CN111187843A - 一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记是以von Hippel‑Lindau disease tumor suppressor(Vhl基因)的cDNA序列为模板设计引物，扩增得出的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，本发明还公开了检测该分子标记的引物对、试剂盒和检测方法。该SNP位点与低氧胁迫下杂交黄颡鱼“黄优1号”的存活率显著相关，该位点基因型为TT的个体耐低氧能力显著强于基因型为AA的个体。本发明公开的SNP位点可以不受杂交黄颡鱼“黄优1号”的年龄和性别等限制，适用于杂交黄颡鱼“黄优1号”的耐低氧苗种筛选和分类，可有效提高杂交黄颡鱼“黄优1号”养殖和运输中低氧条件下的存活率。该方法准确可靠，操作简便。

Description

一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记 及其应用

技术领域

本发明涉及一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应用，属于黄颡鱼遗传育种领域。

背景技术

杂交黄颡鱼“黄优1号”是由同为鲿科、黄颡鱼属的以3代选育的黄颡鱼为母本， 2代选育的瓦氏黄颡鱼为父本，经过人工杂交获得的F1代。与双亲相比，具有生长速度快，抗逆性强、饲料利用率高等特点。并且在耐低氧方面，已有实验证明杂交黄颡鱼“黄优1号”的耐低氧能力介于父母本之间。因此，在生产养殖和长途运输中，杂交黄颡鱼“黄优1号”依然面临着水体缺氧的问题。水体低氧环境会显著影响鱼体摄食及生长活动，甚至造成鱼体内分泌紊乱。

Vhl基因的蛋白产物为VHL蛋白(pVHL)，其β功能区最重要的靶蛋白是缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)。VHL蛋白可以从蛋白水平下调HIF-1α蛋白，而且可以促进HIF-1αmRNA表达，而当pVHL表达异常，细胞中HIF蛋白表达会显著升高，影响血管新生、细胞凋亡、细胞周期、细胞能量代谢等生理过程，进而影响鱼机体稳定。故Vhl基因在低氧调节中起着重要的作用。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，是指在基因组DNA序列特定位点的单个核苷酸(A、G、C、T)变异(转换、颠换、***和缺失)而导致的序列多态性，在1996年由Lander E提出。SNP是继微卫星后发展的第三代DNA分子遗传标记。SNP最主要的突变为转换和颠换，且发生的比例为2：1，所以通常所说的SNP 都是二等位多态性的。SNP具有高密度性、高遗传稳定性等特点，可用于绘制遗传图谱，通过启用全基因组跟踪，对目标区域进行精细定位，快速关联标记物与性状，加速QTL 定位。SNP标记因其在全基因组分布范围广、密度高以及超高通量检测平台的适应性，在植物分子遗传学中应用广泛，后被应用在水产动物的遗传多样性研究、遗传连锁图谱构建、分子标记辅助育种及优良种质保护研究中。

但是，目前现有技术中并没有公开利用SNP分子标记筛选杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状的相关研究。故本发明利用SNP分子标记筛选杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧相关基因，挑选出在已有耐低氧水平上更耐低氧的群体，实现杂交黄颡鱼“黄优1 号”的高效养殖产业，为养殖户增收创益。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记，即利用杂交黄颡鱼“黄优1号”Vhl基因序列上与耐低氧性显著关联的SNP位点进行分子标记选择。

本发明第二个目的是提供用于检测上述SNP分子标记的一对引物。

本发明的第三个目的是提供上述SNP分子标记的应用。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明公开了一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记是以von Hippel-Lindau disease tumor suppressor(Vhl基因)的cDNA 序列为模板设计引物，扩增得出的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，自5’端起，在该序列的第495位存在SNP g.495T>A位点，即所述SNP位点位于SEQ ID NO:1上第495 位，碱基为T或A。

所述SNPg.495T>A位点的TT基因型个体的耐低氧能力显著高于AA基因型个体。

用于检测所述的SNP分子标记的引物对：

上游引物序列为5’-TGAAGAGTCCGAGCGATT-3’(SEQID NO:2)；

下游引物序列为5’-ACTGCGAGGAGGATGAAC-3’(SEQID NO:3)。

用于检测所述SNP分子标记的试剂盒，其包含所述的引物对。

所述的SNP分子标记、引物对或试剂盒在杂交黄颡鱼“黄优1号”辅助耐低氧苗种筛选中的应用。一种检测杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状的方法，包括通过对待测杂交黄颡鱼“黄优1号”进行所述的SNP分子标记的检测，确定所述待测杂交黄颡鱼“黄优1号”的耐低氧能力，主要为前100条低氧敏感耐受群体与后100条低氧耐受群体缺氧时间两部分数据。

进一步的，该方法包括提取待测杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组DNA，利用所述的引物对或所述的试剂盒进行PCR扩增，检测其SNP位点的基因型是TT、TA还是AA，最后进行不同基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状的相关性分析，所述耐低氧能力为低氧条件下存活的时间。

所述检测杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性的方法，具体包括以下步骤：

a)杂交黄颡鱼“黄优1号”低氧敏感群体和低氧耐受群体的获得；

b)以上两个杂交黄颡鱼“黄优1号”群体尾鳍DNA提取；

c)基于所述的引物对，对杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；

d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP分子标记的基因型；

e)SNPg.495T>A位点基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性的关联分析。

通过对杂交黄颡鱼“黄优1号”基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物测序以及测序结果分析，SNPg.495T>A位点的TT基因型个体的耐低氧能力显著高于AA基因型个体。

本发明以杂交黄颡鱼“黄优1号”Vhl基因的单核苷酸多态位点为研究目标，发现Vhl基因序列的SNP位点(SNPg.495T>A)与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性显著相关，其中SNPg.495T>A位点的TT基因型个体的耐低氧能力显著高于AA基因型(P<0.05) 个体。在以耐低氧能力为选育指标，培育缺氧环境下更易生存的食用杂交黄颡鱼“黄优 1号”个体养殖过程中，可以优先选择SNPg.495T>A位点基因型为TT的个体为养殖对象，这对于提高杂交黄颡鱼“黄优1号”的养殖效益具有重要的意义。

技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1)本发明公开的SNP位点可以不受杂交黄颡鱼“黄优1号”的年龄、性别等限制，可用于杂交黄颡鱼“黄优1号”的耐低氧苗种挑选和分类，从而提高杂交黄颡鱼“黄优1号”低氧条件下的存活率，并显著增加杂交黄颡鱼“黄优1号”的养殖经济效益。

2)通过SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的一对引物，检测如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列自5’端第495位SNP位点的方法，准确可靠，操作方便。

附图说明

图1为AA基因型杂交黄颡鱼“黄优1号”Vhl基因自5’端第495位点测序部分峰图；

图2为TT基因型杂交黄颡鱼“黄优1号”Vhl基因自5’端第495位点测序部分峰图；

图3为TA基因型杂交黄颡鱼“黄优1号”Vhl基因自5’端第495位点测序部分峰图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

本发明基于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的一对引物，通过对杂交黄颡鱼“黄优1号”基因组DNA提取、PCR扩增、扩增产物测序以及测序结果分析。得到了一个杂交黄颡鱼“黄优1号”在低氧环境中存活的SNP位点(SNPg.495T>A)，可应用于杂交黄颡鱼“黄优1号”早期耐低氧性幼鱼的挑选和培育。

实施例

a)杂交黄颡鱼“黄优1号”低氧敏感群体和低氧耐受群体的获得；

b)以上两个杂交黄颡鱼“黄优1号”群体尾鳍DNA提取；

c)基于所述SNP引物，对杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组DNA进行PCR扩增；

d)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP的基因型；

e)SNP位点基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性的关联分析；

f)SNP位点应用于杂交黄颡鱼“黄优1号”不同低氧耐受群体的挑选。

具体操作如下：

a)杂交黄颡鱼“黄优1号”低氧敏感群体和低氧耐受群体的获得：

本发明实验用鱼均为池塘养殖鱼类于2018年10月取自江苏南京市水产科学研究所禄口基地，共计5月龄杂交黄颡鱼“黄优1号”505尾(体长9±2.1cm，体质量12±2.3g)。实验前将杂交黄颡鱼“黄优1号”随机分配到5个带生物滤池的水产养殖玻璃池中[0.8m x0.55m x 0.4m(L×W×H)，水流量为5L/min；24±1℃；pH＝7.5±0.2]暂养。实验时选择445条健康无病的杂交黄颡鱼“黄优1号”将其置于400L的水族箱中。实验开始，关闭增氧和进水，充入氮气排出水中氧气，用溶氧仪测定水中溶氧(通过美国LDO HQd 便携式以表的LDO101探针测量)，当水中溶氧无法下降(约0.9mg/L)后用透明膜将水族箱密封，让其自然降氧。在实验过程中，观察鱼的活动，当有第一条杂交黄颡鱼“黄优1号”失去平衡开始下沉时开始计时，取最先沉入池底与最后沉入池底的杂交黄颡鱼“黄优1号”各100尾，分别作为杂交黄颡鱼“黄优1号”低氧敏感与低氧耐受群体。

b)剪取鱼体尾鳍置于-80℃保存，用于基因组DNA提取。

c)杂交黄颡鱼“黄优1号”DNA的提取：

(1)取15mg尾鳍，加入400μL ACL Solution，剪碎，再加10μL的Proteinase K，震荡混匀1分钟，置于55℃裂解约2h，至裂解液澄清。

(2)然后依次加入300μLExt solution和300μLAB solution，用力摇匀，在12,000rpm 离心5分钟。

(3)将枪头穿过上层溶液深入到下层溶液中，将溶液仔细吸出到GenClean Column中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀。

(4)8000rpm离心1分钟，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液。

(5)将GenClean Column放回收集管中，加入500μLWash Solution，8,000rpm室温离心1分钟。

(6)重复步骤(5)一次。

(7)取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12,000rpm室温离心1分钟，以除去残留Wash Solution。

(8)将柱放入新的洁净1.5mL离心管中，在柱中央加入60μl Elution Buffer，室温放置2分钟。然后12,000rpm室温离心1分钟。离心管中的液体即为所提取的DNA，-20℃保存。

d)基于所述SNP引物，对杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组DNA进行PCR扩增

PCR产物扩增长度为213bp，PCR引物为：

上游引物：5’-TGAAGAGTCCGAGCGATT-3’

下游引物：5’-ACTGCGAGGAGGATGAAC-3’

PCR反应体系为20μL:2×Taq Master Max 10μL，正反向引物各0.8μL，DNA模板1μl，灭菌水7.4μl。

PCR反应共计35个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s， 60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后于72℃延伸5min。

扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的PCR产物于-20℃保存用于后续的测序反应。

e)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP的基因型

基于Hiseq2000高通量测序平台，对上述的杂交黄颡鱼“黄优1号”200尾个体的PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行正向测序。基于测序结果，将杂交黄颡鱼“黄优1号”SNP位点基因分型。

f)SNP位点基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性的相关性分析

杂交黄颡鱼“黄优1号”200尾个体的SNP位点基因型与耐低氧时间如表1所示： (见末尾表1)

根据表1的数据，利用SPSS(19.0)GLM程序，根据性状及试验群体的特点，构建线性分析模型从而进行基因多态性与性状间的关联分析：yij＝u+Gi+eij式中，yij为性状表型值，u为群体均值，Gi为标记为基因型效应(i＝1，2，1，4)，eij为随机残差效应。统计数据用平均值±标准误表示。SNP位点基因型与耐低氧性相关性如表2所示。

表2杂交黄颡鱼“黄优1号”Vhl基因SNP位点与耐低氧性的相关性

结果显示：SNPg.495T>A三种基因型中低氧耐受群体TT基因型和T等位基因占优势，低氧敏感群体中AA基因型和A等位基因占优势。表明在培育耐低氧性杂交黄颡鱼“黄优1号”的过程中，表明SNPg.495T>A是一个与耐低氧能力显著相关的SNP 位点。

g)SNP位点应用于耐低氧性杂交黄颡鱼“黄优1号”群体筛选。

如上文所述杂交黄颡鱼“黄优1号”Vhl基因上，SNPg.495T>A位点在低氧耐受群体中TT基因型个体明显占优势，且低氧敏感群体中的优势群体为AA基因型个体， TA基因型个体在两个群体中均无显著差异。因此，在选育过程中，可以优先选择 SNPg.495T>A位点基因型为TT的个体做为养殖对象，培育耐低氧杂交黄颡鱼“黄优1 号”。

本发明选取杂交黄颡鱼“黄优1号”低氧敏感群体100尾，低氧耐受群体100尾作为样本，通过对每个个体Vhl基因的单核苷酸多态性位点分析，发现SNPg.495T>A与杂交黄颡鱼“黄优1号”的耐低氧能力存在显著的相关性，并且能够有效地支持此次试验结果。因此在耐低氧性杂交黄颡鱼“黄优1号”的选择育种过程中，可以优先选择 SNPg.495T>A位点基因型为TT的个体作为养殖对象，能够有效辅助实现短时间、低成本、高准确性的选择耐低氧性杂交黄颡鱼“黄优1号”优良品种。

表1：

A.杂交黄颡鱼“黄优1号”100尾低氧敏感群体缺氧时间与个体SNP位点基因型

B.杂交黄颡鱼“黄优1号”100尾低氧耐受群体缺氧时间与个体SNP位点基因型

A

B

注：缺氧时间以第一条鱼失去平衡沉底为0min开始计时，时间计量单位为(min)。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> 一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1249

<212> DNA

<213> Vhl(Vhl)

<400> 1

acgtgatctc gatgcacact agcttcctca ccacctgcag gcaacgttcc ctcagggaat 60

acactaacac acacacacac acacgtcata tacaaaaccg tgagattaat aagagaagaa 120

gaattattac acagcctgtt tagccaaacc accctgaccc catgcactct gtgcgtgatg 180

atagttaccg ggtagcgtga tgaccactgg ggcttggttg ttgtctcgag cactgggcaa 240

atacatctcc ttattattca ccaacatcgg gtcatccgtc tgagcatcac gaaacatcca 300

cggatgtcct gtcagaaata aacagtcgtc gtcatctttc accatcatac attactcttt 360

cctcttacgt tcttaatttt taatactctt tatgctcatt ttagtagctt caacattaga 420

cttccaaagc cttattcgga tcggtttagt ttattagtct gtaaagactt gctgttgtga 480

tgatgatgat gatgatatac tctgagaggt tcaacacatc actgagaata tgattacgga 540

aaaaaaagca taatattgca cgatattgtt tcttacacta ccatgcacct tatgtacata 600

actgatcagt cctatattct gtattcatat ttaatactca ttctgtctat attgtctcac 660

atagtctgta ttgtctggtc ttgtacagta tagtgttatt tatgtctgta cttttcagag 720

tcaaaaacag ctggaaccaa gttccttgtg tgtggcagga gtgtggtagc ctagtggtta 780

atgcgtcgga ctactgcccg gaaggtcatg agttcaaatc ccagctccaa caagctgccc 840

gtgctgggcc cctgagcaag gcccttaatg ctcagttgta taaaatgaaa taaaatgtaa 900

gtcactctgt ataagtgtgt ctgcttaatg ccagaaatgt aaatgtcaat aaacctgatt 960

cagattcata tatgacaaat atatcccttt ctaatttgca tatataatat atgcacatat 1020

gaatatgcat acatatgcat gattcatgta gcagtcagtt ttccaagcta gttttctctg 1080

ccactatcta gagacggtta atcattggtc tggatgatgt tctagaaaac actggtgcac 1140

ttttacttag atgtaagtgt tggatagtct gaaaagatga atgatgatga tgatgatgat 1200

gatgagaaga agaggatcag acgtaacata gcagatttct cctcctgac 1249

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaagagtcc gagcgatt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgcgagga ggatgaac 18

Claims (8)

1.一种与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO：1所示序列的第495位，碱基为T或A。

2.根据权利要求1所述的与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状相关的SNP分子标记，其特征在于，SNP位点的TT基因型个体耐低氧能力显著高于AA基因型个体。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于，包括正向引物、反向引物，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物：5’-TGAAGAGTCCGAGCGATT-3’，如SEQ ID NO:2所示。

反向引物：5’-ACTGCGAGGAGGATGAAC-3’，如SEQ ID NO:3所示。

4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物对。

5.权利要求1或2所述的SNP分子标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒在杂交黄颡鱼“黄优1号”辅助耐低氧苗种筛选中的应用。

6.一种检测杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状的方法，其特征在于，包括通过对待测杂交黄颡鱼“黄优1号”进行权利要求1或2所述的SNP分子标记的检测，确定所述待测杂交黄颡鱼“黄优1号”的耐低氧能力。

7.根据权利要求6所述的检测杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状的方法，其特征在于，包括提取待测杂交黄颡鱼“黄优1号”的基因组DNA，利用权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒进行PCR扩增，检测其SNP位点的基因型是TT、TA还是AA，最后进行不同基因型与杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状的相关性分析，所述耐低氧能力为低氧条件下存活的时间。

8.根据权利要求7所述的检测杂交黄颡鱼“黄优1号”耐低氧性状的方法，其特征在于，所述SNP位点的TT基因型个体耐低氧能力显著高于AA基因型个体。

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