CN117925613A - 一种缢蛏的生长性状相关的分子标记及其在育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种缢蛏的生长性状相关的分子标记及其在育种中的应用,所述的微卫星位点,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明另一个方面提供一种筛选具有快速生长潜力的缢蛏个体的方法,是通过检测上述的微卫星位点来实现的。本发明通过对不同生长性状的缢蛏品种的扩增产物进行分析,获得了与缢蛏生长性状相连锁的微卫星标记,使用该微卫星标记可以筛选具有更好生长潜力的缢蛏个体,从而为缢蛏的遗传育种操作提供有效的分子标记。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖品种的遗传育种技术领域,具体涉及一种缢蛏的生长性状相关的分子标记及其在育种中的应用。
背景技术
缢蛏(Sinonovaculaconstricta)俗称蛏子,属于双壳纲(Bivalvia)、帘蛤目(Veneroida)、竹蛏科(Solenidae)、缢蛏属(Sinonovacula),广泛分布于中国、日本和朝鲜等国的沿海地区,埋栖生活,生长快,味道鲜美,营养丰富,具有较高的经济价值,是中国四大海产贝类之一。我国在20世纪90年代初开展了缢蛏的人工育苗并且取得成功,目前养殖单位主要采用人工苗进行养殖生产,且用于繁殖人工苗的亲贝多来自池塘人工养殖,随着多年的人工养殖与频繁近交导致缢蛏物种多样性下降,种质退化,近年来,一龄养殖缢蛏个体普遍较小,二龄蛏养殖成本过高,养殖效益差,市场上仍未有人工选育的缢蛏良种。随着缢蛏的人工繁育技术日趋成熟,养殖产业正在逐步形成,对生长快,养殖周期短的缢蛏品种的需求度越来越高,因此,研究与缢蛏生长发育机制相关的基因,认识其生长调控的分子机制,对缢蛏的良种选育、提高其养殖性能和推动养殖业的发展具有重要意义。
长期以来,贝类的养殖工作一直以表型为基础,但是其表型受到环境因素的影响很大。根据表型对性状的选择,其效率较低。因此,利用分子辅助育种的方法能更有效改善其养殖进程,这对缢蛏养殖尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种缢蛏的生长性状相关的分子标记及其在育种中的应用,通过分析育苗养殖场内养殖的种群生长性状的差异,来筛选与生长性状相连锁的分子标记,并使用筛选的分子标记来筛选亲本用于缢蛏的遗传育种。
本发明首先提供一种与缢蛏生长性状相关的微卫星位点,其核苷酸序列为SEQ IDNO:1;
本发明提供的微卫星位点用于选育具有快速生长潜力的缢蛏个体。
本发明另一个方面提供一种筛选具有快速生长潜力的缢蛏个体的方法,是通过检测上述的微卫星位点来实现的;
所述的方法,是通过PCR扩增待检测的缢蛏个体的核酸样品,PCR产物进行基因测序分析后确定待检测的个体的基因型,来确定是否具有快速生长潜力;
所述的PCR扩增方法,其中所使用的引物的序列信息如下:
F:5’-TAAGGGTTTTGAAATTGTGTG-3’(SEQ ID NO:2)、
R:5’-GCTCATTTAGAGCTTATGGTG-3’(SEQ ID NO:3)
所述的PCR与基因测序分析,是确定微卫星位点的基因型分型,其中基因型为153/157个体的壳长、壳宽和总重的均值显著高于其他基因型个体生长性状的表型值(p<0.05)。
本发明通过对不同生长性状的缢蛏品种的扩增产物进行分析,获得了与缢蛏生长性状相连锁的微卫星标记,使用该微卫星标记可以筛选具有更好生长潜力的缢蛏个体,从而为缢蛏的遗传育种操作提供有效的分子标记。
附图说明
图1:缢蛏的生长性状数据柱状图;
图2:微卫星点位SI-9分形图;
图3:微卫星标记点位基因型SSR图;
图4:标记组和其他组缢蛏一龄生长数据柱状图;
图5:子代一龄缢蛏生长数据柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1:筛选快速生长的群体
2021年4月,在浙江省宁海市某缢蛏良种繁殖场内,经过清淤、修整、繁育好基础饵料的池塘投放规格均匀、贝壳坚实、半透明,规格在1~2cm的健康蛏苗,投放密度为35粒/亩,盐度为15‰~20‰,年温度在8℃~30℃,pH在8~8.5,保持弱碱性。每天早、午、晚巡池,观察水色、透明度、缢蛏的生长等情况。
一年后,随机挑选缢蛏个体240个进行编号,利用游标卡尺测量缢蛏形态性状,包括壳长(mm)、壳高(mm)和壳宽(mm),精确度为±0.02mm;擦干表面水分用天平称量体质量(Y,g),精确度为±0.01g,筛选出形态性状优异的个体作为亲本进行育苗,在同一批繁殖的1龄缢蛏,取160个体质量较大的个体(生长较快组),和160个体质量较小的个体(生长缓慢组),测量形态性状,测量数据见表1和图1。
表1:缢蛏的生长性状的平均数据表
由测量结果可见生长较快组和生长缓慢组个体的生长性状差异显著。
实施例2:筛选与缢蛏生长性状相关的微卫星标记
2.1筛选能扩增出产物的微卫星位点
通过从NCBI中筛选缢蛏的微卫星位点,设计扩增微卫星位点用的引物对,将设计的引物对进行合成,正向引物的5′端标记荧光素。合成的引物对使用5个缢蛏的基因组DNA进行初步扩增产物筛选,有扩增产物的微卫星引物对的序列信息如表2所示。
表2:缢蛏微卫星的引物信息表
2.2、多态性扩增
按照活体提取缢蛏DNA的方法所提供的方法进行活体取样,分别取各组水管组织,根据天根生化科技(北京)有限公司的海洋动物基因组提取试剂盒的说明书上的方法与步骤进行缢蛏DNA的提取,具体方法如下:
向剪碎的缢蛏水管组织中加入200μLGA缓冲液和20μL蛋白酶K(20mg/mL),56℃消化2—3h后,加入200μL缓冲液GB,70℃放置10min至溶液变清亮;加入200μL无水乙醇,将所得溶液转移至放入收集管中的吸附柱CB3中,12000r/min离心30s,弃废液,将吸附柱CB3放回收集管中。依次向CB3中添加500μL缓冲液GD、600μL漂洗液PW(2次),反复漂洗后晾干吸附柱,最后加入50μL洗脱缓冲液TE,提取的DNA产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测,检测合格的基因组DNA用于后续引物筛选和PCR扩增。
3、DNA模板进行微卫星扩增
本试验利用实验室前期筛选出的10个具有多态性的微卫星标记进行缢蛏的PCR增。其这10对微卫星引物序列信息如表1所示。
在微卫星标记的正向引物5′端加FAM标记,荧光标记引物由上海生工生物工程有限公司合成。将正常生长组和生长较快组,按照每5个为一组,将基因组DNA按照等体积进行混合,作为PCR扩增的模板,进行PCR扩增。
PCR反应体系为20μL,包含50ng基因组DNA、10μL2×TaqPCRMix(天根生化科技有限公司,北京)、0.6μL正向荧光引物(10μmol/L)和0.6μL反向引物(10μmol/L)、灭菌双蒸水补足至20μL。
PCR反应条件为:94℃预变性5min,之后进入3个步骤的循环,即94℃变性30s,各引物按各自退火温度退火30s,之后72℃延伸30s,此循环共30次,最后72℃延伸7min。PCR扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送由上海生工进行毛细管电泳分型。
Popgene32计算等位基因数(numbersofthealleles,Na)、有效等位基因数(numbersoftheeffectivealleles,Ne)、期望杂合度(expectedheterozygosity,He)、观测杂合度(observedheterozygosity,Ho)及Hard-weinberg平衡检验(P值)。
结果如表3显示,10个微卫星位点共扩增出29个等位基因。各个位点等位基因数和有效等位基因数分别为1—5和0.6254—3.4683,SI-1、SI-7的等位基因数(n=5)最多,SI-6的等位基因数(n=1)最少。SI-1有效等位基因数和SI-9标记的有效等位基因数分别是最多和最少的。各位点的观测杂合度为0.1000—0.3675,其中SI-6的观测杂合度最高,位点SI-7的观测杂合度最低;期望杂合度为0.2107—0.4282,期望杂合度最高为SI-1,最低为SI-9。
表3:缢蛏群体遗传多样性分析
4、与生长相关的微卫星位点标记
在5个微卫星位点中,微卫星位点SI-1和SI-9与壳宽均呈极显著相关(P<0.01;表4)。将这两个位点不同基因型间进行多重比较后发现,基因型是147/155的个体壳宽为最大值,基因型是147/157的个体壳宽为最小值,两者之间存在显著差异(P<0.05)。基因型是151/159的个体总重为最大值,基因型为147/157的个体总重为最小值,两者之间差异显著(P<0.05;表5)。同时发现基因型为153/153的个体壳长、壳宽和总重的均值都是很大,推测为优势基因型,与表型性状存在正相关关系。
表4微卫星点位与缢蛏生长性状相关性分析
表5微卫星位点SI-1、SI-9不同基因型表型性状
筛选出微卫星点位SI-9上存在缢蛏生长性状相关的优势基因,该卫星点位使用的引物对序列如下:
正向引物F:TAAGGGTTTTGAAATTGTGTG(SEQ ID NO:2)、反向引物R:GCTCATTTAGAGCTTATGGTG(SEQ ID NO:3),
微卫星位点SI-9的核苷酸序列如下:
GGTTACTCCTATGTGTGCCGATGCAAATGTTGGGCGCGGGCTGGAGTGCGACATGTAGATGACAGAGATCAACTGGTTGAAATGTATGGAATGCACGTTACATACATACATACATACACCGCTATGCGAATTCTGATGTTGCGCGCCTACTGGTATCCTGCCAGATGGTCCGCTGCGGCCTTGCGACGGCCCAGCAAAAAGGGAACTTTGG(SEQ IDNO:1)
其核心重复单位为(TACA)n,即使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的上下游引物进行扩增,存在153/153和157/157两种基因型(图2),其中153/153为优势基因,扩增出的特异性条带为153bp。
实施例3:与缢蛏生长性状相关的微卫星标记的应用
2022年5月在浙江省宁海市某缢蛏良种繁殖场对1000只缢蛏的子代个体进行检测,通过无损伤取样的方式获得每只线缢蛏的基因组DNA,使用上下游序列为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的引物对,对进行微卫星扩增检测;筛选具有153bp的条带,并检测其基因型。
从总共1000只缢蛏中共筛选了120只具有特定片段的缢蛏,其中基因型为153/153(图3)个体共30只。将筛选出的个体与其它个体在相同的养殖条件下进行室内养殖,养殖一年后进行生长性状测量(表6/图4),结果表明含有特定条带的个体具有显著的生长效果,
表6:微卫星标记组和其他组缢蛏一龄的生长性状数据表
将筛选获得的30只基因型为153/153的个体作为亲本进行育苗,在子代生长至一龄时,随机选取无明显损伤、表观无病变、活力好的个体100个,利用游标卡尺和天平测量缢蛏形态性状(表7/图5)。
表7:子代缢蛏一龄生长性状数据表
由表6/图4和表7/图5可见,用本发明所提供的微卫星点位筛选的个体具有显著的生长效果,以筛选出来的个体为亲本进行繁育,获得的子代也具有生长优势,证实本发明所提供的微卫星标记能够用于更好生长性状的缢蛏亲本的筛选。
Claims (6)
1.一种微卫星位点,其特征在于,所述的微卫星位点的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.权利要求1所述的微卫星位点在选育具有快速生长潜力的缢蛏亲本中的应用。
3.一种筛选具有快速生长潜力的缢蛏个体的方法,其特征在于,所述的额方法是通过检测权利要求1所述的微卫星位点的基因型来进行筛选的。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的方法是通过引物对扩增待检测的缢蛏个体的核酸样品,PCR产物进行基因测序分析后确定待检测的个体的基因型,来确定是否具有快速生长潜力。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的引物对,其上游引物的序列为SEQ IDNO:2,下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的方法是筛选基因型为153/157。
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CN103509792A (zh) * | 2013-10-23 | 2014-01-15 | 上海海洋大学 | 一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法 |
CN116024207A (zh) * | 2022-09-28 | 2023-04-28 | 浙江万里学院 | 一种活体无损伤提取贝类高质量dna的方法及其应用 |
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2023
- 2023-12-29 CN CN202311848662.XA patent/CN117925613A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN103509792A (zh) * | 2013-10-23 | 2014-01-15 | 上海海洋大学 | 一种快速开发缢蛏微卫星分子标记的方法 |
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Non-Patent Citations (5)
Title |
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