CN116041451B - 一种内含肽变体及其在生物法制备蓝铜胜肽中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种内含肽变体及其在生物法制备蓝铜胜肽中的应用，所述内含肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。通过将其与GHK组成融合蛋白，在导入载体质粒后制备得到高效、稳定的蓝铜胜肽的重组表达载体，通过诱导表达能够获得高纯度的蓝铜胜肽。而且，基于该方法的蓝铜胜肽制备难度低，能够有效降低污染和有毒有害副产物的产生，产出量大，适用于蓝铜胜肽的大规模工业化量产，具有较大的市场价值。

Description

一种内含肽变体及其在生物法制备蓝铜胜肽中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种内含肽变体及其在生物法制备蓝铜胜肽中的应用。
背景技术
蓝铜胜肽，又称为三肽-1铜，是由甘氨酸Gly(G)-组氨酸His(H)-赖氨酸Lys(K)残基组成的三肽偶联铜离子形成寡肽-铜复合物(GHK-Cu)。GHK是人体蛋白质中较为罕见的氨基酸序列，因此，由机体自身降解产生的GHK短肽在机体内含量极低。血浆中蓝铜胜肽在20岁时约为200μg/mL，随着年龄的增长，蓝铜胜肽的含量逐渐减少，在60岁时降至80μg/mL。蓝铜胜肽在机体内行使着重要的生物学功能，包括促进胶原蛋白和弹力蛋白再生、促进伤口愈合、抗炎症和修复紫外造成的DNA损伤等。因此，蓝铜胜肽在医疗和护肤领域具有极高的应用价值，也具有极大的市场需求。
目前市面上售卖的蓝铜胜肽主要是来源于化学合成的方式，包括液相合成和固相合成两种方式，均是将氨基酸残基一个个逐步混合添加得到三肽，再跟铜离子进行偶联得到。这些方式虽然能够获得蓝铜胜肽，但是产量极低。这主要是因为采用化学合成会带来很多合成副产物，有些副产物甚至具有较大的细胞毒性，从而使得蓝铜胜肽的生产和提纯消耗大量的成本，且容易带来严重的污染，这极大地限制了蓝铜胜肽的应用。因此，开发一种更加绿色经济且高效的合成方式，是蓝铜胜肽工业化生产所急需的。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种内含肽变体及其在生物法制备蓝铜胜肽中的应用，通过该内含肽变体与GHK三肽的融合，能够高效且规模化生产蓝铜胜肽，有效避免了副产物和有毒有害物质的产生，获得的蓝铜胜肽品质优、纯度高，远优于目前现有传统的蓝铜胜肽生产方法。
本发明的第一个方面，提供一种内含肽变体，所述内含肽变体由Chitinophagaceae bacterium的G14基因片段突变得到。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述基因片段为MCF8340111.1的303～431位氨基酸残基片段。
发明人发现，Chitinophagaceae bacterium的G14基因(数据库编号：MCF8340111.1)与常规商业化内含肽Ssp dnaB序列具有一定的同源性，并基于AlphaFold2对MCF8340111.1和Ssp dnaB进行三级结果预测，发现两者在三级结构上高度相似，从而猜测MCF8340111.1中的片段可能可以作为内含肽行使与Ssp dnaB相似的功能。基于此，进一步发现了MCF8340111.1的303～431位氨基酸残基片段可以作为突变母体进行使用。
在本发明的一些实施方式中，所述内含肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO:1是基于MCF8340111.1的303～431位氨基酸残基片段的第一个氨基酸(半胱氨酸，C)突变为丙氨酸(A)得到的。
在本发明中，发明人发现通过将MCF8340111.1的303～431位氨基酸残基片段的第一个氨基酸(半胱氨酸，C)突变为丙氨酸(A)，可以在保证其功能性的同时，破坏其N端的自切割活性，从而可以用于作为内含肽变体使用。
本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述的内含肽变体的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子还包括与SEQ ID NO:2具有85％以上同一性且具有同样功能的序列。
在本发明的一些实施方式中，所述同一性为85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
本发明的第三个方面，提供一种内含肽-GHK三肽融合蛋白，所述融合蛋白中包括SEQ ID NO:1所示的序列和GHK三肽序列。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白中还包括修饰序列。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰序列包括GST标签序列、Flag标签序列、Halo标签序列、HA标签序列、Myc标签序列、Snap标签序列中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述修饰序列为His标签。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的第四个方面，提供一种GHK三肽产品所述GHK三肽产品包括如下(1)～(8)中的至少一种：
(1)本发明第一个方面所述的内含肽变体；
(2)本发明第二个方面所述的核酸分子；
(3)含有(2)中核酸分子的表达载体；
(4)本发明第三个方面所述的融合蛋白；
(5)编码(4)中融合蛋白的核酸分子；
(6)含有(5)中核酸分子的表达载体；
(7)含有(2)或(5)中核酸分子的转化体；
(8)含有(3)或(6)中表达载体的转化体；
在本发明的一些实施方式中，所述转化体包括病毒、细菌、真菌和细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述转化体为细菌。
在本发明的一些实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。
在本发明的一些实施方式中，(6)中的表达载体是基于SEQ ID NO:4所示序列得到的。
在本发明的一些实施方式中，(6)中的表达载体的制备方法为：使用双酶切法处理SEQ ID NO:4所示序列和空白载体质粒，使用T4 DNA连接酶连接即可。
在本发明的一些实施方式中，(6)中的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一些实施方式中，(8)中的转化体的制备方法为：取(6)中的表达载体转化细菌，将转化后的细菌涂布在含卡那霉素的平板上，筛选出阳性克隆即可。
在本发明中，发明人通过对比本发明中的内含肽Chi G14-GHK表达载体与常规GHK表达载体的表达差异，发现本发明中的内含肽Chi G14-GHK表达载体相比常规GHK表达载体具有显著更高的蛋白表达水平，说明内含肽Chi G14-GHK表达载体可以作为高产GHK的表达载体。
本发明的第五个方面，提供一种蓝铜胜肽的制备方法，包括如下步骤：基于SEQ IDNO:1所示的内含肽和GHK三肽序列构建融合蛋白表达载体，诱导蛋白表达，9～11KDa过滤得到截留液，加入铜离子孵育，2～4KDa过滤，收集流通液即为蓝铜胜肽。
在本发明的一些实施方式中，基于SEQ ID NO:1所示的内含肽和GHK三肽序列构建得到的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一些实施方式中，表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一些实施方式中，诱导蛋白表达的试剂包括IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。
在本发明的一些实施方式中，过滤可采用膜包或者超滤管。
在本发明的一些实施方式中，第一次过滤为10KDa滤膜过滤。
在本发明的一些实施方式中，第一次过滤的具体操作为：使用10KDa滤膜过滤，直至截留液体积小于原来体积的1/20，向截留液中加入20倍体积的裂解液，再次通过10KDa滤膜，直至截留液体积小于原来体积的1/20，重复多次。
在本发明的一些实施方式中，第二次过滤为3KDa滤膜过滤。
在本发明的一些实施方式中，第二次过滤的具体操作为：使用3KDa滤膜过滤，直至截留液体积小于原来体积的1/20。
在本发明的一些实施方式中，所述铜离子来自铜盐或其与缓冲液的混合溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述铜盐包括但不限于醋酸铜、硫酸铜、氯化铜。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液包括但不限于磷酸缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤还包括对流通液进行浓缩、干燥。
在本发明中，发明人发现基于上述方法可以高效地获得高纯度GHK-Cu，GHK-Cu的纯度高达98％以上。而且干燥后得到的蓝铜胜肽粉末具有良好的外观和稳定性。
本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述的内含肽变体在生物法制备蓝铜胜肽中的应用。
蓝铜胜肽是三个氨基酸组成的寡肽，其在化学合成中以逐个添加氨基酸的方式进行合成，实现起来较为复杂。发明人发现，通过利用天然生物***中“中心法则”里的mRNA翻译成多肽链，其能有序的按照基因编码信息实现氨基酸添加，使得蓝铜胜肽可以通过体外制备好的遗传信息转入到细胞***中获得稳定表达该遗传信息产物的工程生命体表达得到。从而在技术角度上相比化学合成具有至少以下优势：1)操作简单，只要构建出表达特定肽类的工程菌，就可以持续的进行肽类的表达；2)成本低，底物都是一些最基础的营养物质，不需要昂贵的材料；3)副产物少，提纯容易，基本没有合成副产物，只有生命体代谢的产物，容易分离和提纯；4)清洁环保，几乎无污染，符合“碳中和”的时代需求；5)效率高，合成效率高效，可以大规模生产和获得。因此，可以看出，本发明中的相关应用相较于化学合成具有显著的技术优势。但现有技术中的问题在于没有蓝铜胜肽生物合成的案例，这是因为蓝铜胜肽肽链太短，难以在生物培养物中检测和分离。虽然有方法提及可以利用包含蛋白酶切割位点的寡肽融合蛋白来提高寡肽的肽链的长度，使其易于在表达过程中检测寡肽的产量，并利用亲和标签来降低寡肽的纯化难度。但这种办法需要在蛋白纯化后引入额外的蛋白内切酶来进行寡肽的释放和分离。这增加了寡肽的生产复杂程度，降低了寡肽的产能。同时还容易引入额外的氨基酸残基，导致寡肽的性能或功能改变。而本发明中的内含肽能够有效地解决上述问题。内含肽是一类能够通过自催化完成切割的氨基酸序列，其能够在特定的条件完成自身和蛋白之间的分离。而本发明中的内含肽能够针对GHK三肽实现定向切割，实现特定蛋白上各类蛋白标签的有效去除。
本发明的有益效果是：
1.本发明中提供了一种新的内含肽变体序列Chi G14，通过将Chi G14与GHK组成融合蛋白，在导入载体质粒后制备得到高效、稳定的蓝铜胜肽的重组表达载体，在转入细菌得到工程菌后，通过诱导表达能够获得高纯度的蓝铜胜肽。
2.本发明中的蓝铜胜肽是基于蓝铜胜肽的重组表达载体得到的，其制备方法简单，仅需经过细胞破碎、超滤、内含肽切割和铜离子结合、二次超滤等简单的步骤，就可以高效地获得高纯度的蓝铜胜肽，且生物合成方法能够有效降低污染和有毒有害副产物的产生，产出量大，适用于蓝铜胜肽的大规模工业化量产，具有较大的市场价值。
附图说明
图1为Chi G14内含肽与Ssp dnaB序列的序列比对。
图2为Chi G14内含肽与Ssp dnaB序列的三级蛋白结构预测比较，其中，浅色为SspdnaB序列，深色为Chi G14内含肽。
图3为实施例中的内含肽Chi G14-GHK表达载体的质粒图谱。
图4为实施例中的常规的GHK表达载体的质粒图谱。
图5为内含肽表达载体诱导表达内含肽G14-GHK融合蛋白的电泳图。
图6为传统表达载体诱导表达丝蛋白酶识别序列-GHK融合蛋白的电泳图。
图7为Ni-NTA树脂亲和层析纯化后得到的-Chi G14-GHK融合蛋白的电泳图
图8为使用本发明实施例中的方法制备得到的蓝铜胜肽产物HPLC鉴定结果。
图9为使用本发明实施例中的方法制备得到的蓝铜胜肽蓝铜胜肽粉末外观照片。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
Chi G14内含肽设计母体的选择
在本发明实施例中，发明人发现了Chitinophagaceae bacterium的G14基因(数据库编号：MCF8340111.1)与常规商业化内含肽Ssp dnaB序列具有一定的同源性(如图1所示)。同时，发明人还利用AlphaFold2对MCF8340111.1和Ssp dnaB进行三级结果预测，发现两者在三级结构上高度相似，从而猜测MCF8340111.1中的片段可能可以作为内含肽行使与Ssp dnaB相似的功能。
对此，发明人将MCF8340111.1的303～431位氨基酸残基片段采用常规方法克隆出来作为突变母体进行使用。
Chi G14内含肽的构建及其在构建GHK表达载体中的应用
(1)Chi G14内含肽的构建：
将上述MCF8340111.1的303～431位氨基酸残基片段的第一个氨基酸(半胱氨酸，C)突变为丙氨酸(A)，从而破坏其N端的自切割活性，得到内含肽Chi G14。
其中，内含肽Chi G14的具体氨基酸序列为：
AVSLDTIVDIENKGLVQIKDVVVGDNILTHKGYKAISYVFPIEKQPVYRIKTKSGKEIKV SAKHKFPTLNKGLVSIDSGLTVGDELFIKNTNILLDEIESIELVGEEDTIDITVDDTHMFYAND IYTHN(SEQ ID NO:1)。
其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5’-GCAGTGTCCCTGGACACTATCGTTGATATTGAAAACAAAGGCCTGGTGCAGATC AAGGACGTAGTCGTAGGCGACAATATCCTGACTCACAAAGGCTACAAAGCGATCTCTTACGTGTTCCCGATCGAAAAACAGCCGGTTTATCGTATTAAAACTAAATCCGGTAAAGAAATCAAAGTCAGCGCTAAGCACAAATTCCCGACTCTGAACAAGGGTCTGGTTTCCATCGATAGCGGCCTGACTGTTGGTGATGAGCTGTTCATTAAAAACACTAACATCCTGCTGGATGAAATCGAATCTATCGAACTGGTTGGTGAAGAAGATACCATCGACATCACCGTAGACGACACGCACATGTTCTACGCTAACGATATCTATACCCACAAC-3’(SEQ ID NO:2)。
(2)Chi G14内含肽在构建GHK表达载体中的应用：
将步骤(1)中得到的Chi G14内含肽与GHK三肽序列进行融合，得到的融合蛋白序列如SEQ ID NO:3所示。
MHHHHHHAVSLDTIVDIENKGLVQIKDVVVGDNILTHKGYKAISYVFPIEKQPVYRIKT KSGKEIKV SAKHKFPTLNKGLVSIDSGLTVGDELFIKNTNILLDEIESIELVGEEDTIDITVDDT HMFYANDIYTHNGHK(SEQID NO:3)。
其中下划线部分为Chi G14内含肽。
融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5’-ATGCACCATCACCACCACCATGCAGTGTCCCTGGACACTATCGTTGATATTGAAA ACAAAGGCCTGGTGCAGATCAAGGACGTAGTCGTAGGCGACAATATCCTGACTCACAAAGGCTACAAAGCGATCTCTTACGTGTTCCCGATCGAAAAACAGCCGGTTTATCGTATTAAAACTAAATCCGGTAAAGAAATCAAAGTCAGCGCTAAGCACAAATTCCCGACTCTGAACAAGGGTCTGGTTTCCATCGATAGCGGCCTGACTGTTGGTGATGAGCTGTTCATTAAAAACACTAACATCCTGCTGGATGAAATCGAATCTATCGAACTGGTTGGTGAAGAAGATACCATCGACATCACCGTAGACGACACGCACATGTTCTACGCTAACGATATCTATACCCACAACGGTCACAAA-3’(SEQ ID NO:4)。
SEQ ID NO:4的合成交由南京金斯瑞生物科技有限责任公司。当然，本领域技术人员也可以根据实际情况选择其他本领域常规方式按照上述序列组成进行合成。
在SEQ ID NO:4的5’端使用酶切位点NcoI进行切割，3’端使用酶切位点XhoI进行切割，得到切割片段。然后取1μg同样经过NcoI和XhoI酶切处理后的空白pET28a质粒(使用琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，即可得到线性化的酶切后的质粒)。使用T4 DNA连接酶对切割片段和pET28a骨架进行连接过夜，连接方法参考pET28a质粒使用说明或本领域中常规技术手册进行。连接后的产物转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，将转化后的大肠杆菌涂布在含卡那霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。挑取阳性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，震荡培养后利用载体通用引物进行菌液PCR鉴定。
其中，所用载体通用引物的序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO:5)。
鉴定无误后的菌液再进行测序验证，保存测序正确的菌株。
内含肽Chi G14-GHK表达载体的质粒图谱如图3所示。内含肽Chi G14-GHK表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
(3)内含肽Chi G14-GHK表达载体与常规GHK表达载体的表达差异：
为了突出内含肽Chi G14-GHK表达载体与常规GHK表达载体的表达差异，发明人以常规的GHK表达载体作为对照，通过在同样条件下诱导蛋白表达来进行对比比较。
其中，在本实施例中，常规的GHK表达载体的构建方法为：通过基因合成的方式获得包含丝蛋白酶识别位点的GHK融合蛋白(SEQ ID NO:7)。包含丝蛋白酶识别位点的GHK融合蛋白的氨基酸序列为：MHHHHHHTVVGIVCRTKPDGSINVCSENDSVPVAVITKVENNN TENIEGCNSDEAVKETVGVIDSKNIVDAVHIKGSVNDVKTRTVVKQSMPDKPMAEVVKNQ PVVNDENVKGHIVGVRCPDHHHHHHPNSSSVDYGHK(SEQ ID NO:7)。
其对应的核苷酸序列为：5’-ATGCACCATCACCACCACCATACAGTTGTAGGAATAGTT TGTAGAACTAAACCGGACGGAAGTATCAATGTATGCTCTGAAAATGATTCAGTTCCTGTTGCTGTGATTACTAAAGTTGAAAATAATAATACAGAAAATATTGAAGGTTGTAATTCAGATGAGGCTGTAAAGGAAACAGTAGGAGTTATTGATAGCAAGAATATAGTTGATGCTGTTCACATAAAAGGCAGCGTTAATGATGTTAAAACTAGAACTGTTGTGAAGCAAAGCATGCCTGATAAGCCAATGGCTGAGGTTGTAAAGAATCAACCTGTGGTTAATGATGAAAATGTTAAGGGACATATAGTTGGGGTTAGGTGTCCGGATCATCATCACCATCACCATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACTATGGTCACAAA-3’(SEQID NO:8)。
SEQ ID NO:8的合成交由南京金斯瑞生物科技有限责任公司。在SEQ ID NO:8的5’端使用酶切位点NcoI进行切割，3’端使用酶切位点XhoI进行切割，得到切割片段。然后取1μg同样经过NcoI和XhoI酶切处理后的空白pET28a质粒(使用琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，即可得到线性化的酶切后的质粒)。使用T4 DNA连接酶对切割片段和pET28a骨架进行连接过夜，连接方法参考pET28a质粒使用说明或本领域中常规技术手册进行。连接后的产物转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，将转化后的大肠杆菌涂布在含卡那霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。挑取阳性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，震荡培养后利用载体通用引物进行菌液PCR鉴定。
其中，所用载体通用引物同上述实施例。鉴定无误后的菌液再进行测序验证，保存测序正确的菌株。常规的GHK表达载体的质粒图谱如图4所示。
将构建成功的含有内含肽Chi G14-GHK表达载体的菌株与含有常规GHK表达载体的菌株均培养至OD600＝0.6～0.8(在本实施例中为0.7)后，分别加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达。表达后的菌体经离心富集后，使用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达水平。
结果如图5和图6所示。
图5为内含肽表达载体诱导表达内含肽G14-GHK融合蛋白的结果，图6为传统表达载体诱导表达丝蛋白酶识别序列-GHK融合蛋白的结果，可以发现，内含肽Chi G14-GHK表达载体相比常规GHK表达载体具有显著更高的蛋白表达水平，说明内含肽Chi G14-GHK表达载体可以作为高产GHK的表达载体。
Chi G14-GHK融合蛋白的纯化
在本实施例中，基于内含肽Chi G14-GHK表达载体的Chi G14-GHK融合蛋白的纯化步骤具体如下：
(1)诱导表达：
将上述实施例中的内含肽Chi G14-GHK表达载体转化到BL21(DE3)表达菌株中，挑取单克隆菌株至LB培养基中扩大培养中OD600值为0.8，加入1/20体积的1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和终浓度为1mM的IPTG，37℃，200rpm继续培养4-6h。4℃离心20min，收集菌体。收集得到的菌体用PBS清洗2次。
(2)菌体破碎：
将洗涤后的菌体重悬在裂解缓冲液(由终浓度20mM Tris和终浓度500mM NaCl组成，pH 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，直至镜检染色确认没有明显的菌体。4℃，12000rpm离心20min，收集上清，0.45μm滤膜过滤。
(3)亲和层析：
Ni-NTA亲和层析柱用20倍柱体积裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的细菌裂解液以0.5mL/min流速移入Ni-NTA亲和层析柱中，再用5倍柱体积的含40mM咪唑的裂解缓冲液充分清洗。再用5倍柱体积的含200mM咪唑的裂解缓冲液洗脱目的蛋白，即得纯化后的ChiG14-GHK融合蛋白。
分别使用SDS-PAGE、Western blot和HPLC检测纯化的目的蛋白，并使用BCA法对纯化的蛋白进行定量。
纯化结果如图7所示。
可以发现，基于Ni-NTA树脂亲和层析可以高效地纯化出Chi G14-GHK融合蛋白，且经过BCA法定量检测发现，Chi G14-GHK融合蛋白的平均产能可以达到20mg/L。
基于Chi G14-GHK融合蛋白得到蓝铜胜肽GHK-Cu
在本实施例中，发明人基于上述实施例中的Chi G14内含肽的切割条件和超滤法得到蓝铜胜肽GHK-Cu，具体操作如下：
(1)融合蛋白表达：
将上述实施例中的内含肽Chi G14-GHK表达载体转化到BL21(DE3)表达菌株中，挑取单克隆菌株至LB培养基中扩大培养中OD600值为0.8，加入1/20体积的1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和终浓度为0.5mM的IPTG，37℃，200rpm继续培养4-6h。4℃离心20mi n，收集菌体。收集得到的菌体用PBS清洗2次。
(2)菌体破碎：
将洗涤后的菌体重悬在裂解缓冲液(由终浓度20mM Tris和终浓度500mM NaCl组成，pH 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，直至镜检染色确认没有明显的菌体。4℃，12000rpm离心20min，收集上清，0.45μm滤膜过滤。
(3)第一轮过滤：
将过滤后的裂解液通过10KDa滤膜(可使用膜包或者超滤管)过滤，直至截留液体积小于原来体积的1/20。向截留液中加入20倍体积的裂解液，再次通过10KDa滤膜，直至截留液体积小于原来体积的1/20。重复3次。收集截留液。
(4)内含肽切割：
向截留液中加入1/3～1/10体积(本实施例中为1/7)的pH 5.0的终浓度0.5M磷酸缓冲液和终浓度0.1～10mM(本实施例中为5mM)醋酸铜混合液(也可以采用硫酸铜或氯化铜替代)，混匀后4℃孵育过夜。
(4)第二轮过滤：
将孵育后的液体通过3KDa滤膜(可使用膜包或者超滤管)过滤，直至截留液体积小于原来体积的1/20。收集通过滤膜的流通液。旋蒸结晶后即得GHK-Cu晶体。纯化的蓝铜胜肽经充分干燥后获得蓝铜胜肽粉末。
取部分流通液，使用HPLC检测流通液中的GHK-Cu含量和纯度。
HPLC结果如图8所示。
可以发现，通过本实施例中的方法可以高效地获得高纯度GHK-Cu，GHK-Cu的纯度高达98％以上。而且干燥后得到的蓝铜胜肽粉末具有良好的外观和稳定性(图9)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种内含肽变体，其特征在于，所述内含肽变体由Chitinophagaceae bacterium的G14基因片段突变得到；所述基因片段为MCF8340111.1的303~431位氨基酸残基片段；
所述内含肽变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的内含肽变体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
4.一种内含肽-GHK三肽融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为SEQ ID NO:1所示的序列和GHK三肽序列。
5.一种内含肽-GHK三肽融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由SEQ ID NO:1所示的序列、GHK三肽序列和修饰序列组成，所述修饰序列包括GST标签序列、Flag标签序列、Halo标签序列、HA标签序列、Myc标签序列、Snap标签序列中的至少一种。
6.一种GHK三肽产品，其特征在于，所述GHK三肽产品包括如下（1）~（8）中的至少一种：
（1）权利要求1所述的内含肽变体；
（2）权利要求2~3任一项所述的核酸分子；
（3）含有（2）中核酸分子的表达载体；
（4）权利要求4或5所述的融合蛋白；
（5）编码（4）中融合蛋白的核酸分子；
（6）含有（5）中核酸分子的表达载体；
（7）含有（2）或（5）中核酸分子的转化体；
（8）含有（3）或（6）中表达载体的转化体；
其中，所述转化体包括病毒、细菌和真菌。
7.一种蓝铜胜肽的制备方法，包括如下步骤：基于SEQ ID NO:1所示的内含肽和GHK三肽序列构建融合蛋白表达载体，诱导蛋白表达，9~11 KDa过滤得到截留液，加入铜离子孵育，2~4 KDa过滤，收集流通液即为蓝铜胜肽。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤还包括对流通液进行浓缩、干燥。
9.权利要求1所述的内含肽变体在生物法制备蓝铜胜肽中的应用。
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