CN117660223A - 用于使用高丙三醇浓度产生1,3-丙二醇的微生物聚生体 - Google Patents

用于使用高丙三醇浓度产生1,3-丙二醇的微生物聚生体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微生物聚生体，其尤其经适应以在具有高甘油含量，特别是具有高浓度的工业甘油的培养基中生长并产生1,3‑丙二醇。更特别地，该微生物聚生体包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种选自产孢梭菌菌株和/或楔形梭菌菌株的菌株。本发明还涉及一种用于通过培养该微生物聚生体导致这些特定的不同微生物的共培养来产生1,3‑丙二醇的方法。

Description

用于使用高丙三醇浓度产生1,3-丙二醇的微生物聚生体
本申请是申请日为2018年2月19日、申请号为201880012950.2、发明名称为“用于使用高丙三醇浓度产生1,3-丙二醇的微生物聚生体”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及一种微生物聚生体，其尤其经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。更特别地，此微生物聚生体包含至少一种丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株和至少一种选自产孢梭菌(Clostridium sporogene)菌株和/或楔形梭菌(Clostridium sphenoide)菌株的菌株。本发明还涉及一种用于通过培养此微生物聚生体导致这些特定的不同微生物的共培养而产生1,3-丙二醇。
发明背景
1,3-丙二醇(PDO)，也称为亚丙基二醇(trimethylene glycol)或丙烯甘醇(propylene glycol)，是已知最古老的发酵产物之一。它最初由August Freund早在1881年在含有巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)的甘油发酵培养物中鉴定。PDO是甘油发酵的典型产物，且已经在其它有机底物的厌氧转化中发现。只有非常少的生物体(它们均是细菌)能够形成它。这些生物体包括克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)(肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae))、肠杆菌属(Enterobacter)(聚团肠杆菌(E.agglomerans))和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(弗氏柠檬酸杆菌(C.freunddi))的肠细菌，乳杆菌属(Lactobacilli)(短乳杆菌(L.brevis)和布赫纳氏乳杆菌(L.buchneri))和丁酸梭菌(C.butyricum)和巴氏梭菌(C.pasteurianum)组的梭菌属(Clostridia)。
作为双官能团的有机化合物，PDO可潜在地用于许多合成反应，特别是作为产生聚酯、聚醚、聚氨酯以及特别是聚对苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethylene terephtalate，PTT)的缩聚作用的单体。这些结构和反应性特征使其在化妆品、纺织品(衣物纤维或地板材料)或塑料(汽车工业和包装或涂料)中有多个应用。
PDO可以通过不同化学途径产生，但它们生成含有极度污染性物质的废水并且生产的成本高。因此，化学产生的PDO不能与石油化学可得的二醇，例如1,2-乙二醇、1,2-丙二醇和1,4-丁二醇竞争。为了提高此竞争力，在1995年，DuPont开始了将葡萄糖生物转化为POD的研究项目。虽然此过程是环境友好的，但其具有以下缺点：i)其使用非常昂贵的辅因子维生素B12，ii)由于生产菌株的不稳定性，其是不连续过程。
相反地，由于生物柴油工业产生的大量丙三醇的可得性，一种连续的、无维生素B12的具有较高碳产率的过程是有利的。
本领域中已知，可以从甘油产生PDO，所述甘油是特别是由生物柴油生产的不必要的副产物，所述生物柴油生产含有与盐和水混合的大约80-85％的甘油。
先前描述了丁酸梭菌能够在分批和两阶段连续发酵中在工业甘油中生长并从工业甘油中所含的丙三醇产生PDO(Papanikolaou等，2000)。然而，在最高丙三醇浓度下，在稀释率为0.02h-1获得的最高PDO效价为48.1g.L-1，这意味着生产率为0.96g.L-1.h-1。在补料培养基中源自甘油的丙三醇的最大浓度为90g.L-1的情况下，且在酵母提取物的存在下进行培养，该酵母提取物是一种昂贵的含有有机氮的混合物，本领域中已知其帮助提高细菌的生物量的产生。
申请WO 2006/128381公开了使用此丙三醇以分批和补料分批培养的方式，使用天然产生PDO的生物体诸如肺炎克雷伯氏杆菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌产生PDO。此外，在WO2006/128381中使用的培养基还含有酵母提取物。如本专利申请中描述的，达到的最大生产率是在0.8和1.1g.l-1.h-1之间。
在Gonzalez-Pajuelo等2005中已经描述了经修饰以含有微生物素B12非依赖性甘油脱氢酶以及来自丁酸梭菌的PDO脱氢酶的丙酮丁醇梭菌菌株(称为“丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5”菌株)的性能。此菌株在含有高达120g.l-1的纯丙三醇的补料培养基中生长并产生PDO。此外，在含有最高60g.l-1的纯丙三醇或工业甘油中含有的丙三醇的补料培养基中的分析未指出任何差异。这些结果是在酵母提取物的存在下获得。而且，在源自工业甘油的丙三醇的浓度高于60g.l-1的情况下，未进行测试。当比较野生型丁酸梭菌与经修饰的微生物“丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5”时，观察到总体相似行为。
在专利申请WO 2010/128070中，发明人描述了使丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5菌株适应的过程，诸如Gonzalez-Pajuelo等(2005)中描述的使其适应在具有高浓度的工业甘油中含有的丙三醇且不具有酵母提取物的培养基中生长。所得的丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5经适应的菌株群能够在含有高达120g.l-1的工业甘油中含有的丙三醇的培养基中产生PDO，效价高达53.5g.L-1的PDO，产率高达0.53g.g-1，且生产率高达2.86g.L-1.h-1。在专利申请WO 2012/062832中，发明人描述了来自通过与WO 2010/128070专利申请中所述的相同过程获得的另一丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5经适应的菌株群的克隆分离物。此第二群能够在含有大约105g.L-1的工业甘油中含有的丙三醇的培养基中产生PDO，效价高达50.45g/L-1的PDO，产率高达0.53g.g-1，且生产率高达3.18g.L-1.h-1，然而分离的克隆能够在含有大约105g.L-1的工业甘油中含有的丙三醇的培养基中产生PDO，效价高达51.30g/L-1PDO，产率高达0.50g.g-1，且生产率高达3.05g.L-1.h-1。
在本专利申请中，发明人已经注意到相较于无微生物聚生体的丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5经适应的菌株群的性能，丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5经适应的菌株群与不同微生物的共培养(所谓的微生物聚生体)提供改善的PDO生产，其具有较高的PDO效价，更好的产率和更低的残留丙三醇。特别地，此微生物聚生体能够以改善的水平在高浓度的工业甘油中含有的丙三醇(高达105g.L-1的来自工业甘油的丙三醇)的存在下产生PDO。因此，使用本发明的共培养不仅允许更好的PDO生产，而且允许更容易的纯化过程，因为相较于仅丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5经适应的菌株而无微生物聚生体的情况下，共培养情况下的残留丙三醇减少。
发明简述
本发明涉及一种微生物聚生体，其包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种选自产孢梭菌菌株和/或楔形梭菌菌株的菌株。
特别地，根据本发明的微生物聚生体包含至少85％的丙酮丁醇梭菌，少于0.2％的产孢梭菌，且优选为0.001％至0.2％的产孢梭菌，和/或少于15％的楔形梭菌，且优选为0.1％至15％的楔形梭菌。
在本发明的一个具体的实施方案中，在根据本发明的微生物聚生体中，该丙酮丁醇梭菌菌株经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。
本发明的微生物聚生体，其包含至少一种丙酮丁醇梭菌和至少一种产孢梭菌菌株，或包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种楔形梭菌菌株，可被命名为共培养物，且在这些情况中，该共培养物优选地包含丙酮丁醇梭菌菌株，该菌株先前经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的工业甘油中含有的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。
本发明还涉及一种用于产生1,3-丙二醇的方法，该方法包括在包含丙三醇作为唯一碳源的培养基中培养根据本发明的微生物聚生体，并从该培养基中回收1,3-丙二醇。
此外，本发明涉及至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株用于在含有高浓度的丙三醇作为唯一碳源的培养基中通过与至少一种丙酮丁醇梭菌菌株共培养来改善发酵过程中1,3-丙二醇的产生，更特别地用于改善PDO的产率和效价的用途。
特别地，该至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株在用于产生PDO的发酵过程中与至少一种丙酮丁醇梭菌菌株一起用作共培养物，该丙酮丁醇梭菌菌株已经经适应以在含有高浓度的丙三醇作为唯一碳源的培养基中生长并产生PDO。
发明详述
术语“微生物聚生体”或“共培养物”可互换地施用，以表示在发酵过程中使用两种或更多种微生物物种。
在第一方面中，本发明涉及一种微生物聚生体，其包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种选自产孢梭菌菌株和/或楔形梭菌菌株的菌株。
根据本发明的微生物聚生体是若干梭菌属菌株的组合，其中大多数属于物种丙酮丁醇梭菌。
在有利的实施方案中，本发明的微生物聚生体包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株，至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株。更优选地，本发明的微生物聚生体包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株，至少一种产孢梭菌菌株和至少一种楔形梭菌菌株。
特别地，考虑到培养基中含有的细胞的总数对应100％，根据本发明的微生物聚生体包含至少85％的丙酮丁醇梭菌，0.001％至0.2％的产孢梭菌，和/或0.1％至15％的楔形梭菌。
在优选的实施方案中，该微生物聚生体包含85％至99.8％的丙酮丁醇梭菌，0.001％至0.15％的产孢梭菌和/或0.2％至15％的楔形梭菌。
在更优选的实施方案中，该微生物聚生体包含90％至99.8％的丙酮丁醇梭菌，0.002％至0.13％的产孢梭菌和/或0.2％至10％的楔形梭菌。
在更优选的实施方案中，本发明的微生物聚生体由至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种楔形梭菌菌株组成。甚至更优选地，本发明的微生物聚生体由至少一种丙酮丁醇梭菌菌株、至少一种楔形梭菌菌株和至少一种产孢梭菌菌株组成。根据这些具体的实施方案，上述的梭菌属中的每一种的各自百分比也经过必要的修正后应用。
在有利的实施方案中，当在具有高丙三醇含量的适当的培养基中培养时，根据本发明的微生物聚生体可用于且允许产生1,3-丙二醇。
因此，在具体的实施方案中，在本发明的微生物聚生体中，该丙酮丁醇梭菌菌株经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的工业甘油中含有的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。
“经适应的丙酮丁醇梭菌”、“先前经适应的丙酮丁醇梭菌”或“正在经适应的丙酮丁醇梭菌”意指经修饰以能够在高浓度的工业甘油上生产的丙酮丁醇梭菌。
用于使丙三醇代谢朝向生成1,3-丙二醇的方法在本领域中是已知的(参见，例如WO 2006/128381，González-Pajuelo&al.2006).
例如，该丙酮丁醇梭菌菌株可通过如WO 2010/128070专利申请中公开的选择压力培养过程经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长。
还例如，经遗传修饰用于从作为唯一碳源的甘油产生1,3-丙二醇的丙酮丁醇梭菌菌株在本领域中是已知的并且是被公开的，特别是在申请WO 2001/04324和WO 2010/128070中公开。
表述“经遗传修饰的”意指菌株已经经转化旨在改变其遗传特征。内源基因可经减弱、缺失或过表达，或优选地，外源基因可导入、通过质粒携带，或整合到菌株的基因组中，以在细胞中表达。
如本文所用的术语“质粒”或“载体”是指通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因且通常为环状双链DNA分子形式的额外染色体元件。
在梭菌属中诱变和/或基因置换的任何标准的技术，诸如内容通过提述并入本文的申请WO 2008/040387中公开的，可用于使丙酮丁醇梭菌菌株适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。
丙酮丁醇梭菌菌株的适应优选地通过厌氧连续过程进行，该厌氧连续过程是技术人员熟知的技术。在本领域技术人员已知的此过程的详情中，例如，可提及的是连续添加补料培养基至发酵罐中，同时从***中去除等量的具有微生物的转化营养液。营养交换的速率表示为稀释率。因此，稀释率应用于培养基中，考虑微生物的最大生长速率并影响培养基的摄取和取出速率。
使丙酮丁醇梭菌菌株适应的连续过程优选地在厌氧条件下进行。
本领域技术人员知道如何管理这些实验条件中的每一个，并确定根据本发明使用的梭菌属的培养条件。特别地，梭菌属菌株在20℃和60℃之间的温度下发酵，优选地，对于丙酮丁醇梭菌，在25℃和40℃之间的温度下。
在优选的实施方案中，在本发明的微生物聚生体中，丙酮丁醇梭菌菌株先前经适应，优选地通过厌氧连续过程进行适应，以在具有高丙三醇含量的培养基中生长并产生1,3-丙二醇，该丙酮丁醇梭菌通过引入额外拷贝的来自丁酸梭菌的1,3-丙二醇操纵子呈现增加的1,3-丙二醇产生通量，该1,3-丙二醇操纵子编码涉及维生素B12非依赖性1,3-丙二醇途径的酶。特别地，来自丁酸梭菌的1,3-丙二醇操纵子通过质粒过表达或整合到待适应的丙酮丁醇梭菌菌株的染色体。例如，pSPD5质粒可用于过表达1,3-丙二醇操纵子(Gonzalez-Pajuelo等，2006)。
在有利的实施方案中，在本发明的微生物聚生体中，丙酮丁醇梭菌菌株先前经适应以在连续培养过程期间生长并产生1,3-丙二醇，在该过程中，补料培养基含有浓度介于90和120g/L之间且优选地为约105g/L的源自工业甘油的丙三醇。
所述生产微生物的“适应”通过以下获得：在含有高工业甘油含量的培养基上以低稀释率培养微生物，并选择经适应的能够在具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基上生长的微生物。
为此，丙酮丁醇梭菌菌株有利地以低稀释率培养24小时至10天的一段时间，优选为多于2天，更优选为约8天。
稀释率通常介于0.005和0.1h-1之间，优选为介于0.005和0.02h-1之间。在适应方法期间可改变稀释率，最终地，第一步介于0.005和0.02h-1之间，且第二步中，增加稀释率高达0.1h-1，更优选为0.07h-1。当在适应方法期间修改稀释率时，介于0.005和0.02h-1之间的稀释率被称为“低稀释率”，而介于0.02和0.1h-1之间的稀释率是常见的稀释率。
在本发明的具体的实施方案中，待适应的丙酮丁醇梭菌菌株在连续培养基中使用含有90至120g/L的丙三醇，优选为约105g.L-1的粗丙三醇的补料培养基进行培养，稀释率介于0.005和0.02h-1之间，优选为0.02h-1。在最多10天，优选5至8天的时间内，丙酮丁醇梭菌菌株适应于补料培养基中存在的高甘油浓度，且稀释率可增加至高达0.1h-1，优选高达0.07h-1。
优选地，丙酮丁醇梭菌菌株先前通过WO 2010/128070和WO 2012/062832中所述的过程进行适应。
本发明的微生物聚生体包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种产孢梭菌菌株，或包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种楔形梭菌菌株，该微生物聚生体可命名为共培养物，且在这些情况中，该共培养物优选地包含丙酮丁醇梭菌菌株，该丙酮丁醇梭菌菌株先前经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的工业甘油中含有的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。涉及上述的经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇的丙酮丁醇梭菌菌株的所有优选的实施方案也经过必要的修正后应用至此具体的实施方案。
包括上述所有优选的实施方案在内的包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种产孢梭菌菌株或由其组成的共培养物，或包含至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种楔形梭菌或由其组成的共培养物，也是本发明的方面。
在另一方面中，本发明涉及一种用于在丙三醇的连续发酵过程中产生1,3-丙二醇的方法，该方法包括在包含丙三醇作为唯一碳源的补料培养基中培养根据本发明的微生物聚生体，并从该培养基中回收产生的1,3-丙二醇。
“适当的培养基”或“培养基”是指为梭菌属菌株的生长和二醇产生而优化的培养基。发酵过程通常在具有经调整适应所使用的梭菌属种的含有已知限定成分的合成的特别是无机的培养基的反应容器中进行。
术语“甘油(glycerine)”是指含有丙三醇分子的溶液。
在特定的实施方案中，将形式为包含至少50％的丙三醇优选至少85％的丙三醇的甘油组合物的丙三醇添加至培养基中。
有利地，在本发明的培养基中使用的甘油是工业甘油。“工业甘油”意指从工业过程中获得的未经充分纯化的甘油产物。工业甘油也可指定为“粗甘油(raw glycerine)”。工业甘油包含多于70％的丙三醇(优选地多于80％的丙三醇)、水和杂质诸如甲醇、矿物盐或脂肪酸。工业甘油中丙三醇的最大含量通常为90％，更通常为约85％。
除了其它以外，获得工业甘油的工业过程是其中将脂肪和油(特别是植物来源的脂肪和油和动物来源的脂肪和油或使用过的烹调用油)加工为工业产物诸如去垢剂或润滑剂的制造方法。在此类制造方法中，工业甘油被认为是副产物。
在一个实施方案中，在用于产生1,3-丙二醇的方法中使用的丙三醇由工业甘油提供。
在具体的实施方案中，该工业甘油是来自生物柴油生产的副产物，且包含已知的从生物柴油生产中获得的甘油的杂质，该工业甘油包含约80至85％的甘油，并带有盐、甲醇、水和一些其它有机化合物，诸如脂肪酸。从生物柴油生产中获得的工业甘油可进一步经过酸化步骤以消除脂肪酸。本领域技术人员已知酸化技术，且能够根据所用的甘油明确酸化的最佳条件。
术语“高丙三醇含量”或“高浓度的丙三醇”意指在补料培养基中多于90g.L-1的丙三醇。在优选的实施方案中，该浓度为介于90至200g.L-1的丙三醇，更特别为90至140g/L的丙三醇，优选为约120g.L-1的丙三醇，且更优选为约105g.L-1的丙三醇，所述丙三醇包含在甘油溶液中。
在优选的实施方案中，在本发明的用于产生1,3-丙二醇的方法中，补料培养基中的丙三醇浓度为90至120g/L丙三醇，且优选为105g/L的丙三醇，所述丙三醇包含在甘油溶液中。
在本发明的方法中，1,3-丙二醇的产生优选通过厌氧连续发酵过程通过在包含丙三醇作为唯一碳源的培养基中培养上述本发明的微生物聚生体或共培养物来进行，所述培养基为基本培养基，未添加有机氮。
术语“基本培养基”意指除了所述甘油溶液之外的有机体在其上生长的包含化学限定的组分的矿物质严格的培养基。
此类培养基在本领域中公开，特别是在2010年5月5日提交的WO 2010/128070和2010年10月5日提交的WO 2011/042434中，其内容通过提述并入本文。
因此，在优选的实施方案中，从根据本发明的方法获得的1,3-丙二醇被进一步纯化。
用于从发酵培养基中回收并最后纯化1,3-丙二醇的方法对于技术人员而言是已知的。1,3-丙二醇可通过蒸馏分离。在大多数实施方案中，从发酵培养基中蒸馏出1,3-丙二醇，同时含有副产物诸如乙酸盐，然后进一步通过已知方法来纯化。
特别优选的纯化方法在申请WO 2009/068110和WO 2010/037843中公开，其内容通过提述并入本文。
在另一方面中，本发明涉及至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株用于在含有高浓度丙三醇作为唯一碳源的培养基中通过与至少一种丙酮丁醇梭菌菌株共培养来改善从发酵过程中1,3-丙二醇的产生，特别是PDO的产率和效价的用途。
优选地，根据本发明的用途是至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株与至少一种丙酮丁醇梭菌菌株，且更优选为至少一种适应于在具有高甘油含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇的丙酮丁醇梭菌菌株的用途。关于适应于在具有高甘油含量的培养基中生长并产生1,3-丙二醇的丙酮丁醇梭菌菌株，所有以上优选的实施方案在经必要的修改后应用于本发明的此方面，此方面涉及改善从发酵过程中产生1,3-丙二醇特别是1,3-丙二醇的产率和效价的用途。
根据本发明的方法和用途，在其不同的实施方案中，导致产生1,3-丙二醇，效价高达52.9g.L-1，产率高达0.5g.g-1且在稀释率为0.069h1情况下生产率高达3.65g.L-1.h-1。
实施例
本文公开的方法和***进一步在下列实施例中说明，这些实施例是以实例说明的方式提供的，且不是限制性的。
本领域技术人员将理解适用性和必要的修改以适应本节中描述的特征。可替换地，该方法可以用本领域技术人员已知的其他标准方法进行。
流程
培养基和条件
针对培养物使用的培养基和条件已经在专利申请WO 2010/128070中描述：
-烧瓶培养：合成和丰富(CGM：梭菌生长培养基)培养基
-厌氧连续培养
DNA分离
从1ml的培养物中提取基因组DNA，该培养物使用24裂解器/匀浆器(Bertin Technologies，Saint Quentin Yvelines，France)经匀浆化并转移至具有玻璃珠管试剂盒(Glass Bead Tube Kit，0.1mm)的2ml管。/>24设置为：6500rpm，20秒循环时间，循环之间5秒延迟时间，共2个循环。在Precellys提取后，以10,000g离心裂解物，持续10分钟，上清液用于总基因组提取，该提取使用来自Macherey的/>Gel和PCRClean up(Macherey Nagel，Hoerdt，France)。
通过定量PCR来定量来自特定微生物的特定脱氧核糖核酸序列
分子技术诸如PCR技术的最新进展使得能够快速、特异和灵敏地检测和鉴定不同类型环境中的潜在微生物，例如在本专利申请中，来自发酵生产的培养液。
通过定量PCR(qPCR)使用Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-rad Mitry Mory，France)来测定样品中的绝对定量。在配置有CFX96TM实时***的Bio-RadC1000TM热循环仪(Bio-Rad Mitry Mory，France)上进行qPCR。
反应混合物由1×Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-RadMitry Mory，France)、6μL的每种正向(F)和反向(R)引物(1μM)、2μL的稀释的样品(Nanodrop测量为2ng/μL)和无核酸酶水，以达到最终体积为20μL。根据下列热循环程序完成扩增：在98℃初始熔解2分钟。(1个循环)随后进行40个循环的在98℃下熔解10秒，引物退火并在60℃延伸30秒。(熔解曲线65至95℃，增量为每5秒0.5℃)。
使用已知浓度的基因组DNA的连续稀释液的Cq值测定每种微生物的标准曲线。每个孔的Cq值(标准曲线和样品)由CFX ManagerTM3.1软件测定。将样品相对于标准曲线作图以测定核酸的丰度。绝对定量基于丙酮丁醇梭菌的每个细胞一个gapC基因拷贝，楔形梭菌的每个细胞一个cpn60基因拷贝和产孢梭菌的每个细胞一个tpi基因拷贝。出于计算的目的，假设核酸提取是完美的，因为没有可用的提取效率的度量。
如专利申请WO2012062832A1中描述的过表达来自丁酸梭菌的1.3-丙二醇操纵子且适应于在具有高浓度的工业甘油的培养基中生长并产生1.3-丙二醇的微生物丙酮丁醇梭菌群被命名为“174P型群”，且在本文中用作参考。
在此专利申请中，包含“174P型群”和其它微生物楔形梭菌和产孢梭菌的微生物聚生体用于改善从具有高甘油含量的培养基中产生1.3-丙二醇。此微生物聚生体被命名为“192P型微生物聚生体”。
实施例1：通过高浓度粗甘油连续培养的恒化器中“174P型群”和“192P型微生物聚 生体”的性能
细菌菌株：
-174P型群：丙酮丁醇梭菌菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05群，其在高浓度的粗甘油上进化
-192P型微生物聚生体：174P型群和其它微生物楔形梭菌和产孢梭菌的聚生体
培养基：
用于梭菌属分批培养的合成培养基每升自来水中含有：丙三醇，30g；KH2PO4，0.5g；K2HPO4，0.5g；MgSO4，7H2O，0.2g；CoCl2 6H2O，0.01g；H2SO4，0.1ml；NH4Cl，1.5g；生物素，0.16mg；对-氨基苯甲酸，32mg和FeSO4，7H2O，0.028g。将该培养基的pH用NH4OH 3N调节至6.3。使用购买自SDS Carlo_Erba的商业甘油(纯度99％)进行分批培养。用于连续培养的补料培养基每升自来水含有：来自粗甘油的丙三醇，105g；KH2PO4，0.45g；K2HPO4，0.45g；MgSO4，7H2O，0.2g；CoCl2 6H2O，0.013g；生物素，0.08mg；对-氨基苯甲酸，16mg；FeSO4，7H2O，0.04g；消泡剂，0,05ml；ZnSO4，7H2O，8mg；CuCl2，2H2O，4mg；MnSO4，H2O，20mg。用H2SO4 96％调节培养基pH为3.5至4之间。来自生物柴油的酯交换过程中的粗甘油是由不同供应商(Novance，ADM，Diester Industries，Greenergy，Carotech Berhad)提供的，且具有80至86％(w/w)的纯度。将这些甘油混合并通过酸化预先处理。
实验设置：
在5L的具有2000mL的工作体积的生物反应器Tryton(Pierre Guerin，France)中进行连续培养。通过自动调控培养水平使培养体积保持在恒定的2000mL。以200RPM搅拌培养物，将温度设置为35℃，并通过自动添加NH4OH 5.5N使pH维持在恒定的6.5。为了创造厌氧条件，在60℃向容器中的经灭菌的培养基中冲入无菌无O2的氮气一小时，并再次冲入直至达到35℃(在2小时过程中冲入)。通过连苯三酚装置(Vasconcelos等，1994)保护生物反应器的气体出口免受氧气。在灭菌后，对补料培养基也以无菌无O2的氮气冲入直至达到室温，且在氮气下维持以避免O2进入。
分批和连续培养过程：
用于评估的方法在专利申请WO 2010/128070(实施例2)中描述。
在100mL青霉素烧瓶中的合成培养基(与上文描述的分批培养物使用的相同但添加乙酸，2.2g.L-1和MOPS，23.03g.L-1)上生长的培养物作为接种物(5％v/v)，该接种物是在对数生长期结束取出。
首先，培养物分批式生长。在早期对数生长期，我们进行了一次来自粗甘油的丙三醇的脉冲：对于该脉冲，将具有105g.L-1的来自粗甘油的丙三醇的合成培养基(与补料培养的描述相同)以恒定流速在3个小时期间添加(即，添加18g.L-1的丙三醇)。然后，以分批式使生长持续，在对数生长期结束之前开始连续补料，稀释率为0.035h-1：补料培养基含有105g.L-1的来自粗甘油的丙三醇。在生物反应器接种后6-8天且在4个滞留时间(residencetime)(RT)后，稀释率在5天中从0.035h-1增加至0.070h-1。在此之后，稳定培养物，随后使用下述的HPLC流程测定1,3-丙二醇产生和丙三醇消耗。特别地，我们等待直至残留的甘油的浓度尽可能低。
192P型微生物聚生体的总体性能呈现在表1中，且与在相同条件下的仅含有在高浓度的粗甘油上进化的丙酮丁醇梭菌菌株DG1 pSPD5PD0001VE05的174P型群的性能进行比较。
分析步骤：
以测量浊度的方法在620nm处测量细胞浓度，并与直接测定的细胞干重相关联。通过HPLC分析测定丙三醇、1,3-丙二醇、乙醇、乳酸、乙酸和丁酸浓度。在Biorad Aminex HPX-87H柱上进行分离，并通过折射率完成检测。运行条件如下：流动相硫酸0.5mM；流速0.5ml/min，温度，25℃。
表1：在连续培养中生长的丙酮丁醇梭菌174P型群的性能和192P型微生物聚生体的性能(分别来自20和19个恒化器的平均数据)。补料培养基含有105g.L-1的来自粗甘油的丙三醇，稀释率为0.035h-1和0.070h-1。数值对应于稀释率为0.070h-1在至少9个滞留时间后分析的样品的平均值。
Y1,3-PDO：PDO产率(g/g消耗的甘油)
Q1,3PDO：PDO容积生产率
这些结果显示192P型微生物聚生体比174P型群表现出更好的PDO产生的结果(更高的PDO效价和产率且更少的残留甘油)。
实施例2：微生物聚生体定量
样品中每种微生物的丰度通过定量PCR(qPCR)使用Sso Advanced UniversalSYBR Green Supermix(Bio-rad Mitry Mory，France)在装配有CFX96TM实时***(在流程中描述)的Bio-Rad C1000TM热循环仪上测定。用于靶向丙酮丁醇梭菌的基于gapC基因的引物为gapC_F，5′-TGCTGCTGTAAGTATCATC-3′(SEQ ID NO:1)和gapC_R，5′-GTTGGAACTGGAACTCTT-3′(SEQ ID NO:2)。用于靶向楔形梭菌的基于cpn60基因的引物为cpn60_F，5′-TTATATGTGCACCGATATG-3′(SEQ ID NO:3)和cpn60_R，5′-GAGAAGTCTTGCGCCGGAC-3′(SEQ ID NO:4)。用于靶向产孢梭菌的基于tpi基因的引物为tpi_F，5′-CCAGCGGTATTAGAAGAA-3′(SEQ ID NO:5)和tpi_R，5′-GTCCTATAATTACATAATGAACTC-3′(SEQ ID NO:6)。
在以下两个表格中，给出了174P型群和192P型微生物聚生体的培养物中存在的不同菌种的代表性百分比，考虑到每种培养物中含有的细胞总数对应于100％。
表2：在培养的不同步骤的“174P型群”组成
用于1,3-丙二醇产生的“174P型群”发酵不含有任何楔形梭菌或产孢梭菌细菌。此群不是聚生体。
表3：在培养的不同步骤的“192P型微生物聚生体”组成。实现了不同试验，且指示获得的最小和最大比例。
相反地，以上表3显示，在培养的所有步骤和在生产发酵过程中，楔形梭菌和产孢梭菌细菌存在于“192P型微生物聚生体”中。每种微生物的比例在连续培养阶段中变化。
根据在如上定义的相同条件下进行的进一步实验踪迹，在“192P型微生物聚生体”的建立的持久状态培养中存在的不同菌种如下：
-丙酮丁醇梭菌 96.34％-98.64％
-楔形梭菌 1.29％-3.63％
-产孢梭菌 0,03％-0.11％。
实施例3：楔形梭菌和产孢梭菌分批培养物测定
作为本发明的对照，楔形梭菌和产孢梭菌在含有商业丙三醇或源自甘油的丙三醇(30g/L)的丰富培养基(CGM：梭菌生长培养基，如流程中所述的)中一起培养或单独培养。尽管微生物生长，但无丙三醇/甘油消耗，且无1.3-丙二醇产生。
另外，进行了几个测定，以使楔形梭菌或产孢梭菌或楔形梭菌和产孢梭菌在含有具有丙三醇/甘油(30g/L)的合成基本培养基的烧瓶培养物(在流程中描述)中生长，但未观察到生长。
所有这些数据表明楔形梭菌和产孢梭菌均不能够从作为唯一碳源的丙三醇/甘油产生1.3-丙二醇，且“192P型微生物聚生体”的的生长和其1，3-丙二醇的连续生产的持久性在某些程度上是由于丙酮丁醇梭菌的存在。而且，实施例1、2、3和4的结果显示楔形梭菌和/或产孢梭菌与丙酮丁醇梭菌的聚生体在改善在高浓度的工业粗甘油情况下的PDO产生性能中起关键作用。
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更具体地，本申请提供下列各项：
1.微生物聚生体，其包含至少一种丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株和至少一种选自产孢梭菌(Clostridium sporogenes)菌株和/或楔形梭菌(Clostridium sphenoide)菌株的菌株。
2.根据项1的微生物聚生体，其包含至少85％的丙酮丁醇梭菌和0.001％至0.2％的产孢梭菌和/或0.1％至15％的楔形梭菌。
3.根据项1或项2的微生物聚生体，其包含85％至99.8％的丙酮丁醇梭菌和0.001％至0.15％的产孢梭菌和/或0.2％至15％的楔形梭菌。
4.根据项1或项2的微生物聚生体，其包含90％至99.8％的丙酮丁醇梭菌和0.002％至0.13％的产孢梭菌和/或0.2％至10％的楔形梭菌。
5.根据前述项中任一项的微生物聚生体，其由至少一种丙酮丁醇梭菌菌株和至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株组成。
6.根据前述项中任一项的微生物聚生体，其中该丙酮丁醇梭菌菌株先前经适应以在具有高丙三醇含量的培养基中生长并产生1,3-丙二醇，该丙酮丁醇梭菌通过引入额外拷贝的来自丁酸梭菌(C.butyricum)的1,3-丙二醇操纵子呈现增加的1,3-丙二醇产生通量，该1,3-丙二醇操纵子编码涉及维生素B12非依赖性1,3-丙二醇途径的酶。
7.根据前述项中任一项的微生物聚生体，其中该丙酮丁醇梭菌菌株经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。
8.根据项6的微生物聚生体，其中所述丙酮丁醇梭菌先前经适应以在连续培养过程期间生长并产生1,3-丙二醇，在该过程中补料培养基含有一定浓度的源自工业甘油的丙三醇，该浓度介于90至120g/L之间的丙三醇，且优选为约105g/L的丙三醇。
9.一种用于在甘油的连续发酵过程中产生1,3-丙二醇的方法，该方法包括在包含丙三醇作为唯一碳源的补料培养基中培养根据项1至8中任一项所述的微生物聚生体，并从该培养基中回收产生的1,3-丙二醇。
10.根据项9的方法，其中该补料培养基中的甘油浓度为90至120g/L丙三醇，且优选为约105g/L的丙三醇，所述丙三醇包含在甘油溶液中。
11.根据项9至10中任一项的方法，其中该培养基为基本培养基，不添加有机氮。
12.根据项9至11中任一项的方法，其中该1,3-丙二醇经进一步纯化。
13.至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株用于通过在含有高浓度丙三醇作为唯一碳源的培养基中与至少一种丙酮丁醇梭菌菌株共培养来改善发酵过程中1,3-丙二醇的产生的用途。

Claims (10)

1.微生物聚生体，其包含至少一种丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株和至少一种选自产孢梭菌(Clostridium sporogenes)菌株和/或楔形梭菌(Clostridiumsphenoide)菌株的菌株。
2.根据权利要求1的微生物聚生体，其包含至少85％的丙酮丁醇梭菌、0.001％至0.2％的产孢梭菌和/或0.1％至15％的楔形梭菌，优选包含85％至99.8％的丙酮丁醇梭菌、0.001％至0.15％的产孢梭菌和/或0.2％至15％的楔形梭菌，且更优选包含90％至99.8％的丙酮丁醇梭菌、0.002％至0.13％的产孢梭菌和/或0.2％至10％的楔形梭菌。
3.根据前述权利要求中任一项的微生物聚生体，其由至少一种丙酮丁醇梭菌菌株、至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株组成。
4.根据前述权利要求中任一项的微生物聚生体，其中该丙酮丁醇梭菌菌株先前经适应以在具有高丙三醇含量的培养基中生长并产生1,3-丙二醇，该丙酮丁醇梭菌通过引入额外拷贝的来自丁酸梭菌(C.butyricum)的1,3-丙二醇操纵子呈现增加的1,3-丙二醇产生通量，该1,3-丙二醇操纵子编码涉及维生素B12非依赖性1,3-丙二醇途径的酶。
5.根据前述权利要求中任一项的微生物聚生体，其中该丙酮丁醇梭菌菌株经适应以在具有高丙三醇含量，特别是具有高浓度的源自工业甘油的丙三醇的培养基中生长并产生1,3-丙二醇。
6.根据权利要求4的微生物聚生体，其中所述丙酮丁醇梭菌先前经适应以在连续培养过程期间生长并产生1,3-丙二醇，在该过程中补料培养基含有一定浓度的源自工业甘油的丙三醇，该浓度介于90至120g/L之间的丙三醇，且优选为约105g/L的丙三醇。
7.一种用于在甘油的连续发酵过程中产生1,3-丙二醇的方法，该方法包括(i)在包含丙三醇作为唯一碳源的补料培养基中培养根据权利要求1至6中任一项所述的微生物聚生体，(ii)从该培养基中回收产生的1,3-丙二醇，且任选地其中所述1,3-丙二醇经进一步纯化。
8.根据权利要求7的方法，其中该补料培养基中的甘油浓度为90至120g/L丙三醇，且优选为约105g/L的丙三醇，所述丙三醇包含在甘油溶液中。
9.根据权利要求7或8的方法，其中该培养基为基本培养基，不添加有机氮。
10.至少一种产孢梭菌菌株和/或至少一种楔形梭菌菌株用于通过在含有高浓度丙三醇作为唯一碳源的培养基中与至少一种丙酮丁醇梭菌菌株共培养来改善发酵过程中1,3-丙二醇的产生的用途。
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