CN117448196A

CN117448196A - 一种藤黄色单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN117448196A
Application number: CN202311168779.3A
Authority: CN
Inventors: 孙纪全; 田婧; 董文霞; 杨康
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2023-09-11
Filing date: 2023-09-11
Publication date: 2024-01-26

Abstract

本发明提供了一种藤黄色单胞菌及其应用，属于微生物工程技术领域。藤黄色单胞菌DCA‑T2(Luteimonas sp.DCA‑T2)，已于2023年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27950。本申请的藤黄色单胞菌DCA‑T2菌株及其微生物菌剂在富含阿魏酸的土壤中使用时，可以降解土壤中的阿魏酸，显著降低高浓度阿魏酸对黄瓜等作物的抑制，提高黄瓜等植物的生物量。该藤黄色单胞菌DCA‑T2菌株及其微生物菌剂可用于解决因阿魏酸代表的酚酸类化合物在土壤中过度积累而导致的作物减产问题。

Description

一种藤黄色单胞菌及其应用

技术领域

本申请属于微生物工程技术领域，涉及一种藤黄色单胞菌DCA-T2，还涉及利用该藤黄色单胞菌DCA-T2生产的微生物菌剂、微生物菌剂的制备方法以及所述藤黄色单胞菌DCA-T2与微生物菌剂在降解酚酸类化合物中的应用。

背景技术

酚酸类化合物是一种常见的植物化感物质，该类化合物有很强的植物化感活性。酚酸类化合物是植物残体分解过程的中间产物，也是植物根系分泌物重要成分，在环境中广泛存在。作物的连作可以导致某些单一类型的酚酸类化合物在土壤中的严重累积。单一类型的酚酸类化合物在土壤中的高浓度累积，是导致土壤连作障碍的重要机制之一。高浓度的酚酸会严重降低植物种子萌发率，抑制植物的生长发育，是导致的敏感作物严重减产重要原因之一。

环境生物修复是一种利用微生物的生命活动修复受损环境的技术，具有修复效率高、成本低、无药物残留和二次污染等优点。在自然界的土壤内存在大量的细菌、真菌和放线菌，这些菌株不但不会引起植物的疾病，反而可以通过降解土壤中的酚酸从而促进植物的生长。从环境中分离酚酸高效降解菌株，制成菌剂直接投加到污染土壤，去除其中的关键性酚酸类化合物，可解决农作物的连作障碍问题，并促进农业可持续发展。

发明内容

本发明主要从土壤中筛选能够降解酚酸类化合物的细菌，以期降解土壤中的酚酸类化合物从而促进植物的生长。本发明的藤黄色单胞菌及其微生物菌剂的使用操作简便、成本低，能够应用于含酚酸类化合物的土壤，菌株可以降解土壤中的酚酸类化合物，显著促进黄瓜等植物的发芽率和生物量，从而促进黄瓜等植物的生长。

具体来说，本发明提出了如下技术方案。

一方面，本发明提供了一种藤黄色单胞菌DCA-T2，所述藤黄色单胞菌为藤黄色单胞菌DCA-T2，已于2023年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27950。

另一方面，本发明提供了一种所述的藤黄色单胞菌在降解酚酸类化合物中的应用。

优选的，所述藤黄色单胞菌DCA-T2菌株应用于酚酸类化合物积累的土壤，所述酚酸积累的土壤是指含有酚酸类化合物的土壤。所述藤黄色单胞菌DCA-T2能够降解土壤中的酚酸类化合物。

优选的，所述作物是黄瓜。

另一方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂利用所述藤黄色单胞菌DCA-T2生产制得，所述微生物菌剂的活性成分为所述藤黄色单胞菌DCA-T2。

优选的，所述微生物菌剂含有10亿个/ml以上所述藤黄色单胞菌DCA-T2。

又一方面，本发明提供了一种微生物菌剂在降解酚酸类化合物中的应用。

优选的，所述微生物菌剂应用于酚酸类化合物积累的土壤，所述酚酸类化合物积累的土壤是指含有酚酸类化合物的土壤。

优选的，所述酚酸类化合物为阿魏酸。

再一方面，本发明提供了一种该微生物菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤一、平板种培养：将所述的藤黄色单胞菌DCA-T2活化后接种于平板上，得到平板菌种；

步骤二、锥形瓶种培养：将所述步骤一中的平板菌种接种于LB培养基中，恒温震荡培养至对数生长期，得到微生物菌剂。

优选的，所述LB培养基按质量百分数计，包含如下组分：胰蛋白胨1.0％、酵母提取物0.5％、NaCl 1.0％，其余为水，pH值为6.8～7.2。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的藤黄色单胞菌DCA-T2及其微生物菌剂能够应用于含酚酸类化合物的土壤，菌株可以降解土壤中的酚酸类化合物，显著促进黄瓜等植物的发芽率和生物量，从而促进黄瓜等植物的生长；

2、使用本发明藤黄色单胞菌DCA-T2及其微生物菌剂可以扩大黄瓜的种植范围，提高作物产量；

3、本发明提供了一种含有藤黄色单胞菌DCA-T2的微生物菌剂，能够在富含酚酸类化合物的土壤中使用，降解土壤中的酚酸类化合物从而促进植物的生长，也可以作为微生物肥料在富含酚酸类化合物的农田中使用，提高作物的种子发芽率、生物量或作物产量；

4、本发明还提供了一种微生物菌剂的制备方法，具有适用性广泛及实用性强的优点。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1示出了藤黄色单胞菌DCA-T2菌株降解阿魏酸的生长曲线图；

图2示出了藤黄色单胞菌DCA-T2菌株对不同酚酸化合物的降解率柱状图。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的微生物学、生物化学、分析化学、细胞培养及相关领域的常规技术。

保藏信息：

本发明提供的藤黄色单胞菌属(Luteimonas)藤黄色单胞菌DCA-T2(Luteimonassp.DCA-T2)菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏编号为CGMCC No.27950，保藏日期为2023年7月19日。

本发明的藤黄色单胞菌DCA-T2菌株具有如下性质：

1.形态特征：菌体为杆状。

2.生理生化特征：革兰氏染色反应阴性，氧化酶和过氧化氢酶阳性；在LB培养基培养3天后，形成直径0.5mm、不透明、有光泽，表面光滑湿润，有***的淡黄色菌落。

3.16S rRNA序列鉴定

采用如下引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5'-TACGACTTAACCCCAATCGC-3')，进行PCR扩增，通过凝胶电泳等方法分析PCR产物，确定无误后送华大基因(北京)公司进行双向测序。16SrRNA的序列见序列表SEQ ID No：1所示的碱基序列，与GenBank中的序列比对发现，DCA-T2菌株的16S rRNA序列与藤黄色单胞菌属(Luteimonas)菌株序列的同源性最高，达99％以上。

本发明主要从根际土中筛选能够降解酚酸类化合物的细菌，以期降解土壤中的酚酸类化合物从而促进植物的生长。本发明提供的藤黄色单胞菌DCA-T2及其微生物菌剂本身能在含酚酸类化合物(阿魏酸)量为200mg/L的无机盐培养基等培养基中生长，在含有250mg/kg酚酸类化合物的土壤中，可以显著提高黄瓜种子发芽率。将本发明菌剂加入到含有250mg/kg酚酸类化合物的土壤中，可以显著提高黄瓜等作物发芽率，并明显提高作物的生物量，从而促进了植物的生长。

藤黄色单胞菌DCA-T2具体的制备步骤如下：

采集马铃薯根际土样品，取纯马铃薯根际土壤1g，添加至含100mg/L的阿魏酸的无机盐培养基内，置于150rpm、30℃的摇床富集培养7天后，对其进行梯度稀释后，涂布在LB培养基(酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，琼脂粉20.0g/L，用水定容至1L，pH7.0左右)平板上。平板放置在30℃的培养箱内避光培养7天。收集在LB培养基平板上生长出的菌落，并进行划线纯化后保存。

本发明还提供了利用上述藤黄色单胞菌DCA-T2菌株生产的微生物菌剂，其活性成分为藤黄色单胞菌DCA-T2菌体。

所述微生物菌剂的制备方法如下所述：

生产菌剂的工艺为：平板种－锥形瓶种－产品，所述产品的包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂。

在一个优选的实施方式中，所述菌剂的制备具体可采用如下步骤：

S1、平板种培养：将菌株DCA-T2(原种)在LB培养基(成分如下：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0～7.2)平板上培养，备用。

S2、锥形瓶种培养：将平板种接种于200mL LB液体培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，其他为水，pH 7.0～7.2)中，恒温振荡培养至对数生长期，离心用无菌水重悬后，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

本发明能降解土壤中的酚酸类化合物从而促进黄瓜生长的藤黄色单胞菌DCA-T2和微生物菌剂具有生产使用成本低、使用方便的优点，通过降解土壤中的酚酸类化合物能够显著促进黄瓜的生长。本发明提供的菌株和微生物菌剂可以作为微生物肥料在酚酸类化合物积累的农田中使用，提高作物在酚酸积累土壤中的发芽率、生物量或作物产量。使用该菌剂可以扩大黄瓜的种植范围，提高作物的种植面积。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，具体如表1所示，所用黄瓜种子为常规黄瓜种子，以下实验均设置三次重复，结果取平均值。

表1各试剂的商购来源信息表

实施例1、藤黄色单胞菌DCA-T2的获得及鉴定

一、藤黄色单胞菌DCA-T2的获得

取2021年9月从内蒙古大学南校区马铃薯农田中采集的马铃薯根际土样品，取纯马铃薯根际土壤1g，添加至含100g/L的阿魏酸的无机盐培养基内，置于150rpm、30℃的摇床富集培养7天后，对其进行梯度稀释后，涂布在LB培养基(酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，琼脂粉20.0g/L，用水定容至1L，pH 7.0左右)平板上。平板放置在30℃的培养箱内避光培养7天。收集在LB培养基平板上生长出的单菌落，并进行划线纯化后保存。

二、藤黄色单胞菌DCA-T2的鉴定

(1)形态特征：菌体为杆状。

(2)生理生化特征：革兰氏染色反应阴性，氧化酶和过氧化氢酶阳性；在LB培养基培养3天后，形成直径0.5mm、不透明、有光泽，表面光滑湿润，有***的淡黄色菌落。

(3)16S rRNA序列鉴定

采用如下引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5'-TACGACTTAACCCCAATCGC-3')，进行PCR扩增，通过凝胶电泳等方法分析PCR产物，确定无误后送华大基因(北京)公司进行双向测序。16SrRNA的序列见序列表SEQ ID No：1所示的碱基序列，与GenBank中的序列比对发现，DCA-T2菌株的16S rRNA序列与藤黄色单胞菌属(Luteimonas)菌株序列的同源性最高，生理、生化指标与藤黄色单胞菌的标准菌株的一致，将菌株DCA-T2鉴定为藤黄色单胞菌。

三、藤黄色单胞菌DCA-T2菌株的保藏

通过以上鉴定结果，确认上述菌株为藤黄色单胞菌的一个新菌株，将其命名为藤黄色单胞菌DCA-T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27950。

实施例2、藤黄色单胞菌DCA-T2菌株在无机盐培养液中降解阿魏酸

按1％接种量在含100mg/L阿魏酸的无机盐培养基中接种DCA-T2种子液。放置在30℃、150rpm摇床中振荡培养。以只加阿魏酸和只接种菌株的样品分别作为对照，每组设置3个重复。定时取样测定培养液中的阿魏酸浓度和菌体浓度，测定液体培养基中的阿魏酸浓度和菌体OD₆₀₀值，确定菌株降解阿魏酸的生长曲线。其中菌株降解阿魏酸的降解率的计算公式为：

降解率＝(对照组阿魏酸浓度-处理组阿魏酸浓度)/对照组阿魏酸浓度×100％。

图1示出了藤黄色单胞菌DCA-T2菌株降解阿魏酸的生长曲线图。如图1所示，实验组中，在0-32h期间，阿魏酸的浓度下降较慢；在32-52h期间，阿魏酸的浓度下降较快；在64h时，阿魏酸降解殆尽，随后阿魏酸浓度基本保持稳定，到72h时，阿魏酸的降解率为97.57％，降解量达到最大。

实施例3、藤黄色单胞菌DCA-T2菌株在无机盐培养液中降解其他酚酸类化合物。

分别在不同的无机盐培养液中添加终浓度为100mg/L的对羟基苯甲酸、香豆酸和丁香酸做为唯一碳源，以1％的接种量向上述液体培养基中加入提前制备好的DCA-T2种子液。将加入以上化合物不加菌株的样品作为对照组，每组设置三个平行。将样品放入温度30℃、150rpm的恒温摇床中振荡培养46h，测定培养基中的各种化合物浓度，分析菌株降解其它酚酸类化合物的能力。其中菌株降解酚酸化合物的降解率的计算公式为：

降解率＝(对照组化合物浓度-处理组化合物浓度)/对照组化合物浓度×100％。

图2示出了藤黄色单胞菌DCA-T2菌株对不同酚酸化合物的降解率柱状图。如图2所示，藤黄色单胞菌DCA-T2菌株对丁香酸和香豆酸的降解效果不明显，但是可以降解对羟基苯甲酸，经过46h的培养，对羟基苯甲酸的降解率为85.62％。

实施例4、在含高浓度酚酸类化合物土壤中接种菌株DCA-T2提高黄瓜苗的生物量

挑取菌株DCA-T2单菌落于3mL LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h，获得新鲜菌液。离心后用无菌水重悬获得菌剂，调OD₆₀₀为1，加到酚酸积累的土壤中，不加菌剂的土壤作为对照组。将大小均匀的黄瓜种子分为两组，一组种在加入菌剂的阿魏酸的土壤中，一组种在不加菌剂的阿魏酸土壤中。将其放在28℃的光照培养箱中培养，定时浇水维持土壤含水量在20％。10天时观察黄瓜的生长情况。用天平和米尺测量黄瓜的根长、株高和鲜重，取平均值。结果如表2所示。

由表2可知，接种了藤黄色单胞菌DCA-T2的酚酸土壤中的黄瓜苗的生长(包括根长、株高和鲜重等指标)明显优于未接种藤黄色单胞菌DCA-T2的样品，其中根长提高了32.7％，株高提高了31.5％，鲜重提高了31.4％。实验表明，在富含阿魏酸的土壤中，接种藤黄色单胞菌DCA-T2可以显著提高黄瓜苗的生长，具有较好的促生效果。

表2接种菌株对土壤种植黄瓜的影响

处理	根长(cm)	株高(cm)	鲜重(g)
				未接入菌株DCA-T2	5.2	5.0	0.35
接入菌株DCA-T2	6.9	6.7	0.46
				提高比例(％)	32.7	31.5	31.4

实施例5、利用藤黄色单胞菌DCA-T2生产微生物菌剂

步骤一、将藤黄色单胞菌DCA-T2菌株(原种)在LB培养基(成分如下：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 20g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0～7.2)平板上培养，备用。

步骤二、挑取LB培养基平板上的单菌落接种于100mL LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 20g/L，其余为水，pH值7.0～7.2)中，恒温振荡培养至对数生长期，离心用无菌水重悬后，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

由上实施例可见，本发明提供的藤黄色单胞菌DCA-T2及其微生物菌剂可以提高黄瓜等植物在酚酸类化合物积累土壤中的生长速度。本发明成功地解决了在黄瓜等普通作物在酚酸类化合物积累土壤中不能生长或长势较差的现状，显著降低生产和使用过程中的工作量，生产和使用成本低，促进了农业的可持续发展。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明权利要求的涵盖范围。

Claims

1.一种藤黄色单胞菌，其特征在于，所述藤黄色单胞菌为藤黄色单胞菌DCA-T2，已于2023年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.27950。

2.一种权利要求1所述的藤黄色单胞菌在降解酚酸类化合物中的应用。

3.一种含有如权利要求1所述的藤黄色单胞菌的微生物菌剂。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂利用所述藤黄色单胞菌DCA-T2生产制得，所述微生物菌剂的活性成分为所述藤黄色单胞菌DCA-T2。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有10亿个/ml以上所述藤黄色单胞菌DCA-T2。

6.一种权利要求3-5任意一项所述的微生物菌剂在降解酚酸类化合物从而提高作物生长中的应用。

7.根据权利要求6所述的微生物菌剂在降解酚酸类化合物中的应用，其特征在于，所述微生物菌剂应用于酚酸类化合物积累的土壤中。

8.根据权利要求6-7任意一项所述的微生物菌剂在降解酚酸类化合物中的应用，其特征在于，所述酚酸类化合物为阿魏酸。

9.一种权利要求3-5任意一项所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

10.权利要求9所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述LB培养基按质量百分数计，包含如下组分：胰蛋白胨1.0％、酵母提取物0.5％、NaCl 1.0％，其余为水，pH值为6.8～7.2。