CN117659212A - 一种表皮细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种表皮细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法与应用，属于基因工程与蛋白质工程技术领域。针对利用原核表达***表达EGF存在形成不可溶的蛋白包涵体，对包涵体的纯化工艺繁琐，还会产生大量的废水，并且EGF的产率低，活性也会降低等技术问题，本发明在编码EGF的序列前加入了一段编码麦芽糖结合蛋白的序列，在保证蛋白的可溶性表达，避免复杂的包涵体复性步骤的基础上，利用同一个原核表达载体既能够制备含His tag的EGF，又能够制备不含His tag的EGF，扩展了单一原核表达载体的生产应用范围。本发明提供的制备EGF的方法具有成本低廉，产量大，纯度高，活性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种表皮细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
表皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF）是目前商品开发程度最高，应用最广的一种生长因子。大量研究表明，EGF对多种细胞的增殖和成熟都具有明显的促进作用，并且担载EGF的修复材料（纤维膜、可吸收医用棉、微载体、支架等）也可以有效的促进组织的损伤修复，在生物医学领域具有非常广阔的应用前景。
利用大肠杆菌原核表达目的蛋白是工业上大规模制备重组蛋白的手段之一，其优点在于能够短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉，方法也比较简单，可以表达的蛋白也比较多，但缺点是表达出来的蛋白没有经过修饰，不一定具有天然的活性，且目前蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难，提高了生产成本。例如，在EGF的原核表达***中，EGF常会因为表达速率过快而形成错误的空间折叠，从而形成不可溶的蛋白包涵体。对包涵体的纯化需要进行变性溶解和蛋白复性两个过程，不仅工艺繁琐，还会产生大量的废水。并且EGF的产率低，活性也会降低。
His tag标签是当下最流行的一种亲和纯化标签，由六个组氨酸残基组成，可***在目的蛋白的C末端或N末端，用于蛋白的亲和层析纯化。除此之外，His tag标签还可以作为蛋白的标记或检测位点。在生产过程中，亲和纯化标签的引入有利于缩短纯化时间，降低纯化成本，提高目标产物纯度。但在蛋白应用时，多余的纯化标签可能具有潜在生物安全风险。为了提高蛋白的生物安全性，就需要通过酶切的方式去除多余的纯化标签。
麦芽糖结合蛋白（MBP）是一种天然的大肠杆菌蛋白，由其组成的复合物负责麦芽糖糊精的吸收和高效分解代谢，可以与直链淀粉凝胶结合，并利用低浓度的麦芽糖进行温和洗脱，因此可以作为蛋白的亲和纯化标签。此外，MBP有助于其下游蛋白质在表达过程中形成正确的空间折叠，提高在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
发明内容
为解决利用原核表达***表达表皮细胞生长因子存在EGF常会因为表达速率过快而形成错误的空间折叠，从而形成不可溶的蛋白包涵体，对包涵体的纯化需要进行变性溶解和蛋白复性两个过程，不仅工艺繁琐，还会产生大量的废水，并且EGF的产率低，活性也会降低等技术问题，本发明在编码目的蛋白（EGF）的序列前加入了一段编码麦芽糖结合蛋白（MBP）的序列，MBP有助于其下游蛋白质在表达过程中形成正确的空间折叠，增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，避免复杂的包涵体复性步骤，并且在保证蛋白的可溶性表达基础上，利用同一个原核表达载体既能够制备含His tag的EGF，又能够制备不含His tag的EGF，扩展了单一原核表达载体的生产应用范围。
为解决本发明的技术问题，并实现相应技术效果，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是将表皮细胞生长因子蛋白与麦芽糖结合蛋白偶联制成的融合蛋白；所述表皮细胞生长因子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述麦芽糖结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述融合蛋白中麦芽糖结合蛋白与表皮细胞生长因子蛋白之间添加有组氨酸标签，麦芽糖结合蛋白与组氨酸标签之间添加有蛋白酶酶切位点，所述蛋白酶为Factor Xa、Thrombin、TEV protease、PreScisson、HRV 3C protease中的任意一种，组氨酸标签与表皮细胞生长因子蛋白之间添加有肠激酶酶切位点。
在本发明的一种实施方式中，所述组氨酸标签含有6个His，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白酶为Factor Xa。
在本发明的一种实施方式中，所述Factor Xa酶切位点的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述肠激酶酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二个目的是提供上述融合蛋白的编码序列。
本发明的第三个目的是提供含有上述编码序列的重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供含有上述编码序列或上述重组表达载体的重组菌。
本发明的第四个目的是提供一种用于表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的表皮细胞生长因子的方法，所述方法是在宿主菌中重组表达上述的融合蛋白，对获得的重组菌进行培养，经IPTG溶液诱导，收集菌体，超声破碎菌体，收集上清液，再利用直链淀粉亲和层析柱纯化目的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述方法诱导过程中IPTG的终浓度为0.5 M。
在本发明的一种实施方式中，所述方法需要进行两次直链淀粉亲和层析柱纯化，第一次直链淀粉亲和层析柱纯化的目的是纯化获得融合蛋白，第二次直链淀粉亲和层析柱纯化的目的是获得酶切后的终产物目的蛋白。
在本发明的一种实施方式中，第二次直链淀粉亲和层析柱纯化获得含组氨酸标签的表皮细胞生长因子的纯化方法为在50 μL 1×Reaction Buffer反应体系中，加入50 μg融合蛋白和1 μg Factor Xa，于25℃条件下切割6小时后，过直链淀粉亲和层析柱，收集流出液。
在本发明的一种实施方式中，第二次直链淀粉亲和层析柱纯化获得不含组氨酸标签的表皮细胞生长因子的纯化方法为在50 μL 1×Reaction Buffer反应体系中，加入50 μg融合蛋白和1 μg 肠激酶，于25℃条件下切割6小时后，过直链淀粉亲和层析柱，收集流出液。
在本发明的一种实施方式中，在两次直链淀粉亲和层析柱纯化后还包括利用分子筛去除蛋白液中可能残留的杂蛋白（残留的酶，切掉的标签等），获得精纯蛋白。
本发明的有益效果：
本发明在编码目的蛋白（EGF）的序列前加入了一段编码麦芽糖结合蛋白（MBP）的序列，MBP有助于其下游蛋白质在表达过程中形成正确的空间折叠，增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，避免复杂的包涵体复性步骤。
在本发明中，His tag标签的C端含有MBP标签。按照以往的技术，在保证蛋白可溶性表达的基础上，制备含His tag和不含His tag的EGF需要两个不同的表达载体。为了能够根据需求，利用同一个原核表达载体既能够制备含His tag的EGF，又能够制备不含His tag的EGF，我们在His tag与MBP标签之间加入了Factor Xa酶切位点，同时在His tag与EGF之间加入了肠激酶酶切位点。这样在制备重组EGF的过程中，如果想要目的蛋白含有His tag，就用Factor Xa酶切掉MBP标签；如果想要目的蛋白不含His tag，就用肠激酶将前面的标签全部切掉。
利用本发明构建的融合蛋白表达EGF具有成本低廉，产量大等优点，同时也实现了目的蛋白的可溶性表达，省略了复杂的包涵体复性步骤。本发明使用直链淀粉凝胶亲和层析和分子筛层析两步纯化，可获得高纯度的目的蛋白，纯度约95%，且具有良好的生物活性。本发明可以选择不同的酶对蛋白进行酶切，以获得含或不含His标签的目的蛋白，以适应不同的应用需求。
附图说明
图1为实施例1所述融合蛋白的表达框示意图；
图2为重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图；其中，图2中的1为Marker，图2中的2为诱导前，图2中的3为诱导后，图2中的4为菌体破碎后上清，图2中的5为菌体破碎后沉淀；
图3为重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图；其中，图3中的1为Marker，图3中的2为菌体破碎后上清，图3中的3为第一次直链淀粉亲和层析过程中获得的流出液，图3中的4为第一次直链淀粉亲和层析过程中获得的洗涤液，图3中的5为第一次直链淀粉亲和层析过程中获得的洗脱液；
图4为Factor Xa和肠激酶酶切后依次进行亲和层析和分子筛得到的目的重组蛋白的电泳结果图；其中，图4中的M为Marker，图4中的FactorXa为Factor Xa酶切后依次进行亲和层析和分子筛得到的目的重组蛋白的电泳结果，图4中的EK为肠激酶酶切后依次进行亲和层析和分子筛得到的目的重组蛋白的电泳结果；
图5为使用His tag抗体对不含有组氨酸标签的表皮细胞生长因子进行westernblot检测的结果图；其中，图5中的FactorXa为FactorXa酶切获得的蛋白，图5中的EK为肠激酶酶切获得的蛋白；
图6为使用EGF抗体对含有组氨酸标签的表皮细胞生长因子进行westernblot检测的结果图；其中，图6中的FactorXa为FactorXa酶切获得的蛋白，图6中的EK为肠激酶酶切获得的蛋白；
图7为含有组氨酸标签的表皮细胞生长因子和不含有组氨酸标签的表皮细胞生长因子的活性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式和附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本发明所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明的技术。
实施例1：融合蛋白的构建
将麦芽糖结合蛋白（MBP）、Factor Xa酶切位点、组氨酸亲和纯化标签（His tag）、肠激酶酶切位点与表皮细胞生长因子（EGF）偶联制成融合蛋白，该融合蛋白的表达框示意图如图1所示。融合蛋白中表皮细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，麦芽糖结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，组氨酸亲和纯化标签的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，Factor Xa酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，肠激酶酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.1：NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR；
SEQ ID NO.2：
KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQT；
SEQ ID NO.3：HHHHHH；
SEQ ID NO.4：IEGR；
SEQ ID NO.5：DDDDK。
实施例2：表达融合蛋白的重组表达载体的构建
将实施例1所述融合蛋白的蛋白序列转化成基因碱基序列，装载于pET21b质粒载体中获得表达融合蛋白的重组表达载体。
编码表皮细胞生长因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
AATTCTGATTCCGAATGTCCTTTATCACATGACGGTTATTGCTTGCACGATGGCGTTTGTATGTACATTGAGGCTCTTGACAAATATGCCTGCAACTGTGTCGTAGGATACATCGGGGAACGTTGCCAATATCGCGATCTCAAGTGGTGGGAGCTACGA；
编码麦芽糖结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
AAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGCCTAGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGTGAAAGATCCGCGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACT；
组氨酸亲和纯化标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
CATCACCATCACCATCAC；
Factor Xa酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：
ATTGAAGGCCGT；
肠激酶酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：
GATGACGATGACAAA。
实施例3：一种表达表皮生长因子的方法
将实施例2获得的重组表达载体转化到BL21（DE3）大肠杆菌中，构建出表达融合蛋白的重组大肠杆菌。将重组大肠杆菌接种至含氨苄青霉素（Amp）抗生素的LB培养基中，于37℃培养过夜，然后挑取单菌落，常规PCR鉴定阳性克隆，将阳性克隆送交DNA序列分析，保留序列正确的克隆，用100 mL LB培养基培养。当OD600达到1.0-1.2时，加入浓度为1 M的IPTG溶液进行诱导，使IPTG终浓度达到0.5 mM。28℃诱导表达过夜（12-16 h）之后，4000 rpm离心收集菌体。超声破碎菌体，10000 g离心20 min后，收集上清液，利用直链淀粉亲和层析柱进行第一次纯化获得目的融合蛋白。
本发明对上述过程中诱导前、诱导后、菌体破碎后上清及菌体破碎后沉淀中的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图2所示。图2表明目标蛋白都存在于破碎后上清中，仅有极少量的包涵体产生。
本发明对上述过程中菌体破碎后上清、直链淀粉亲和层析过程中获得的流出液、洗涤液及洗脱液（洗脱液中是含MBP标签和His tag的融合蛋白）进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图3所示。
在利用直链淀粉亲和层析柱进行第一次纯化后再利用直链淀粉亲和层析柱进行第二次纯化，在第二次纯化过程中，当需要获得含组氨酸标签的表皮细胞生长因子时，对应的纯化方法为在50 μL 1×Reaction Buffer反应体系中，加入50 μg融合蛋白和1 μgFactor Xa，于25℃条件下切割6小时后，过直链淀粉亲和层析柱，收集流出液；当需要获得不含组氨酸标签的表皮细胞生长因子时，对应的的纯化方法为在50 μL 1×ReactionBuffer反应体系中，加入50 μg融合蛋白和1 μg肠激酶，于25℃条件下切割6小时后，过直链淀粉亲和层析柱，收集流出液。
经直链淀粉亲和层析后，最后利用分子筛去除蛋白液中可能残留的杂蛋白（残留的酶，切掉的标签等），获得精纯蛋白。
本发明对肠激酶（EK）酶切后依次进行亲和层析和分子筛得到的不含组氨酸标签的表皮细胞生长因子和Factor Xa酶切后依次进行亲和层析和分子筛得到的含有组氨酸标签的表皮细胞生长因子进行电泳检测，检测结果如图4所示。
本发明利用westernblot检测了上述方法获得的含有组氨酸标签的表皮细胞生长因子和不含有组氨酸标签的表皮细胞生长因子，具体方法是利用响应的抗体，免疫标记不同样品中含有的目标基团，从而对蛋白进行鉴定，鉴定结果如图5和图6所示。图5是用Histag抗体对蛋白中是否存在His tag进行鉴定。结果显示，肠激酶酶切后的蛋白不含有Higtag，而Factor Xa酶切后的蛋白仍保留着His tag。图6是利用EGF抗体对样品中是否为重组人源EGF进行鉴定。结果显示所制备的样品均为重组人源EGF。
本发明采用实验室小制，单次1L摇瓶发酵的产量约为1 mg。
终产物的纯度经SDS-PAGE鉴定。采用ImageJ对SDS-PAGE电泳结果图中单个泳道进行灰度扫描分析。具体方法为利用ImageJ软件分别测量整条泳道的灰度值和目的灰度值，蛋白纯度=目的灰度值/总灰度值×100%。结果表明产品的纯度可达95%以上。
利用重组蛋白促进Balc/3T3细胞增殖的能力，评价重组EGF的活力。将Balc/3T3细胞按5000每孔的数量种植于96孔板中。培养一天后，将培养基换成含0.4%血清的含有不同EGF浓度的培养基。连续培养48小时后，用CCK-8检测细胞活力，对照组为不含生长因子组（见图7）。该结果表明，本发明获得的EGF具有较好的生物活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，是将表皮细胞生长因子蛋白与麦芽糖结合蛋白偶联制成的融合蛋白；表皮细胞生长因子蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，麦芽糖结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，麦芽糖结合蛋白与表皮细胞生长因子蛋白之间添加有组氨酸标签，麦芽糖结合蛋白与组氨酸标签之间添加有蛋白酶酶切位点，蛋白酶为Factor Xa、Thrombin、TEV protease、PreScisson、HRV 3C protease中的任意一种，组氨酸标签与表皮细胞生长因子蛋白之间添加有肠激酶酶切位点。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，组氨酸标签含有6个His，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，蛋白酶为Factor Xa。
5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，Factor Xa酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，肠激酶酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.一种编码序列，其特征在于，所述编码序列为权利要求1-5任一所述融合蛋白的编码序列。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是含有权利要求6所述编码序列的重组表达载体。
8.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌是含有权利要求6所述编码序列或权利要求7所述重组表达载体的重组菌。
9.一种用于表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的表皮细胞生长因子的方法，其特征在于，是在宿主菌中重组表达权利要求1-5任一所述的融合蛋白，对获得的重组菌进行培养，经IPTG溶液诱导，收集菌体，超声破碎菌体，收集上清液，再利用直链淀粉亲和层析柱纯化目的蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，宿主菌为大肠杆菌。
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