CN117467695A - 过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，涉及生物技术技术领域，包括以下步骤：采用mCherry‑XL作为报告蛋白；筛选最高拷贝且荧光蛋白在胞内聚集的菌株作为出发菌株SK01；通过CRISPR‑Cas9基因编辑技术将MPDI1、PDI1、HAC1、YAP1、Kar2、Ero1分泌辅助因子基因分别过表达整合至SK01菌株；本发明筛选荧光蛋白作为出发菌株，从基因工程方面进行分泌途径遗传改造，通过基因编辑技术将分泌辅助因子基因分别过表达整合至筛选出的菌株，从而提高外源荧光蛋白分泌能力；且转化体系在PCR八连管操作及孵育、热激过程在PCR扩增仪完成，大幅提高了实验操作效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法。
背景技术
酵母菌是一种被广泛应用于生产蛋白质类药物的菌种，与细菌相比，酵母细胞本身具有一定的安全性，不产生内毒素，具有翻译后修饰、分泌表达、易于遗传操作等优点，大大降低了纯化成本，目前已经有超过5 000种外源蛋白可以利用毕赤酵母成功表达，随着越来越多外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达，许多研究都发现，某些外源蛋白在分泌表达过程中存在胞内聚集而导致分泌表达量较低、宿主蛋白酶对外源蛋白存在不同程度的降解等问题；
现有技术方案：通过优化发酵工艺，包括培养基的成分和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现外源蛋白的高效表达，这种技术的缺点主要为：可变单一因素多、实验操作繁琐、工作量大、耗时、实验稳定性差等，目前国内外已有的研究结果对外源蛋白分泌过程进行分析，认为外源蛋白表达量降低，主要是因为过表达外源蛋白导致分泌途径的过载，因此，本发明提出过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提出过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，该方法筛选荧光蛋白作为出发菌株，从基因工程方面进行分泌途径遗传改造，通过基因编辑技术将分泌辅助因子基因分别过表达整合至筛选出的菌株，从而提高外源荧光蛋白分泌能力。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，包括以下步骤：
S1：采用mCherry-XL作为报告蛋白；
S2：筛选最高拷贝且荧光蛋白在胞内聚集的菌株作为出发菌株SK01；
S3：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术将MPDI1、PDI1、HAC1、YAP1、Kar2、Ero1分泌辅助因子基因分别过表达整合至SK01菌株。
进一步改进在于：所述S1包括以下步骤：
S11：根据毕赤酵母密码子偏好性对mCherry-XL进行优化，优化的序列基因通过体外全基因合成得到，如SEQ ID NO.1所示；
S12：构建PL405毕赤酵母重组分泌表达载体。
进一步改进在于：所述S12包括以下步骤：
S121：将毕赤酵母分泌表达载体pPICZaA与S11中得到的mCherry-XL基因高保真PCR产物通过Gibson assembly连接；
S122：转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建得到mCherry-XL重组毕赤酵母分泌表达载体Gibson assembly，保存载体的菌株命名为PL405；
S123：挑取若干个转化子进行测序，将测序结果正确的菌落保种。
进一步改进在于：所述S2包括以下步骤：
S21：将PL405载体质粒通过PCR引物5’-AOXI(TTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTT)、3’-AOXI(CTTAGTTCATCTTGGATGAGATCACGCTTTTGTCATATTAGGTT)线性化，用PCR产物纯化回收试剂盒对线性化产物进行回收，PCR引物5’-AOXI(TTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTT)如SEQ ID NO.2所示，3’-AOXI(CTTAGTTCATCTTGGATGAGATCACGCTTTTGTCATATTAGGTT)如SEQ ID NO.3所示；
S22：将-80℃保藏的毕赤酵母野生型菌株X33划线活化，在30℃恒温培养箱培养3d，挑取单菌落至YPD液体培养10h，转接至50mLYPD过夜培养，当OD600达到0.8-1.0时，离心收集细胞，25mL无菌水重悬细胞，离心弃上清，再重复1次，离心弃上清；加入1mL无菌水重悬细胞，转至1.5mL EP管中，离心，弃上清；加入1mL 1M LiCl重悬细胞，在30℃下静置孵育1h；离心弃上清，加入400uL 1MLiCl重悬细胞，分装25uL至PCR八连管，获得感受态细胞A；
S23：将感受态细胞A加入120uL 50%PEG4000、18uL 1MLiCl、5uL 10mg/mL鲑鱼精DNA，以及2.5 ug待转化DNA，涡旋混匀，在PCR扩增仪30℃孵育30 min，然后42℃热激20min；离心枪头去除上清，加入0.2mL YPD重悬细胞，转移至96浅孔板，恒温振荡器30℃，900rpm，孵育2 h，全部涂布于0.8 mg/mL Zeocin抗性YPD平板，在30℃恒温培养箱培养48h，得到的0.8mg/mL Zeocin的酵母表达菌株；
S24：将得到的0.8mg/mL Zeocin的酵母表达菌株挑取若干个转化子接种于BMGY液体培养基，进行24深孔板发酵，每隔24h补料3%的甲醇进行诱导，发酵96h，发酵完后，收集菌体，在激发波长558nm、发射波长590nm、增益60条件下测定胞外、胞内荧光值，将PL405-A2作为出发菌株，命名为SK01。
进一步改进在于：所述S3包括以下步骤：
S31：构建gRNA质粒和供体质粒；
S32：制备感受态细胞B；
S33：构建毕赤酵母分泌辅助因子过表达菌株；
S34：验证毕赤酵母分泌优化。
进一步改进在于：所述S31包括以下步骤：
S311：在benchling在线网站设计得到sgRNA，以X33基因组DNA为模板通过PCR扩增得到供体左右同源臂片段；
S312：将每种基因分别以组成型启动子PGAP和诱导型启动子PAOX1调控，表达框为PGAP-gene-TAOX1或 PAOX1-gene-TAOX1；
S313：将左右同源臂片段及表达框、KanaR抗性基因通过Gibson assembly方法连接构建供体质粒；
S314：将gRNA质粒和供体质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑取若干个转化子进行测序，将测序结果正确的菌落抽提治理，将正确的供体质粒进行线性化，用PCR产物纯化回收试剂盒对线性化产物进行回收。
进一步改进在于：所述S32包括以下步骤：
S321：将-80℃保藏的重组菌SK01划线活化，30℃恒温培养箱培养3d，挑取单菌落至YPD液体培养10h，转接至50mLYPD过夜培养；
S322：当OD600达到0.8-1.0时，离心收集细胞，25mL无菌水重悬细胞，离心弃上清，再重复1次，离心弃上清；
S323：加入1mL无菌水重悬细胞，转至1.5mL EP管中，离心，弃上清；
S324：加入1 mL 1MLiCl重悬细胞，在30℃下静置孵育1h；
S325：离心弃上清，加入400uL 1MLiCl重悬细胞，分装25uL至PCR八连管中，得到感受态细胞B。
进一步改进在于：所述S33包括以下步骤：
S331：将感受态细胞B加入120μL 50%PEG4000、18μL 1MLiCl、5μL 10mg/mL鲑鱼精DNA，将每种基因的gRNA质粒和供体质粒线性化片段分别取1ug加入转化体系中，涡旋混匀；
S332：在PCR扩增仪30℃孵育30 min，然后42℃热激20 min；
S333：用离心枪头去除上清，加入0.2mL YPD重悬细胞，转移至96浅孔板，恒温振荡器30℃，900 rpm，孵育2h，全部涂布于0.1mg/mL Zeocin抗性YPD平板，30℃恒温培养箱培养96h，得到0.1mg/mL Zeocin的酵母重组菌株。
进一步改进在于：所述S34包括以下步骤：
S341：在得到的 0.1mg/mL Zeocin的酵母重组菌株中，挑取若干个转化子进行菌落PCR验证；
S342：将验证成功的菌落，每种分别挑取若干个转化子接种于BMGY液体培养基，进行24深孔板发酵，发酵96h，发酵完后，收集菌体；
S343：在激发波长558nm、发射波长590nm、增益60条件下，以SK01作为对照，测定胞外、胞内荧光值。
本发明的有益效果为：
1、本发明筛选荧光蛋白作为出发菌株，从基因工程方面进行分泌途径遗传改造，通过基因编辑技术将分泌辅助因子基因分别过表达整合至筛选出的菌株，从而提高外源荧光蛋白分泌能力。
2、本发明转化体系在PCR八连管操作及孵育、热激过程在PCR扩增仪完成，大幅提高了实验操作效率、简化了实验方法、节省了试剂成本。
附图说明
图1为本发明的PL405测序比对结果图图；
图2为本发明的出发菌株筛选结果图；
图3为本发明的过表达分泌辅助因子基因整合至SK01基因组菌落PCR结果图，其中，泳道M为DL 5000标准分子量Marker；所有CK阴性对照大小为2.5k，阳性转化子条带大小5k，其中，1、2代表该构建菌株发酵时挑取两个转化子，即两个生物学重复，胶图是该构建菌株两个生物学重复进行PCR鉴定；
图4为本发明的毕赤酵母分泌途径优化结果图。
实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例一
根据图1、2、3、4所示，本实施例提出了过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，包括以下步骤：
S1：采用mCherry-XL作为报告蛋白；
S2：筛选最高拷贝且荧光蛋白在胞内聚集的菌株作为出发菌株SK01；
S3：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术将MPDI1、PDI1、HAC1、YAP1、Kar2、Ero1分泌辅助因子基因分别过表达整合至SK01菌株。
具体包括：
一种出发菌株，构建过程为：荧光蛋白基因mCherry-XL密码子的优化；毕赤酵母分泌表达载体pPICZaA-mCherry-XL的构建；单交换整合至毕赤野生型X33；0.8 mg/mL Zeocin高拷贝菌株的筛选；24孔板发酵；激发波长558nm、发射波长590nm、增益60测定荧光值；筛选目的菌株作为出发菌株。
一种适用于外源蛋白分泌表达的优化方法。方法为：在原出发菌株的基础上，通过选择折叠酶基因MPDI1、PDI1、HAC1、转录因子基因YAP1、分子伴侣基因Kar2、Ero1等分泌辅助因子，这些基因在毕赤酵母常用的强组成型启动子(PGAP)和强诱导型启动子(PAOX1) 调控下表征外源蛋白分泌表达效果。
基于基因工程技术的，从过表达分泌辅助因子进行毕赤酵母分泌途径优化，基于过表达分泌辅助因子，以不同启动子表征调控强度，转化方法进行了优化，提高了大批量进行毕赤酵母转化的能力。
实施例二
根据图1、2、3、4所示，本实施例提出了过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，包括以下步骤：
探究分泌途径优化效果，建立方便快捷的报告体系。荧光蛋白因其具有蛋白分子量小、荧光表达强且稳定等特性，已广泛被应用于哺乳动物、细菌、真菌的研究中，因此采用mCherry-XL作为报告蛋白。
根据毕赤酵母密码子偏好性对mCherry-XL进行优化，优化的序列基因通过体外全基因合成得到。优化后的序列如序列表所示。
构建PL405毕赤酵母重组分泌表达载体：将毕赤酵母分泌表达载体pPICZaA与上述步骤中得到的mCherry-XL基因高保真PCR产物用通过Gibson assembly连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建得到mCherry-XL重组毕赤酵母分泌表达载体Gibson assembly，保存载体的菌株命名为PL405。挑取三个转化子进行测序，结果测序比对结果如图1所示，将测序结果正确的菌落保种。
为更好的表征过表达分泌辅助因子对毕赤酵母荧光蛋白分泌表达的影响，需筛选高拷贝且荧光蛋白在胞内聚集的菌株作为出发菌株。
将PL405载体质粒通过PCR引物5’-AOXI(TTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTT)、3’-AOXI(CTTAGTTCATCTTGGATGAGATCACGCTTTTGTCATATTAGGTT)线性化，用PCR产物纯化回收试剂盒对线性化产物进行回收。
感受态细胞的制备：将-80℃保藏的毕赤酵母野生型菌株X33划线活化，30℃恒温培养箱培养3d，挑取单菌落至YPD液体培养10h，转接至50mLYPD过夜培养，当OD600达到0.8~1.0时，离心收集细胞，25 mL无菌水重悬细胞，离心弃上清，再重复1次，离心弃上清；加入1mL无菌水重悬细胞，转至1.5 mL EP管中，离心，弃上清；加入1 mL 1 M LiCl重悬细胞，30℃，静置孵育1 h；离心弃上清，加入400 uL 1 M LiCl重悬细胞，分装25uL至PCR八连管中。
PL405毕赤酵母分泌表达菌株的构建及高拷贝菌株的筛选：上述步骤中的感受态细胞加入120uL 50%PEG4000、18uL 1 M LiCl、5 uL 10 mg/mL 鲑鱼精DNA，以及2.5 ug 待转化DNA，涡旋混匀，在PCR扩增仪30℃孵育30 min，然后42℃热激20 min；离心枪头去除上清，加入0.2 mL YPD重悬细胞，转移至96浅孔板，恒温振荡器30℃，900 rpm，孵育2 h，全部涂布于0.8 mg/mL Zeocin抗性YPD平板，30℃恒温培养箱培养48 h。
出发菌株的筛选：将上述步骤得到的 0.8 mg/mL Zeocin的酵母表达菌株挑取8个转化子接种于BMGY液体培养基，进行24深孔板发酵，每隔24h补料3%的甲醇进行诱导，发酵96h，发酵完后，收集菌体，在激发波长558nm、发射波长590nm、增益60条件下测定胞外、胞内荧光值，荧光值分析结果如图2所示，将PL405-A2作为出发菌株，命名为SK01。
通过CRISPR-Cas9基因编辑技术将MPDI1、PDI1、HAC1、YAP1、Kar2、Ero1分泌辅助因子基因分别过表达整合至SK01菌株。
驻留于内质网的分子伴侣Kar2会与初生多肽链结合，通过屏蔽未折叠区域与邻近蛋白的相互作用来辅助蛋白质折叠。属于HSP70分子伴侣家族中的Kar2主要作用于初生多肽链并促进其向内质网的转运。
gRNA质粒和供体质粒的构建：sgRNA在benchling在线网站设计得到，供体1kb左右同源臂片段分别以X33基因组DNA为模板通过PCR扩增得到，每种基因分别以组成型启动子PGAP和诱导型启动子PAOX1调控，表达框为PGAP-gene-TAOX1或 PAOX1-gene-TAOX1，左右同源臂片段及表达框、KanaR抗性基因通过Gibson assembly方法连接构建供体质粒，gRNA质粒和供体质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑取三个转化子进行测序，将测序结果正确的菌落抽提治理，将正确的供体质粒进行线性化，用PCR产物纯化回收试剂盒对线性化产物进行回收。
感受态细胞的制备：将-80℃保藏的重组菌SK01划线活化，30℃恒温培养箱培养3d，挑取单菌落至YPD液体培养10h，转接至50mLYPD过夜培养，当OD600达到0.8~1.0时，离心收集细胞，25 mL无菌水重悬细胞，离心弃上清，再重复1次，离心弃上清；加入1mL无菌水重悬细胞，转至1.5 mL EP管中，离心，弃上清；加入1mL 1 M LiCl重悬细胞，30℃，静置孵育1h；离心弃上清，加入400uL 1 M LiCl重悬细胞，分装25uL至PCR八连管中。
毕赤酵母分泌辅助因子过表达菌株的构建：上述步骤中的感受态细胞加入120μL50%PEG4000、18μL 1 M LiCl、5μL 10mg/mL 鲑鱼精DNA，将每种基因的gRNA质粒和供体质粒线性化片段分别取1ug加入转化体系中，涡旋混匀，在PCR扩增仪30℃孵育30 min，然后42℃热激20 min；离心枪头去除上清，加入0.2 mL YPD重悬细胞，转移至96浅孔板，恒温振荡器30℃，900 rpm，孵育2 h，全部涂布于0.1 mg/mL Zeocin抗性YPD平板，30℃恒温培养箱培养96 h。
毕赤酵母分泌优化方法验证：将上述步骤得到的 0.1 mg/mL Zeocin的酵母重组菌株挑取转化子进行菌落PCR验证，将验证成功的菌落，如图3所示，每种分别挑取两个转化子接种于BMGY液体培养基，进行24深孔板发酵，发酵96h，发酵完后，收集菌体，在激发波长558nm、发射波长590nm、增益60条件下测定胞外、胞内荧光值，以SK01作为对照，菌株信息见下表1，荧光值分析结果如图4所示。
表1 毕赤酵母分泌途径优化重组菌株信息
说明：例SK01/FP1+FP7A*，表示SK02菌株是以SK01为出发菌株，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术以FP1为sgRNA质粒、FP7为供体质粒，A表示供体质粒线性化构建得到。
其中，mCherry-XL基因优化序列：
ATGGTTTCTAAAGGCGAAGAGGATAATATGGCGATTATTAAAGAATTCATGAGATTTAAGGTTCATATGGAAGGTTCCGTTAACGGGCATGAATTTGAAATTGAAGGGGAAGGGGAAGGACGTCCTTATGAAGGTACCCAAACAGCAAAGCTGAAAGTTACAAAAGGTGGTCCGCTTCCCTTTGCTTGGGATATCCTGAGCCCCCAGTTTATGTACGGCAGCAAAGCCTATGTCAAGCATCCAGCAGACATTCCTGATTATCTAAAACTCAGTTTTCCTGAAGGATTTAAATGGGAACGTGTGATGAATTTTGAGGATGGCGGCGTTGTCACCGTGACCCAGGATTCAAGCCTACAGGACGGTGAGTTTATTTATAAAGTAAAACTGCGGGGTACCAATTTCCCGTCTGATGGCCCGGTCATGCAAAAAAAAACGATGGGTAGCGAAGCCAGCAGTGAAAGGATGTATCCGGAAGATGGCGCGCTGAAAGGAGAAGTGAAATACCGTCTGAAGCTGAAAGATGGAGGACATTATGATGCAGAAGTTAAAACAACATATAAGGCAAAAAAGCCGGTTCAGCTGCCGGGAGCATATAACGTCAACCGTAAACTTGATATCACAAGCCACAATGAAGACTATACGATTGTTGAGCAGTATGAGAGAGCTGAAGGCCGCCATTCAACCGGCGGAATGGATGAATTATATAAA。（SEQ ID NO.1）
mCherry-XL主要作用是作为荧光蛋白分子信标，表征毕赤酵母分泌途径优化效果，mCherry-XL荧光蛋白分子信标可以直观快速的做实验筛选。
PCR引物：
5’-AOXI(TTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTT)如SEQ ID NO.2所示；
3’-AOXI(CTTAGTTCATCTTGGATGAGATCACGCTTTTGTCATATTAGGTT)如SEQ ID NO.3所示。
该引物是将构建成功的PL405质粒，通过PCR将所需的DNA片段扩增出来，为下一步毕赤转化实验做准备的。
验证例：
如表2所示，通过实验结果分析，与对照SK01相比，过表达分子伴侣基因Kar2，外源荧光蛋白分泌能力提高了27%，胞内荧光表达量降低25%，而且pAOX1诱导型启动子调控能力强于组成型启动子PGAP(SK06)。
表2 过表达分子伴侣基因Kar2优化分泌水平
注：FL/OD600为两个独立重复平均值±标准差。
该过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法筛选荧光蛋白作为出发菌株，从基因工程方面进行分泌途径遗传改造，通过基因编辑技术将分泌辅助因子基因分别过表达整合至筛选出的菌株，从而提高外源荧光蛋白分泌能力。且本发明转化体系在PCR八连管操作及孵育、热激过程在PCR扩增仪完成，大幅提高了实验操作效率、简化了实验方法、节省了试剂成本。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (9)
1.过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：采用mCherry-XL作为报告蛋白；
S2：筛选最高拷贝且荧光蛋白在胞内聚集的菌株作为出发菌株SK01；
S3：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术将MPDI1、PDI1、HAC1、YAP1、Kar2、Ero1分泌辅助因子基因分别过表达整合至SK01菌株。
2.根据权利要求1所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S1包括以下步骤：
S11：根据毕赤酵母密码子偏好性对mCherry-XL进行优化，优化的序列基因通过体外全基因合成得到，如SEQ ID NO.1所示；
S12：构建PL405毕赤酵母重组分泌表达载体。
3.根据权利要求2所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S12包括以下步骤：
S121：将毕赤酵母分泌表达载体pPICZaA与S11中得到的mCherry-XL基因高保真PCR产物通过Gibson assembly连接；
S122：转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建得到mCherry-XL重组毕赤酵母分泌表达载体Gibson assembly，保存载体的菌株命名为PL405；
S123：挑取若干个转化子进行测序，将测序结果正确的菌落保种。
4.根据权利要求3所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S2包括以下步骤：
S21：将PL405载体质粒通过PCR引物5’-AOXI(TTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTT)、3’-AOXI(CTTAGTTCATCTTGGATGAGATCACGCTTTTGTCATATTAGGTT)线性化，用PCR产物纯化回收试剂盒对线性化产物进行回收，PCR引物5’-AOXI(TTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTT)如SEQ ID NO.2所示，3’-AOXI(CTTAGTTCATCTTGGATGAGATCACGCTTTTGTCATATTAGGTT)如SEQ ID NO.3所示；
S22：将-80℃保藏的毕赤酵母野生型菌株X33划线活化，在30℃恒温培养箱培养3d，挑取单菌落至YPD液体培养10h，转接至50mLYPD过夜培养，当OD600达到0.8-1.0时，离心收集细胞，25mL无菌水重悬细胞，离心弃上清，再重复1次，离心弃上清；加入1mL无菌水重悬细胞，转至1.5mL EP管中，离心，弃上清；加入1mL 1M LiCl重悬细胞，在30℃下静置孵育1h；离心弃上清，加入400uL 1MLiCl重悬细胞，分装25uL至PCR八连管，获得感受态细胞A；
S23：将感受态细胞A加入120uL 50%PEG4000、18uL 1MLiCl、5uL 10mg/mL鲑鱼精DNA，以及2.5 ug待转化DNA，涡旋混匀，在PCR扩增仪30℃孵育30 min，然后42℃热激20 min；离心枪头去除上清，加入0.2mL YPD重悬细胞，转移至96浅孔板，恒温振荡器30℃，900 rpm，孵育2 h，全部涂布于0.8 mg/mL Zeocin抗性YPD平板，在30℃恒温培养箱培养48h，得到的0.8mg/mL Zeocin的酵母表达菌株；
S24：将得到的0.8mg/mL Zeocin的酵母表达菌株挑取若干个转化子接种于BMGY液体培养基，进行24深孔板发酵，每隔24h补料3%的甲醇进行诱导，发酵96h，发酵完后，收集菌体，在激发波长558nm、发射波长590nm、增益60条件下测定胞外、胞内荧光值，将PL405-A2作为出发菌株，命名为SK01。
5.根据权利要求4所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S3包括以下步骤：
S31：构建gRNA质粒和供体质粒；
S32：制备感受态细胞B；
S33：构建毕赤酵母分泌辅助因子过表达菌株；
S34：验证毕赤酵母分泌优化。
6.根据权利要求5所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S31包括以下步骤：
S311：在benchling在线网站设计得到sgRNA，以X33基因组DNA为模板通过PCR扩增得到供体左右同源臂片段；
S312：将每种基因分别以组成型启动子PGAP和诱导型启动子PAOX1调控，表达框为PGAP-gene-TAOX1或 PAOX1-gene-TAOX1；
S313：将左右同源臂片段及表达框、KanaR抗性基因通过Gibson assembly方法连接构建供体质粒；
S314：将gRNA质粒和供体质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑取若干个转化子进行测序，将测序结果正确的菌落抽提治理，将正确的供体质粒进行线性化，用PCR产物纯化回收试剂盒对线性化产物进行回收。
7.根据权利要求6所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S32包括以下步骤：
S321：将-80℃保藏的重组菌SK01划线活化，30℃恒温培养箱培养3d，挑取单菌落至YPD液体培养10h，转接至50mLYPD过夜培养；
S322：当OD600达到0.8-1.0时，离心收集细胞，25mL无菌水重悬细胞，离心弃上清，再重复1次，离心弃上清；
S323：加入1mL无菌水重悬细胞，转至1.5mL EP管中，离心，弃上清；
S324：加入1 mL 1MLiCl重悬细胞，在30℃下静置孵育1h；
S325：离心弃上清，加入400uL 1MLiCl重悬细胞，分装25uL至PCR八连管中，得到感受态细胞B。
8.根据权利要求7所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S33包括以下步骤：
S331：将感受态细胞B加入120μL 50%PEG4000、18μL 1MLiCl、5μL 10mg/mL鲑鱼精DNA，将每种基因的gRNA质粒和供体质粒线性化片段分别取1ug加入转化体系中，涡旋混匀；
S332：在PCR扩增仪30℃孵育30 min，然后42℃热激20 min；
S333：用离心枪头去除上清，加入0.2mL YPD重悬细胞，转移至96浅孔板，恒温振荡器30℃，900 rpm，孵育2h，全部涂布于0.1mg/mL Zeocin抗性YPD平板，30℃恒温培养箱培养96h，得到0.1mg/mL Zeocin的酵母重组菌株。
9.根据权利要求8所述的过表达毕赤酵母分子伴侣提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于：所述S34包括以下步骤：
S341：在得到的0.1mg/mL Zeocin的酵母重组菌株中，挑取若干个转化子进行菌落PCR验证；
S342：将验证成功的菌落，每种分别挑取若干个转化子接种于BMGY液体培养基，进行24深孔板发酵，发酵96h，发酵完后，收集菌体；
S343：在激发波长558nm、发射波长590nm、增益60条件下，以SK01作为对照，测定胞外、胞内荧光值。
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