中包含：2μL稀释后的cDNA(cDNA浓度大约是350ng·μL-1)，10μLFastStartΜniversal SYBR Green Master(Rox)，6pmol上游引物，6pmol下游引物以及6.8μL ddH2O。
基因的相对表达量按照2-ΔΔCt方法进行计算。试验数据经SPSS19.0软件统计分析并绘图。定量PCR结果图表2和图3所示，试验组和对照组拟南芥第15天时的生长状态如图4所示。图4中左图为转基因拟南芥，图4中右图为对照植株。
表2基因的相对表达量
由表2、图3和图4可得，转基因植株中，在干旱胁迫第4天ThDREB2基因的表达量逐渐上升，至第10天后处于相对稳定的表达。干旱胁迫下，在第15天对照拟南芥全部干枯死亡，而转基因1305-eGFP-ThDREB2拟南芥受影响明显较小。表明过表达ThDREB2提高了植株的耐干旱能力，ThDREB2是影响中山杉118耐旱能力的重要基因。其中在对照组拟南芥植株干旱处理的过程中，叶片在开始干旱处理的1～6天，拟南芥即出现叶片萎蔫的状态，对此时的拟南芥的叶片提取RNA后，RNA的提取效果差，RNA量少，且纯度较低，不适宜用于后续定量，因此，未得到对照组拟南芥的实时定量分子检测结果。
综上，本发明提供的ThDREB2基因在调控植物耐旱性中国发挥重要的作用。在拟南芥中过表达ThDREB2基因，能够提高拟南芥植物的耐旱性。ThDREB2是影响中山杉118耐旱能力的重要基因。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种影响中山杉118耐旱能力的ThDREB2基因，其特征在于，所述ThDREB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ThDREB2基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种含有权利要求1所述ThDREB2基因的重组载体。
3.根据权利要求2所述重组载体，其特征在于，所述重组载体为过表达ThDREB2基因的载体。
4.一种权利要求3所述重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将ThDREB2基因转移到入门载体，得到重组入门载体；
将所述重组入门载体的ThDREB2基因克隆到目的载体，得到重组载体。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述入门载体包括pCRTM8/GW/TOPOTMvector；所述目的载体包括pCAMBIA 1305-eGFP。
6.一种含有权利要求1所述ThDREB2基因的重组菌株或重组细胞；所述重组细胞不包括能够发育为完整植株的细胞。
7.权利要求1所述ThDREB2基因在调控植物耐旱性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，过表达ThDREB2基因能够增强植物的耐旱性。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。
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