CN107828790B - 一种在酸条件下诱导表达的启动子 - Google Patents

一种在酸条件下诱导表达的启动子 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在酸性条件下诱导表达的启动子，属于微生物分子生物学领域。本发明提供的启动子序列如SEQ ID NO.1所示，来源于产甘油假丝酵母WL2002‑5‑59，其能在产甘油假丝酵母中驱动和/或调节有效连接核酸的表达，该启动子的克隆扩大了微生物酸调控研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母发酵生产有机酸以及其他需要在酸性条件下发酵生产的产品提供了有效的方法和新的思路。

Description

一种在酸条件下诱导表达的启动子
技术领域
本发明涉及一种在酸性条件下诱导表达的启动子，特别是一种来源于产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes的启动子，属于生物工程技术领域。
背景技术
产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes，CCTCC：M93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，在中国专利CN1070235C中公开，公告日2001年8月29日，具有耐高渗，高产量，高转化率，生产强度大等特点，居世界领先地位。它能在25％葡萄糖或5％NaCl的高渗透压培养基上正常生长，在实验室规模发酵中，甘油产量可达12％，即使在工业化规模中，甘油产量也达10％。同时，当产甘油假丝酵母发酵进入细胞生长稳定期以后pH下降至3.0左右，甚至更低，而甘油产量依然维持在较高水平。相对于模式菌株酿酒酵母而言，产甘油假丝酵母具有良好的在低pH条件下生长的特性。
启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上的重要作用，不仅决定了基因的表达水平，也决定了基因表达的时空顺序，可以说启动子活性的高低在很大程度上影响着基因表达最终产物的表达水平。
具有不同强度和调节机制的启动子是代谢工程和合成生物学中的重要工具，虽然有许多组成型启动子可用，但是诱导型启动子的数量仍然局限于酿酒酵母中的途径工程。目前对酿酒酵母进行代谢改造，大多利用组成型启动子，如糖酵解途径中的强组成型启动子PTDH3(也称为PGPD)，PPGK1，PTPI1和PPDC1启动子已被广泛用于酿酒酵母中的基因表达。虽然组成型启动子方便维持基因表达而无需额外的操作，但它们不适用于含有毒性中间体的代谢途径或在特定时间点表达靶基因。而诱导型或调节型启动子可弥补这些问题，在发酵初期，菌体生长阶段，尽可能不表达外源基因，随着发酵时间延长，中间代谢产物的增加，诱导启动子表达目的基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的产甘油假丝酵母酸诱导基因及启动子序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
如上所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，来源于产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列SEQ ID NO.1，命名为Pgmt。
在本发明的一种实施方式中，所述酸诱导指的酸性环境是pH2左右。
包含所述启动子的载体，例如表达载体、克隆载体及穿梭载体均在本专利保护范围之内。
本发明提供的载体可应用于酵母表达***；功能基因的筛选(基因克隆于启动子后)、鉴定及优化、调控基因的表达；功能基因的稳定表达(基因克隆于启动子后)或过表达(采用多个启动子或启动胁迫机制)。上述关于启动子的常规应用均属于该发明保护范畴。
产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因启动子表达强度的验证；
甘露糖转运蛋白基因启动子表达强度的重组表达载体(图1)，构建过程如下：
将外源绿色荧光蛋白基因GFP克隆连接到质粒pUR-5.8S rDNA-URA5上，得到载体pUR-5.8S rDNA-gfp-URA5；
PCR克隆或者化学方法合成SEQ ID NO.1的酸诱导启动子片段，将其连接到pUR-5.8S rDNA-gfp-URA5上得到pUR-PCgGMT-GFP；
通过构建的重组表达载体pUR-PCgGMT-GFP，重组质粒采用醋酸锂转化法转化产甘油假丝酵母，涂布于选择性培养基，挑取单菌落进行PCR验证。
从平板上挑取阳性转化子，接种于10mL YEPD液体培养基中。37℃，培养24h，利用玻璃珠法提取基因组，PCR验证。
利用Olympus荧光显微镜进行荧光分析。以绿色荧光蛋白为标记证实了构建整合表达载体的实用性及可行性，进一步验证了产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因启动子的表达强度。
本发明的有益效果：
本发明成功从产甘油假丝酵母中克隆获得一个酸诱导启动子，为代谢改造产甘油假丝酵母在酸性条件下合成产品奠定了基础。
附图说明
图1：pUR-PCgGMT-GFP物理图谱；
图2：PCggmt和Pgap在不同pH条件下启动gfp荧光。
具体实施方式
实施例1：产甘油假丝酵母基因组DNA的提取
将产甘油假丝酵母野生菌培养至稳定期，按照参考文献《酵母遗传学技术手册》进行。将提取的DNA用核酸蛋白分析仪进行测定，根据A260/A280的比值判断所提取的DNA的纯度，同时通过琼脂糖凝胶电泳判断模板质量。
实例2：酸诱导启动子的获取
对产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因在不同pH条件下做实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究其在不同酸条件下转录水平情况，结果发现甘露糖转运蛋白基因随着pH的降低，相对转录倍数增大，将这个基因序列上游约1.5kb碱基序列克隆，预测得到启动子。
Pgmt通过引物gmt-F和gmt-R进行扩增，两端含有BamHI和SacII酶切位点，启动子连接到pMD-19(sample)上进行测序，引物序列如下：
上游引物：CGCGGATCCATACTATACAATTGTAAAATACA
下游引物：TCCCCGCGGTTCTAGTATGTTGATAGGAA
实例3：产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因启动子表达强度验证
酸诱导启动子表达载体的构建
绿色荧光蛋白GFP序列参照文献设计引物，序列5’端引入酶切位点Not I、Sac II和Stu I酶切位点，以保证后续启动子有足够的酶切位点使用，3’端引入Kpn I酶切位点，克隆得到GFP基因后采用Not I和Kpn I双酶切，连接pUR-5.8S rDNA-URA5，得到得到重组载体pUR-5.8S rDNA-gfp-URA5。
PCR克隆产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因启动子，酶切，连接重组载体pUR-5.8S rDNA-gfp-URA5，采用热激法转化至大肠杆菌JM109，获得pUR-PCgGMT-GFP。
GFP基因引物：
GFP-F：
ATTTGCGGCCGCCCGCGGAGGCCTATGGTAGATCTGACTAGTAAAGGAGAAGA
GFP-R：CGGGGTACCTCACACGTGGTGGTGGTG
实例4：重组表达载体的转化与筛选
将构建的重组表达质粒pUP-PCgGMT-GFP，Hind III单酶切线性化后，采用醋酸锂转化法转化至产甘油假丝酵母URA缺陷菌株中，涂布于选择性培养基。从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR验证，然后挑取阳性转化子，转接到YEPD液体培养基中，培养至对数生长期，玻璃珠法提取其基因组，PCR验证，保存菌株。
实例5：重组酵母培养，酸诱导表达和荧光强度分析
从平板上挑取验证的重组菌，接种于10mL液体YEPD培养基中，培养至对数生长期，转接到不同pH(pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0荧光)的YEPD培养基中，37℃、150r/m培养24h。利用Olympus荧光显微镜进行荧光观察，绿色荧光蛋白是一种极具潜力的标记物，其内源荧光基因在受到紫外光或蓝光激发时可发射清晰可见的绿光且荧光信号稳定，故实验以蓝光为激发光，检测重组菌在不同pH条件下的荧光强度。可见野生型对照在pH 2.0和pH 5.0条件下均没有荧光产生，组成型启动子Pgap转化子在pH 5.0条件下有强荧光，在pH 2.0条件下也有较强的荧光产生；Pgmt转化子在pH 5.0条件下荧光微弱，随着pH降低，荧光强度越强，在pH 2.0的时候，荧光强度最强，说明Pgmt是酸诱导启动子。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种在酸条件下诱导表达的启动子
<141> 2017-11-10
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1553
<212> DNA
<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)
<400> 1
atactataca attgtaaaat acaatccaat acaccgcatc acgtgcgtgc gcacagggca 60
tggctgccca gacaaagccc caattgccgt tttgggcgcc aacgcgctcc ttccaaaaac 120
ggacggcaca gagggcacaa aaaatttcag gcggcgaaat gataatttgt gagggcaaga 180
aaagtttcag tgcggaaagg ggggaacttc agtggggagg aaaaaaaaaa aagcggcgga 240
gtacagagaa attggatggt tttccccccc atcagttgta aaattgacaa ttttttcgag 300
tgtctgtttc acttttgaag ttggtttatg aatcttgtct tgatataatt tgctttactt 360
aagtatattt tatttaactc tattttattt cagtttattt tagtttattt cagtttattt 420
tagtgnattt tatttaactc tattttattt tagtttattt tagtttattt tattttcttc 480
cttctccaac ttgaacgtcc catagagtaa ccatgtctgc agagaagaaa gatatcgagc 540
aaccacaaga tcttaacaag atcagaatca ccttcacctc caccaatgtc agagcattgg 600
aaaaggtttc tggcttagtc atcagaaacg ctagaagaga aggtatcaac aagaagggtc 660
ctgtcagaat gccaaccaag gcgctctcca ttgcaaccag aaagactcct aatggtgaag 720
gttccaagac ctgggaacat tatgaaatga gaatccacaa gagatacatt gacttggaag 780
ctccatccac cttgatcaag aagattactt ccttgaccat tgagccaggt gttgatgtcg 840
aagtcactgt ctctgtctaa ggacatggac aggtgtcgtt attttccttt tttttttctt 900
ttttttttct gttctggcat tgttgttgag tggttgattg cccaataatc ctctgacatc 960
acatatcgca gccgtactcc ggcgtgccgt gttgtgcaca ccctctaggc gtgccgtgta 1020
tgagacaagt ccagcttatc aagttcttca acaattttta gatggttatc tcgtatatga 1080
gacgttgcgg tagacagcta tcagcgtgtg tattccacgg cgcaatatgt atcttgttta 1140
gctttatagt gtcgttaatg ctcttcacac agtactacaa acagcaatat ccaatgtaga 1200
tatttaaaca tgttggtcct tgcctttgta ttgtttttag acttttaacc tatttgcgcc 1260
cgtgtcacgt gacacacatt atcgttagta tgcaagtcac gtgccacgca ccccctcccc 1320
ccaccgagac ttatatttac acactttaac gcggttttct atatttaacg agttcaggca 1380
cctgcatttt cttcacattt ggcctgttta aatgaaattt ctcgcgtttg cgtctctgga 1440
gcgtcgaatt tttcccattc tcataaaaga agctgcattt tccactagtt tggtgtttgt 1500
tactcctttg ttttcacttg tttgatccag ttgttcctat caacatacta gaa 1553
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cgcggatcca tactatacaa ttgtaaaata ca 32
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tccccgcggt tctagtatgt tgataggaa 29
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
atttgcggcc gcccgcggag gcctatggta gatctgacta gtaaaggaga aga 53
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cggggtacct cacacgtggt ggtggtg 27

Claims (7)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述启动子的遗传构建体。
3.根据权利要求2所述的遗传构建体，其特征在于，所述遗传构建体含有所述启动子、与所述启动子有效连接的异源核苷酸序列，3’转录终止子。
4.含有权利要求1所述启动子的表达载体。
5.权利要求1所述启动子在调控基因方面的应用，其特征在于，所述应用是将含有所述启动子的遗传构建体转化到酵母细胞中，在酸性条件下培养，所述遗传构建体的启动子与异源核苷酸序列连接，异源核苷酸序列受到启动子的调控。
6.含有权利要求1所述的启动子的重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以细菌、藻类、真菌为宿主细胞，将含有启动子、异源基因序列、终止子的表达框转化到宿主细胞中得到。
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