CN117425494A - 抗tigit抗体、抗cd96抗体和其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了特异性结合至CD96(例如人CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT)的多特异性分子，和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT)的经分离的抗体。还提供了包含这些多特异性分子和抗体的药物组合物、编码这些多特异性分子和抗体的核酸、产生这些多特异性分子和抗体的表达载体和宿主细胞，以及使用这些多特异性分子和抗体治疗受试者的方法。
Description
相关申请交叉引用
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序列表
以电子方式提交的ASCII文本文件(名称：190448_SL；大小：293,587个字节；创建日期：2022年4月26日)中的序列表的内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及特异性结合至CD96(例如人CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT)的多特异性分子、抗TIGIT抗体和其使用方法。
背景技术
CD96(分化簇96)，也称为TACTILE(T细胞活化，晚期表达增加)，是免疫球蛋白(Ig)超家族中的I型跨膜蛋白。它具有单个Ig结构域、I型跨膜结构域、单个胞内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和单个YXXM磷酸化基序，并且在T细胞和自然杀伤(NK)细胞的表面上表达。
CD96被认为在调节免疫细胞(例如NK细胞和T细胞)和肿瘤转移中发挥作用。尤其是，已经表明，CD96功能的阻断以CD8+T细胞依赖性方式抑制若干小鼠肿瘤模型中的原发性肿瘤生长。
具有Ig和ITIM结构域的蛋白质T细胞免疫受体(TIGIT)，又称为VSIG9或VSTM3，是免疫球蛋白(Ig)超家族中的I型跨膜蛋白。它具有单一Ig结构域、I型跨膜结构域、单一细胞内免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和单一免疫球蛋白尾酪氨酸(ITT)样磷酸化基序并且在活化的CD4阳性/CD25阳性调节性T细胞(Treg)、记忆CD45RO阳性T细胞和自然杀手(NK)细胞上表达，但不在初始T细胞上表达。
CD155(又称为脊髓灰质炎病毒受体(PVR))在单核细胞和树突状细胞上高水平表达，并且能够通过结合其两种受体CD226和CD96活化效应T细胞和NK细胞，以及削弱Treg的活性。TIGIT结合至CD155，并且经显示，它拮抗CD155与CD226和CD96的相互作用，由此抑制T细胞和NK细胞介导的免疫活性。
鉴于人CD96和人TIGIT在调节免疫反应方面的作用，因此设计成阻断CD96配体相互作用和/或TIGIT配体相互作用的治疗剂在治疗涉及免疫抑制的疾病方面拥有巨大的前景。
发明内容
本公开提供了特异性结合至CD96(例如人CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT)的多特异性分子以及特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT)的抗体。还提供了包含这些多特异性分子和抗体的药物组合物、编码这些多特异性分子和抗体的核酸、产生这些多特异性分子和抗体的表达载体和宿主细胞，以及使用这些多特异性分子和抗体治疗受试者的方法。
在一个方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至人CD96的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有CDRCDRH1、CDRH2和CDRH3的第一VH以及含有CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3的第一VL，其中
(i)所述第一VH包含SEQ ID NO:34的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且所述第一VL包含SEQ ID NO:35的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，
(ii)所述第一VH包含SEQ ID NO:36的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且所述第一VL包含SEQ ID NO:37的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，或
(iii)所述第一VH包含SEQ ID NO:38的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且所述第一VL包含SEQ ID NO:39的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；以及
(b)特异性结合至除人CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含含有CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3的第二VH以及含有CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3的第二VL。
在某些实施例中，第一抗原结合区的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15；16、17、18、19、20和21；或22、23、24、25、26和27的氨基酸序列。
在某些实施例中，第二抗原结合区特异性结合至人TIGIT。在一个具体实施例中，第二VH包含SEQ ID NO:40的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且第二VL包含SEQ ID NO:41的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在另一实施例中，第二抗原结合区的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至除人TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3的第一VH以及含有CDRCDRL1、CDRL2和CDRL3的第一VL；以及
(b)特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二VH，所述第二VH包含SEQ ID NO:40的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；以及第二VL，所述第二VL包含SEQ ID NO:41的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施例中，第二抗原结合区的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33的氨基酸序列。
在某些实施例中，第一抗原结合区特异性结合至人CD96。在一个具体实施例中，第一VH包含与SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，第一VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列组成。在另一实施例中，第一VL包含与SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，第一VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，第二VH包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。在一个具体实施例中，第二VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，第二VL包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。在一个具体实施例中，第二VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至人CD96的第一抗原结合区，所述抗原结合区包含第一VH和第一VL，其中所述第一VH包含SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列；且/或所述第一VL包含SEQID NO:35、37或39的氨基酸序列；以及
(b)特异性结合至除人CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二VH和第二VL。
在某些实施例中，第二抗原结合区特异性结合至人TIGIT。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至除人TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一VH和第一VL；以及
(b)特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，所述抗原结合区包含第二VH和第二VL，其中所述第二VH包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；且/或所述第二VL包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在某些实施例中，第一抗原结合区特异性结合至人CD96。在一个具体实施例中，第一VH包含SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列，并且第一VL包含SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列。在另一个实施例中，第一VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:34、36或38组成并且第一VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:35、37或39组成。在另一个实施例中，第一VH和第一VL分别包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列。在另一个实施例中，第一VH和第一VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列组成。在另一个实施例中，第二VH包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，并且第二VL包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。在另一个实施例中，第二VH和第二VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列组成。在另一个实施例中，第一VH和第一VL分别包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列；并且第二VH和第二VL分别包含SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列。在另一个实施例中，第一VH和第一VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列组成；并且第二VH和第二VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，第一和/或第二抗原结合区包含重链恒定区，所述重链恒定区选自由以下组成的组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在一个具体实施例中，重链恒定区是IgG1重链恒定区。在另一个实施例中，重链恒定区包含SEQ ID NO:49-60中的任一种的氨基酸序列。
在某些实施例中，IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的N297A突变。
在某些实施例中，第一和/或第二抗原结合区包含重链恒定区，所述重链恒定区是野生型重链恒定区的变体，其中所述变体重链恒定区结合至FcγR的亲和力比野生型重链恒定区结合至FcγR的亲和力高。在一个具体实施例中，FcγR是FcγRIIB或FcγRIIIA。
在某些实施例中，IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的S267E和L328F突变。
在某些实施例中，IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的至少一个选自由S239D、A330L和I332E组成的组的突变。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含氨基酸位置239处的天冬氨酸；分别位于氨基酸位置239和332处的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区和第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:58和57；59和57；或60和57。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239和332处的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
第二抗原结合区包含含有位于氨基酸位置239处的天冬氨酸的第二重链恒定区，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区和第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:59和58；或60和58。
在某些实施例中，第一重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
第二重链恒定区还包含氨基酸位置332处的谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区和第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:60和59。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含氨基酸位置239处的天冬氨酸；分别位于氨基酸位置239和332处的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区和第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:57和60；57和59；或57和58。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含含有位于氨基酸位置239处的天冬氨酸的第一重链恒定区；并且
第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239和332处的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区和第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:58和60；或58和59。
在某些实施例中，第一重链恒定区还包含氨基酸位置332处的谷氨酸；并且
第二重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区和第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:59和60。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含含有氨基酸位置366处的色氨酸的第一重链恒定区；并且
第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区包含SEQ ID NO:53、54、55或56；并且第二重链恒定区包含SEQ ID NO:49、50、51或52。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸；并且
第二抗原结合区包含含有氨基酸位置366处的色氨酸的第二重链恒定区，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一个具体实施例中，第一重链恒定区包含SEQ ID NO:49、50、51或52；并且第二重链恒定区包含SEQ ID NO:53、54、55或56。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列的第一重链。在一个具体实施例中，第一重链由SEQ ID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列组成。在某些实施例中，第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:7或100-110的氨基酸序列的第二重链。在一个具体实施例中，第二重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:7或100-110的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，多特异性分子包含含有SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列的轻链恒定区。在一个具体实施例中，第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列的第一轻链。在另一个实施例中，第一轻链由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列组成。在一个具体实施例中，第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的第二轻链。在另一个实施例中，第二轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列组成。
在另一方面中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至人CD96的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列的第一重链；和/或含有SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列的第一轻链；以及
(b)特异性结合至除人CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二重链和第二轻链。
在某些实施例中，第二抗原结合区特异性结合至人TIGIT。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至除人TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一重链和第一轻链；以及
(b)特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含含有SEQID NO:7或100-110的氨基酸序列的第二重链；和/或含有SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的第二轻链。
在某些实施例中，第一抗原结合区特异性结合至人CD96。在一个具体实施例中，第一重链包含SEQ ID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列；且/或第一轻链包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列。在另一个实施例中，第一重链包含SEQ ID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列；并且第一轻链包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列。在另一个实施例中，第一重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、3、5或67-99组成；且第一轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，第二重链包含SEQ ID NO:7或100-110的氨基酸序列；且/或第二轻链包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列。在一个具体实施例中，第二重链包含SEQ ID NO:7或100-110的氨基酸序列；并且第二轻链包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列。在另一个实施例中，第二重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:7组成；且第二轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，第一重链和第一轻链分别包含SEQ ID NO:1和2；3和4；或5和6的氨基酸序列；且/或第二重链和第二轻链分别包含SEQ ID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列。在一个具体实施例中，第一重链和第一轻链分别包含SEQ ID NO:1和2；3和4；或5和6的氨基酸序列；并且第二重链和第二轻链分别包含SEQ ID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列。在另一个实施例中，第一重链和第一轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1和2；3和4；或5和6组成；并且第二重链和第二轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在一些实施例中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:73、84、95或56；并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:103或49。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:73、84、95或56；并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:104或50。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:67、78、89或49；并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:7或56。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:1、3、5或50；并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:7或56。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:72、83、94或55；并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:103或49。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
在某些实施例中，第一抗原结合区包含SEQ ID NO:67、78、89或49；并且第二抗原结合区包含SEQ ID NO:102或55。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合至人TIGIT的经分离的抗体，所述抗体包含：VH，其包含SEQ ID NO:40的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:41的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33。在一个具体实施例中，抗体包含SEQ ID NO:40的VH氨基酸序列。在另一个实施例中，VH由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成。在另一个实施例中，抗体包含SEQ IDNO:41的VL氨基酸序列。在另一实施例中，VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供了特异性结合至人TIGIT的经分离的抗体，所述抗体包含分别含有SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列的VH和VL。在某些实施例中，VH和VL分别由SEQID NO:40和41的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2组成的组。在一个具体实施例中，抗体包含IgG1重链恒定区。在另一个实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:57、58、59或60的氨基酸序列的重链恒定区。
在某些实施例中，IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的N297A突变。
在某些实施例中，所述抗体包含作为野生型重链恒定区的变体的重链恒定区，其中所述变体重链恒定区结合至FcγR的亲和力比所述野生型重链恒定区结合至FcγR的亲和力高。在一个具体实施例中，FcγR是FcγRIIB或FcγRIIIA。
在某些实施例中，IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的S267E和L328F突变。
在某些实施例中，IgG1重链恒定区包含至少一个根据EU编号***编号的选自由S239D、A330L、和I332E突变组成的组的突变。
在某些实施例中，抗体包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链。在一个具体实施例中，重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列。在另一个实施例中，轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列组成。
在另一方面，本公开提供了一种特异性结合至人TIGIT的经分离的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:107、108、109或110的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的轻链。在一个具体实施例中，重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:107、108、109或110的氨基酸序列组成；并且轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列组成。在另一个实施例中，重链和轻链包含的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:107和8；107和9；108和8；108和9；109和8；109和9；110和8；或110和9。在另一个实施例中，重链和轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:107和8；107和9；108和8；108和9；109和8；109和9；110和8；或110和9的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，所述抗体是多特异性抗体。
在某些实施例中，多特异性分子或经分离的抗体与细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素、放射性核素或可检测标记缀合。在某些实施例中，多特异性分子或经分离的抗体与抗体缀合。
在另一方面，本公开提供了一种经分离的多核苷酸，其编码：
(a)本文公开的多特异性分子的VH、VL、重链和/或轻链；
(b)本文公开的多特异性分子的第一VH和第一VL；
(c)本文公开的多特异性分子的第二VH和第二VL；
(d)本文公开的多特异性分子的第一重链和第一轻链；或
(e)本文公开的多特异性分子的第二重链和第二轻链。
在另一方面，本公开提供了一种经分离的多核苷酸，其编码本文所公开的经分离抗体的VH和/或VL，或重链和/或轻链。
在另一方面，本公开提供了一种载体，其包含本文中所公开的多核苷酸。
另一方面，本公开提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)本文所公开的多核苷酸；
(b)本文所公开的载体；
(c)编码本文所公开的第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸，和编码本文所公开的第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸；
(d)第一载体，其包含编码本文公开的第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸；和第二载体，其包含编码本文公开的第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸；
(e)编码本文公开的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸、编码本文公开的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸、编码本文公开的第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸和编码本文公开的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸；
(f)第一载体，其包含编码本文公开的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸；第二载体，其包含编码本文公开的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸；第三载体，其包含编码本文公开的第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸；和第四载体，其包含编码本文公开的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸；
(g)编码本文公开的第一抗原结合区的重链和轻链的第一多核苷酸，和编码本文公开的第二抗原结合区的重链和轻链的第二多核苷酸；
(d)第一载体，其包含编码本文公开的第一抗原结合区的重链和轻链的第一多核苷酸；和第二载体，其包含编码本文公开的第二抗原结合区的重链和轻链的第二多核苷酸；
(i)编码本文公开的第一抗原结合区的重链的第一多核苷酸、编码本文公开的第一抗原结合区的轻链的第二多核苷酸、编码本文公开的第二抗原结合区的重链的第三多核苷酸和编码本文公开的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸；或
(j)第一载体，其包含编码本文公开的第一抗原结合区的重链的第一多核苷酸；第二载体，其包含编码本文公开的第一抗原结合区的轻链的第二多核苷酸；第三载体，其包含编码本文公开的第二抗原结合区的重链的第三多核苷酸；和第四载体，其包含编码本文公开的第二抗原结合区的轻链的第四多核苷酸。
另一方面，本公开提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)本文所公开的多核苷酸；
(b)本文所公开的载体；
(c)编码本文公开的经分离的抗体的VH和VL的多核苷酸；
(d)第一载体，其包含编码本文公开的经分离抗体的VH和VL的多核苷酸；
(e)编码本文公开的经分离抗体的VH的第一多核苷酸，和编码本文公开的经分离抗体的VL的第二多核苷酸；或
(f)第一载体，其包含编码本文公开的经分离抗体的VH的第一多核苷酸；和第二载体，其包含编码本文公开的经分离抗体的VL的第二多核苷酸。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文公开的多特异性分子、本文公开的经分离抗体、本文公开的多核苷酸、本文公开的载体或本文公开的宿主细胞；和药学上可接受的载剂或赋形剂。
在另一方面，本公开提供了一种产生多特异性分子或经分离抗体的方法，所述方法包括在表达多核苷酸且产生多特异性分子或经分离的抗体的适合条件下培养本文公开的宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)编码本文所公开的第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸，和编码本文所公开的第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸；或
(b)编码本文公开的第一抗原结合区的重链和轻链的第一多核苷酸，和编码本文公开的第二抗原结合区的重链和轻链的第二多核苷酸，
所述方法在表达所述多核苷酸且产生所述多特异性分子的适合条件下进行。
在另一方面，本公开提供了一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)编码本文公开的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸、编码本文公开的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸、编码本文公开的第二抗原结合的VH的第三多核苷酸和编码本文公开的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸；或
(b)编码本文公开的第一抗原结合区的重链的第一多核苷酸、编码本文公开的第一抗原结合区的轻链的第二多核苷酸、编码本文公开的第二抗原结合区的重链的第三多核苷酸和编码本文公开的第二抗原结合区的轻链的第四多核苷酸，
所述方法是在表达所述多核苷酸和产生所述多特异性分子的适合条件下进行。
在另一方面，本公开提供了一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括：
(a)在借以产生第一抗原结合区的条件下，在第一细胞中表达编码本文所公开的第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸；
(b)在借以产生第二抗原结合区的条件下，在第二细胞中表达编码本文所公开的第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸；以及
(c)使步骤(a)和(b)所产生的所述第一与第二抗原结合区在产生所述多特异性分子的适合条件下接触。
在另一方面，本公开提供了一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括：
(a)在借以产生第一抗原结合区的条件下，在第一细胞中表达编码本文所公开的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸和编码本文所公开的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸；
(b)在借以产生第二抗原结合区的条件下，在第二细胞中表达编码本文所公开的第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸和编码本文所公开的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸；以及
(c)使步骤(a)和(b)所产生的所述第一与第二抗原结合区在产生所述多特异性分子的条件下接触。
在另一方面，本公开提供了一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括使本文所公开的第一抗原结合区与第二抗原结合区在产生多特异性分子的条件下接触。
在另一方面，本公开提供了一种产生经分离的抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)编码本文公开的抗体的VH和VL的多核苷酸；或
(b)编码本文所公开的抗体重链和轻链的多核苷酸，
所述方法是在表达所述多核苷酸和产生所述抗体的适合条件下进行。
在另一方面，本公开提供了一种产生经分离的抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)编码本文所公开的抗体的VH的第一多核苷酸，和编码本文所公开的抗体的VL的第二多核苷酸；或
(b)编码本文所公开的抗体的重链的第一多核苷酸，和编码本文所公开的抗体的轻链的第二多核苷酸，
所述方法是在表达所述多核苷酸和产生所述抗体的适合条件下进行。
在另一方面，本公开提供了一种增强受试者的免疫反应的方法，所述方法包括将有效量的本文所公开的多特异性分子、本文所公开的经分离抗体、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的宿主细胞或本文所公开的药物组合物施予所述受试者。
在另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将有效量的本文所公开的多特异性分子、本文所公开的经分离抗体、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的宿主细胞或本文所公开的药物组合物施予所述受试者。
在某些实施例中，多特异性分子、经分离的抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物是通过全身、静脉内、皮下、肿瘤内施用，或者递送至肿瘤引流***。
在某些实施例中，所述方法还包括将另外的治疗剂施用给受试者。在一个具体实施例中，所述另外的治疗剂是化疗剂。在一个具体实施例中，所述另外的治疗剂是检查点靶向剂。在另一个实施例中，所述检查点靶向剂选自由以下组成的组：拮抗性抗PD-1抗体、拮抗性抗PD-L1抗体、拮抗性抗PD-L2抗体、拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗TIM-3抗体、拮抗性抗LAG-3抗体、拮抗性抗VISTA抗体、拮抗性抗TIGIT抗体、拮抗性抗CEACAM1抗体、拮抗性抗CD96抗体、激动性抗GITR抗体和激动性抗OX40抗体。在另一个实施例中，所述另外的治疗剂是抗PD-1抗体，任选地其中所述抗PD-1抗体是帕博利珠单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab)。在一个具体实施例中，所述另外的治疗剂是吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂。在另一个实施例中，所述抑制剂选自由以下组成的组：艾卡哚司他(epacadostat)、F001287、吲哚莫德(indoximod)和NLG919。在某些实施例中，所述另外的治疗剂是疫苗。在另一个实施例中，所述疫苗包含热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，所述HSPPC包含与抗原肽复合的热休克蛋白。在另一个实施例中，所述热休克蛋白是hsc70并且与肿瘤相关抗原肽复合。在另一个实施例中，所述热休克蛋白是gp96蛋白并且与肿瘤相关抗原肽复合，任选地其中所述HSPPC来源于从受试者获得的肿瘤。
在另一方面，本公开提供一种治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括将有效量的本文所公开的多特异性分子、本文所公开的经分离的抗体、本文所公开的多核苷酸、本文所公开的载体、本文所公开的宿主细胞或本文所公开的药物组合物施予所述受试者。
附图说明
图1A至图1C是一系列传感图，其显示人TIGIT和人CD96的胞外结构域同时结合至多特异性分子BA123(图1A)、BA125(图1B)和BA127(图1C)。
图2A至图2B是显示与对照多特异性分子BA128、BA131和BA133相比，抗TIGITxCD96多特异性分子BA127同时结合至CHO细胞的图，所述CHO细胞经工程改造以表达人TIGIT或人CD96。使用荧光染料(Alex Fluor488)缀合的抗His抗体，通过流式细胞术检测细胞表达的人TIGIT和可溶性His标记的人CD96(图2A)或细胞表达的人CD96和可溶性His标记的人TIGIT(图2B)的双重结合。
图3A至图3I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图3A)、BA125(图3B)或BA127(图3C)或对照多特异性分子BA129(图3D)、BA130(图3E)、BA131(图3F)、BA133(图3G)、BA134(图3H)或BA136(图3I)对CHO细胞的结合与同型对照多特异性分子(BA128)的比较情况，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与BA128对CHO细胞的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图4A至图4I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图4A)、BA127(图4B)或BA125(图4C)或对照多特异性分子BA129(图4D)、BA130(图4E)、BA131(图4F)、BA133(图4G)、BA134(图4H)或BA136(图4I)对CHO细胞的结合与同型对照多特异性分子(BA128)的比较情况，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人CD96的细胞表面同种型1。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与BA128对CHO细胞的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图5A至图5I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图5A)、BA125(图5B)或BA127(图5C)或对照多特异性分子BA129(图5D)、BA130(图5E)、BA131(图5F)、BA133(图5G)、BA134(图5H)或BA136(图5I)对CHO细胞的结合与同型对照多特异性分子(BA128)的比较情况，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达食蟹猕猴CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与BA128对CHO细胞的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图6A至图6I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图6A)、BA125(图6B)或BA127(图6C)或对照多特异性分子BA129(图6D)、BA130(图6E)、BA131(图6F)、BA133(图6G)、BA134(图6H)或BA136(图6I)阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图7A至图7I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图7A)、BA125(图7B)或BA127(图7C)或对照多特异性分子BA129(图7D)、BA130(图7E)、BA131(图7F)、BA133(图7G)、BA134(图7H)或BA136(图7I)阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达食蟹猕猴CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应多特异性分子的浓度作图。
图8A至图8I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图8A)、BA125(图8B)或BA127(图8C)或对照多特异性分子BA129(图8D)、BA130(图8E)、BA131(图8F)、BA133(图8G)、BA134(图8H)或BA136(图8I)对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达细胞表面人TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的阻断作用相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图9A至图9I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图9A)、BA125(图9B)或BA127(图9C)或对照多特异性分子BA129(图9D)、BA130(图9E)、BA131(图9F)、BA133(图9G)、BA134(图9H)或BA136(图9I)对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达细胞表面食蟹猕猴TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的阻断作用相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图10A至图10I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图10A)、BA125(图10B)或BA127(图10C)或对照多特异性分子BA129(图10D)、BA134(图10E)、BA131(图10F)、BA133(图10G)、BA130(图10H)或BA136(图10I)阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达细胞表面人TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图11A至图11I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图11A)、BA125(图11B)或BA127(图11C)或对照多特异性分子BA129(图11D)、BA130(图11E)、BA131(图11F)、BA133(图11G)、BA134(图11H)或BA136(图11I)阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达细胞表面食蟹猕猴TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图12A至图12I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图12A)、BA125(图12B)或BA127(图12C)或对照多特异性分子BA129(图12D)、BA130(图12E)、BA131(图12F)、BA133(图12G)、BA134(图12H)或BA136(图12I)对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平共表达细胞表面人TIGIT和人CD96同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图13A至图13I是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图13A)、BA125(图13B)或BA127(图13C)或对照多特异性分子BA129(图13D)、BA130(图13E)、BA131(图13F)、BA133(图13G)、BA134(图13H)或BA136(图13I)阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平共表达细胞表面人TIGIT和人CD96同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照多特异性分子(BA128)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图14A至图14F是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图14A)、BA125(图14B)或BA127(图14C)或对照多特异性分子BA129(图14D)、BA130(图14E)和BA131(图14F)对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人FcγRIIIa的细胞表面变体V/V。将按照中值荧光强度(MFI)评估的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图15A至图15F是一系列图，其显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA123(图15A)、BA125(图15B)或BA127(图15C)或对照多特异性分子BA129(图15D)、BA130(图15E)和BA131(图15F)对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人FcγRIIIa的细胞表面变体F/F。将按照中值荧光强度(MFI)评估的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图16A至图16C是一系列图，其显示抗CD96抗体BA143(图16A)、BA144(图16B)、BA145(图16C)对CHO细胞的结合与同型对照抗体(BA146)的比较情况，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与BA146对CHO细胞的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图17A至图17C是一系列图，其显示抗CD96抗体BA143(图17A)、BA144(图17B)、BA145(图17C)对CHO细胞的结合与同型对照抗体(BA146)的比较情况，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达食蟹猕猴CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与BA146对CHO细胞的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图18A至图18C是一系列图，其显示抗CD96抗体BA143(图18A)、BA144(图18B)和BA145(图18C)阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照抗体(BA146)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图19A至图19C是一系列图，其显示抗CD96抗体BA143(图19A)、BA144(图19B)和BA145(图19C)阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达食蟹猕猴CD96的细胞表面同种型2。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与同型对照抗体(BA146)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图20是显示抗TIGIT IgG1抗体BA148对CHO细胞的结合与同型对照抗体(BA149)的比较情况的图，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达细胞表面人TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与BA149对CHO细胞的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图21是显示抗TIGIT抗体BA148对CHO细胞的结合与同型对照抗体(BA149)的比较情况的图，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达细胞表面食蟹猕猴TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、在各种情况下与BA149对CHO细胞的结合相比较的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图22是显示抗TIGIT抗体BA148阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合的图，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、与同型对照抗体(BA149)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图23是显示抗TIGIT抗体BA148阻断人CD155-Fc对CHO细胞的结合的图，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达食蟹猕猴TIGIT。将按照中值荧光强度(MFI)评估、与同型对照抗体(BA149)的阻断作用相比较的CD155-Fc结合水平以最大应答百分比相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图24A至图24D是一系列图，其显示抗TIGIT抗体BA148和抗CD96抗体BA143、BA144和BA145对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人FcγRIIIa的细胞表面变体V/V。将按照中值荧光强度(MFI)评估的BA143(图24A)、BA144(图24B)、BA145(图24C)和BA148(图24D)的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图25A至图25D是一系列图，其显示抗TIGIT IgG1抗体BA148和抗CD96 IgG1WT抗体BA143、BA144和BA145对CHO细胞的结合，所述CHO细胞经工程改造以高水平表达人FcγRIIIa的细胞表面变体F/F。将按照中值荧光强度(MFI)评估的BA143(图25A)、BA144(图25B)、BA145(图25C)和BA148(图25D)的结合水平相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图26A至图26F是一系列图，其显示BA127、BA143、BA148或BA128在三个不同供体中结合至人活化T细胞的能力。将按照中值荧光强度(MFI)评估的对CD4+T细胞(图26A、图26B和图26C)和CD8+T细胞(图26D、图26E和图26F)的结合相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图27A至图27F是一系列图，其显示BA127或BA128在三个不同供体中结合至人活化T细胞的能力。将按照中值荧光强度(MFI)评估的对CD4+T细胞(图27A、图27B和图27C)和CD8+T细胞(图27D、图27E和图27F)的结合相对于与细胞一起温育的对应抗体的浓度作图。
图28A至图28C是一系列图，其显示BA123、BA125、BA127、BA128、BA129、BA130和BA131多特异性分子在多特异性分子浓度范围内促进来自单一供体的经SEA刺激的PBMC分泌IL-2的能力。每个图表示使用同一供体的独立实验。
图29是显示BA127和BA128多特异性分子以及BA143和BA148抗体在多特异性分子浓度范围内促进来自单一供体的经SEA刺激的PBMC分泌IL-2的能力的图。
图30A至图30F是一系列图，其显示BA127和BA128在抗体浓度范围内促进来自六个不同供体的经SEA刺激的PBMC分泌IL-2的能力。
图31A至图31B是显示BA125、BA127、BA128和BA133(图31A)和BA127、BA143、BA146、抗TIGIT单特异性参考抗体1和抗TIGIT单特异性参考抗体2(图31B)阻断杰卡特细胞(Jurkat cells)上所表达的TIGIT结合至CHO细胞上所表达的CD155的能力的图。图31C是显示BA127、BA131、BA128和抗TIGIT参考抗体3阻断杰卡特细胞上所表达的TIGIT结合至CHO细胞上所表达的CD155的能力的图。阻断表示为NFAT-萤光素酶信号在抗体浓度范围内的变化倍数。
图32A至图32B是显示抗TIGITxCD96多特异性分子BA127、参考抗TIGIT抗体和同型对照抗体在浓度范围内引起健康人供体原代PBMC分泌IL-2细胞因子的能力的图，所述健康人供体原代PBMC经来自两个供体的次优浓度的SEA超抗原刺激。
图33A至图33E是一系列图，其显示小鼠结肠直肠癌模型中的随时间变化的肿瘤体积，其中小鼠被施予双特异性同型对照物(图33A)、抗TIGIT小鼠替代单特异性抗体(图33B)、抗CD96小鼠替代单特异性抗体(图33C)、抗TIGIT与抗CD96小鼠替代单特异性抗体(图33D)、或抗TIGITxCD96小鼠替代多特异性分子(图33E)。
图34A是显示小鼠结肠直肠癌模型中的随时间变化的平均肿瘤体积的图，其中小鼠被施予抗TIGIT与抗CD96小鼠替代单特异性抗体、抗TIGITxCD96小鼠替代多特异性分子、Fc静默抗TIGITxCD96小鼠替代多特异性分子，或同型对照物。图34B至图34E是一系列图，其显示各个别小鼠的随时间变化的个别肿瘤体积，所述小鼠被施予抗TIGIT与抗CD96小鼠替代单特异性抗体(图34C)、抗TIGITxCD96小鼠替代多特异性分子(图34D)、Fc静默抗TIGITxCD96小鼠替代多特异性分子(图34E)或同型对照物(图34B)。
具体实施方式
本公开提供了特异性结合至CD96(例如人CD96或猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或猕猴TIGIT)的多特异性分子和经分离的抗TIGIT抗体。还提供了包含这些多特异性分子和抗体的药物组合物、编码这些多特异性分子和抗体的核酸、产生这些多特异性分子和抗体的表达载体和宿主细胞，以及使用这些多特异性分子和抗体治疗受试者的方法。本文所公开的多特异性分子和抗体特别适用于增强免疫细胞活化且因此适用于治疗受试者的癌症或治疗或预防受试者的感染性疾病。
7.1定义
如本文所用，术语“CD96”是指在人类中由CD96基因编码的分化簇96，也称为TACTILE(T细胞活化，晚期表达增加)。如本文所用，术语“人CD96”是指由野生型人CD96基因(例如GenBankTM登录号NM_005816.5)、它们的片段或变体编码的CD96蛋白。人CD96的示例性胞外部分在本文中作为SEQ ID NO 61-65提供。食蟹猕猴CD96的示例性胞外部分在本文中作为SEQ ID NO:66、111和112提供。
如本文所使用，术语“TIGIT”是指具有Ig和IMIM结构域的T细胞免疫受体(又称为VSIG9或VSTM3)，它在人体中由TIGIT基因编码。如本文所使用，术语“人TIGIT”是指由野生型人TIGIT基因(例如GenBankTM登录号NM_173799.3)编码的TIGIT蛋白或此类蛋白质的细胞外结构域。成熟人TIGIT蛋白和食蟹猕猴TIGIT蛋白的胞外结构域的示例性氨基酸序列分别作为SEQ ID NO:113和114提供。
如本文所用，“多特异性分子”是包含特异性结合至不同抗原的两个或更多个抗原结合区的分子。
如本文所用，“抗原结合区”是指多特异性分子或抗体的一部分，所述部分包含赋予多特异性分子或抗体对抗原的特异性的氨基酸残基。抗原结合区的实例包括抗体互补决定区(CDR)、重链可变区、轻链可变区、重链、轻链及其任何片段。抗原结合区可以来源于任何动物物种，诸如啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)和人。
如本文所使用，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包含抗体CDR、VH区和/或VL区的分子。抗体的实例包括但不限于单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异源缀合物抗体、抗体-药物缀合物、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和体(affibodies)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗-抗Id抗体)以及上述任一者的抗原结合片段。在某些实施例中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群体。抗体可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何子类(例如IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施例中，本文所述的抗体是IgG抗体或它们的类别(例如人IgG1或IgG4)或子类。在一个具体实施例中，抗体是人源化单克隆抗体。在另一个具体实施例中，抗体是人单克隆抗体。
“多特异性抗体”是特异性结合至两种或更多种不同抗原或者同一抗原的两个或更多个不同区域的抗体(例如双特异性抗体)。多特异性抗体包括含有两个不同抗原结合位点(不包括Fc区)的双特异性抗体。多特异性抗体可包括例如重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、表面重塑抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、异源缀合物抗体、连接的单链抗体或连接的单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和体、连接的Fab片段、F(ab')2片段、以化学方式连接的Fv以及二硫键连接的Fv(sdFv)。多特异性抗体可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何子类(例如IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施例中，本文所述的多特异性抗体是IgG抗体，或其某一类别(例如IgG1、IgG2或IgG4)或子类。
如本文所使用，术语“CDR”或“互补决定区”意思指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原组合位点。例如，Kabat等人,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等人,Sequences of protein of immunological interest.(1991),Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，和MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)已经描述了这些特定区域，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文，其中当彼此比较时，该定义包括氨基酸残基的重叠和子集。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。
如本文所使用，术语“可变区”和“可变结构域”可互换使用，并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，通常是轻链或重链的一部分，通常在成熟重链中的氨基末端约110至120个氨基酸或110至125个氨基酸以及成熟轻链中的约90至115个氨基酸，它在抗体之间的序列差异很大，并且被用于特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性。序列变化集中在称为互补决定区(CDR)的区域中，而可变区中保守性较高的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施例中，可变区是人可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在某些实施例中，可变区是灵长类动物(例如非人灵长类动物)可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如非人灵长类动物)框架区(FR)。
如本文所使用，术语“VH”和“VL”分别指抗体重链和轻链可变区，如Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(NIH Publication No.91-3242,Bethesda)中所描述，该文献以引用的方式整体并入本文。
如本文所使用，术语“恒定区”是本领域中常见的。恒定区是抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分，它不直接涉及抗体与抗原的结合，但是可以表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体(例如Fcγ受体)的相互作用。
如本文所使用，当用于指抗体时，术语“重链”可以基于恒定区的氨基酸序列而指任何独特的类型，例如α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)和μ(mu)，分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包括IgG的子类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所使用，当用于指抗体时，术语“轻链”可以基于恒定区的氨基酸序列而指任何独特类型，例如κ(k appa)或λ(lambda)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体实施例中，抗体轻链是人轻链。
如本文所使用，术语“特异性结合”、“特异性识别”、“免疫特异性结合”和“免疫特异性识别”在抗体的上下文中是类似的术语，并且是指结合至抗原(例如抗原决定基或免疫复合物)的分子，因为这种结合是本领域的技术人员所理解的。例如，特异性结合至抗原的分子可以结合至其它肽或多肽，通常具有较低亲和力，如通过例如免疫分析、KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或本领域已知的其它分析所测定。在一个具体实施例中，特异性结合至抗原的分子结合至所述抗原的KA，比所述分子非特异性结合至另一种抗原时的KA大至少2个对数(例如10倍)、2.5个对数、3个对数、4个对数或更大。
如本文所使用，术语“EU编号***”是指抗体的恒定区的EU编号规定，如Edelman,G.M.等人,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)以及Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,U.S.Dept.Health and Human Services,第5版,1991所述，这些专利各自以引用的方式整体并入本文。
如本文所使用，术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指本文所述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用将抗体施予患有疾病或障碍或者易患此类疾病或障碍的受试者，以预防、治愈、延迟、降低所述疾病或障碍或者复发性疾病或障碍的严重性，或者改善所述疾病或障碍或者复发性疾病或障碍的一种或多种症状，或者将受试者的存活时间延长至超过在不存在此类治疗的情况下的预期存活时间。
如本文所使用，在将疗法施予受试者的上下文中，术语“有效量”是指实现所期望的预防或治疗效果的疗法的量。
如本文所使用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。在某些实施例中，受试者是人或非人哺乳动物。在某些实施例中，受试者是人。
如本文关于抗体或多核苷酸所使用，术语“分离的”是指与抗体或多核苷酸的天然来源中存在的一种或多种污染物(例如多肽、多核苷酸、脂质或碳水化合物等)分离的抗体或多核苷酸。本文所述的“分离的抗体”的所有实例被另外考虑为抗体，所述抗体可以但不必是分离的。本文所述的“分离的多核苷酸”的所有实例被另外考虑为多核苷酸，所述多核苷酸可以但不必是分离的。本文所述的“抗体”的所有实例被另外考虑为抗体，所述抗体可以但不必是分离的。本文所述的“多核苷酸”的所有实例被另外考虑为多核苷酸，所述多核苷酸可以但不必是分离的。
两个序列(例如氨基酸序列或核酸序列)之间的“同一性百分比”的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的具体非限制性实例是Karlin S&Altschul SF(1990)PNAS 87:2264-2268的算法，该算法在Karlin S&Altschul SF(1993)PNAS 90:5873-5877中进行了修改，这些文献各自以引用的方式整体并入本文。这种算法被纳入Altschul SF等人,(1990)JMol Biol 215:403的NBLAST和XBLAST程序中，该文献以引用的方式整体并入本文。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集进行，例如，分数＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序参数集进行，例如，分数＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用空位BLAST，如Altschul SF等人,(1997)Nuc Acids Res 25:3389-3402所述，该文献以引用的方式整体并入本文。或者，PSI BLAST可用于执行迭代搜索，以检测分子之间的远距离关系(Id.)。当使用BLAST、空位BLAST和PSI Blast程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见，例如，万维网上的美国国家生物技术信息中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一个具体非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:11-17的算法，该文献以引用的方式整体并入本文。这种算法被纳入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。
两个序列之间的同一性百分比可以使用与上述技术类似的技术，在允许或不允许缺口的情况下确定。在计算同一性百分比时，通常只计算完全匹配。
7.2结合至CD96和/或TIGIT的多特异性分子以及抗TIGIT抗体
在一个方面，本公开提供了特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子。举例来说，本文所提供的多特异性分子可包含结合至CD96的第一抗原结合区和结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区。本文所提供的多特异性分子还可以包含结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和结合至TIGIT的第二抗原结合区。本文还提供包含结合至CD96的第一抗原结合区和结合至TIGIT的第二抗原结合区的多特异性分子。示例性抗CD96抗原结合区和抗TIGIT抗原结合区的氨基酸序列分别示于表1和表2中。
在另一方面，本公开提供了特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体。示例性抗体的氨基酸序列示于表2中。
表1.示例性抗CD96抗原结合区的氨基酸序列。
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表2.示例性抗TIGIT抗原结合区和抗TIGIT抗体的氨基酸序列。
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表3.示例性CD96序列。
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1根据hCD96结构域的UniProt描述分配的结构域。
2对于cyCD96序列，hCD96序列和cyCD96序列之间的同源性被用于定义结构域1、结构域2或结构域3。
表4.示例性TIGIT序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区以及特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有表1中所示的VH的一个、两个或所有三个CDR的VH。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VH的CDRH1。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VH的CDRH2。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VH的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区以及特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有表1中所公开的VL的一个、两个或所有三个CDR的VL。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VL的CDRL1。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VL的CDRL2。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VL的CDRL3。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含含有表2中所示的VH的一个、两个或所有三个CDR的VH。在某些实施例中，第二抗原结合区包含表2中所示的VH的CDRH1。在某些实施例中，第二抗原结合区包含表2中所示的VH的CDRH2。在某些实施例中，第二抗原结合区包含表2中所示的VH的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含含有表2中所示的VL的一个、两个或所有三个CDR的VL。在某些实施例中，第二抗原结合区包含表2中所示的VL的CDRH1。在某些实施例中，第二抗原结合区包含表2中所示的VL的CDRH2。在某些实施例中，第二抗原结合区包含表2中所示的VL的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区，和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有表1中所示的VH的一个、两个或所有三个CDR的VH，且所述第二抗原结合区包含表2中所示的VH的一个、两个或所有三个CDR的VH。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VH的CDRH1，且第二抗原结合区包含表2中所示的VH的CDRH1。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VH的CDRH2，且第二抗原结合区包含表2中所示的VH的CDRH2。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VH的CDRH3，且第二抗原结合区包含表2中所示的VH的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区，和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有表1中所示的VL的一个、两个或所有三个CDR的VL，且所述第二抗原结合区包含表2中所示的VL的一个、两个或所有三个CDR的VL。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VL的CDRH1，且第二抗原结合区包含表2中所示的VL的CDRH1。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VL的CDRH2，且第二抗原结合区包含表2中所示的VL的CDRH2。在某些实施例中，第一抗原结合区包含表1中所示的VL的CDRH3，且第二抗原结合区包含表2中所示的VL的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离抗体，所述抗体包含含有表2中所示的VH结构域的一个、两个或所有三个CDR的VH结构域。在某些实施例中，所述抗体包含表2中所示的VH结构域的CDRH1。在某些实施例中，所述抗体包含表2中所示的VH结构域的CDRH2。在某些实施例中，所述抗体包含表2中所示的VH结构域的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离抗体，所述抗体包含含有表2中所公开的VL结构域的一个、两个或所有三个CDR的VL结构域。在某些实施例中，所述抗体包含表2中所示的VL结构域的CDRL1。在某些实施例中，所述抗体包含表2中所示的VL结构域的CDRL2。在某些实施例中，所述抗体包含表2中所示的VL结构域的CDRL3。
本文所公开的多特异性分子或抗体的个别CDR能够根据所属领域中已知的任何CDR编号方案来确定。
在某些实施例中，本文所公开的多特异性分子或抗体的一个或多个CDR能够根据以下文献来测定：Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等人,Sequencesof protein of immunological interest(1991)来确定，这些文献中的每个均以引用的方式整体并入本文。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含本文表1中所公开的根据Kabat编号方案所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的根据Kabat编号方案所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含本文表1中所公开的抗原结合区的CDR，且所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的抗原结合区的CDR，如根据Kabat编号方案所测定。
在某些实施例中，本公开提供的抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且包含本文表2中所公开的根据Kabat编号方案所测定的抗体的CDR。
在某些实施例中，本文所公开的多特异性分子或抗体的一个或多个CDR能够根据Chothia编号方案测定，所述编号方案涉及免疫球蛋白结构环的位置(参见例如Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；以及美国专利第7,709,226号，所述全部文献都以整体引用的方式并入本文中)。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含本文表1中所公开的根据Chothia编号***所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的根据Chothia编号方案所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含本文表1中所公开的抗原结合区的CDR，且所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的抗原结合区的CDR，如根据Chothia编号方案所测定。
在某些实施例中，本公开提供的抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且包含本文表2中所公开的根据Chothia编号***所测定的抗体的CDR。
在某些实施例中，本文所公开的多特异性分子或抗体的一个或多个CDR能够根据MacCallum RM等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745测定，所述文献以全文引用的方式并入本文中。另外参见例如Martin A.“Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains”,载于Antibody Engineering,Kontermann和Dübel编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001)，该文献以引用的方式整体并入本文。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含本文表1中所公开的根据MacCallum编号***所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的根据MacCallum编号***所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含本文表1中所公开的抗原结合区的CDR，且所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的抗原结合区的CDR，如根据MacCallum编号***所测定。
在某些实施例中，本公开提供的抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且包含本文表2中所公开的根据MacCallum编号***所测定的抗体的CDR。
在某些实施例中，本文所公开的多特异性分子或抗体的CDR能够根据以下文献中所述的IMGT编号***测定：Lefranc M-P,(1999)The Immunologist 7:132-136；LefrancM-P等人,(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212，这些文献各自以引用的方式整体并入本文；和Lefranc M-P等人,(2009)Nucleic Acids Res 37:D1006-D1012。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含本文表1中所公开的根据IMGT编号***所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的根据IMGT编号***所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含本文表1中所公开的抗原结合区的CDR，且所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的抗原结合区的CDR，如根据IMGT编号***所测定。
在某些实施例中，本公开提供的抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且包含本文表2中所公开的根据IMGT编号***所测定的抗体的CDR。
在某些实施例中，本文所公开的多特异性分子或抗体的CDR能够根据AbM编号方案测定，所述编号方案涉及AbM高变区，其代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)使用，其以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含本文表1中所公开的根据AbM编号方案所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的根据AbM编号方案所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含本文表1中所公开的抗原结合区的CDR，且所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的抗原结合区的CDR，如根据AbM编号方案所测定。
在某些实施例中，本公开提供的抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且包含本文表2中所公开的根据AbM编号方案所测定的抗体CDR。
在某些实施例中，本文所公开的抗体CDR能够根据以下文献中所述的AHo编号***测定：Honegger和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.309:657-670(2001)，所述文献以全文引用的方式并入本文。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含本文表1中所公开的根据AHo编号***所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的根据AHo编号***所测定的抗原结合区的CDR。
在某些实施例中，本公开提供了多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区包含本文表1中所公开的抗原结合区的CDR，且所述第二抗原结合区包含本文表2中所公开的抗原结合区的CDR，如根据AHo编号***所测定。
在某些实施例中，本公开提供的抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且包含本文表2中所公开的根据AHo编号***所测定的抗体CDR。
在某些实施例中，本文所公开的多特异性分子或抗体的个别CDR各自独立地根据Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM编号方案之一，或通过多特异性分子的结构分析加以测定，其中所述结构分析是鉴定可变区中的经预测可与CD96或TIGIT的抗原决定基区域接触的残基。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:34、36或38中所示的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的VH，以及含有SEQ ID NO:35、37或39中所示的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列的VL，其中各CDR独立地根据Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM编号方案之一测定，或通过多特异性分子的结构分析加以测定，其中所述结构分析鉴定可变区中的经预测可与CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的抗原决定基区域接触的残基。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:40中所示的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的VH，以及含有SEQ ID NO:41中所示的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列的VL，其中各CDR独立地根据Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM编号方案之一测定，或通过多特异性分子的结构分析加以测定，其中所述结构分析鉴定可变区中的经预测可与TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗原决定基区域接触的残基。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:34、36或38中所示的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的VH，以及含有SEQ ID NO:35、37或39中所示的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列的VL，且第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:40中所示的VH的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的VH，以及含有SEQ ID NO:41中所示的VL的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列的VL，其中各CDR独立地根据Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT、AHo或AbM编号方案之一测定，或通过多特异性分子的结构分析加以测定，其中所述结构分析鉴定可变区中的经预测可分别与CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗原决定基区域接触的残基。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:10、11和12；16、17和18；或22、23和24中分别所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:13、14和15；19、20和21；或25、26和27中分别所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区，和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有CDRH1、CDRH2和CDRH3区的VH，以及含有CDRL1、CDRL2和CDRL3区的VL，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15；16、17、18、19、20和21；或22、23、24、25、26和27中分别所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:34、36或38中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:34、36或38中所示的氨基酸序列的VH。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:34、36和38组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO:35、37或39中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:35、37或39中所示的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VL的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:35、37和39组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:34、36或38中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列；和VL，所述VL包含与SEQ ID NO:35、37或39中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列组成；且VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列组成。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列组成；且VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列组成。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列组成；且VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39中分别所示的VH和VL氨基酸序列。在某些实施例中，VH和VL的氨基酸序列分别由选自由SEQ ID NO:34和35；36和37；以及38和39组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其与包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子交叉竞争结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其与本文所述的多特异性分子，例如包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子结合至CD96的相同或重叠抗原决定基(例如人CD96的抗原决定基或食蟹猕猴CD96的抗原决定基)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:28、29和30中分别所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:31、32和33中分别所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含含有CDRH1、CDRH2和CDRH3区的VH以及含有CDRL1、CDRL2和CDRL3区的VL，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33中分别所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含含有SEQ IDNO:40中所示的氨基酸序列的VH。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含含有SEQ IDNO:41中所示的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列；和VL，所述VL包含与SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT的第二抗原结合区(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)，其中第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列组成；且VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第二抗原结合区包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列。在某些实施例中，VH和VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:40和41中分别所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其与包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子交叉竞争结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其与本文所述的多特异性分子，例如包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子结合至TIGIT的相同或重叠抗原决定基(例如人TIGIT的抗原决定基或食蟹猕猴TIGIT的抗原决定基)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合分子包含第一VH，所述第一VH包含SEQID NO:10、11和12；16、17和18；或22、23和24中分别所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，且第二抗原结合区包含第二VH，所述第二VH包含SEQ ID NO:28、29和30中分别所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合分子包含第一VL，所述第一VL包含SEQID NO:13、14和15；19、20和21；或25、26和27中分别所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列，且第二抗原结合区包含第二VL，所述第二VL包含SEQ ID NO:31、32和33中分别所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合分子包含含有CDRH1、CDRH2和CDRH3区的第一VH以及含有CDRL1、CDRL2和CDRL3区的第一VL，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15；16、17、18、19、20和21；或22、23、24、25、26和27中分别所示的氨基酸序列，且第二抗原结合区包含含有CDRH1、CDRH2和CDRH3区的第二VH，以及含有CDRL1、CDRL2和CDRL3区的第二VL，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33中分别所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含第一VH，所述第一VH包含与SEQID NO:34、36或38中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列；且第二抗原结合区包含第二VH，所述第二VH包含与SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:34、36或38中所示的氨基酸序列的第一VH且第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列的第二VH。在某些实施例中，第一VH的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:34、36和38组成的组的氨基酸序列组成，且第二VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含第一VL，所述第一VL包含与SEQID NO:35、37或39中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列；且第二抗原结合区包含第二VH，所述第二VH包含与SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:35、37或39中所示的氨基酸序列的第一VL且第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列的第二VL。在某些实施例中，第一VL的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:35、37和39组成的组的氨基酸序列组成，且第二VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96的(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含第一VH，所述第一VH包含与SEQID NO:34、36或38中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列；和第一VL，所述第一VL包含与SEQ ID NO:35、37或39中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列，并且第二抗原结合区包含第二VH，所述第二VH包含与SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列；以及第二VL，所述第二VL包含与SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列的第一VH和含有SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列的第一VL，第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的第二VH和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第二VL。在某些实施例中，第一VH的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:34、36和38组成的组的氨基酸序列组成；且第一VL的氨基酸序列由选自由SEQID NO:35、37和39组成的组的氨基酸序列组成，且第二VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列组成；且第二VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合分子包含分别含有SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39中所示的氨基酸序列的第一VH和第一VL，且第二抗原结合区包含分别含有SEQ ID NO:40和41中所示的氨基酸序列的第二VH和第二VL。在某些实施例中，第一VH和第一VL的氨基酸序列由分别选自由SEQ ID NO:34和35；36和37；及38和39组成的组的氨基酸序列组成；并且第二VH和第二VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:40和41中分别所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含第一抗原结合区，所述第一抗原结合区与SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子交叉竞争结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)；和第二抗原结合区，所述第二抗原结合区与包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子交叉竞争结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含第一抗原结合区，所述第一抗原结合区与本文所述的多特异性分子，例如包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子结合至CD96的相同或重叠抗原决定基(例如人CD96的抗原决定基或食蟹猕猴CD96的抗原决定基)；和第二抗原结合区，所述第二抗原结合区与本文所述的多特异性分子，例如包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列的多特异性分子结合至TIGIT的相同或重叠抗原决定基(例如人TIGIT的抗原决定基或食蟹猕猴TIGIT的抗原决定基)。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其中经分离的抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:28、29和30中分别所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其中经分离的抗体包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:31、32和33中分别所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其中经分离的抗体包含含有CDRH1、CDRH2和CDRH3区的VH，以及含有CDRL1、CDRL2和CDRL3区的VL，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33中分别所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，所述抗体包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列的VH。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，所述抗体包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其包含含有SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列；和VL，所述VL包含与SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)一致的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL。在某些实施例中，VH的氨基酸序列由SEQ IDNO:40中所示的氨基酸序列组成；且VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列。在某些实施例中，VH和VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:40和41中分别所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种经分离的抗体，其与包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列的抗体交叉竞争结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。
在某些实施例中，本公开提供了一种经分离的抗体，其与本文所述的抗体，例如包含SEQ ID NO:40和41中分别所示的VH和VL氨基酸序列的抗体结合至TIGIT的相同或重叠抗原决定基(例如人TIGIT的抗原决定基或食蟹猕猴TIGIT的抗原决定基)。
在某些实施例中，多特异性分子或抗体的抗原决定基能够通过例如NMR光谱法、表面等离子体共振X射线衍射晶体学研究、ELISA分析、氢/氘交换联合质谱(例如液相色谱电喷雾质谱)、基于阵列的寡核苷酸-肽扫描分析和/或诱变定位(例如定点诱变定位)来测定。对于X射线晶体学来说，结晶可以使用本领域中已知方法中的任一种来实现(例如GiegéR等人,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文)。多特异性分子:抗原或抗体:抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术进行研究，并且可以使用计算机软件精修，诸如X-PLOR(Yale University,1992，由MolecularSimulations,Inc.分配；参见例如Meth Enzymol(1985)第114和115卷,Wyckoff HW等人编辑；美国专利申请号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,Carter CW；Roversi P等人编辑,(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt10):1316-1323，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文)。可以使用本领域的技术人员已知的任何方法来实现诱变作图研究。关于诱变技术，包括丙氨酸扫描诱变技术的描述，参见例如Champe M等人,(1995)同上和Cunningham BC&Wells JA(1989)同上。在一个具体实施例中，使用丙氨酸扫描诱变研究来测定多特异性分子或抗体的抗原决定基。另外，识别且结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的相同或重叠抗原决定基的多特异性分子或抗体能够利用常规技术加以鉴定，例如免疫分析，例如通过显示一种多特异性分子或抗体阻断另一种多特异性分子或抗体结合至目标抗原的能力来鉴定，即，竞争性结合分析。竞争结合分析还能够用于确定两种多特异性分子或抗体对抗原决定基是否具有相似结合特异性。竞争性结合能够在分析中测定，其中受测试的免疫球蛋白抑制参考多特异性分子或抗体特异性结合至共同抗原，例如CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。已知许多类型的竞争性结合分析，例如：固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见Stahli C等人,(1983)Methods Enzymol 9:242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland TN等人,(1986)J Immunol 137:3614-9)；固相直接标记分析、固相直接标记夹心分析(参见Harlow E和Lane D,(1988)Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel GA等人,(1988)Mol Immunol 25(1):7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Cheung RC等人,(1990)Virology 176:546-52)；以及直接标记的RIA(参见Moldenhauer G等人,(1990)Scand J Immunol 32:77-82)，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文。典型地，此类分析涉及使用结合至固体表面的经纯化之抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96，或TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)或带有未标记的测试免疫球蛋白和经标记的参考免疫球蛋白这些免疫球蛋白中的任一种免疫球蛋白的细胞。竞争性抑制可以通过在存在测试免疫球蛋白的情况下测定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，测试免疫球蛋白是过量存在的。通常，当竞争型多特异性分子或抗体过量存在时，其将参考多特异性分子或抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。使用经标记的抗原或经标记的多特异性分子或抗体能够将竞争型结合分析配置成许多不同形式。在该分析的常见形式中，抗原被固定在96孔板上。然后使用放射性或酶标记测量未标记的多特异性分子或抗体阻断经标记的抗体结合至抗原的能力。有关进一步详情，参见例如Wagener C等人,(1983)J Immunol 130:2308-2315；Wagener C等人,(1984)JImmunol Methods 68:269-274；Kuroki M等人,(1990)Cancer Res 50:4872-4879；KurokiM等人,(1992)Immunol Invest 21:523-538；Kuroki M等人,(1992)Hybridoma11:391-407and Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E和Lane D编,同上,第386-389页，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文。
在某些实施例中，多特异性分子抑制人CD96结合至人CD155(又称为脊髓灰质炎病毒受体(PVR))。在某些实施例中，相对于缺乏多特异性分子的情况下人CD96对人CD155的结合，多特异性分子的存在使人CD96对人CD155的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制人CD96的可溶性片段结合至人CD155的可溶性片段。在某些实施例中，相对于缺乏多特异性分子的情况下人CD96的可溶性片段对人CD155的可溶性片段的结合，多特异性分子的存在使人CD96的可溶性片段对人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，抗体抑制表达CD96的细胞与人CD155的可溶性片段的结合。在某些实施例中，相对于表达CD96的细胞在缺乏多特异性分子的情况下对人CD155的可溶性片段的结合，多特异性分子的存在使表达CD96的细胞对人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制表达CD96的细胞结合至表达人CD155的细胞。在某些实施例中，相对于表达CD96的细胞在缺乏多特异性分子的情况下对表达CD155的细胞的结合，多特异性分子的存在使表达CD96的细胞对表达CD155的细胞的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:1、3、5或67-99中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，重链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:1、3、5和67-99组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，轻链的氨基酸序列由选自SEQ ID NO:2、4和6组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含重链和轻链，其中所述重链和轻链分别包含SEQ IDNO:1和2；3和4；或5和6的氨基酸序列。在某些实施例中，重链和轻链的氨基酸序列由分别选自由SEQ ID NO:1和2；3和4；及5和6组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，多特异性分子抑制人TIGIT结合至人CD155(又称为脊髓灰质炎病毒受体(PVR))。在某些实施例中，相对于缺乏多特异性分子的情况下人TIGIT对人CD155的结合，多特异性分子的存在使人TIGIT对人CD155的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制人TIGIT的可溶性片段结合至人CD155的可溶性片段。在某些实施例中，相对于缺乏多特异性分子的情况下人TIGIT的可溶性片段对人CD155的可溶性片段的结合，多特异性分子的存在使人TIGIT的可溶性片段对人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制表达TIGIT的细胞结合至人CD155的可溶性片段。在某些实施例中，相对于表达TIGIT的细胞在缺乏多特异性分子的情况下对人CD155的可溶性片段的结合，多特异性分子的存在使表达TIGIT的细胞对人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制表达TIGIT的细胞结合至表达人CD155的细胞。在某些实施例中，相对于表达TIGIT的细胞在缺乏多特异性分子的情况下对表达CD155的细胞的结合，多特异性分子的存在使表达TIGIT的细胞对表达CD155的细胞的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:7或100-110中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，重链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:7和100-110组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:8或9中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，轻链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:8和9组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含重链和轻链，其中所述重链和轻链分别包含SEQID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列。在某些实施例中，重链和轻链的氨基酸序列由分别选自由SEQ ID NO:7和8；以及7和9组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，多特异性分子抑制人CD96和人TIGIT结合至人CD155(又称为脊髓灰质炎病毒受体(PVR))。在某些实施例中，相对于缺乏多特异性分子的情况下人CD96和人TIGIT对人CD155的结合，多特异性分子的存在使人CD96和人TIGIT对人CD155的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制人CD96的可溶性片段和人TIGIT的可溶性片段结合至人CD155的可溶性片段。在某些实施例中，相对于人CD96的可溶性片段和人TIGIT的可溶性片段在缺乏多特异性分子的情况下对人CD155的可溶性片段的结合，多特异性分子的存在使人CD96的可溶性片段和人TIGIT的可溶性片段对人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制表达CD96、TIGIT、或CD96和TIGIT的细胞结合至人CD155的可溶性片段。在某些实施例中，相对于表达CD96、TIGIT、或CD96和TIGIT的细胞在缺乏多特异性分子的情况下对人CD155的可溶性片段的结合，多特异性分子的存在使表达CD96、TIGIT、或CD96和TIGIT的细胞对人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，多特异性分子抑制表达CD96、TIGIT、或CD96和TIGIT的细胞结合至表达人CD155的细胞。在某些实施例中，相对于表达CD96、TIGIT、或CD96和TIGIT的细胞在缺乏多特异性分子的情况下对表达CD155的细胞的结合，多特异性分子的存在使表达CD96、TIGIT、或CD96和TIGIT的细胞对表达CD155的细胞的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:1、2、3或67-99中所示的氨基酸序列的第一VL且第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:7或100-110中所示的氨基酸序列的第二重链。在某些实施例中，第一重链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:1、2、3和67-99组成的组的氨基酸序列组成，并且第二重链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:7和100-110组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:2、4或6中所示的氨基酸序列的第一轻链，且第二抗原结合区包含含有SEQ ID:8或9中所示的氨基酸序列的第二轻链。在某些实施例中，第一轻链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:2、4和6组成的组的氨基酸序列组成，并且第二轻链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:8和9组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一重链和第一轻链，其中所述第一重链和第一轻链分别包含SEQ ID NO:1和2；3和4；或5和6的氨基酸序列，且所述第二抗原结合区包含第二重链和第二轻链，其中所述第二重链和第二轻链分别包含SEQ ID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列。在某些实施例中，第一重链和第一轻链的氨基酸序列由分别选自由SEQ ID NO:1和2；3和4；以及5和6组成的组的氨基酸序列组成，且第二重链和第二轻链的氨基酸序列由分别选自由SEQ ID NO:7和8；及7和9组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，抗体抑制人TIGIT与人CD155(又称为脊髓灰质炎病毒受体(PVR))的结合。在某些实施例中，相对于缺乏抗体的情况下人TIGIT与人CD155的结合，抗体的存在使人TIGIT与人CD155的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，抗体抑制人TIGIT的可溶性片段与人CD155的可溶性片段的结合。在某些实施例中，相对于缺乏抗体的情况下人TIGIT的可溶性片段与人CD155的可溶性片段的结合，抗体的存在使人TIGIT的可溶性片段与人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，抗体抑制表达TIGIT的细胞与人CD155的可溶性片段的结合。在某些实施例中，相对于缺乏抗体的情况下表达TIGIT的细胞与人CD155的可溶性片段的结合，抗体的存在使表达TIGIT的细胞与人CD155的可溶性片段的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，抗体抑制表达TIGIT的细胞与表达人CD155的细胞的结合。在某些实施例中，相对于缺乏抗体的情况下表达TIGIT的细胞与表达CD155的细胞的结合，抗体的存在使表达TIGIT的细胞与表达CD155的细胞的结合减少超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施例中，本公开提供一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:107、108、109或110中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:107、108、109或110中所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:8或9中所示的氨基酸序列的轻链。在某些实施例中，轻链的氨基酸序列由选自由SEQ ID NO:8和9组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，其包含重链和轻链，其中所述重链和轻链分别包含SEQ ID NO:107和8；107和9；108和8；108和9；109和8；109和9；110和8；或110和9的氨基酸序列。
在某些实施例中，重链和轻链的氨基酸序列由分别选自由SEQ ID NO:107和8；107和9；108和8；108和9；109和8；109和9；110和8；或110和9组成的组的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，本文所公开的多特异性分子或抗体与细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素、放射性核素或可检测标记缀合。在某些实施例中，细胞毒性剂能够诱导与其接触的细胞的死亡或破坏。在某些实施例中，细胞抑制剂能够防止或基本上减少增殖和/或抑制与其接触的细胞的活性或功能。在某些实施例中，细胞毒性剂或细胞生长抑制剂是化疗剂。在某些实施例中，放射性核素选自由以下组成的组：同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。在某些实施例中，可检测标记包含荧光部分或点击化学柄部。
任何免疫球蛋白(Ig)恒定区能够用于本文所公开的多特异性分子或抗体中。在某些实施例中，Ig区是人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何子类(例如IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:49-60中的任一种的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:49-60中的任一种的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列的轻链恒定区。
在某些实施例中，所述多特异性分子包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链恒定区且第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链恒定区且所述第二抗原结合区包含含有SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列的轻链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:57、58、59或60的氨基酸序列的重链恒定区。在某些实施例中，本公开提供一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的经分离的抗体，所述抗体包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列。
在某些实施例中，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的多特异性分子或抗体的Fc区(例如根据EU编号***编号的CH2结构域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区(根据EU编号***编号的残基216-230)中，以改变多特异性分子或抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞的细胞毒性。
在某些实施例中，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的多特异性分子或抗体的铰链区中，以便改变(例如增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基的数目，如例如美国专利第5,677,425号中所述，所述专利以全文引用的方式并入本文中。可以改变铰链区中的半胱氨酸残基的数量，以例如促进轻链和重链的组装，或改变(例如增加或减少)多特异性分子或抗体的稳定性。
在一个具体实施例中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、***或缺失)引入IgG恒定区或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc片段)中，以改变(例如减少或增加)多特异性分子或抗体在活体内的半衰期。关于改变(减少或增加)多特异性分子或抗体在活体内的半衰期的突变的实例，参见例如国际公开号WO 02/060919；WO 98/23289；和WO 97/34631；以及美国专利号5,869,046、6,121,022、6,277,375和6,165,745，所述全部文献以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、***或缺失)引入IgG恒定区或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc片段)中，以减少多特异性分子或抗体在活体内的半衰期。在其它具体实例中，将一个、两个或更多个氨基酸突变(例如取代、***或缺失)引入IgG恒定区或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc片段)中，以增加多特异性分子或抗体在活体内的半衰期。在一个具体实施例中，多特异性分子或抗体在根据EU编号***编号的第二恒定(CH2)结构域(人IgG1的残基231-340)和/或第三恒定(CH3)结构域(人IgG1的残基341-447)中可具有一个或多个氨基酸突变(例如取代)。在一个具体实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体的IgG1恒定区包含根据EU编号***编号的位置252处的甲硫氨酸(M)→酪氨酸(Y)取代、位置254处的丝氨酸(S)→苏氨酸(T)取代，以及位置256处的苏氨酸(T)→谷氨酸(E)取代。参见美国专利号7,658,921，该专利以引用的方式整体并入本文。这种类型的突变IgG，称为“YTE突变体”，与相同多特异性分子或抗体的野生型形式相比，已显示半衰期增加四倍(参见Dall'Acqua WF等人,(2006)J BiolChem281:23514-24，所述文献以全文引用的方式并入本文)。在某些实施例中，多特异性分子或抗体包含IgG恒定区，其包含根据EU编号***编号的位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。
在某些实施例中，将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的多特异性分子或抗体的Fc区(例如根据EU编号***编号的CH2结构域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人IgG1的残基341-447))和/或铰链区(根据EU编号***编号的残基216-230)中，以增加或减少多特异性分子或抗体对效应细胞表面上的Fc受体(例如活化Fc受体)的亲和力。多特异性分子或抗体Fc区中的使多特异性分子或抗体对Fc受体的亲和力减少或增加的突变以及用于将此类突变引入Fc受体或其片段的技术已为本领域技术人员所知。为了改变抗体对Fc受体的亲和力而在多特异性分子或抗体的Fc受体中达成的突变实例描述于例如Smith P等人,(2012)PNAS109:6181-6186、美国专利号6,737,056和国际公开号WO 02/060919；WO 98/23289；和WO 97/34631中，所有这些专利均以引用的方式整体并入本文。
在某些实施例中，多特异性分子或抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区是野生型重链恒定区的变体，其中所述变体重链恒定区结合至FcγRIIB的亲和力比野生型重链恒定区结合至FcγRIIB的亲和力高。在某些实施例中，变体重链恒定区是变体人重链恒定区，例如变体人IgG1、变体人IgG2或变体人IgG4重链恒定区。在某些实施例中，变体人IgG重链恒定区包含根据EU编号***编号的以下氨基酸突变中的一者或多者：G236D、P238D、S239D、S267E、L328F和L328E。在某些实施例中，变体人IgG重链恒定区包含一组选自由以下各项组成的组的氨基酸突变：根据EU编号***编号的S267E和L328F；P238D和L328E；P238D和一个或多个选自由以下各项组成的组的置换：E233D、G237D、H268D、P271G和A330R；P238D、E233D、G237D、H268D、P271G和A330R；G236D和S267E；S239D和S267E；V262E、S267E和L328F；以及V264E、S267E和L328F。在某些实施例中，FcγRIIB在选自由以下各项组成的组的细胞上表达：巨噬细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞、内皮细胞和活化的T细胞。
在另一个实施例中，将一个、两个或更多个氨基酸取代引入IgG恒定区Fc区中，以改变多特异性分子或抗体的一种或多种效应功能。举例来说，根据EU编号***编号的选自氨基酸残基234、235、236、237、239、243、267、292、297、300、318、320、322、328、330、332和396的一个或多个氨基酸可被不同氨基酸残基置换，使得多特异性分子或抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保持亲本多特异性分子或抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这种方法在美国专利号5,624,821和5,648,260中更详细地描述，这些专利中的每个均以引用的方式整体并入本文。在某些实施例中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可能减少循环多特异性分子或抗体的Fc受体结合，从而增强肿瘤定位。关于使恒定区缺失或失活并由此增加肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利号5,585,097和8,591,886，这些专利各自以引用的方式整体并入本文。在某些实施例中，可将一个或多个氨基酸取代引入本文所述的多特异性分子或抗体的Fc区中，以移除Fc区上的潜在糖基化位点，所述糖基化位点可减少Fc受体结合(参见例如Shields RL等人,(2001)J Biol Chem276:6591-604，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。在各种实施例中，可在本文所述的多特异性分子或抗体的恒定区中产生一个或多个以下突变：根据EU编号***编号的N297A取代；N297Q取代；L234A取代；L234F取代；L235A取代；L235F取代；L235V取代；L237A取代；S239D取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；S239D取代；F243L取代；D265A取代；S267E取代；L328F取代；R292P取代；Y300L取代；A327Q取代；P329A取代；A330L取代；I332E取代；或P396L取代。
在某些实施例中，可在本文所述的多特异性分子或抗体的恒定区中产生选自由根据EU编号***编号的D265A、P329A和其组合组成的组的突变。在某些实施例中，可在本文所述的多特异性分子或抗体的恒定区中产生选自由根据EU编号***编号的L235A、L237A和其组合组成的组的突变。在某些实施例中，可在本文所述的多特异性分子或抗体的恒定区中产生选自由根据EU编号***编号的S267E、L328F和其组合组成的组的突变。在某些实施例中，可在本文所述的多特异性分子或抗体的恒定区中产生选自由根据EU编号***编号的S239D、I332E、任选存在的A330L和其组合组成的组的突变。在某些实施例中，可在本文所述的多特异性分子或抗体的恒定区中产生选自由根据EU编号***编号的L235V、F243L、R292P、Y300L、P396L和其组合组成的组的突变。在某些实施例中，可在本文所述的多特异性分子或抗体的恒定区中产生选自由根据EU编号***编号的S267E、L328F和其组合组成的组的突变。
在一个具体实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体包含IgG1的恒定区，其具有根据EU编号***编号的N297Q或N297A氨基酸取代。在某些实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体包含IgG1的恒定区，其具有选自由根据EU编号***编号的D265A、P329A和其组合组成的组的突变。在另一个实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体包含IgG1的恒定区，其具有选自由根据EU编号***编号的L234A、L235A和其组合组成的组的突变。在另一个实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体包含IgG1的恒定区，其具有选自由根据EU编号***编号的L234F、L235F、N297A和其组合组成的组的突变。在某些实施例中，本文所述多特异性分子或抗体恒定区中的与人IgG1重链中的位置L234、L235和D265对应的位置的氨基酸残基分别不是L、L和D。该方法在国际公开号WO 14/108483中有所详细描述，该公开以引用的方式整体并入本文。在某些实施例中，根据EU编号***编号，对应于人IgG1重链中位置L234、L235和D265的氨基酸分别是F、E和A；或者A、A和A。
在某些实施例中，本文所述多特异性分子或抗体的恒定区中的一个或多个选自根据EU编号***编号的氨基酸残基329、331和322的氨基酸能够被不同氨基酸残基置换，使得多特异性分子或抗体具有改变的C1q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在美国专利号6,194,551(Idusogie等人)中更详细地描述，该专利以引用的方式整体并入本文。在某些实施例中，改变本文所述的多特异性分子或抗体的CH2结构域的N端区中的根据EU编号***编号的氨基酸位置231至238内的一个或多个氨基酸残基，从而改变多特异性分子或抗体固定补体的能力。该方法在国际公开号WO 94/29351中进一步描述，该公开以引用的方式整体并入本文。在某些实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体的Fc区通过使根据EU编号***编号的以下位置的一个或多个氨基酸突变(例如引入氨基酸取代)而经修饰以增强多特异性分子或抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增强抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法在国际公开号WO 00/42072中进一步描述，该公开以引用的方式整体并入本文。
在某些实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体包含IgG1的经修饰的恒定区，其中所述修饰增强多特异性分子或抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。在某些实施例中，0.1、1或10μg/mL多特异性分子或抗体能够在1、2或3小时内诱导至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的表达CD96的细胞和/或表达TIGIT的细胞发生细胞死亡，正如利用本文所述和/或本领域的技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，根据EU编号***编号，经修饰的IgG1恒定区包含S239D和I332E取代。在某些实施例中，根据EU编号***编号，经修饰的IgG1恒定区包含S239D、A330L和I332E取代。在某些实施例中，根据EU编号***编号，经修饰的IgG1恒定区包含L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L取代。在某些实施例中，抗体能够在效应T细胞和Treg中诱导细胞死亡，其中经历细胞死亡的Treg的百分比要比经历细胞死亡的效应T细胞的百分比多至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。
在某些实施例中，本文所述的多特异性分子包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区包含不同的氨基酸取代。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含不含S239D和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，结合至CD96和/或TIGIT的多特异性分子包含“臼包杵”突变，其中多特异性分子包含“杵链”中的T366W突变和“臼链”中的T366S、L368A、Y407V突变，以及任选地介于CH3结构域之间的另一链间二硫桥键，其例如通过将Y349C突变引入“杵链”和E356C突变或S354C突变引入“臼链”而产生；“杵链”中的R409D、K370E突变和“臼链”中的D399K、E357K突变；“杵链”中的R409D、K370E突变和“臼链”中的D399K、E357K突变；“杵链”中的T366W突变和“臼链”中的T366S、L368A、Y407V突变；“杵链”中的R409D、K370E突变和“臼链”中的D399K、E357K突变；一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变；一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变；一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变；以及一条链中的Y349C、T366W突变和对应链中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(根据EU编号***编号)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本文所述的多特异性分子包含第一和第二重链恒定区，其中第一重链恒定区和第二重链恒定区包含臼包杵取代，且另外包含额外的氨基酸取代，所述额外的氨基酸取代在第一抗原结合区和第二抗原结合区中是不同的。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
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在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至除CD96之外的抗原(例如TIGIT，例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
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在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
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在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区。
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在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区。
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在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有T366S、L368A和Y407V突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E和T366W突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其包含特异性结合至除TIGIT之外的抗原(例如CD96，例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的第一抗原结合区和特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的第二抗原结合区，其中第一抗原结合区包含含有T366W突变、但不含S239D、A330L和I332E突变的重链恒定区，且第二抗原结合区包含含有S239D、A330L、I332E、T366S、L368A和Y407V突变的重链恒定区。
在某些实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体包含IgG4抗体的恒定区，且根据EU编号***编号的重链的氨基酸残基228的丝氨酸取代脯氨酸。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子，所述多特异性分子包含含有SEQ ID NO:49-60中的任一种的氨基酸序列的重链恒定区。
在某些实施例中，本文所述的恒定区突变或修饰中的任一个能够引入具有两个重链恒定区的本文所述多特异性分子或抗体的一个或两个重链恒定区中。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且充当拮抗剂(例如减少或抑制CD96活性)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)活性，将CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)活性减少或抑制至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96)的多特异性分子)存在下的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)活性，将CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)活性减少或抑制至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)活性的非限制性实例可包括CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)信号传导；CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)结合至其配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白；T细胞(例如表达人CD96的T细胞)的活化；自然杀手(NK)细胞的活化；Treg的减少或抑制；细胞因子(例如IL-2)产生的增加；CD155(例如人CD155)活性的增加。在具体实施例中，如实施例所述评估CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)活性的增加。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且相对于CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下对其配体的结合，将CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)对此配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白的结合减少或抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且相对于CD96(例如人CD96)在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的抗体)存在下对其配体的结合，将CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)对此配体(例如CD155(例如人或食蟹猕猴CD155)或其片段和/或融合蛋白)的结合增强至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且活化T细胞(例如表达人CD96的T细胞)。在某些实施例中，T细胞是记忆T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达CD3的原代T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达CD96的杰卡特细胞。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的NFAT活性，本文所公开的多特异性分子使活化T细胞核因子(NFAT)的活性增强至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的NFAT活性，本文所公开的多特异性分子使NFAT活性增强至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，多特异性分子在CD96配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白和/或表达CD96配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增强NFAT活性。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，多特异性分子在CD96配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白和/或表达CD96配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增加细胞因子产生(例如IL-2)。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的抗体)存在下的IL-2产生，多特异性分子使IL-2的产生增加。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的IFNγ和/或IL-2产生，所述多特异性分子单独或与抗PD-1抗体(例如帕博利珠单抗或纳武单抗)的组合使人外周血单核细胞(PBMC)响应于葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的IFNγ和/或IL-2产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下仅经SEA刺激的PBMC的IFNγ和/或IL-2产生，在特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的本文所述多特异性分子存在下经葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)的IFNγ和/或IL-2产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且增加或促进记忆T细胞的记忆回忆。在某些实施例中，记忆T细胞是CD8效应记忆T细胞。在某些实施例中，记忆T细胞是CD4效应记忆T细胞。在某些实施例中，相对于记忆T细胞与其同源抗原在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下接触时的增殖记忆T细胞数目，多特异性分子使记忆T细胞与其同源抗原接触时的增殖记忆T细胞数目增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于记忆T细胞与其同源抗原在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下接触时由记忆T细胞产生的细胞因子，当记忆T细胞与其同源抗原接触时，多特异性分子使记忆T细胞产生的细胞因子(例如IFNγ、TNFα)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)且活化NK细胞。在某些实施例中，NK细胞是分离的。在某些实施例中，NK细胞处于PBMC的混合培养物中。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的抗体)存在下的NK细胞中的CD107a表达水平，本文所公开的多特异性分子使NK细胞中的CD107a的表达水平增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的NK细胞中的CD107a表达水平，本文所公开的多特异性分子使NK细胞中的CD107a表达水平增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)，本文所公开的多特异性分子使NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)的多特异性分子)存在下的NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)，本文所公开的多特异性分子使NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且充当拮抗剂(例如减少或抑制TIGIT活性)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性，将TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性减少或抑制至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT)的多特异性分子)存在下的TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性，将TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性减少或抑制至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性的非限制性实例可包括TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)信号传导；TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)结合至其配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白；T细胞(例如表达人TIGIT的T细胞)的活化；自然杀手(NK)细胞的活化；Treg的减少或抑制；细胞因子(例如IL-2)产生的增加；CD155(例如人CD155)的活性增加。在具体实施例中，如实例中所述评估TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性的增加。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下对其配体的结合，将TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)对此配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白的结合减少或抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于TIGIT(例如人TIGIT)在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下对其配体的结合，使TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)对此配体(例如CD155(例如人或食蟹猕猴CD155)或其片段和/或融合蛋白)的结合增强至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且活化T细胞(例如表达人TIGIT的T细胞)。在某些实施例中，T细胞是记忆T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达CD3的原代T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达TIGIT的杰卡特细胞。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NFAT活性，本文所公开的多特异性分子使活化T细胞核因子(NFAT)的活性增强至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NFAT活性，本文所公开的多特异性分子使NFAT活性增强至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，多特异性分子在TIGIT配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白和/或表达TIGIT配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增强NFAT活性。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，多特异性分子在TIGIT配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白和/或表达TIGIT配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增加细胞因子产生(例如IL-2)。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下的IL-2产生，多特异性分子使IL-2的产生增加。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的IFNγ和/或IL-2产生，所述多特异性分子单独或与抗PD-1抗体(例如帕博利珠单抗或纳武单抗)的组合使人外周血单核细胞(PBMC)响应于葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的IFNγ和/或IL-2产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下仅经SEA刺激的PBMC的IFNγ和/或IL-2产生，在特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述多特异性分子存在下经葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)的IFNγ和/或IL-2产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且增加或促进记忆T细胞的记忆回忆。在某些实施例中，记忆T细胞是CD8效应记忆T细胞。在某些实施例中，记忆T细胞是CD4效应记忆T细胞。在某些实施例中，相对于记忆T细胞与其同源抗原在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下接触时的增殖记忆T细胞数目，多特异性分子使记忆T细胞与其同源抗原接触时的增殖记忆T细胞数目增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于记忆T细胞与其同源抗原在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下接触时由记忆T细胞产生的细胞因子，当记忆T细胞与其同源抗原接触时，多特异性分子使记忆T细胞产生的细胞因子(例如IFNγ、TNFα)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且活化NK细胞。在某些实施例中，NK细胞是分离的。在某些实施例中，NK细胞处于PBMC的混合培养物中。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下的NK细胞中的CD107a表达水平，本文所公开的多特异性分子使NK细胞中的CD107a表达水平增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NK细胞中的CD107a表达水平，本文所公开的多特异性分子使NK细胞中的CD107a表达水平增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)，本文所公开的多特异性分子使NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)，本文所公开的多特异性分子使NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且充当拮抗剂(例如减少或抑制CD96和TIGIT活性)。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性，使CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性减少或抑制至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96)或TIGIT(例如人TIGIT)的多特异性分子)存在下的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性，将CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性减少或抑制至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性的非限制性实例可包括CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)信号传导；CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)结合至其配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白；T细胞(例如表达人CD96和/或TIGIT的T细胞)的活化；自然杀手(NK)细胞的活化；Treg的减少或抑制；细胞因子(例如IL-2)产生的增加；CD155(例如人CD155)的活性增加。在具体实施例中，如实例中所述评估CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性的增加。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，且特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下对其配体的结合，将CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)对此配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白的结合减少或抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于CD96(例如人CD96)和TIGIT(例如人TIGIT)在任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下对其配体的结合，使CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)对其配体(例如CD155(例如人或食蟹猕猴CD155)或其片段和/或融合蛋白)的结合增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且活化T细胞(例如表达人CD96和/或人TIGIT的T细胞)。在某些实施例中，T细胞是记忆T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达CD3的原代T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达CD96和/或表达TIGIT的杰卡特细胞。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NFAT活性，本文所公开的多特异性分子使活化T细胞核因子(NFAT)的活性增强至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NFAT活性，本文所公开的多特异性分子使NFAT活性增强至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，多特异性分子在CD96和/或TIGIT配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白和/或表达CD96和/或TIGIT配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增强NFAT活性。
在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的细胞因子产生，使细胞因子产生(例如IL-2)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，多特异性分子在CD96和/或TIGIT配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白和/或表达CD96和/或TIGIT配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增加细胞因子产生(例如IL-2)。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下的IL-2产生，多特异性分子使IL-2的产生增加。
在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的IFNγ和/或IL-2产生，所述多特异性分子单独或与抗PD-1抗体(例如帕博利珠单抗或纳武单抗)的组合使人外周血单核细胞(PBMC)响应于葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的IFNγ和/或IL-2产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下仅经SEA刺激的PBMC的IFNγ和/或IL-2产生，在特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述多特异性分子存在下经葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)使IFNγ和/或IL-2产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且增加或促进记忆T细胞的记忆回忆。在某些实施例中，记忆T细胞是CD8效应记忆T细胞。在某些实施例中，记忆T细胞是CD4效应记忆T细胞。在某些实施例中，相对于记忆T细胞与其同源抗原在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下接触时的增殖记忆T细胞数目，多特异性分子使记忆T细胞与其同源抗原接触时的增殖记忆T细胞数目增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于记忆T细胞与其同源抗原在任何多特异性分子不存在下或在无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下接触时由记忆T细胞产生的细胞因子，当记忆T细胞与其同源抗原接触时，多特异性分子使记忆T细胞产生的细胞因子(例如IFNγ、TNFα)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供了一种多特异性分子，其特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且活化NK细胞。在某些实施例中，NK细胞是分离的。在某些实施例中，NK细胞处于PBMC的混合培养物中。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下的NK细胞中的CD107a表达水平，本文所公开的多特异性分子使NK细胞中的CD107a表达水平增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NK细胞中的CD107a表达水平，本文所公开的多特异性分子使NK细胞中的CD107a表达水平增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)，本文所公开的多特异性分子使NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在某些实施例中，相对于任何多特异性分子不存在下或无关的多特异性分子(例如不特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的多特异性分子)存在下的NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)，本文所公开的多特异性分子使NK细胞的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。
在某些实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)并且作为拮抗剂发挥作用(例如减弱或抑制TIGIT活性)。
在某些实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)并且通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，使TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下的TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性减弱或抑制至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)并且通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，使TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的活性相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的活性减弱或抑制至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍。TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性的非限制性实例可包括TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)信号传导；TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)结合至其配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白；T细胞(例如表达人TIGIT的T细胞)的活化；自然杀手(NK)细胞的活化；Treg的减少或抑制；细胞因子(例如IL-2)产生的增加；CD155(例如人CD155)的活性增加。在具体实施例中，TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性的增加是如实施例所描述进行评估。
在具体实施例中，本公开提供了一种经分离的抗体，其特异性结合TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)且相对于TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)在任何抗体不存在下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下对其配体的结合，将TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)对此配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白的结合减少或抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，正如利用本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估。在具体实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)并且通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，使TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)与其配体(例如CD155(例如人或食蟹猕猴CD155)或其片段和/或融合蛋白)的结合相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下TIGIT(例如人TIGIT)与这一配体的结合减少或抑制至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在具体实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)并活化T细胞(例如表达人TIGIT的T细胞)。在某些实施例中，T细胞是记忆T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达CD3的原代T细胞。在某些实施例中，T细胞是表达TIGIT的杰卡特细胞。在某些实施例中，通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，本文所公开的抗体使活化的T细胞核因子(NFAT)的活性相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下NFAT的活性增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施例中，通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，本文所公开的抗体使NFAT的活性相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下NFAT的活性增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，或更多倍。在某些实施例中，所述抗体在TIGIT配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白，和/或表达TIGIT配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增加NFAT的活性。
在具体实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)，并且通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，使细胞因子产生(例如IL-2)相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下的细胞因子产生增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在具体实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)，并且通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，使细胞因子产生(例如IL-2)相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下的细胞因子产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，或更多倍。在某些实施例中，抗体在TIGIT配体(例如CD155)或其片段和/或融合蛋白和/或表达TIGIT配体的细胞(例如单核细胞或树突状细胞)存在下增加细胞因子产生(例如IL-2)。在某些实施例中，所述抗体使IL-2的产生相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下IL-2的产生增加。
在某些实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)，并通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，单独或与抗PD-1抗体(例如帕博利珠单抗或纳武单抗)组合时使人外周血单核细胞(PBMC)中响应于葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的IFNγ和/或IL-2产生相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下IFNγ和/或IL-2的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在某些实施例中，通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，在特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述抗体存在下，用葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)的IFNγ和/或IL-2产生相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下仅用SEA刺激的PBMC中IFNγ和/或IL-2的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在某些实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)并增加或促进记忆T细胞的记忆回忆。在某些实施例中，记忆T细胞是CD8效应记忆T细胞。在某些实施例中，记忆T细胞是CD4效应记忆T细胞。在某些实施例中，通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，当使记忆T细胞与其同源抗原接触时，所述抗体使增殖的记忆T细胞的数量相对于在无任何抗体存在下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下使记忆T细胞与其同源抗原接触时增殖的记忆T细胞的数量增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在某些实施例中，通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，当使记忆T细胞与其同源抗原接触时，所述抗体使记忆T细胞中细胞因子(例如、TNFα)的产生相对于在无任何抗体存在下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下使记忆T细胞与其同源抗原接触时记忆T细胞中细胞因子的产生增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
在某些实施例中，本公开提供一种分离的抗体，所述抗体特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)并活化NK细胞。在某些实施例中，NK细胞是分离的。在某些实施例中，NK细胞处于PBMC的混合培养物中。在某些实施例中，通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，本文所公开的抗体使NK细胞中CD107a的表达水平相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下NK细胞中CD107a的表达水平增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施例中，通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，本文所公开的抗体使NK细胞中CD107a的表达水平相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下NK细胞中CD107a的表达水平增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，或更多倍。在某些实施例中，通过本文所述或本领域技术人员已知的方法所评估，本文所公开的抗体使NK细胞中的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下NK细胞中的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施例中，通过本文所述和/或本领域技术人员已知的方法所评估，本文所公开的抗体使NK细胞中的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)相对于在无任何抗体情况下或在无关抗体(例如不特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体)存在下NK细胞中的细胞因子产生(例如IFNγ和/或TNFα)增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，或更多倍。
7.3药物组合物
本文提供了组合物，其包含具有期望纯度的本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体于生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂中(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且包括包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵(benzalkonium chlorid)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚(catechol)；间苯二酚(resorcinol)；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一个具体实施例中，药物组合物包含本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体以及任选地一种或多种额外的预防剂或治疗剂于药学上可接受的载剂中。在一个具体实施例中，药物组合物包含有效量的本文抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体以及任选地一种或多种额外的预防剂或治疗剂于药学上可接受的载剂中。在某些实施例中，多特异性分子或抗体是药物组合物中所含的唯一活性成分。本文所述的药物组合物可适用于增强或促进CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)活性和治疗病状，例如癌症或感染性疾病。在某些实施例中，本发明涉及用作药剂的本发明药物组合物，其包含本发明的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体。在另一实施例中，本发明涉及一种用于用于在治疗癌症或感染性疾病的方法中使用的本发明的药物组合物。
用于肠胃外制剂中的药学上可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequestering/chelating agent)和其它药学上可接受的物质。水性媒剂的实例包括氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、右旋糖和乳酸林格氏注射液(Lactated Ringers Injection)。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂添加到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述多剂量容器包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞(thimerosal)、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的螯合剂包括EDTA。药物载剂还包括用于水可混溶媒剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
药物组合物可以针对受试者的任何施用途径进行配制。施用途径的具体实例包括鼻内、口服、经肺、透皮、皮内和肠胃外。本文还涵盖以皮下、肌肉内或静脉内注射为特征的肠胃外施用。可注射物可以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液、适用于在注射之前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式，或作为乳剂。可注射物、溶液和乳剂也含有一种或多种赋形剂。适合的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，待施用的药物组合物还可以含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂和其它此类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
用于肠胃外施用多特异性分子或抗体的制剂包含准备注射的无菌溶液；准备在临用前与溶剂合并的无菌干燥可溶性产品，例如冻干粉末，包括皮下注射片剂；准备注射的无菌悬浮液；准备在临用前与媒剂合并的无菌干燥不溶性产品，以及无菌乳剂。溶液可以是水性或非水性的。
如果静脉内施用，则合适的载剂包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂(诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇以及它们的混合物)的溶液剂。
如关于局部和全身施用所述制备包含抗体的局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳剂等，并且可以配制成乳膏、凝胶、软膏、乳剂、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、膏剂、泡沫、气溶胶、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或适合于局部施用的任何其它配方。
本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体能够被配制成局部施用的气溶胶，例如通过吸入(参见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述用于递送适用于治疗发炎疾病、特别是哮喘的类固醇的气溶胶，且所述专利以全文引用的方式并入本文中)。用于施用至呼吸道的这些配制物可以呈用于喷雾器的气溶胶或溶液的形式，或作为用于吹入的微细粉末，单独或与惰性载体(例如乳糖)组合。在此类情况下，配制物的颗粒在某些实施例中将具有小于50微米的直径，在某些实施例中具有小于10微米的直径。
本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体能够被调配成以凝胶、乳膏和洗剂形式局域或局部施用，例如局部施用于皮肤和粘膜，例如眼睛，以及施用于眼睛或脑池内或脊柱内施用。局部施用被考虑用于透皮递送，也用于向眼睛或粘膜施用，或用于吸入疗法。还可以单独施用抗体的鼻腔溶液或与其它药学上可接受的赋形剂组合施用。
透皮贴剂，包括离子电渗和电泳装置，是本领域的技术人员熟知的，可用于施用抗体。例如，此类贴片公开于美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中，所述专利全部以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施例中，包含本文所述的多特异性分子或抗体的药物组合物是冻干粉末，所述冻干粉末可以复水成溶液、乳剂和其它混合物施用。其还可复水且配制为固体或凝胶。通过将本文所述的多特异性分子或抗体或其药学上可接受的衍生物溶解在适合的溶剂中来制备冻干粉末。在某些实施例中，冻干粉末是无菌的。溶剂可含有赋形剂，其改善由粉末制备的粉末或复水溶液的稳定性或其它药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它适合的试剂。溶剂还可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾，或本领域技术人员已知的在某些实施例中呈约中性pH的其它此类缓冲剂。随后对溶液进行除菌过滤，随后在本领域技术人员已知的标准条件下进行冻干，提供了所需配方。在某些实施例中，将所得溶液分配到小瓶中以用于冻干。每瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。冻干粉末可存储在适当条件下，例如约4℃至室温。用注射用水复水这种冻干粉末提供了用于肠胃外施用的配方。为了复水，将冻干粉末添加至无菌水或其它合适的载体中。精确量取决于所选择的化合物。此量可以凭经验确定。
本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子和经分离的抗TIGIT抗体和本文所提供的其它组合物还可以被配制成靶向待治疗的受试者身体的特定组织、受体或其它区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员众所周知的。本文考虑用于本发明的组合物中的所有此类靶向方法。关于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874，所有这些专利均以引用的方式整体并入本文中。在一个具体实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体靶向肿瘤。
用于体内施用的组合物可以是无菌的。这很容易通过例如无菌过滤膜过滤来实现。
7.4使用方法和用途
在另一方面，本公开提供了一种使用本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子和经分离的抗TIGIT抗体治疗受试者的方法。受益于CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)功能减少的受试者的任何疾病或病症能够使用本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子和经分离的抗TIGIT抗体治疗。在某些实施例中，疾病或病症对检查点靶向剂(例如拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗PD-L1抗体、拮抗性抗PD-L2抗体或拮抗性抗PD-1抗体)具有耐受性。在某些实施例中，疾病或病症在用检查点靶向剂(例如拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗PD-L1抗体、拮抗性抗PD-L2抗体或拮抗性抗PD-1抗体)治疗后复发。
本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子和经分离的抗TIGIT抗体特别适用于抑制免疫***对肿瘤的耐受性，且因此可用作患有癌症的受试者的免疫疗法。举例来说，在某些实施例中，本公开提供了一种增强受试者中的响应于抗原的T细胞(例如CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞、NKT细胞、效应T细胞或记忆T细胞)活化的方法，所述方法包括将有效量的如本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其药物组合物施予受试者。在某些实施例中，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物施予受试者。
能够用本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或药物组合物治疗的癌症包括但不限于实体肿瘤、血液学癌症(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)和转移病灶。在某些实施例中，癌症是实体瘤。实体瘤的实例包括恶性肿瘤，例如肉瘤和癌，例如各种器官***的腺癌，诸如影响肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠(例如结肠)、***、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮、膀胱细胞、***)、咽、CNS(例如脑细胞、神经细胞或神经胶质细胞)、头颈部、皮肤(例如黑色素瘤)和胰腺的那些腺癌，以及包括恶性肿瘤的腺癌，例如结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、小肠癌和食道癌。癌症可以处于早期、中期、晚期或可以是转移性癌症。在某些实施例中，癌症对检查点靶向剂(例如拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗PD-L1抗体、拮抗性抗PD-L2抗体或拮抗性抗PD-1抗体)具有耐受性。在某些实施例中，癌症在用检查点靶向剂(例如拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗PD-L1抗体、拮抗性抗PD-L2抗体或拮抗性抗PD-1抗体)治疗后复发。
在某些实施例中，癌症选自肺癌(例如肺腺癌或非小细胞肺癌(NSCLC)(例如具有鳞状和/或非鳞状组织学的NSCLC，或NSCLC腺癌))、黑色素瘤(例如晚期黑色素瘤)、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、***癌、乳腺癌(例如不表达***受体、孕酮受体或Her2/neu中的一者、两者或全部的乳腺癌，例如三阴性乳腺癌)、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌(例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、***癌、胃食管癌(例如食管鳞状细胞癌)、间皮瘤、鼻咽癌、甲状腺癌、子***、上皮癌、腹膜癌或淋巴增生性疾病(例如移植后淋巴增生性疾病)。在一个具体实施例中，癌症是***。
在某些实施例中，癌症是血液癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在某些实施例中，癌症是白血病，例如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性成骨髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或毛细胞白血病。在某些实施例中，癌症是淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞样(ABC)弥漫性大B细胞淋巴瘤、生发中心B细胞(GCB)弥散性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、复发性非霍奇金氏淋巴瘤、难治性非霍奇金氏淋巴瘤、复发性滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤或结外边缘区淋巴瘤。在某些实施例中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
在另一个实施例中，癌症选自癌瘤(例如晚期或转移性癌)、黑色素瘤或肺癌(例如非小细胞肺癌)。
在某些实施例中，癌症是肺癌，例如肺腺癌、非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
在某些实施例中，癌症是黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。在某些实施例中，癌症是对其它疗法无反应的晚期或不可切除性黑色素瘤。在其它实施例中，癌症是具有BRAF突变(例如BRAF V600突变)的黑色素瘤。在又其它实施例中，在抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗(ipilimumab))联合或不联合BRAF抑制剂(例如维罗非尼(vemurafenib)或达拉非尼(dabrafenib))治疗之后，施予本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子、经分离的抗TIGIT抗体或药物组合物。
在另一个实施例中，癌症是伴有或不伴有病毒感染(例如慢性病毒性肝炎)的肝癌(例如晚期肝癌)。
在另一个实施例中，癌症是***癌，例如晚期***癌。
在又一个实施例中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。
在又一个实施例中，癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如转移性RCC、透明细胞肾细胞癌(CCRCC)或肾***状细胞癌)。
在又一个实施例中，癌症选自肺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、白血病或癌症的转移性病变。
在某些实施例中，本公开提供了一种预防或治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括将有效量的如本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其药物组合物施予受试者。在某些实施例中，本文提供用于预防和/或治疗感染(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染或寄生虫感染)的方法。根据所述方法预防和/或治疗的感染可以由本文鉴定的传染原引起。在一个具体实施例中，本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其组合物是施予受试者的唯一活性剂。在某些实施例中，本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其组合物与抗感染干预(例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂或抗蠕虫剂)组合使用以治疗感染性疾病。因此，在一个实施例中，本发明涉及本发明的多特异性分子或抗体和/或药物组合物，其用于预防和/或治疗感染性疾病的方法中，任选地其中抗体或药物组合物是施予受试者的唯一活性剂，或其中抗体或药物组合物与抗感染干预组合使用。
能够用本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子、经分离的抗TIGIT抗体或药物组合物治疗和/或预防的感染性疾病是由包括但不限于细菌、寄生虫、真菌、原虫和病毒的传染原引起。在一个具体实施例中，用本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子、经分离的抗TIGIT抗体或药物组合物治疗和/或预防的感染性疾病是由病毒引起。能够根据本文所述的方法预防和/或治疗的病毒性疾病或病毒感染包括但不限于由以下引起的病毒性疾病或病毒感染：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感(例如甲型流感或乙型流感)、水痘、腺病毒、I型单纯疱疹(HSV-I)、II型单纯疱疹(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、埃可病毒(echovirus)、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、***瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘状病毒、虫媒病毒、汉坦病毒(huntavirus)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus)、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)以及例如病毒性脑膜炎、脑炎、登革热(dengue)或天花等病毒性疾病传染原。
能够预防和/或治疗的细菌感染包括由大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、草绿色葡萄球菌和铜绿假单胞菌引起的感染。能够根据本文所述的方法预防和/或治疗的由细菌(例如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、普通变形杆菌、草绿色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)引起的细菌性疾病包括但不限于立克次氏体、支原体、奈瑟氏菌、肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体(莱姆病)、炭疽杆菌(炭疽)、破伤风、链球菌、葡萄球菌、分枝杆菌、百日咳、霍乱、鼠疫、白喉、衣原体、金黄色葡萄球菌和军团菌。
能够根据本文所述的方法预防和/或治疗的由原虫引起的原虫疾病或原虫感染包括但不限于利什曼原虫病(leishmania)、球虫病(coccidiosis)、锥虫血吸虫病(trypanosoma schistosoma)或疟疾。能够根据本文描述的方法预防和/或治疗的由寄生虫引起的寄生虫病或寄生虫感染包括但不限于衣原体和立克次氏体。
可以根据本文所述的方法预防和/或治疗的真菌疾病或真菌感染包括但不限于由念珠菌感染、接合菌病、念珠菌乳腺炎、伴有潜伏性毛孢菌病的进行性播散性毛孢菌病、播散性念珠菌病、肺类球孢子菌病、肺曲霉病、卡氏肺孢子菌肺炎、隐球菌性脑膜炎、球孢子脑膜炎和脑脊髓血管炎、黑曲霉感染、镰刀菌角膜炎、副鼻窦真菌病、烟曲霉心内膜炎、胫骨软骨发育不全、光滑念珠菌***炎、口咽念珠菌症、X连锁慢性肉芽肿病、足癣、皮肤念珠菌病、霉菌性胎盘炎、播散性毛孢菌病、过敏性支气管肺曲霉病、霉菌性角膜炎、新型隐球菌感染、真菌性腹膜炎、弯曲菌感染、葡萄球菌性眼内炎、毛癣菌病和皮肤癣菌病引起的那些。
在某些实施例中，这些方法还包括将另外的治疗剂施予受试者。在某些实施例中，另外的治疗剂是化疗剂、放疗剂或检查点靶向剂。在某些实施例中，化疗剂是低甲基化剂(例如阿扎胞苷)。在某些实施例中，化疗剂是DNA损伤诱导剂(例如吉西他滨)。在某些实施例中，检查点靶向剂选自由以下各项组成的组：拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗PD-L1抗体、拮抗性抗PD-L2抗体、拮抗性抗PD-1抗体、拮抗性抗TIM-3抗体、拮抗性抗LAG-3抗体、拮抗性抗VISTA抗体、激动性抗CD96抗体、拮抗性抗CEACAM1抗体、拮抗性抗CD137抗体、激动性抗GITR抗体和激动性抗OX40抗体。在某些实施例中，检查点靶向剂选自由以下各项组成的组：拮抗性抗CTLA-4抗体、拮抗性抗PD-L1抗体、拮抗性抗PD-L2抗体和拮抗性抗PD-1抗体，其中本文公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗体或药物组合物与检查点靶向剂协同作用。
在某些实施例中，本发明涉及用于本发明方法中的本发明多特异性分子、抗体和/或药物组合物，其中所述方法进一步包括向受试者施予另一种治疗剂。在某些实施例中，本发明涉及(a)本发明的多特异性分子、抗体和/或药物组合物，以及(b)用作药剂的另一种治疗剂。在某些实施例中，本发明涉及(a)本发明的多特异性分子、抗体和/或药物组合物，以及(b)用于治疗癌症的方法中的另一种治疗剂。在另一个实施例中，本发明涉及一种药物组合物、试剂盒或成套试剂盒，其包含(a)本发明的多特异性分子或抗体和/或药物组合物，以及(b)另一种治疗剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是化疗剂、放疗剂或检查点靶向剂。
在某些实施例中，抗PD-1抗体被用于本文所公开的方法。在某些实施例中，抗PD-1抗体是Bristol-Myers Squibb开发的纳武单抗(nivolumab)，也称为BMS-936558或MDX1106。在某些实施例中，抗PD-1抗体是Merck&Co.开发的帕博利珠单抗(pembrolizumab)，也称为兰布鲁珠单抗(lambrolizumab)或MK-3475。在某些实施例中，抗PD-1抗体是CureTech开发的皮地利珠单抗(pidilizumab)，也称为CT-011。在某些实施例中，抗PD-1抗体是由Medimmune开发的MEDI0680，又称为AMP-514。在某些实施例中，抗PD-1抗体是Novartis Pharmaceuticals开发的PDR001。在某些实施例中，抗PD-1抗体是Regeneron Pharmaceuticals开发的REGN2810。在某些实施例中，抗PD-1抗体是Pfizer开发的PF-06801591。在某些实施例中，抗PD-1抗体是BeiGene开发的BGB-A317。在某些实施例中，抗PD-1抗体是AnaptysBio和Tesaro开发的TSR-042。在某些实施例中，抗PD-1抗体是恒瑞开发的SHR-1210。
可以用于本文所公开的治疗方法的抗PD-1抗体的其它非限制性实例公开于以下专利和专利申请中，所有这些专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文用于所有目的：美国专利号6,808,710、美国专利号7,332,582、美国专利号7,488,802、美国专利号8,008,449、美国专利号8,114,845、美国专利号8,168,757、美国专利号8,354,509、美国专利号8,686,119、美国专利号8,735,553、美国专利号8,747,847、美国专利号8,779,105、美国专利号8,927,697、美国专利号8,993,731、美国专利号9,102,727、美国专利号9,205,148、美国公开号US2013/0202623 A1、美国公开号US2013/0291136A1、美国公开号US2014/0044738 A1、美国公开号US2014/0356363 A1、美国公开号US2016/0075783 A1以及PCT公开号WO 2013/033091 A1、PCT公开号WO 2015/036394 A1、PCT公开号WO 2014/179664 A2、PCT公开号WO 2014/209804A1、PCT公开号WO 2014/206107A1、PCT公开号WO 2015/058573A1、PCT公开号WO 2015/085847 A1、PCT公开号WO 2015/200119A1、PCT公开号WO 2016/015685A1和PCT公开号WO 2016/020856A1。
在某些实施例中，抗PD-L1抗体被用于本文所公开的方法。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是Genentech开发的阿特珠单抗(atezolizumab)。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是由AstraZeneca、Celgene和MedImmune开发的德瓦鲁单抗(durvalumab)。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是Merck Serono和Pfizer开发的阿维鲁单抗(avelumab)，也称为MSB0010718C。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是Bristol-Myers Squibb开发的MDX-1105。在某些实施例中，抗PD-L1抗体是Amplimmune和GSK开发的AMP-224。
可以用于本文所公开的治疗方法的抗PD-L1抗体的非限制性实例公开于以下专利和专利申请中，所有这些专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文用于所有目的：美国专利号7,943,743；美国专利号8,168,179；美国专利号8,217,149；美国专利号8,552,154；美国专利号8,779,108；美国专利号8,981,063；美国专利号9,175,082；美国公开号US2010/0203056 A1；美国公开号U.S.2003/0232323A1；美国公开号U.S.2013/0323249A1；美国公开号U.S.2014/0341917A1；美国公开号U.S.2014/0044738A1；美国公开号U.S.2015/0203580A1；美国公开号U.S.2015/0225483A1；美国公开号U.S.2015/0346208A1；美国公开号U.S.2015/0355184A1；以及PCT公开号WO 2014/100079A1；PCT公开号WO 2014/022758A1；PCT公开号WO 2014/055897A2；PCT公开号WO 2015/061668 A1；PCT公开号WO 2015/109124A1；PCT公开号WO 2015/195163 A1；PCT公开号WO 2016/000619A1；和PCT公开号WO2016/030350 A1。
在某些实施例中，抗CTLA-4抗体被用于本文所公开的方法。在某些实施例中，抗CTLA-4抗体是Bristol-Myers Squibb开发的伊匹单抗。
在某些实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与靶向免疫调节酶的化合物组合施予受试者，免疫调节酶例如IDO(吲哚胺-(2,3)-双加氧酶)和/或TDO(色氨酸2,3-双加氧酶)。因此，在某些实施例中，另外的治疗剂是靶向免疫调节酶的化合物如吲哚胺-(2,3)-双加氧酶(IDO)的抑制剂。在某些实施例中，此类化合物选自由以下各项组成的组：艾卡哚司他(Incyte Corp；参见，例如，WO 2010/005958，该文献以引用的方式整体并入本文)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(NewLinkGenetics)和NLG919(NewLink Genetics)。在某些实施例中，化合物是艾卡哚司他。在另一个实施例中，化合物是F001287。在另一个实施例中，化合物是吲哚莫德。在另一个实施例中，化合物是NLG919。在一个具体实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与用于治疗癌症的IDO抑制剂组合施予受试者。本文所述的用于治疗癌症的IDO抑制剂存在于药物组合物的固体剂型，例如片剂、丸剂或胶囊中，其中所述药物组合物包括IDO抑制剂和药学上可接受的赋形剂。因此，如本文所述的多特异性分子或抗体和如本文所述的IDO抑制剂能够作为单独的剂型分开、依序或同时施予。在某些实施例中，肠胃外施予多特异性分子或抗体，且口服施予IDO抑制剂。在某些实施例中，抑制剂选自由以下组成的组：艾卡哚司他(Incyte Corporation)、F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb)、吲哚莫德(NewLink Genetics)和NLG919(NewLink Genetics)。艾卡哚司他已经在PCT公开号WO 2010/005958中有所描述，该公开以引用的方式整体并入本文用于所有目的。在某些实施例中，抑制剂是艾卡哚司他。在另一个实施例中，抑制剂是F001287。在另一个实施例中，抑制剂是吲哚莫德。在另一个实施例中，抑制剂是NLG919。
在某些实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与疫苗组合施予受试者。疫苗可以是例如肽疫苗、DNA疫苗或RNA疫苗。在某些实施例中，疫苗是基于热休克蛋白的肿瘤疫苗或基于热休克蛋白的病原体疫苗。在一个具体实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与基于热休克蛋白的肿瘤疫苗组合施予受试者。热休克蛋白(HSP)是在所有物种中普遍存在的高度保守蛋白的家族。由于热休克或者包括暴露于毒素、氧化应激或葡萄糖剥夺在内的其它形式的应激，热休克蛋白的表达可以有力地诱导到高得多的水平。根据分子量可分为五个家族：HSP-110、HSP-90、HSP-70、HSP-60和HSP-28。HSP通过抗原呈递细胞(APC)诸如巨噬细胞和树突细胞(DC)中的交叉呈递途径递送免疫原性肽，从而导致T细胞活化。HSP充当肿瘤相关抗原肽的分子伴侣载体，形成能够诱导肿瘤特异性免疫的复合物。在从垂死的肿瘤细胞中释放出来后，HSP-抗原复合物被抗原呈递细胞(APC)吸收，其中抗原被加工成结合MHC I类和II类分子的肽，从而活化抗肿瘤CD8+和CD4+T细胞。来源于肿瘤制剂的HSP复合物引发的免疫特异性针对每个受试者的癌症表达的独特抗原肽库。因此，在某些实施例中，本发明涉及(a)本发明的多特异性分子、抗体和/或药物组合物，以及(b)疫苗，其用作药剂，例如用于治疗癌症的方法中。在某些实施例中，本发明涉及一种药物组合物、试剂盒或成套试剂盒，其包含(a)本发明的多特异性分子、抗体和/或药物组合物，以及(b)疫苗。在某些实施例中，疫苗是基于热休克蛋白的肿瘤疫苗。在某些实施例中，疫苗是基于热休克蛋白的病原体疫苗。在某些实施例中，疫苗如WO 2016/183486所述，该专利以引用的方式整体并入本文。
热休克蛋白肽复合物(HSPPC)是由与抗原肽非共价复合的热休克蛋白组成的蛋白质肽复合物。HSPPC引发先天性和适应性免疫应答。在一个具体实施例中，抗原肽显示出对正在治疗的癌症的抗原性。HSPPC通过膜受体(主要是CD91)或通过与Toll样受体结合被APC有效捕获。HSPPC内化导致APC功能成熟，产生趋化因子和细胞因子，从而活化自然杀伤细胞(NK)、单核细胞以及Th1和Th-2介导的免疫应答。在某些实施例中，本文所公开的方法中使用的HSPPC包括来自与抗原肽复合的应激蛋白的hsp60、hsp70或hsp90家族的一种或多种热休克蛋白。在某些实施例中，HSPPC包括hsc70、hsp70、hsp90、hsp110、grp170、gp96、钙网蛋白或它们的两种或更多种的组合。
在一个具体实施例中，热休克蛋白肽复合物(HSPPC)包含重组热休克蛋白(例如hsp70或hsc70)或其与重组抗原肽复合的肽结合区。重组热休克蛋白可以通过重组DNA技术产生，例如，使用Dworniczak和Mirault,Nucleic Acids Res.15:5181-5197(1987)和GenBank登录号P11142和/或Y00371描述的人hsc70序列，这些文献中的每个均以引用的方式整体并入本文。在某些实施例中，Hsp70序列如Hunt和MorimotoProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(19),6455-6459(1985)和GenBank登录号P0DMV8和/或M11717所述，这些文献中的每个均以引用的方式整体并入本文。抗原肽也可以通过本领域已知的重组DNA方法制备。
在某些实施例中，抗原肽包含经修饰的氨基酸。在某些实施例中，经修饰的氨基酸包含翻译后修饰。在某些实施例中，经修饰的氨基酸包含翻译后修饰的模拟物。在某些实施例中，经修饰的氨基酸是已经在侧链羟基或胺上磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His。在某些实施例中，经修饰的氨基酸是已经在侧链羟基或胺上磷酸化的Tyr、Ser、Thr、Arg、Lys或His氨基酸的模拟物。
在一个具体实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与热休克蛋白肽复合物(HSPPC)组合施予受试者以治疗癌症，所述热休克蛋白肽复合物例如热休克蛋白肽复合物-96(HSPPC-96)。HSPPC-96包含与抗原肽复合的96kDa热休克蛋白(Hsp)gp96。HSPPC-96是一种癌症免疫疗法，由受试者的肿瘤制成，包含癌症的抗原“指纹”。在某些实施例中，该指纹包含仅存在于该特定受试者的特定癌细胞中的独特抗原，并且疫苗的注射旨在刺激受试者的免疫***以识别和攻击具有特定癌症指纹的任何细胞。因此，在某些实施例中，本发明涉及本发明的抗体和/或药物组合物与热休克蛋白肽复合物(HSPPC)的组合，其用作药剂和/或用于治疗癌症的方法中。
在某些实施例中，HSPPC，例如HSPPC-96，由受试者的肿瘤组织产生。在一个具体实施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)由所治疗的癌症类型或其转移的肿瘤产生。在另一个具体实施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)对于被治疗的受试者是自体的。在某些实施例中，肿瘤组织是非坏死肿瘤组织。在某些实施例中，至少1克(例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10克)非坏死肿瘤组织被用于产生疫苗方案。在某些实施例中，在手术切除后，非坏死肿瘤组织在用于疫苗制备之前被冷冻。在某些实施例中，HSPPC，例如HSPPC-96，通过纯化技术从肿瘤组织中分离、过滤并制备用于注射用疫苗。在某些实施例中，将6-12剂HSPPC，例如HSPCC-96施予受试者。在这些实施例中，HSPPC(例如HSPPC-96)剂量可以针对前4个剂量每周施用，然后对于2-8个附加剂量每两周施用一次。
可以根据本文所述的方法使用的HSPPC的其它实例在以下专利和专利申请中公开，所有这些专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文：美国专利号6,391,306、6,383,492、6,403,095、6,410,026、6,436,404、6,447,780、6,447,781和6,610,659。
在某些实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与佐剂组合施予受试者。根据治疗情况，可以使用各种佐剂。适合佐剂的非限制性实例包括但不限于完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund'sAdjuvant，IFA)、montanide ISA(不完全赛比克佐剂(incomplete Seppic adjuvant))、Ribi佐剂***(RAS)、Titer Max、胞壁酰肽、Syntex佐剂配制物(SAF)、明矾(氢氧化铝和/或磷酸铝)、铝盐佐剂、佐剂、硝酸纤维素吸附抗原、被囊封或包埋的抗原、3脱O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)、免疫刺激性寡核苷酸、toll样受体(TLR)配体、甘露聚糖结合凝集素(MBL)配体、STING激动剂、免疫刺激复合物，如皂苷、Quil A、QS-21、QS-7、ISCOMATRIX等等。其它佐剂包括CpG寡核苷酸和双链RNA分子，诸如多聚(a)和多聚(U)。还可以使用上述佐剂的组合。参见，例如，美国专利号6,645,495；7,029,678；和7,858,589，所有这些专利均以引用的方式整体并入本文。在某些实施例中，本文所使用的佐剂是QS-21STIMULON。
在某些实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与包含TCR的另一种治疗剂组合施予受试者。在某些实施例中，另外的治疗剂是可溶性TCR。在某些实施例中，另外的治疗剂是表达TCR的细胞。因此，在某些实施例中，本发明涉及本发明的多特异性分子、抗体和/或药物组合物与包含TCR的另一种治疗剂的组合，其用作药剂和/或用于治疗癌症的方法中。
在某些实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞组合施予受试者。在某些实施例中，细胞是T细胞。
在某些实施例中，本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与TCR模拟抗体组合施予受试者。在某些实施例中，TCR模拟抗体是特异性结合至肽-MHC复合物的抗体。对于TCR模拟抗体的非限制性实例，参见例如美国专利号9,074,000和美国公开号US 2009/0304679A1和US2014/0134191 A1，所有这些专利均以引用的方式整体并入本文。
在某些实施例中，将本文所公开的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与双特异性T细胞接合体(BiTE)(例如WO2005061547A2中所述，其以全文引用的方式并入本文中)和/或双重亲和力再靶向抗体(DART)(例如WO2012162067A2中所述，其以全文引用的方式并入本文中)组合施予受试者。在某些实施例中，BiTE和/或DART特异性结合至肿瘤相关抗原(例如在肿瘤中过表达的多肽、来源于肿瘤病毒的多肽、包含对肿瘤特异的翻译后修饰的多肽、多肽在肿瘤中特异性突变)和效应细胞上的分子(例如CD3或CD16)。在某些实施例中，肿瘤相关抗原是EGFR(例如人EGFR)，任选地其中BiTE和/或DART包含西妥昔单抗的VH和VL序列。在某些实施例中，肿瘤相关抗原是Her2(例如人Her2)，任选地其中BiTE和/或DART包含曲妥珠单抗的VH和VL序列。在某些实施例中，肿瘤相关抗原是CD20(例如人CD20)。
抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体和额外治疗剂(例如化学治疗剂、放射性治疗剂、检查点靶向剂、IDO抑制剂、疫苗、佐剂、可溶性TCR、表达TCR的细胞、表达嵌合抗原受体的细胞，和/或TCR模拟抗体)能够作为单独的剂型分开、依序或同时施予。在某些实施例中，肠胃外施予抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体，且经口施予IDO抑制剂。
本文所述的抗体或药物组合物可通过多种途径递送至受试者。这些包括但不限于肠胃外、鼻内、气管内、口服、皮内、局部、肌肉内、腹膜内、透皮、静脉内、肿瘤内、结膜、动脉内和皮下途径。还可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，以及与雾化剂一起用作喷雾剂的制剂。在某些实施例中，皮下或静脉内递送本文所述的多特异性分子、抗体或药物组合物。在某些实施例中，动脉内递送本文所述的多特异性分子、抗体或药物组合物。在某些实施例中，瘤内递送本文所述的多特异性分子、抗体或药物组合物。在某些实施例中，将本文所述的多特异性分子、抗体或药物组合物递送到肿瘤引流***中。
有效治疗和/或预防病状的多特异性分子、抗体或组合物的量将取决于疾病的性质，并且能够通过标准临床技术确定。
组合物中所采用的精确剂量还将取决于施用途径和感染或由其引起的疾病的严重性，并且应根据从业人员的判断和每名受试者的情况来决定。例如，有效剂量也可以因给药方式、靶点、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康)、患者是人还是动物、所用的其它药物或治疗是否为预防性或治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗非人哺乳动物(包括转基因哺乳动物)。最佳滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。
还能够使用本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体，使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，包括免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫沉淀或蛋白质印迹法，分析生物样品中的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)蛋白质水平。合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括酶标记，诸如、葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，诸如鲁米诺；和荧光标记，诸如荧光素和罗丹明以及生物素。此类标记能够用于标记本文所述的多特异性分子或抗体。或者，本文所述的识别抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体的第二多特异性分子或抗体能够被标记并且与抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体组合使用，以检测CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)蛋白质水平。因此，在某些实施例中，本发明涉及本发明的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体用于试管内检测生物样品中的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)蛋白质的用途。在另一个实施例中，本发明涉及本发明的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体用于试管内分析和/或检测生物样品中的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)蛋白质水平，任选地，其中抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体与放射性核素或可检测标记缀合且/或携带本文所述的标记，且/或其中使用免疫组织学方法。
分析CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)蛋白质的表达水平旨在包括直接地(例如通过测定或估算绝对蛋白质水平)或相对地(例如通过与第二生物样品中的疾病相关蛋白质水平进行比较)定性或定量测量或估算第一生物样品中的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)蛋白质水平。能够测量或估算第一生物样品中的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多肽表达水平，并且与标准CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)蛋白质水平进行比较，所述标准取自例如从不患有病症的个体获得的第二生物样品或通过将不患有病症的个体群体的水平平均化来测定。如所属领域中将了解，一旦“标准”CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多肽水平已知，则其能够重复地用作比较标准。因此，在另一个实施例中，本发明涉及一种用于试管内分析和/或检测生物样品中的CD96和/或TIGIT蛋白质水平、例如人CD96和/或TIGIT蛋白水平的方法，包括利用免疫组织学方法定性地或定量地测量或估算生物样品中的CD96和/或TIGIT蛋白、例如人CD96和/或TIGIT蛋白的水平。
如本文所用，术语「生物样品」是指从潜在地表达CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的受试者、细胞系、组织或其它细胞来源获得的任何生物样品。从动物(例如人或食蟹猕猴)获得组织活检和体液的方法在本领域中是熟知的。生物样品包括外周血单核细胞(PBMC)。
本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体能够用于预后、诊断、监测和筛选应用，包括本领域技术人员众所周知的和标准的以及基于本说明书的试管内和体内应用。用于试管内评估和评价免疫***状态和/或免疫反应的预后、诊断、监测和筛选分析和试剂盒可以用于预测、诊断和监测以评价患者样品，包括已知具有或怀疑具有免疫***功能异常的那些样品，或评价预期或期望的免疫***反应、抗原反应或疫苗反应。相对于不同的试剂或抗体，免疫***状态和/或免疫应答的评估和评价也可用于确定患者是否适合进行药物临床试验或施用特定化疗剂、放疗剂或抗体，包括它们的组合。这种类型的预后和诊断监测和评估已经在实践中利用针对乳腺癌中HER2蛋白的抗体(HercepTestTM，Dako)，其中该测定还用于评估患者使用的抗体治疗。体内应用包括定向细胞治疗和免疫***调节以及免疫应答的放射成像。因此，在某些实施例中，本发明涉及一种用作诊断剂的本发明抗CD96抗体和/或药物组合物。在某些实施例中，本发明涉及本发明的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体和/或药物组合物，其用于预测、诊断和/或监测具有或怀疑具有免疫***功能异常的受试者和/或受试者的预期或期望免疫***反应、抗原反应或疫苗反应的方法中。在另一个实施例中，本发明涉及本发明的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体的用途，其通过在试管内分析和/或检测受试者的生物样品中的人CD96和/或人TIGIT蛋白水平而用于预测、诊断和/或监测具有或怀疑具有免疫***功能异常的受试者和/或受试者的预期或期望免疫***反应、抗原反应或疫苗反应。
在某些实施例中，抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体能够用于对活检样品进行免疫组织化学。在某些实施例中，所述方法是一种试管内方法。在另一个实施例中，抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体能够用于检测CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的水平，或膜表面上含有CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的细胞的水平，然后将所述水平与某些疾病症状关联。本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子和经分离的抗TIGIT抗体可携带可检测标记或功能标记且/或可与放射性核素或可检测标记缀合。当使用荧光标记时，目前可用的显微镜和荧光活化细胞分选仪分析(FACS)或本领域已知的两种方法程序的组合可用于鉴定和定量特异性结合成员。本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子和经分离的抗TIGIT抗体可携带或可与荧光标记缀合。示例性荧光标记包括例如反应性和缀合探针，例如氨基香豆素、荧光素和德克萨斯红、Alexa Fluor染料、Cy染料和DyLight染料。抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体可携带或可缀合到放射性标记或放射性核素，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。当使用放射性标记时，可利用所属领域中已知的当前可利用的计数程序鉴定和定量抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子对CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的特异性结合，或经分离的抗TIGIT抗体对TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的特异性结合。在标记是酶的情况下，可以通过本领域已知的任何目前使用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流分析法或气体分析法来完成检测。这能够如下实现：在允许抗CD96和/或抗TIGIT多特异性分子与CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)之间或抗TIGIT抗体与TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)之间形成复合物的条件下，使样品或对照样品与抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体接触。检测样品和对照组中的抗CD96和/或抗TIGIT多特异性分子与CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)之间或抗TIGIT抗体与TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)之间所形成的任何复合物且进行比较。鉴于本文所述的多特异性分子对CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的特异性结合以及本文所述的抗TIGIT抗体对TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的特异性结合，因此多特异性分子能够用于特异性检测细胞表面上的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)表达，并且抗TIGIT抗体能够用于特异性检测TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。本文所述的抗CD96和/或抗TIGIT多特异性分子还能够通过免疫亲和纯化用于纯化CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。本文所述的抗TIGIT抗体还可以用于经由免疫亲和纯化来纯化TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。本文还包括一种分析***，其可制备成测试试剂盒、试剂盒或成套试剂盒形式，用于定量分析例如CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)或CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)/CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)配体复合物和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)/TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)配体复合物的存在程度。***、测试试剂盒、试剂盒或成套试剂盒可以包含标记的组分，例如标记的抗体，以及一种或多种另外的免疫化学试剂。
7.5产生多特异性分子和抗体的多核苷酸、载体和方法
在另一方面，本文提供包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原的本文所述多特异性分子或抗体或其一部分或其片段(例如VL和/或VH；和轻链和/或重链)的核苷酸序列；以及载体，例如包含此类多核苷酸的载体，用于在宿主细胞(例如大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达。本文提供了包含编码本文提供的任何抗体的重链和/或轻链的核苷酸序列的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸序列的载体，例如用于它们在宿主细胞例如哺乳动物细胞中有效表达的表达载体。
如本文所使用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与核酸分子的天然来源(例如小鼠或人)中存在的其它核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(例如cDNA分子)在通过重组技术产生时可基本上不含其它细胞材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。例如，语言“基本上不含”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是小于约10％)的其它材料的多核苷酸或核酸分子的制剂，所述其它材料是例如细胞材料、培养基、其它核酸分子、化学前体和/或其它化学试剂。在一个具体实施例中，编码本文所述抗体的核酸分子是分离的或纯化的。
在特定方面，本文提供包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多肽且包含本文所述的氨基酸序列的多特异性分子和抗体，以及与此类多特异性分子和抗体竞争结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多肽(例如以剂量依赖性方式)或与此类多特异性分子和抗体结合至相同抗原决定基的多特异性分子和抗体。
在某些方面，本文提供了多核苷酸，其包含编码本文所述多特异性分子或抗体的轻链或重链的核苷酸序列。多核苷酸可包含编码轻链的核苷酸序列或编码重链的核苷酸序列，所述轻链包含本文所述的多特异性分子或抗体的VL FR和CDR(参见例如表1和表2)，所述重链包含本文所述的多特异性分子或抗体的VH FR和CDR(参见例如表1和表2)。在某些实施例中，多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的VH、VL、重链和/或轻链。在另一个实施例中，多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第一VH和第一VL。在另一个实施例中，多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第二VH和第二VL。在另一个实施例中，多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第一重链和第一轻链。在另一个实施例中，多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第二重链和第二轻链。在另一个实施例中，多核苷酸编码本文所述的分离的抗体的VH和/或VL或重链和/或轻链。
本文还提供经优化、例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换和mRNA不稳定性元件消除来优化的多核苷酸，所述多核苷酸编码抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体。通过将密码子变化引入mRNA和/或消除mRNA中的抑制性区域来产生经优化的核酸的方法能够通过采用以下文献中所述的优化方法执行：例如美国专利号5,965,726、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498，相应地，所述美国专利皆以全文引用的方式并入本文中，所述经优化的核酸编码抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其片段(例如轻链、重链、VH结构域或VL结构域)以便实现重组表达。例如，可以在不改变核酸序列编码的氨基酸的情况下突变RNA内的潜在剪接位点和不稳定元件(例如富含A/T或A/U的元件)以增加RNA用于重组表达的稳定性。改变利用遗传密码的简并性，例如，使用相同氨基酸的替代密码子。在某些实施例中，可能需要改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如具有与原始氨基酸相似的化学结构和性质和/或功能的相似氨基酸。相对于由尚未优化的多核苷酸编码的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体的表达，此类方法能够使抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其片段的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多倍。
在某些实施例中，编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其片段(例如VL结构域和/或VH结构域)的优化多核苷酸序列能够与编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其片段(例如VL结构域和/或VH结构域)的未优化多核苷酸序列的反义(例如互补)多核苷酸杂交。在具体实施例中，编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或片段的优化核苷酸序列在高严格度条件下与编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其片段的未优化多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在一个具体实施例中，编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其片段的优化核苷酸序列在高严格度、中或较低严格度杂交条件下与编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或经分离的抗TIGIT抗体或其片段的未优化核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。关于杂交条件的信息已有描述，参见例如美国专利申请公开号US2005/0048549(例如第72-73段)，该案以引用的方式整体并入本文中。
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述的多特异性分子和抗体、例如表1和表2中所述的多特异性分子和抗体以及这些多特异性分子和抗体的经修饰版本的核苷酸序列能够使用所属领域中众所周知的方法测定，即，已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子是以产生编码多特异性分子或抗体的核酸的方式组装。编码多特异性分子或抗体的此类多核苷酸能够由化学合成的寡核苷酸组装(例如Kutmeier G等人,(1994),BioTechniques 17:242-6中所述，所述文献以全文引用的方式并入本文中)，简单来说，这涉及合成含有编码多特异性分子或抗体的序列的各部分的重叠寡核苷酸，退火和连接这些寡核苷酸，然后通过PCR来扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码本文所述的多特异性分子或本文所述的抗体的抗原结合区的多核苷酸能够由来自适合来源(例如融合瘤)的核酸、使用所属领域中众所周知的方法(例如PCR和其它分子克隆方法)产生。例如，使用可与已知序列的3'和5'端杂交的合成引物的PCR扩增可以使用从产生所关注的抗体的融合瘤细胞获得的基因组DNA进行。此类PCR扩增方法能够用于获得包含编码多特异性分子或抗体的轻链和/或重链的序列的核酸。此类PCR扩增方法能够用于获得包含编码多特异性分子或抗体的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达并且用于进一步的克隆。
如果无法得到含有编码特定抗原结合区或抗体的核酸的克隆，但所述抗原结合区或抗体分子的序列已知，则编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成，或通过使用可与序列的3'端和5'端杂交的合成引物的PCR扩增或通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针鉴别例如来自编码所述抗体的cDNA文库的cDNA克隆进行克隆，从适合来源(例如抗体cDNA文库或由表达所述抗体的任何组织或细胞，例如所选择的表达本文所述的抗体的融合瘤细胞产生的cDNA文库，或由其分离的核酸，优选为聚腺苷酸+RNA)获得。然后，可使用本领域已知的任何方法将通过PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合片段或经分离的抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体的DNA可容易使用常规程序分离和测序(例如通过使用寡核苷酸探针，所述探针能够特异性结合至编码抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原结合区、抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原结合区或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体的重链和轻链的基因)。融合瘤细胞可以作为这种DNA的来源。DNA在分离后能够放入表达载体中，然后转染至宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞)或原本不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以实现抗CD96和/或抗TIGIT多特异性分子或抗TIGIT抗体在重组宿主细胞中的合成。
为了产生全抗体或抗原结合区，可使用PCR引物扩增scFv克隆中的VH或VL序列，所述PCR引物包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护限制位点的侧接序列。利用本领域的技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区例如人γ1或人γ4恒定区的载体中，并且PCR扩增的VL结构域可以克隆到表达轻链恒定区，例如人κ或λ恒定区的载体中。在某些实施例中，用于表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、用于可变区的克隆位点、恒定区和选择标记物如新霉素(neomycin)。VH和VL结构域也可以克隆到一个表达必需恒定区的载体中。然后使用本领域的技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体例如IgG的稳定或瞬时细胞系。
DNA也可以通过以下方式修饰：例如，用人重链和轻链恒定区的编码序列代替鼠序列，或使非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价接合。
还提供了在高度严格、中等或较低严格杂交条件下与编码本文所述抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。在具体实施例中，本文所述的多核苷酸在高度严格、中等或较低严格杂交条件下与编码本文提供的VH结构域和/或VL结构域的多核苷酸杂交。
杂交条件已在本领域中描述并且是本领域的技术人员已知的。例如，在严格度条件下的杂交可以涉及在约45℃下、在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA杂交，然后在约50-65℃下、在0.2×SSC/0.1％SDS中进行一或多次洗涤；在高严格度条件下的杂交可以涉及在约45℃下、在6×SSC中与滤膜结合的核酸杂交，然后在约68℃下、在0.1×SSC/0.2％SDS中进行一或多次洗涤。在其它严格度杂交条件下的杂交是本领域的技术人员已知和描述的，参见例如Ausubel FM等人编，(1989)Current Protocols in MolecularBiology,第I卷,Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,NewYork，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页，所述文献以引用的方式整体并入本文。
在某些方面，本文提供了表达(例如重组表达)特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述多特异性分子或其抗原结合区的细胞(例如宿主细胞)；表达(例如重组表达)特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述抗体的细胞(例如宿主细胞)；以及相关多核苷酸和表达载体。本文提供了包含多核苷酸的载体(例如表达载体)，所述多核苷酸包含编码抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区和抗TIGIT抗体或片段的核苷酸序列以便重组表达于宿主细胞中，优选哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。本文还提供了包含此类载体的宿主细胞，用于重组表达本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子和抗TIGIT抗体(例如人或人源化抗体)。在一特定方面，本文提供了用于本文所述的多特异性分子或抗体的方法，包括由宿主细胞表达多特异性分子或其抗原结合区或抗体。
特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述多特异性分子或其抗原结合区或抗体(例如本文所述的全长抗原结合区或抗体或抗体重链和/或轻链)的重组表达通常涉及构建含有多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸编码多特异性分子或其抗原结合区或抗体。编码本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或抗体分子、多特异性分子或抗体的重链和/或轻链、或其片段(例如重链和/或轻链可变区)的多核苷酸已获得之后，用于产生多特异性分子或其抗原结合区或抗体分子的载体能够通过重组DNA技术、使用所属领域中众所周知的技术产生。因此，本文中描述了通过表达多核苷酸来制备蛋白质的方法，所述多核苷酸含有编码多特异性分子或其抗原结合区或抗体或抗体片段(例如轻链或重链)的核苷酸序列。本领域技术人员众所周知的方法能够用于构建表达载体，所述表达载体含有编码多特异性分子或其抗原结合区或抗体或抗体片段(例如轻链或重链)的序列以及适当的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如试管内重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了包含可操作地连接至启动子的核苷酸序列的可复制载体，所述核苷酸序列编码、含有本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变区或其片段、或重链或轻链CDR。此类载体能够例如包括编码多特异性分子或抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036；及美国专利号5,122,464，各文献以引用的方式整体并入本文中)并且能够将多特异性分子或抗体的可变区克隆至此类载体中以表达完整重链、完整轻链、或完整重链和轻链。
在某些实施例中，载体包含编码本文所述的多特异性分子的VH、VL、重链和/或轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一VH和第一VL的多核苷酸。在另一个实施例中，载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二VH和第二VL的多核苷酸。在另一个实施例中，载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一重链和第一轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二重链和第二轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，载体包含编码本文所述的经分离抗体的VH和/或VL、或重链和/或轻链的多核苷酸。
能够通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如宿主细胞)中，且所得细胞然后能够通过常规技术培养以产生、含有本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或抗体或其片段。因此，本文提供了含有多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码、含有本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或抗体或其片段、或其重链或轻链、或其片段、或本文所述的单链抗体且可操作地连接至启动子以便在宿主细胞中表达此类序列。
在某些实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的VH、VL、重链和/或轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第一VH和第一VL的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第二VH和第二VL的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第一重链和第一轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第二重链和第二轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的经分离抗体的VH和/或VL、或重链和/或轻链的多核苷酸。
在某些实施例中，宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的多特异性分子的VH、VL、重链和/或轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一VH和第一VL的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二VH和第二VL的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一重链和第一轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二重链和第二轻链的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的经分离抗体的VH和/或VL、或重链和/或轻链的多核苷酸。
在某些实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸，以及编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含含有第一多核苷酸的第一载体和含有第二多核苷酸的第二载体，所述第一多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH和VL，且所述第二多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH和VL。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸，和编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸、编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸，和编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含第一载体和第二载体、第三载体和第四载体，所述第一载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸，所述第三载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸，所述第四载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸。
在某些实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的重链和轻链的第一多核苷酸，以及编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的重链和轻链的第二多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含含有第一多核苷酸的第一载体和含有第二多核苷酸的第二载体，所述第一多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的重链和轻链，且所述第二多核苷酸编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的重链和轻链。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的重链的第一多核苷酸，和编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的轻链的第二多核苷酸、编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的重链的第三多核苷酸，和编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的轻链的第四多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含第一载体和第二载体、第三载体和第四载体，所述第一载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的重链的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的轻链的第二多核苷酸，所述第三载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的重链的第三多核苷酸，所述第四载体包含编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的轻链的第四多核苷酸。
在某些实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的分离的抗体的VH和VL的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含载体，该载体包含编码本文所述的分离的抗体的VH和VL的多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含编码本文所述的分离的抗体的VH的第一多核苷酸和编码本文所述的分离的抗体的VL的第二多核苷酸。在另一个实施例中，宿主细胞包含第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码本文所述的分离的抗体的VH的第一多核苷酸，并且所述第二载体包含编码本文所述的分离的抗体的VL的第二多核苷酸。
在具体实施例中，第一细胞表达的重链/重链可变区与第二细胞的轻链/轻链可变区缔合以形成本文所述的抗CD96抗体(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区，或本文所述的抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)。在某些实施例中，本文提供了包含此类第一宿主细胞和此类第二宿主细胞的宿主细胞群体。
在某些实施例中，本文提供了载体群，其包含第一载体，所述第一载体包含编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子的轻链/轻链可变区或其抗原结合区、或本文所述的抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体的多核苷酸；和第二载体，所述第二载体包含编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子的重链/重链可变区、或其抗原结合区、或本文所述的抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体的多核苷酸。
多种宿主表达载体***能够用于表达本文所述的多特异性分子，或其抗原结合区，或本文所述的抗体分子(参见例如美国专利号5,807,715，所述专利以全文引用的方式并入本文中)。此类宿主表达***代表能够借以产生且随后纯化所关注的编码序列的媒介物，而且代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时能够原位表达本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或本文所述的抗体分子的细胞。这些表达***包括但不限于微生物，例如经例如含有多特异性分子或其抗原结合区的编码序列或抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘质粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；经例如含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母菌和毕赤酵母属)；经例如含有多特异性分子或其抗原结合区的编码序列或抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；经例如重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或经例如含有多特异性分子或其抗原结合区的编码序列或抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞***(例如绿藻，例如莱茵衣藻)；或含有例如重组表达构建体的哺乳动物细胞***(COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10)，所述构建体含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。在一个具体实施例中，用于表达本文所述抗体的细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在某些实施例中，多特异性分子的重链和/或轻链或其抗原结合区或由CHO细胞产生的抗体的N端谷氨酰胺或谷氨酸残基可经焦谷氨酸置换。在某些实施例中，用于表达本文所述的抗体的细胞是人细胞，例如人细胞系。在一个具体实施例中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在某些实施例中，细菌细胞诸如大肠杆菌或真核细胞(例如哺乳动物细胞)被用于表达重组抗体分子，特别是用于表达完整的重组抗体分子。举例来说，哺乳动物细胞，例如CHO细胞，连同载体，例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，是抗体的有效表达***(Foecking MK和Hofstetter H(1986)Gene 45:101-5；和Cockett MI等人,(1990)Biotechnology 8(7):662-7，这些文献各自以引用的方式整体并入本文)。在某些实施例中，本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或本文所述的抗体由CHO细胞或NS0细胞产生。在一个具体实施例中，编码本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区或特异性结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述抗体的核苷酸序列的表达是由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控。
在细菌***中，根据被表达的多特异性分子或抗体分子的预期用途，能够有利地选择多种表达载体。举例来说，当要产生大量的此类多特异性分子或抗体时，为了产生多特异性分子或抗体分子的药物组合物，引导容易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体可为所需的。此类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U和Mueller-Hill B(1983)EMBO J 2:1791-1794)，其中编码序列可以与lac Z编码区独立地同框连接到载体中，由此产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S和Inouye M(1985)Nuc Acids Res 13:3101-3109；Van Heeke G和Schuster SM(1989)J Biol Chem 24:5503-5509)等等，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文。例如，pGEX载体还可以用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附并结合至基质谷胱甘肽琼脂糖珠，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而容易地从裂解细胞纯化。pGEX载体被设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分中释放。
例如，在昆虫***中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus；AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。该病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。编码序列可以独立地克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达***。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，感兴趣的编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，可以通过试管内或体内重组将这种嵌合基因***腺病毒基因组中。***病毒基因组的非必需区(例如区域El或E3)将产生重组病毒，该病毒是有活力的并且能够在受感染的宿主中表达分子(参见例如Logan J和Shenk T(1984)PNAS 81(12):3655-9，该文献以引用的方式整体并入本文)。***的编码序列的高效翻译也可能需要特定起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的读框同相，以确保整个***物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，包括天然的和合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强表达的效率(参见例如，Bitter G等人,(1987)Methods Enzymol.153:516-544，该文献以引用的方式整体并入本文)。
另外，可以选择调节***序列的表达，或以所需的特定方式修饰和处理基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(如糖基化)和加工(如切割)对于蛋白质的功能可以是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的翻译后处理和修饰的特征和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主***以确保所表达的外来蛋白质的正确修饰和处理。为此，可以使用真核宿主细胞，其具有用于适当处理基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(一种不内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施例中，本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体是在哺乳动物细胞、例如CHO细胞中产生。
在一个具体实施例中，本文所述的多特异性分子或抗体具有减少的岩藻糖含量或无岩藻糖含量。此类多特异性分子或抗体能够使用本领域技术人员已知的技术产生。举例来说，多特异性分子或其抗原结合区或抗体能够在缺乏或缺少岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一个具体实例中，其中α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因敲除的细胞系能够用于产生岩藻糖含量减少的多特异性分子或其抗原结合区或抗体。***(Lonza)是此类***的一个实例，可用于产生岩藻糖含量降低的抗体。
对于重组蛋白的长期、高产量生产，可以产生稳定的表达细胞。举例来说，稳定表达本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体的细胞系能够加以工程改造。在具体实施例中，本文所提供的细胞稳定表达轻链/轻链可变区和重链/重链可变区，所述轻链/轻链可变区和重链/重链可变区缔合形成本文所述的抗原结合区或抗体。
在某些方面，不使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择性标记转化。在引入外源DNA/多核苷酸后，工程化的细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其的染色体中并生长以形成病灶，所述病灶又可被克隆并扩增到细胞系中。此方法能够有利地用于对表达本文所述的抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)或其片段的细胞系进行工程改造。此类工程化细胞系可特别用于筛选和评估与多特异性分子或抗体分子直接或间接相互作用的组合物。
可以使用许多选择***，包括但不限于分别地tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977)Cell 11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶((Szybalska EH&Szybalski W(1962)PNAS 48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy I等人,(1980)Cell 22(3):817-23)基因所有这些文献均以引用的方式整体并入本文。此外，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M等人,(1980)PNAS 77(6):3567-70；O'Hare K等人,(1981)PNAS 78:1527-31)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan RC与Berg P(1981)PNAS 78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu GY与Wu CH(1991)Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev P(1993)Ann Rev Pharmacol Toxicol32:573-596；Mulligan RC(1993)Science 260:926-932；和Morgan RA与Anderson WF(1993)Ann Rev Biochem 62:191-217；Nabel GJ与Felgner PL(1993)Trends Biotechnol 11(5):211-5)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre RF等人,(1984)Gene 30(1-3):147-56)，所述文献全部以引用的方式整体并入本文中。重组DNA技术领域中通常已知的方法可以常规地应用于选择所需的重组克隆并且这类方法描述于例如Ausubel FM等人(编),Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler M,Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；以及第12和13章,Dracopoli NC等人,(编),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colbère-Garapin F等人,(1981)J Mol Biol 150:1-14中，所述文献全部以引用的方式整体并入本文中。
通过载体扩增能够增加多特异性分子或其抗原结合区或抗体分子的表达水平(欲回顾，参见Bebbington CR和Hentschel CCG,The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNAcloning,第3卷(Academic Press,New York,1987)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。当载体***中的标记物可扩增时，增加宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平将增加标记物基因的拷贝数。由于扩增的区域与感兴趣基因相关，故蛋白质的产生也将增加(Crouse GF等人,(1983)Mol Cell Biol 3:257-66，该文献以引用的方式整体并入本文)。
宿主细胞可以用本文所述的两种或更多种表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽，而第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可以含有相同的选择性标记，使重链和轻链多肽能够等同表达。宿主细胞可以用不同量的两种或更多种表达载体共转染。例如，宿主细胞可以用以下比率中的任一者的第一表达载体和第二表达载体转染：约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
或者，可以使用编码并能够表达重链和轻链多肽的单一载体。在这种情况下，应将轻链置于重链之前以避免过量的无毒重链(Proudfoot NJ(1986)Nature 322:562-565；和G(1980)PNAS 77:2197-2199，这些文献中的每个以引用的方式整体并入本文)。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可以编码2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基因/核苷酸序列，或在2-5、5-10或10-20个范围内的基因/核苷酸序列。例如，双顺反子核酸构建体可以按以下顺序包含启动子、第一基因(例如本文所述抗体的重链)和第二基因和(例如本文所述抗体的轻链)。在这种表达载体中，两个基因的转录都可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性扫描机制进行，而来自第二基因的mRNA的翻译可以通过与上限不相关机制，例如，通过IRES来进行。
本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或抗体分子已通过重组表达产生后，它能够通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如通过色谱法(例如离子交换、亲和色谱，特别是蛋白质A后对特异性抗原的亲和色谱，以及分级柱色谱)、离心、差示溶解度，或通过任何其它用于纯化蛋白质的标准技术。此外，本文所述的多特异性分子和抗体能够与本文所述的或本领域中另外已知的异源多肽序列融合以促进纯化。
在具体实施例中，分离或纯化本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或本文所述的抗体。在某些实施例中，分离的抗体是基本上不含具有与该分离的抗体不同的抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在某些实施例中，本文所述抗体的制剂基本上不含细胞材料和/或化学前体。术语“基本上不含细胞材料”包括抗体制剂，其中抗体与分离或重组产生抗体的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(以干重计)的异源蛋白质(本文也称为“污染蛋白质”)和/或抗体变体，例如抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其它不同形式(例如抗体片段)的抗体制剂。当重组产生抗体时，它通常也基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体时，它通常基本上不含化学前体或其它化学物质，即它与化学前体或参与蛋白质合成的其它化学物质分离。因此，此类抗体制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的化学前体或除所关注的抗体之外的化合物。在一个具体实施例中，本文所述的抗体是分离的或纯化的。
通过本领域中已知用于合成蛋白质或抗体的任何方法，例如通过化学合成或通过重组表达技术，能够产生抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体或其片段。除非另有说明，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域内的相关领域中的常规技术。这些技术例如在本文引用的参考文献中描述，并且在文献中充分解释。参见例如Maniatis T等人,(1982)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人,(1989),Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook J等人,(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)；Current Protocols in Immunology,JohnWiley&Sons(1987和年度更新)；Gait(编)(1984)Oligonucleotide Synthesis:APracticalApproach,IRL Press；Eckstein(编)(1991)Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,IRL Press；Birren B等人(编)(1999)Genome Analysis:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，所有这些文献都以引用的方式整体并入本文。
在一个具体实施例中，通过涉及产生DNA序列的任何方式，例如通过DNA序列的合成、基因工程来制备、表达、产生或分离出本文所述的多特异性分子或其抗原结合区或本文所述的抗体。在某些实施例中，此类多特异性分子或其抗原结合区或抗体包含天然不存在于动物或哺乳动物(例如人)体内的抗体生殖系谱系内的序列(例如DNA序列或氨基酸序列)。
在一个方面，本文提供了一种产生抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体的方法，包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在某些实施例中，所述方法是在试管内进行。在某一方面，本文提供一种产生抗CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)多特异性分子或其抗原结合区或抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体的方法，包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包含编码本文所述抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如重组表达)多特异性分子或其抗原结合区或抗体。在某些实施例中，细胞是分离的细胞。在某些实施例中，外源多核苷酸已经被引入细胞中。在某些实施例中，方法进一步包括纯化获自细胞或宿主细胞的多特异性分子或其抗原结合区或抗体的步骤。
在某些实施例中，通过在表达多核苷酸且产生多特异性分子的适合条件下、在细胞中表达编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸和编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸来产生多特异性分子。在某些实施例中，通过在表达多核苷酸且产生多特异性分子的适合条件下、在细胞中表达编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的重链和轻链的第一多核苷酸和编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的重链和轻链的第二多核苷酸来产生多特异性分子。
在某些实施例中，通过在表达多核苷酸且产生多特异性分子的适合条件下、在细胞中表达编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸、编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸、编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸和编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸来产生多特异性分子。在某些实施例中，通过在表达多核苷酸且产生多特异性分子的适合条件下、在细胞中表达编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的重链的第一多核苷酸、编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的轻链的第二多核苷酸、编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的重链的第三多核苷酸和编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的轻链的第四多核苷酸来产生多特异性分子。
在某些实施例中，通过使本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区与第二抗原结合区在产生多特异性分子的条件下接触来产生多特异性分子。举例来说，在某些实施例中，如下产生多特异性分子：在借以产生第一抗原结合区的条件下、在第一细胞中表达编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸，并且在借以产生第二抗原结合区的条件下、在第二细胞中表达本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸，且在产生多特异性分子的适合条件下使第一与第二抗原结合区接触。或者，在某些实施例中，如下产生多特异性分子：在借以产生第一抗原结合区的条件下、在第一细胞中表达编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸和编码本文所述的多特异性分子的第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸，并且在借以产生第二抗原结合区的条件下、在第二细胞中表达编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸和编码本文所述的多特异性分子的第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸，并且使第一与第二抗原结合区在产生多特异性分子的适合条件下接触。适用于第一与第二抗原结合区接触以产生多特异性分子的方法和条件包括但不限于WO 2011/131746、WO 2011/147986、WO 2008/119353和WO 2013/060867以及Labrijn AF等人,(2013)PNAS110(13):5145-5150中所述的那些方法和条件，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，分离的抗体是通过以下方式产生：在适合条件下，在细胞中表达编码本文所述的抗体的VH和VL的多核苷酸，由此表达多核苷酸并测试抗体。在另一个实施例中，分离的抗体是通过以下方式产生：在适合的条件下，在细胞中表达编码本文所述的抗体的重链和轻链的多核苷酸，由此表达多核苷酸并产生抗体。在某些实施例中，经分离的抗体如下产生：在表达多核苷酸且产生抗体的适合条件下、在细胞中表达编码本文所述抗体的VH的第一多核苷酸和编码本文所述抗体的VH的第二多核苷酸。在某些实施例中，分离的抗体是通过以下方式产生：在适合的条件下，在细胞中表达编码本文所述的抗体的重链的第一多核苷酸以及编码本文所述的抗体的轻链的第二多核苷酸，由此表达所述多核苷酸并产生抗体。
用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如第11章：Short Protocolsin Molecular Biology,(2002)第5版，Ausubel FM等人编，John Wiley and Sons,NewYork,该文献以引用的方式整体并入本文)。
可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用融合瘤、重组和噬菌体展示技术或它们的组合。例如，单克隆抗体可以使用融合瘤技术生产，包括本领域中已知且例如以下文献中所教导的技术：Harlow E和Lane D,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling GJ等人,载于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681(Elsevier,N.Y.,1981)，这些文献各自以引用的方式整体并入本文。如本文所使用，术语“单克隆抗体”不限于通过融合瘤技术产生的抗体。例如，单克隆抗体可以由外源表达本文所述抗体或其片段(例如此类抗体的轻链和/或重链)的宿主细胞重组产生。
在具体实施例中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单细胞(例如产生重组抗体的融合瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中所述抗体特异性结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)，如通过例如ELISA或本领域或本文提供的实施例中已知的其它抗原结合或竞争性结合分析所确定。在某些实施例中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施例中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如二价)抗体。在某些实施例中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。本文所述的单克隆抗体可以例如通过如KohlerG&Milstein C(1975)Nature 256:495中所述的融合瘤方法制备，该文献以引用的方式整体并入本文，或者可以例如使用如本文描述的技术从噬菌体文库中分离。用于制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其它方法是本领域熟知的(参见例如Short Protocols inMolecular Biology,(2002)第5版第11章，Ausubel FM等人，同上)。
如本文所使用，当抗体包含至少两个(例如两个或更多个)单价结合区，每个单价结合区均能够结合至抗原上的抗原决定基时，该抗体与抗原多价(例如二价)结合。每个单价结合区可以结合至抗原上相同或不同的抗原决定基。
使用融合瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是本领域常规和熟知的。举例来说，在融合瘤方法中，对小鼠或其它适当的宿主动物，例如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或猕猴进行免疫接种以引起淋巴细胞产生或能够产生抗体，所述抗体特异性结合至用于免疫接种的蛋白质(例如CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96))。或者，淋巴细胞可以在试管内免疫。然后，使用适合的融合剂，例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成融合瘤细胞(Goding JW(编),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986)，所述文献以引用的方式整体并入本文)。此外，RIMMS(重复免疫多位点)技术可用于免疫动物(Kilpatrick KE等人，(1997)Hybridoma 16：381-9，该文献以引用的方式整体并入本文)。
在某些实施例中，小鼠(或其它动物，诸如大鼠、猴、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)可以用抗原(例如CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96))进行免疫，并且一旦免疫检测反应，例如在小鼠血清中检测抗原特异性抗体，即可收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)的细胞系SP20的细胞，以形成融合瘤。通过有限稀释选择和克隆融合瘤。在某些实施例中，免疫小鼠的***被收获并且与NS0骨髓瘤细胞融合。
将这样制备的融合瘤细胞接种，并在优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质的合适培养基中生长。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶，即次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于融合瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基碟呤和胸苷(HAT培养基)，它们是阻止HGPRT缺陷细胞生长的物质。
具体实施例采用有效融合的骨髓瘤细胞，支持所选抗体产生细胞稳定地高水平产生抗体，并且对培养基诸如HAT培养基敏感。在这些骨髓瘤细胞系中，有鼠科动物骨髓瘤细胞系，诸如NS0细胞系或衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，它们可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的索克研究所(Salk Institute)细胞分布中心获得，以及SP-2或X63-Ag8.653细胞，它可从美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心获得。也已经描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系(Kozbor D(1984)JImmunol 133:3001-5；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)，所述文献各自以引用的方式整体并入本文中)。
测定生长融合瘤细胞的培养基中针对TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴)的单克隆抗体的产生。由融合瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本领域已知的方法确定，例如免疫沉淀或试管内结合分析，诸如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)。
在鉴别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的融合瘤细胞之后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding JW(编),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，同上)。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI 1640培养基。此外，融合瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-Sepharose、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，从培养基、腹水或血清适当地分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
本文所述的抗体包括例如识别TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的抗体片段，它可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，本文所述的Fab和F(ab')2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割，使用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)切割来产生。Fab片段对应于抗体分子的两个相同臂之一，并包含与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab')2片段包含通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。
此外，本文所述的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别地，编码VH和VL结构域的DNA序列从动物cDNA文库(例如受影响组织的人或鼠科动物cDNA文库)中扩增。通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起并克隆到噬菌粒载体中。使载体在大肠杆菌中电穿孔，然后大肠杆菌被辅助噬菌体感染。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。表达结合至特定抗原的抗原结合区的噬菌体可以用抗原，例如使用标记的抗原或者被结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原来选择或鉴别。可用于制备本文所述的抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下中所公开的那些方法：Brinkman U等人,(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames RS等人,(1995)J Immunol Methods 184:177-186；Kettleborough CA等人,(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic L等人,(1997)Gene 187:9-18；Burton DR和Barbas CF(1994)Advan Immunol 57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/001134；国际公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108，所有这些文献都以引用的方式整体并入本文。
如上述参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以将来自噬菌体的抗体编码区分离并用于产生完整抗体，包括人抗体，或任何其它所需的抗原结合片段，并在任何所需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如下文所描述。也可采用重组产生抗体片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，使用本领域已知的方法，诸如以下中所公开的方法：PCT公开号WO 92/22324；Mullinax RL等人,(1992)BioTechniques12(6):864-9；Sawai H等人,(1995)Am J Reprod Immunol 34:26-34；和Better M等人,(1988)Science 240:1041-1043，所有这些文献以引用的方式整体并入本文。
在某些实施例中，为了产生完整抗体，包括VH或VL核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧接序列的PCR引物可用于从模板例如scFv克隆扩增VH或VL序列。利用本领域的技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达VH恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达VL恒定区的载体中，例如人κ或λ恒定区。VH和VL结构域也可以克隆到一个表达必需恒定区的载体中。然后使用本领域的技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体例如IgG的稳定或瞬时细胞系。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可以包含与人抗体的恒定区融合的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如Morrison SL(1985)Science 229:1202-7；Oi VT和Morrison SL(1986)BioTechniques 4:214-221；Gillies SD等人,(1989)J ImmunolMethods 125:191-202；以及美国专利号5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文。
人源化抗体能够与预定抗原结合并且其包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白(例如鼠科动物免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。在某些实施例中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可使用本领域中已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239400；国际公开号WO 91/09967；及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰或表面重塑(欧洲专利号EP 592106和EP 519596；Padlan EA(1991)MolImmunol28(4/5):489-498；Studnicka GM等人,(1994)Prot Engineering 7(6):805-814；以及Roguska MA等人,(1994)PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利号5,565,332)以及例如以下中所公开的技术：美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO 93/17105；Tan P等人,(2002)J Immunol 169:1119-25；Caldas C等人,(2000)Protein Eng.13(5):353-60；Morea V等人,(2000)Methods 20(3):267-79；Baca M等人,(1997)J BiolChem 272(16):10678-84；Roguska MA等人,(1996)Protein Eng 9(10):895 904；Couto JR等人,(1995)Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s；Couto JR等人,(1995)Cancer Res 55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)Gene 150(2):409-10；和Pedersen JT等人,(1994)J MolBiol 235(3):959-73，所有这些文献以引用的方式整体并入本文。还参见美国申请公开号US2005/0042664 A1(2005年2月24日)，所述文献以引用的方式整体并入本文。
用于制备多特异性分子和多特异性抗体(例如双特异性抗体)的方法已有描述，参见例如美国专利号7,951,917、7,183,076、8,227,577、5,837,242、5,989,830、5,869,620、6,132,992和8,586,713，所有这些文献以引用的方式整体并入本文中。
双特异性、二价抗体及其制备方法描述于例如以下中：美国专利号5,731,168、5,807,706、5,821,333；以及美国申请公开号2003/020734和2002/0155537，这些文献各自以引用的方式整体并入本文。双特异性四价抗体及其制备方法描述于例如国际申请公开号WO02/096948和WO00/44788中，两项申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。一般参见国际申请公开号WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360和WO92/05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利号4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；以及Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
本文所述的多特异性分子或双特异性抗体可以根据DuoBody技术平台(Genmab A/S)产生，如例如国际公开号WO 2011/131746、WO 2011/147986、WO 2008/119353和WO 2013/060867，以及Labrijn AF等人,(2013)PNAS 110(13):5145-5150。DuoBody技术可用于组合含有两条重链和两条轻链的第一单特异性抗体或第一抗原结合区的一半与含有两条重链和两条轻链的第二单特异性抗体或第二抗原结合区的一半。所得到的异二聚体含有与来自第二抗体或第二抗原结合区的一条重链和一条轻链配对的来自第一抗体或第一抗原结合区的一条重链和一条轻链。当两个单特异性抗体或抗原结合区识别不同抗原上的不同抗原决定基时，所得异二聚体是多特异性分子或双特异性抗体。
DuoBody技术需要单特异性抗体或抗原结合区各自包括在CH3结构域中具有单点突变的重链恒定区。所述点突变使所得到的双特异性抗体中的CH3结构域之间的相互作用强于任一单特异性抗体或抗原结合区中的CH3结构域之间的相互作用。根据EU编号***编号，每个单特异性抗体或抗原结合区中的单点突变在重链恒定区CH3结构域中的残基366、368、370、399、405、407或409处，如例如国际公开号WO 2011/131746中所描述。此外，单点突变位于一种单特异性抗体或抗原结合区中与另一单特异性抗体或抗原结合区不同的残基处。例如，根据EU编号***编号，一种单特异性抗体或抗原结合区可包含突变F405L(即，残基405处的苯丙氨酸变为亮氨酸的突变)，而另一单特异性抗体或抗原结合区可包含突变K409R(即，残基409处的赖氨酸变为精氨酸的突变)。单特异性抗体或抗原结合区的重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型(例如人IgG1同种型)，并且由DuoBody技术产生的双特异性抗体或多特异性分子可保持Fc介导的效应功能。
另一种用于产生多特异性分子或双特异性抗体的方法被称为“臼包杵(knobs-into-holes)”策略(参见例如国际公开WO2006/028936)。在这种技术中，通过使所选氨基酸突变，在IgG中形成CH3结构域的界面，使Ig重链的错配减少。在CH3结构域内两条重链直接相互作用的位置处，将具有小侧链的氨基酸(孔)引入一条重链的序列中并将具有大侧链的氨基酸(节)引入另一条重链上对应的相互作用残基位置。在一些实施例中，本发明的组合物具有免疫球蛋白链，其中CH3结构域已通过使所选择的在两个多肽之间的界面处相互作用的氨基酸突变进行修饰，由此优先形成双特异性抗体。双特异性抗体或多特异性分子可由相同亚类(例如IgG1或IgG3)或不同亚类(例如IgG1和IgG3，或IgG3和IgG4)的免疫球蛋白链构成。
在一些情况下，结合至CD96和/或TIGIT的多特异性分子可含有IgG4和IgG1、IgG4和IgG2、IgG4和IgG2、IgG4和IgG3或IgG1和IgG3链异二聚体。此类异二聚重链抗体能够如下常规地进行工程改造：例如修饰所选氨基酸，形成人IgG4和IgG1或IgG3中的CH3结构域的界面，从而有利于异二聚重链形成。
在某些实施例中，与本文所述的抗TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗体结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的相同抗原决定基的本文所述抗体是人抗体。在某些实施例中，竞争性阻断(例如以剂量依赖性方式)本文所述的任一抗体结合至TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)的本文所述的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的任何方法产生人抗体。例如，可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。具体而言，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区和多样性区可以被引入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以在通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座的同时或单独或同时失去功能。具体而言，JH区的纯合缺失阻止了内源性抗体的产生。将经修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后温育嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子代。将转基因小鼠以正常方式用所选抗原，例如抗原(例如TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT))的全部或一部分进行免疫接种。可以使用常规融合瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重新排列，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于用于产生人抗体的该技术的概述，参见Lonberg N&Huszar D(1995)Int Rev Immunol 13:65-93，该文献以引用的方式整体并入本文。关于用于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术和用于产生这类抗体的方案的详细论述，参见例如国际公开号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，所有这些文献以引用的方式整体并入本文中。能够产生人抗体的小鼠的实例包括XenomouseTM(Abgenix,Inc.；美国专利号6,075,181和6,150,184)、HuAb-MouseTM(Medarex,Inc./Gen Pharm；美国专利号5,545,806和5,569,825)、TransChromo MouseTM(Kirin)和KM MouseTM(Medarex/Kirin)，所有这些文献均以引用的方式整体并入本文。
与TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)特异性结合的人抗体可通过本领域中已知的多种方法制备，包括以上描述的使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。还参见美国专利号4,444,887、4,716,111和5,885,793；以及国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，所有这些专利以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施例中，人抗体可以使用小鼠-人融合瘤产生。例如，可以将用埃-巴二氏病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人融合瘤，并且可以筛选这些小鼠-人融合瘤，以确定分泌特异性结合至靶抗原(例如TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT))的人单克隆抗体的融合瘤。此类方法是已知的并且在本领域中有描述，参见例如Shinmoto H等人,(2004)Cytotechnology 46:19-23；Naganawa Y等人,(2005)Human Antibodies 14:27-31，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。
7.6试剂盒
还提供了包含本文所述的一种或多种多特异性分子或抗体或其药物组合物或缀合物的试剂盒。在一个具体实施例中，本文提供包含一个或多个容器的药包或试剂盒，所述容器装填有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，例如本文所提供的一种或多种多特异性分子或抗体。在某些实施例中，试剂盒含有本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，诸如本文所述的那些。在某些实施例中，试剂盒可包含T细胞有丝***原，例如植物血凝素(PHA)和/或佛波醇肉豆蔻酸酯(PMA)或TCR复合物刺激抗体，诸如抗CD3抗体和抗CD28抗体。任选地与一个或多个此类容器相关联的可以是呈由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了制造、使用或销售机构对人施用的许可。
还提供了可用于前述方法的试剂盒。在某些实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的抗体，优选多特异性分子或经纯化的抗体。在一个具体实施例中，本文所述的试剂盒包含基本上分离的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原作为对照。在另一具体实施例中，本文所述的试剂盒进一步包含与CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原不反应的对照抗体。在另一具体实施例中，本文所述的试剂盒含有用于检测多特异性分子或抗体结合至CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原(例如)(例如多特异性分子或抗体能够缀合到可检测底物，例如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物，或识别第一抗体的第二抗体能够缀合到可检测底物)的一种或多种成分。在具体实施例中，本文提供的试剂盒可包括重组产生的或化学合成的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原。试剂盒中所提供的CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原还能够附着到固体载体。在一个更具体实施例中，上述试剂盒的检测方式包括CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原所附着的固体载体。这种试剂盒还可以包括未附着的报告标记的抗人抗体或抗小鼠/大鼠抗体。在此实施例中，多特异性分子或抗体对CD96(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)抗原和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原的结合能够根据所述经报导体标记的抗体的结合检测。在某些实施例中，本发明涉及本发明的试剂盒用于试管内分析和/或检测生物样品中的CD96抗原(例如人CD96或食蟹猕猴CD96)和/或TIGIT(例如人TIGIT或食蟹猕猴TIGIT)抗原的用途。
8.实例
本节(即第6节)中的实例是为了说明而非限制的方式提供的。
表5提供了以下实例中使用的各种多特异性分子和单特异性抗体的细节。
表5.示例性多特异性分子和单特异性抗体。
8.1实例1：抗TIGITxCD96多特异性分子的表征
8.1.1抗TIGITxCD96多特异性分子对经纯化的人和食蟹猕猴CD96蛋白质的结合
对具有C89S突变的人CD96的经His标记的同种型2的结合
通过表面等离子体共振来评估多特异性分子BA123、BA125和BA127对包含C89S突变的CD96的人同种型2的全长胞外结构域(ECD)的变体(SEQ ID NO:63)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约2μg/mL BA123、BA125和BA127被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE HealthcareLtd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约350个共振单位(RU)来捕获多特异性分子。将具有C89S突变的人CD96的全长同种型2ECD(SEQ ID NO:63)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度且以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表6中。
表6.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至具有C89S突变的人CD96的全长同种型2ECD(SEQ ID NO:63)的动力学参数。
对食蟹猕猴CD96的经His标记的同种型2的结合
通过表面等离子体共振来评估多特异性分子BA123、BA125和BA127对CD96的食蟹猕猴同种型2的全长ECD(SEQ ID NO:111)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约2μg/mL BA123、BA125和BA127被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE HealthcareLtd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约350个共振单位(RU)来捕获多特异性分子。将食蟹猕猴CD96的全长同种型2ECD(SEQ ID NO:111)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度且以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表7中。
表7.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴CD96的全长同种型2ECD(SEQ IDNO:111)的动力学参数。
8.1.2抗TIGITxCD96多特异性分子对经纯化的人和食蟹猕猴TIGIT蛋白的结合
对His标记的人TIGIT的结合
通过表面等离子体共振来评估多特异性分子BA123、BA125和BA127对人TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:113)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约4μg/mL BA123、BA125和BA127被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE HealthcareLtd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约1000个共振单位(RU)来捕获多特异性分子。将人TIGIT的全长ECD(SEQID NO:113)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度且以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH 1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表8中。
表8.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:113)的动力学参数。
对His标记的食蟹猕猴TIGIT的结合
通过表面等离子体共振来评估多特异性分子BA123、BA125和BA127对食蟹猕猴TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:114)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约4μg/mL BA123、BA125和BA127被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE HealthcareLtd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约350个共振单位(RU)来捕获多特异性分子。将食蟹猕猴TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:114)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度且以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH 1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表9中。
表9.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:114)的动力学参数。
8.2实例2：抗CD96抗体对经纯化的人和食蟹猕猴CD96蛋白质的结合
对具有C89S突变的人CD96的经His标记的同种型2的结合
通过表面等离子体共振来评估单特异性抗体BA143、BA144和BA145对具有C89S突变的CD96的人同种型2的全长ECD(SEQ ID NO:63)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约1μg/mL BA143、BA144和BA145被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE HealthcareLtd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约175个共振单位(RU)来捕获抗体。将具有C89S突变的人CD96的全长同种型2ECD(SEQ ID NO:63)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度，以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表10中。
表10.抗CD96抗体结合至具有C89S突变的人CD96的全长同种型2ECD(SEQ ID NO:63)的动力学参数。
对食蟹猕猴CD96的经His标记的同种型2的结合
通过表面等离子体共振来评估单特异性抗体BA143、BA144和BA145对CD96的食蟹猕猴同种型2的全长ECD(SEQ ID NO:111)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约1μg/mL BA143、BA144和BA145被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE HealthcareLtd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约175个共振单位(RU)来捕获抗体。将食蟹猕猴CD96的全长同种型2ECD(SEQ ID NO:111)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度且以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH 1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表11中。
表11.抗CD96抗体结合至食蟹猕猴CD96的全长同种型2ECD(SEQ ID NO:111)的动力学参数。
8.3实例3：抗TIGIT抗体对经纯化的人和食蟹猕猴TIGIT蛋白的结合
对His标记的人TIGIT的结合
通过表面等离子体共振来评估单特异性抗体BA148对人TIGIT的全长ECD(SEQ IDNO:113)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约2μg/mL BA148被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE Healthcare Ltd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约500个共振单位(RU)来捕获抗体。将人TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:113)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度且以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH 1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表12中。
表12.抗TIGIT抗体结合至人TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:113)的动力学参数。
对His标记的食蟹猕猴TIGIT的结合
通过表面等离子体共振来评估单特异性抗体BA148对食蟹猕猴TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:114)的结合亲和力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用1:1结合模型和Biacore T200评估软件计算各实验的缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约4μg/mL BA148被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE Healthcare Ltd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约500个共振单位(RU)来捕获抗体。将食蟹猕猴TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:114)稀释至0、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3和100nM的浓度，以30μl/min的流速流过芯片表面，缔合期为3分钟且解离期为10分钟。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH 1.5进行再生。使用BIAevaluation 3.0软件的全局数据分析选项，对传感图进行评估且与简单的朗格缪尔1:1交互模型拟合。通过视觉检查偏差和曲线拟合以及评估Rmax、Chi2和Tc的参数来验证数据质量。利用传感图分析测定结合动力学(ka、kd和KD)且显示于表13中。
表13.抗TIGIT抗体结合至食蟹猕猴TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:114)的动力学参数。
8.4实例4：纯化的人TIGIT和CD96蛋白质对抗TIGITxCD96多特异性分子的同时双重结合
表面等离子体共振结合分析
使用表面等离子体共振来证实多特异性分子BA123、BA125和BA127同时结合至人TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:113)和具有C89S突变的CD96的人同种型2的全长ECD(SEQ IDNO:63)的能力。
简单来说，使用Biacore T200仪器进行表面等离子体共振实验，且使用BiacoreT200评估软件目视检查传感图。
在运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％表面活性剂P20)中稀释的约4μg/mL BA123、BA125和BA127被捕获于S系列蛋白质A传感器芯片(GE HealthcareLtd，目录号29-1275-56)的个别流动池上，保留单个流动池作为参照。通过使用10μl/min流速注射30秒以达到约1000个共振单位(RU)来捕获多特异性分子。然后利用Biacore T200的双重注射方案对不同TIGIT和/或CD96样品进行两次各别注射，一次紧接在另一次之后。第一次注射100nM人TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:113)，缔合期为3分钟，紧接着第二次3分钟注射缓冲液；100nM人TIGIT的全长ECD(SEQ ID NO:113)；100nM人TIGIT的全长ECD(SEQ IDNO:113)与100nM具有C89S突变的CD96的人同种型2的全长ECD(SEQ ID NO:63)的混合物；或100nM具有C89S突变的CD96的人同种型2的全长ECD(SEQ ID NO:63)。第二次注射后是10分钟解离期。传感器芯片在循环之间通过两次30秒注射10mM甘氨酸pH 1.5进行再生。使用BIAevaluation3.0软件评估传感图。
如图1A-1C所示，BA123(图1A)、BA125(图1B)和BA127(图1C)能够同时结合至人TIGIT和人CD96蛋白质，正如当TIGIT结合的多特异性分子含有TIGIT和CD96的混合物、随后流过其时发生的信号(RU)增加所证明，表明CD96结合至多特异性分子的其它抗原结合区。
细胞结合分析
在此实例中，与对照多特异性分子BA128、BA131和BA133相比，抗TIGITxCD96多特异性分子BA127同时结合至经工程改造以表达人TIGIT或人CD96的CHO细胞。
表达人TIGIT或人CD96的CHO细胞系在含有1μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中、在振荡器烧瓶中、在37℃下培养。对于抗体结合分析来说，从温育箱中检取人TIGIT或CD96-CHO细胞且转移到含有细胞培养物的管中。将细胞以300g离心五分钟。舍弃上清液，且将再悬浮于FACS缓冲液(补充有2％胎牛血清的冷PBS)中的细胞以每孔1×105个细胞/50μL的密度接种于96孔U形底组织培养板中。
在单独的微孔板中制备抗体。抗体在FACS缓冲液中按1比3连续稀释。制备了总共12种工作稀释液，其范围为90μg/mL至0.0005μg/mL用于结合至CHO-人TIGIT，或30μg/mL至0.0002μg/mL用于结合至CHO-人CD96。将细胞以300g离心五分钟，丢弃上清液，并将细胞再悬浮于50μl抗体混合物中。在4℃下温育细胞45分钟。在45分钟后，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，并且丢弃上清液。
如图2A和2B所示，与对照多特异性分子BA128、BA131和BA133相比，抗TIGITxCD96多特异性分子BA127能够同时结合至人TIGIT和人CD96。使用荧光染料(Alex Fluor 488)缀合的抗His抗体，通过流式细胞术检测细胞表达的人TIGIT和可溶性His标记的人CD96(图2A)或细胞表达的人CD96和可溶性His标记的人TIGIT(图2B)的双重结合。
8.5实例5：一组主要抗TIGITxCD96多特异性分子的表征
8.5.1抗TIGITxCD96多特异性分子结合至表达人和食蟹猕猴CD96的细胞
在此实例中，通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子结合各类型细胞的表面上的野生型人CD96或野生型食蟹猕猴CD96的能力。
对表达人CD96的CHO细胞的结合
评估抗TIGITxCD96多特异性分子结合至CHO细胞表面上所表达的人CD96的能力。简单来说，用编码野生型全长人CD96(人CD96-CHO)同种型1或同种型2的载体转染CHO细胞且选择稳定表达野生型CD96同种型1或同种型2的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。
对于抗体结合分析来说，将冷冻的人CD96-CHO细胞(同种型1或同种型2)等分试样在37℃解冻，然后转移到含有补充有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)的管中。将细胞以300g离心五分钟。弃去上清液，将再悬浮于FACS缓冲液中的细胞以每孔2×105个细胞/50μL的密度接种在96孔U型底组织培养板中。在单独的微孔板中制备各种抗体的2倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比3连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从60μg/mL至0.001μg/mL。然后将五十微升的各种稀释液转移到含有人CD96-CHO细胞的微孔板中。然后在4℃下温育细胞45分钟。对于抗体染色来说，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次且以1:800最终稀释度再悬浮于含有R-藻红蛋白(PE)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图。使用四参数逻辑方程式，通过曲线拟合，使用所述软件测定引起50％最大结合的多特异性分子浓度(有效浓度50，[EC50])。
如图3A-3I(同种型2)和图4A-4I(同种型1)所示，BA123、BA125、BA127、BA129、BA130、BA131、BA134和BA136以剂量依赖性方式结合到表达人CD96的CHO细胞。计算每种抗体的平均EC50值，并在表14和表16中报告(分别为同种型2和同种型1)。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表15和17中报告(分别为同种型2和同种型1)。
表14.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人CD96-CHO(同种型2)细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 196.3 |
| BA125 | 81.1 |
| BA127 | 95.1 |
| BA129 | 1921.7 |
| BA130 | 468.1 |
| BA131 | 697.4 |
| BA133 | 不结合 |
| BA134 | 123.4 |
| BA136 | 341.3 |
*由2个实验计算出。
表15.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人CD96-CHO(同种型2)细胞的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 102640 | N/A |
| BA125 | 131901 | 1551 |
| BA127 | 131867 | 2754 |
| BA128 | 6875 | N/A |
| BA129 | 70253 | 1258 |
| BA130 | 91914 | 1450 |
| BA131 | 109014 | 2236 |
| BA133 | 21002 | N/A |
| BA134 | 163929 | N/A |
| BA136 | 153274 | N/A |
表16.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人CD96-CHO(同种型1)细胞的EC50值。
| 多特异性分子 | EC50，ng/mL |
| BA123 | 11.3 |
| BA125 | 108.4 |
| BA127 | 48.9 |
| BA129 | 123.3 |
| BA130 | 30.2 |
| BA131 | 9.9 |
| BA133 | 不结合 |
| BA134 | 8.1 |
| BA136 | 10.7 |
*由1个实验计算出。
表17.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人CD96-CHO(同种型1)CHO细胞的代表性实验的AUC值。
对表达食蟹猕猴CD96的CHO细胞的结合
在类似的实验中，测试抗TIGITxCD96多特异性分子结合至CHO细胞的能力，所述CHO细胞被工程改造以在其细胞表面(食蟹猕猴CD96-CHO细胞)上表达野生型食蟹猕猴CD96(同种型2)。简单来说，用编码野生型全长食蟹猕猴CD96同种型2的载体转染CHO细胞，且选择稳定表达CD96的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。如上文关于人CD96-CHO细胞所述，测定抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴CD96-CHO的能力。
如图5A-5I所示，抗TIGITxCD96多特异性分子BA123、BA127、BA129、BA131、BA134和BA136以剂量依赖性方式结合至表达食蟹猕猴CD96的CHO细胞。针对每种抗体计算抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴CD96-CHO细胞的EC50值并且在表18中报告。计算曲线下面积(AUC)，并在表19中报告。
表18.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴CD96-CHO(同种型2)细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50，ng/mL |
| BA123 | 1039 |
| BA125 | 不结合 |
| BA127 | 不拟合 |
| BA129 | 323.8 |
| BA130 | 不结合 |
| BA131 | 不拟合 |
| BA133 | 不结合 |
| BA134 | 202.2 |
| BA136 | 415.3 |
*由1个实验计算出。
表19.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴CD96-CHO(同种型2)细胞的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 3179 | 59.2 |
| BA125 | 486 | 3.6 |
| BA127 | 2016 | 72.8 |
| BA128 | 580 | N/A |
| BA129 | 3076 | 69.5 |
| BA130 | 499 | 8.7 |
| BA131 | 1667 | 56.4 |
| BA133 | 708 | N/A |
| BA134 | 4357 | N/A |
| BA136 | 4350 | N/A |
8.5.2抗TIGITxCD96多特异性分子阻断配体结合至人CD96
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子阻断野生型人CD96(同种型2)或野生型食蟹猕猴CD96(同种型2)与其配体CD155之间结合的能力。
阻断人CD96-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子在试管内阻断CHO细胞上过度表达的野生型人CD96(同种型2)与可溶性人CD155之间结合的能力。
简单来说，在FACS缓冲液中制备含有2μg/mL与R-藻红蛋白缀合的人CD155-Fc(CD155-Fc-PE)的溶液。然后将五十微升这种人CD155-Fc-PE工作储备液添加到96孔U形底微孔板的孔中。在微孔板中制备各种多特异性分子的4倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比3连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从120μg/mL至0.002μg/mL。将二十五微升的各种稀释液添加到含有CD155-Fc-PE的微孔板中。最后将如上文所述制备的25μL野生型人CD96-CHO细胞(同种型2)添加到各孔中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图且如上文所述加以分析。对于各种抗体浓度来说，根据方程式1，使用在多特异性分子不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的人CD96-CHO细胞所获得的MFI值和人CD96-CHO细胞自体荧光(背景)的MFI值将实验数据归一化。
方程式1
％最大信号＝
(“多特异性分子”MFI-“背景”MFI)/(“总”MFI-“背景”MFI)
其中
“多特异性分子”是BA123、BA125、BA127、BA129、BA130、BA131、BA133、BA134或BA136
“背景”是单独的细胞(无抗体或CD155-Fc-PE)
“总”是在抗体不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的细胞
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至人CD96-CHO细胞的多特异性分子的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图6A-6I所示，BA123、BA125、BA127、BA129、BA130、BA131、BA134和BA136阻断人CD96结合至CD155。计算各种抗体的平均IC50值且在表20中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)且在表21中报告。
表20.抗TIGITxCD96多特异性分子阻断人CD96-CHO(同种型2)细胞结合至人CD155的IC50值。*
| 多特异性分子 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 5633 |
| BA125 | 3489 |
| BA127 | 1992 |
| BA129 | 11460 |
| BA130 | 7603 |
| BA131 | 4698 |
| BA133 | 非阻断剂 |
| BA134 | 1363 |
| BA136 | 983 |
*由3个实验计算出。
表21.显示抗TIGITxCD96多特异性分子阻断人CD96-CHO(同种型2)结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 379.7 | 1.66 |
| BA125 | 360.8 | 2.02 |
| BA127 | 338.6 | 2.94 |
| BA128 | 466.4 | N/A |
| BA129 | 404.8 | 2.78 |
| BA130 | 396.3 | 3.25 |
| BA131 | 385.0 | 1.98 |
| BA133 | 455.9 | N/A |
| BA134 | 328.8 | N/A |
| BA136 | 340.7 | N/A |
阻断食蟹猕猴CD96-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
在类似实验中，如上文关于人CD96-CHO细胞所述，通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子在试管内阻断CHO细胞上过度表达的野生型食蟹猕猴CD96(同种型2)与可溶性人CD155之间结合的能力。
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至人CD96-CHO细胞的抗体的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图7A-7I所示，抗TIGITxCD96多特异性分子BA129、BA131、BA134和BA136部分地阻断野生型食蟹猕猴CD96与人CD155之间的相互作用。由于多特异性分子是部分阻断剂，因此无法计算IC50值。计算曲线下面积(AUC)并在表22中报告。
表22.显示抗TIGITxCD96多特异性分子阻断食蟹猕猴CD96-CHO(同种型2)细胞结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
8.5.3抗TIGITxCD96多特异性分子结合至表达人和食蟹猕猴TIGIT的细胞
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子结合至各类型细胞的表面上的野生型人TIGIT或野生型食蟹猕猴TIGIT的能力。
对表达人TIGIT的CHO细胞的结合
评估抗TIGITxCD96多特异性分子结合至CHO细胞表面上所表达的野生型人TIGIT的能力。简单来说，用编码野生型全长人TIGIT的载体转染CHO细胞(人TIGIT-CHO)，且选择稳定表达TIGIT的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。
对于抗体结合分析来说，将人TIGIT-CHO细胞的冷冻等分试样在37℃下解冻，然后转移到含有补充有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)的管中。将细胞以300g离心五分钟。弃去上清液，将再悬浮于FACS缓冲液中的细胞以每孔2×105个细胞/50μL的密度接种在96孔U型底组织培养板中。在单独的微孔板中制备各种抗体的2倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从60μg/mL至0.000057μg/mL。然后将五十微升的各种稀释液转移到含有人TIGIT-CHO细胞的微孔板中。然后将细胞在4℃下温育45分钟。对于抗体染色来说，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次且以1:800最终稀释度再悬浮于含有R-藻红蛋白(PE)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图。使用四参数逻辑方程式，通过曲线拟合，使用所述软件测定引起50％最大结合的多特异性分子浓度(有效浓度50，[EC50])。
如图8A-8I所示，BA123、BA125、BA127、BA133和BA136以剂量依赖性方式结合至表达人TIGIT的CHO细胞。计算各种多特异性分子的平均EC50值且在表23中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表24中报告。
表23.多特异性分子结合至人TIGIT CHO细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 44.9 |
| BA125 | 30.7 |
| BA127 | 33.0 |
| BA129 | 不结合 |
| BA130 | 不结合 |
| BA131 | 不结合 |
| BA133 | 27.1 |
| BA134 | 不结合 |
| BA136 | 28.4 |
*由2个实验计算出。
表24.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人TIGIT-CHO细胞的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 143147 | 1866 |
| BA125 | 133572 | 8920 |
| BA127 | 122832 | 3169 |
| BA128 | 1304 | N/A |
| BA129 | 1197 | 75.4 |
| BA130 | 1437 | 94.2 |
| BA131 | 1297 | 148.5 |
| BA133 | 160549 | N/A |
| BA134 | 3073 | N/A |
| BA136 | 156823 | N/A |
对表达食蟹猕猴TIGIT的CHO细胞的结合
在类似实验中，测试抗TIGITxCD96多特异性分子结合至CHO细胞的能力，所述CHO细胞经工程改造以表达其细胞表面(食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞)上的野生型食蟹猕猴TIGIT。简单来说，用编码野生型全长食蟹猕猴TIGIT的载体转染CHO细胞，且选择稳定表达TIGIT的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的PowerCHO-2培养基中培养稳定细胞系。如上文关于人TIGIT-CHO细胞所述，测定抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO的能力。
如图9A-9I所示，BA123、BA125、BA127、BA133和BA136以剂量依赖性方式结合至表达食蟹猕猴TIGIT的CHO细胞。对于各种抗体，计算抗体结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞的平均EC50值且在表25中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表26中报告。
表25.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 165.0 |
| BA125 | 406.1 |
| BA127 | 257.7 |
| BA129 | 不结合 |
| BA130 | 不结合 |
| BA131 | 不结合 |
| BA133 | 235.1 |
| BA134 | 不结合 |
| BA136 | 456.9 |
*由2个实验计算出。
表26.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞的代表性实验的AUC值。
/>
8.5.4抗TIGITxCD96多特异性分子阻断配体结合至TIGIT
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子阻断野生型人TIGIT或野生型食蟹猕猴TIGIT与其配体人CD155之间结合的能力。
阻断人TIGIT-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
在此实例中，测试抗TIGITxCD96多特异性分子阻断野生型人TIGIT与其配体人CD155(也称为PVR)之间结合的能力。具体地说，通过流式细胞术在试管内测试抗体阻断CHO细胞上过度表达的人TIGIT与可溶性人CD155之间结合的能力。
简单来说，在FACS缓冲液中制备含有2μg/mL与R-藻红蛋白缀合的人CD155-Fc(CD155-Fc-PE)的溶液。然后将五十微升这种人CD155-Fc-PE工作储备液添加到96孔U形底微孔板的孔中。在微孔板中制备各种多特异性分子的4倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比3连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从120μg/mL至0.002μg/mL。将二十五微升的各种稀释液添加到含有CD155-Fc-PE的微孔板中。最后，将如上文所述制备的25μL人TIGIT-CHO细胞添加到各孔中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图且如上文所述加以分析。对于各种抗体浓度来说，根据方程式2，使用在多特异性分子不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的人TIGIT-CHO细胞所获得的MFI值和人TIGIT-CHO细胞自体荧光(背景)的MFI值将实验数据归一化。
方程式2
％最大信号＝
(“多特异性分子”MFI-“背景”MFI)/(“总”MFI-“背景”MFI)
其中
“多特异性分子”是BA123、BA125、BA127、BA129、BA130、BA131、BA133、BA134或BA136
“背景”是单独的细胞(无抗体或CD155-Fc-PE)
“总”是在抗体不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的细胞
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至人TIGIT-CHO细胞的多特异性分子的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图10A-10I所示，BA123、BA125、BA127、BA133和BA136阻断人TIGIT结合至CD155。计算各种抗体的平均IC50值且在表27中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表28中报告。
表27.抗TIGITxCD96多特异性分子阻断人TIGIT-CHO结合至人CD155的IC50值。*
| 多特异性分子 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 142 |
| BA125 | 135 |
| BA127 | 164 |
| BA129 | 非阻断剂 |
| BA130 | 非阻断剂 |
| BA131 | 非阻断剂 |
| BA133 | 200 |
| BA134 | 非阻断剂 |
| BA136 | 144 |
*由3个实验计算出。
表28.显示抗TIGITxCD96多特异性分子阻断人TIGIT-CHO结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 221.4 | 2.53 |
| BA125 | 210.7 | 0.93 |
| BA127 | 228.9 | 1.32 |
| BA128 | 449.3 | N/A |
| BA129 | 462.1 | 2.14 |
| BA130 | 456.7 | 2.01 |
| BA131 | 460.4 | 2.83 |
| BA133 | 244.5 | N/A |
| BA134 | 453.5 | N/A |
| BA136 | 216.8 | N/A |
阻断食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
在类似实验中，测试抗TIGITxCD96多特异性分子阻断野生型食蟹猕猴TIGIT与其配体人CD155(也称为PVR)之间结合的能力。简单来说，如上文关于人TIGIT-CHO细胞所述，通过流式细胞术在试管内测试抗体阻断CHO细胞上过度表达的野生型食蟹猕猴TIGIT与可溶性人CD155之间结合的能力。
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至人TIGIT-CHO细胞的抗体的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图11A-11I所示，抗TIGITxCD96多特异性分子BA123、BA125、BA127、BA133和BA136阻断食蟹猕猴CD96与CD155之间的相互作用。计算各种抗体的平均IC50值且在表29中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)且在表30中报告。
表29.抗TIGITxCD96多特异性分子阻断食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞结合至人CD155的IC50值。*
| 多特异性分子 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 2354 |
| BA125 | 2763 |
| BA127 | 2811 |
| BA129 | 非阻断剂 |
| BA130 | 非阻断剂 |
| BA131 | 非阻断剂 |
| BA133 | 2641 |
| BA134 | 非阻断剂 |
| BA136 | 2538 |
*由2个实验计算出。
表30.显示抗TIGITxCD96多特异性分子阻断食蟹猕猴TIGIT-CHO结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
8.5.5抗TIGITxCD96多特异性分子结合至共表达人TIGIT和人CD96的细胞
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子结合至各类型细胞的表面上的人TIGIT或人CD96的能力。
对共表达人TIGIT和人CD96的CHO细胞的结合
评估抗TIGITxCD96多特异性分子结合至CHO细胞表面上共表达的野生型人TIGIT和野生型人CD96的能力。简单来说，用编码野生型人TIGIT的载体转染CHO细胞(人TIGIT-CHO)，且选择稳定表达TIGIT的克隆系。然后用编码野生型人CD96(同种型2)的载体转染这些细胞，以产生表达人TIGIT和人CD96两者的细胞系(人TIGIT-CD96-CHO)。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养这些稳定细胞系。通过流式细胞术确认表达。细胞经克隆具有高TIGIT表达水平，而且具有一定的CD96表达范围。
对于抗体结合分析来说，将人TIGIT-CD96 CHO细胞的冷冻等分试样在37℃下解冻，然后转移到含有补充有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)的管中。将细胞以300g离心五分钟。弃去上清液，将再悬浮于FACS缓冲液中的细胞以每孔2×105个细胞/50μL的密度接种在96孔U型底组织培养板中。在单独的微孔板中制备各种抗体的2倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比3连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从60μg/mL至0.001μg/mL。然后将五十微升的各种稀释液转移到含有人TIGIT-CD96-CHO细胞的微孔板中。然后将细胞在4℃下温育45分钟。对于抗体染色来说，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次且以1:800最终稀释度再悬浮于含有R-藻红蛋白(PE)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图。使用四参数逻辑方程式，通过曲线拟合，使用所述软件测定引起50％最大结合的多特异性分子浓度(有效浓度50，[EC50])。
如图12A-12I所示，BA123、BA125、BA127、BA129、BA130、BA131、BA133、BA134和BA136以剂量依赖性方式结合至表达人TIGIT-CD96的CHO细胞。计算各种多特异性抗体的平均EC50值且在表31中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表32中报告。
表31.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人TIGIT-CD96-CHO细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 2.36 |
| BA125 | 2.58 |
| BA127 | 11.91 |
| BA129 | 不拟合 |
| BA130 | 不拟合 |
| BA131 | 不拟合 |
| BA133 | 24.37 |
| BA134 | 不拟合 |
| BA136 | 4.40 |
*由2个实验计算出。
表32.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人TIGIT-CD96 CHO细胞的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 145831 | 2716 |
| BA125 | 172085 | 6165 |
| BA127 | 156923 | 2020 |
| BA128 | 1458 | N/A |
| BA129 | 7233 | 128.9 |
| BA130 | 8971 | 122.6 |
| BA131 | 13367 | 374.9 |
| BA133 | 131494 | N/A |
| BA134 | 15662 | N/A |
| BA136 | 177760 | N/A |
8.5.6抗TIGITxCD96多特异性分子阻断配体结合至共表达人TIGIT和人CD96的细胞
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子阻断各类型细胞的表面上的人TIGIT与人CD96之间结合的能力。
阻断可溶性人CD155结合至表达人TIGIT和人CD96的CHO细胞
在此实例中，测试抗TIGITxCD96多特异性分子阻断野生型人TIGIT和野生型人CD96与其配体人CD155(也称为PVR)之间结合的能力。具体地说，通过流式细胞术在试管内测试抗体阻断CHO细胞上过度表达的人TIGIT和人CD96与可溶性人CD155之间结合的能力。
简单来说，在FACS缓冲液中制备含有2μg/mL与R-藻红蛋白缀合的人CD155-Fc(CD155-Fc-PE)的溶液。然后将五十微升这种人CD155-Fc-PE工作储备液添加到96孔U形底微孔板的孔中。在微孔板中制备各种多特异性分子的4倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比3连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从120μg/mL至0.002μg/mL。将二十五微升的各种稀释液添加到含有CD155-Fc-PE的微孔板中。最后，将如上文所述制备的25μL人TIGIT-CHO细胞添加到各孔中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图且如上文所述加以分析。对于各种多特异性分子浓度来说，根据方程式3，使用在多特异性分子不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的人TIGIT-CHO细胞所获得的MFI值和人TIGIT-CHO细胞自体荧光(背景)的MFI值将实验数据归一化。
方程式3
％最大信号＝
(“多特异性分子”MFI-“背景”MFI)/(“总”MFI-“背景”MFI)
其中
“多特异性分子”是BA123、BA125、BA127、BA129、BA130、BA131、BA133、BA134或BA136
“背景”是单独的细胞(无抗体或CD155-Fc-PE)
“总”是在抗体不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的细胞
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至人TIGIT-CD96-CHO细胞的多特异性分子的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图13A-13I所示，BA123、BA125、BA127、BA133和BA136阻断人TIGIT-CD96结合至CD155。BA129、BA130、BA131和BA134部分地阻断人TIGIT-CD96结合至CD155。计算各种多特异性分子的平均IC50值且在表33中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表34中报告。
表33.抗TIGITxCD96多特异性分子阻断人TIGIT-CD96-CHO结合至人CD155的IC50值。*
| 多特异性分子 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 111.6 |
| BA125 | 143.2 |
| BA127 | 141.2 |
| BA129 | 不拟合 |
| BA130 | 不拟合 |
| BA131 | 不拟合 |
| BA133 | 266.6 |
| BA134 | 不拟合 |
| BA136 | 113.7 |
*由2个实验计算出。
表34.显示抗TIGITxCD96多特异性分子阻断人TIGIT-CD96-CHO结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 209.2 | 2.406 |
| BA125 | 213.0 | 3.209 |
| BA127 | 217.1 | 2.936 |
| BA128 | 448.9 | N/A |
| BA129 | 399.1 | 4.603 |
| BA130 | 432.1 | 7.002 |
| BA131 | 447.6 | 3.035 |
| BA133 | 254.2 | N/A |
| BA134 | 428.1 | N/A |
| BA136 | 204.6 | N/A |
8.6实例6：抗TIGITxCD96多特异性分子结合至表达人FcγRIIIa的细胞
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGITxCD96多特异性分子结合至各类型细胞的表面上的人FcγRIIIa的变体V/V或变体F/F的能力。
对表达人FcγRIIIa的CHO细胞的结合
评估抗TIGITxCD96多特异性分子结合至CHO细胞表面上所表达的人FcγRIIIa的变体V/V或变体F/F的能力。简单来说，用编码全长人FcγRIIIa(人FcγRIIIa-CHO)变体V/V或F/F的载体转染CHO细胞，且选择稳定表达FcγRIIIa(变体V/V或变体F/F)的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。
对于抗体结合分析来说，将人FcγRIIIa-CHO细胞(变体V/V或变体F/F)细胞的冷冻等分试样在37℃下解冻，然后转移到含有补充有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)的管中。将细胞以300g离心五分钟。弃去上清液，将再悬浮于FACS缓冲液中的细胞以每孔2×105个细胞/50μL的密度接种在96孔U型底组织培养板中。在单独的微孔板中制备各种多特异性分子的2倍浓缩中间储备液。多特异性分子在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从60μg/mL至0.000057μg/mL。然后将五十微升的各种稀释液转移到含有人FcγRIIIa-CHO(变体V/V或变体F/F)细胞的微孔板中。然后将细胞在4℃下温育45分钟。对于抗体染色来说，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次且以1:800最终稀释度再悬浮于含有R-藻红蛋白(PE)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图。使用四参数逻辑方程式，通过曲线拟合，使用所述软件测定引起50％最大结合的多特异性分子浓度(有效浓度50，[EC50])。
如图14A-14F(变体V/V)和15A-15F(变体F/F)所示，BA123、BA125、BA127、BA129、BA130和BA131以剂量依赖性方式结合至表达人FcγRIIIa的CHO细胞。计算各种多特异性分子的平均EC50值且变体V/V的值在表35中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)且在表36和37中报告(分别为变体V/V和变体F/F)。
表35.抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人FcγRIIIa-CHO(变体V/V)细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA123 | 188.8 |
| BA125 | 153.3 |
| BA127 | 147.8 |
| BA129 | 126.5 |
| BA130 | 118.4 |
| BA131 | 123.6 |
*由2个实验计算出。
表36.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人FcγRIIIa-CHO(变体V/V)细胞的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 36722 | 545.6 |
| BA125 | 43351 | 167.6 |
| BA127 | 35159 | 97.1 |
| BA129 | 36957 | 317.6 |
| BA130 | 44399 | 701.1 |
| BA131 | 35486 | 267.1 |
表37.显示抗TIGITxCD96多特异性分子结合至人FcγRIIIa-CHO(变体F/F)细胞的实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA123 | 27774 | 732 |
| BA125 | 35798 | 426 |
| BA127 | 28498 | 653 |
| BA129 | 23351 | 695 |
| BA130 | 29783 | 689 |
| BA131 | 25318 | 434 |
8.7实例7：抗CD96抗体的表征
8.7.1抗人CD96抗体结合至表达人和食蟹猕猴CD96(同种型2)的细胞
通过流式细胞术在试管内测试抗CD96抗体结合至各类型细胞的表面上的野生型人CD96或野生型食蟹猕猴CD96的能力。
对表达人CD96的CHO细胞的结合
评估抗CD96抗体结合至CHO细胞表面上所表达的野生型人CD96的能力。简单来说，用编码人CD96(人CD96-CHO)同种型2的载体转染CHO细胞，且选择稳定表达CD96同种型2的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的PowerCHO-2培养基中培养稳定细胞系。
对于抗体结合分析来说，将人CD96-CHO细胞(同种型2)的冷冻等分试样在37℃下解冻，然后转移到含有补充有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)的管中。将细胞以300g离心五分钟。弃去上清液，将再悬浮于FACS缓冲液中的细胞以每孔2×105个细胞/50μL的密度接种在96孔U型底组织培养板中。在单独的微孔板中制备各种抗体的2倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从60μg/mL至0.000057μg/mL。然后将五十微升的各种稀释液转移到含有人CD96-CHO细胞的微孔板中。然后将细胞在4℃下温育45分钟。对于抗体染色来说，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次且以1:800最终稀释度再悬浮于含有R-藻红蛋白(PE)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图。该软件用于通过使用四参数逻辑方程的曲线拟合来确定导产生50％最大结合的抗体浓度(有效浓度50，[EC50])。
如图16A-16C所示，抗CD96抗体BA143、BA144和BA145以剂量依赖性方式结合至表达人CD96的CHO细胞(同种型2)。计算各种抗体的平均EC50值且在表38中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表39中报告。
表38.抗CD96抗体结合至人CD96(iso2)CHO细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA143 | 5.9 |
| BA144 | 21.1 |
| BA145 | 26.7 |
*由2个实验计算出。
表39.显示抗CD96抗体结合至人CD96(iso2)CHO细胞的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA143 | 215277 | 2774 |
| BA144 | 236887 | 4647 |
| BA145 | 225036 | 1556 |
| BA146 | 2057 | N/A |
对表达食蟹猕猴CD96的CHO细胞的结合
在类似实验中，测试抗CD96抗体结合至CHO细胞的能力，所述CHO细胞经工程改造以表达其细胞表面(食蟹猕猴CD96-CHO细胞)上的野生型食蟹猕猴CD96(同种型2)。简单来说，用编码野生型食蟹猕猴CD96同种型2的载体转染CHO细胞，且选择稳定表达食蟹猕猴CD96的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。如上文关于人CD96-CHO细胞所述，测定抗CD96抗体结合至食蟹猕猴CD96-CHO的能力。
如图17A-17C所示，抗CD96抗体BA143和BA145以剂量依赖性方式结合至表达食蟹猕猴CD96的CHO细胞。对于各种抗体，计算抗CD96抗体结合至食蟹猕猴CD96-CHO细胞的平均EC50值且在表40中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表41中报告。
表40.抗CD96抗体结合至食蟹猕猴CD96-CHO细胞的EC50值。*
| 多特异性分子 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA143 | 不拟合 |
| BA144 | 不结合 |
| BA145 | 1046 |
*由2个实验计算出。
表41.显示抗CD96抗体结合至食蟹猕猴CD96-CHO细胞的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA143 | 3675 | 144.9 |
| BA144 | 862.3 | 11.65 |
| BA145 | 4115 | 62.17 |
| BA146 | 781.4 | N/A |
8.7.2抗人CD96抗体阻断配体结合至人CD96
阻断人CD96-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
在此实例中，测试抗CD96抗体阻断野生型人CD96与其配体人CD155(也称为PVR)之间结合的能力。具体地说，通过流式细胞术在试管内测试抗体阻断CHO细胞上过度表达的人CD96(同种型2)与可溶性人CD155之间结合的能力。
简单来说，在FACS缓冲液中制备含有2μg/mL与R-藻红蛋白缀合的人CD155-Fc(CD155-Fc-PE)的溶液。然后将五十微升这种人CD155-Fc-PE工作储备液添加到96孔U形底微孔板的孔中。在微孔板中制备各种抗体的4倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从120μg/mL至0.0001μg/mL。将二十五微升的各种稀释液添加到含有CD155-Fc-PE的微孔板中。最后将如上文所述制备的25μL人CD96-CHO细胞(同种型2)添加到各孔中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图且如上文所述加以分析。
对于各种抗体浓度来说，根据方程式4，使用在抗体不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的人CD96-CHO细胞所获得的MFI值和人CD96-CHO细胞自体荧光(背景)的MFI值将实验数据归一化。
方程式4
％最大信号＝
(“抗体”MFI-“背景”MFI)/(“总”MFI-“背景”MFI)
其中
“抗体”是BA143、BA144或BA145
“背景”是单独的细胞(无抗体或CD155-Fc-PE)
“总”是在抗体不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的细胞
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至人CD96-CHO细胞的抗体的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图18A-18C所示，BA143、BA144和BA145阻断人CD96-CHO结合至CD155。计算各种抗体的平均IC50值且在表42中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表43中报告。
表42.抗CD96抗体阻断人CD96-CHO(同种型2)结合至人CD155的IC50值。*
| 抗体 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA143 | 152.4 |
| BA144 | 257.2 |
| BA145 | 542.1 |
*由3个实验计算出。
表43.显示抗CD96抗体阻断人CD96-CHO(同种型2)结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
| 抗体 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA143 | 357.2 | 3.61 |
| BA144 | 370.2 | 3.53 |
| BA145 | 401.7 | 2.58 |
| BA146 | 573.5 | N/A |
阻断食蟹猕猴CD96-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
在类似实验中，测试抗CD96抗体阻断野生型食蟹猕猴CD96与其配体人CD155(也称为PVR)之间结合的能力。简单来说，如上文关于人CD96-CHO细胞所述，通过流式细胞术在试管内测试抗体阻断CHO细胞上过度表达的野生型食蟹猕猴CD96(同种型2)与可溶性人CD155之间结合的能力。
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至人CD96-CHO细胞的抗体的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图19A-19C所示，抗CD96抗体BA145阻断而BA143部分地阻断食蟹猕猴CD96与CD155之间的相互作用。计算BA145的平均IC50值，并在表44中报告。由于部分阻断，因此无法计算BA143的IC50值。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表45中报告。
表44.抗CD96抗体阻断食蟹猕猴CD96(同种型2)结合至人CD155的IC50值。*
| 抗体 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA143 | 不拟合 |
| BA144 | 不阻断 |
| BA145 | 794.8 |
*由3个实验计算出。
表45.显示抗CD96抗体阻断食蟹猕猴CD96(同种型2)结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
| 多特异性分子 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA143 | 543.9 | 4.19 |
| BA144 | 569.5 | 4.70 |
| BA145 | 417.0 | 4.70 |
| BA146 | 567.0 | N/A |
8.8实例8：抗TIGIT抗体的表征
8.8.1抗人TIGIT抗体结合至表达人和食蟹猕猴TIGIT的细胞
通过流式细胞术在试管内测试抗TIGIT抗体结合至各类型细胞的表面上的野生型人TIGIT或野生型食蟹猕猴TIGIT的能力。
对表达人TIGIT的CHO细胞的结合
评估抗TIGIT抗体结合至CHO细胞表面上所表达的野生型人TIGIT的能力。简单来说，用编码野生型人TIGIT的载体转染CHO细胞(人TIGIT-CHO)，且选择稳定表达TIGIT的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。
对于抗体结合分析来说，将人TIGIT-CHO细胞的冷冻等分试样在37℃下解冻，然后转移到含有补充有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)的管中。将细胞以300g离心五分钟。弃去上清液，将再悬浮于FACS缓冲液中的细胞以每孔2×105个细胞/50μL的密度接种在96孔U型底组织培养板中。在单独的微孔板中制备各种抗体的2倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从60μg/mL至0.000057μg/mL。然后将五十微升的各种稀释液转移到含有人TIGIT-CHO细胞的微孔板中。然后将细胞在4℃下温育45分钟。对于抗体染色来说，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次且以1:800最终稀释度再悬浮于含有R-藻红蛋白(PE)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图。使用四参数逻辑方程式，通过曲线拟合，使用所述软件测定引起50％最大结合的抗体浓度(有效浓度50，[EC50])。
如图20所示，BA148以剂量依赖性方式结合至表达人TIGIT的CHO细胞。计算各种抗体的平均EC50值且在表46中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表47中报告。
表46.抗TIGIT抗体结合至人TIGIT CHO细胞的EC50值。*
| 抗体 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA148 | 8.2 |
*由2个实验计算出。
表47.显示抗TIGIT抗体结合至人TIGIT CHO细胞的代表性实验的AUC值。
| 抗体 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA148 | 297761 | 1286 |
| BA149 | 653.3 | 49.26 |
对表达食蟹猕猴TIGIT的CHO细胞的结合
在类似实验中，测试抗TIGIT抗体结合至CHO细胞的能力，所述CHO细胞经工程改造以表达其细胞表面(食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞)上的野生型食蟹猕猴TIGIT。简单来说，用编码野生型食蟹猕猴TIGIT的载体转染CHO细胞，且选择稳定表达食蟹猕猴TIGIT的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1x HT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。如上文关于人TIGIT-CHO细胞所述，测定抗TIGIT抗体结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO的能力。
如图21所示，BA148以剂量依赖性方式结合至表达食蟹猕猴TIGIT的CHO细胞。对于各种抗体，计算BA148结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞的平均EC50值且在表48中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表49中报告。
表48.抗TIGIT抗体结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞的EC50值。*
| 抗体 | EC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA148 | 53.42 |
*由2个实验计算出。
表49.显示抗TIGIT抗体结合至食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞的代表性实验的AUC值。
| 抗体 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA148 | 283737 | 1822 |
| BA149 | 578.8 | 31.16 |
8.8.2抗人TIGIT抗体阻断配体结合至TIGIT
阻断人TIGIT-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
在此实例中，测试抗TIGIT抗体阻断野生型人TIGIT与其配体人CD155(也称为PVR)之间结合的能力。具体地说，通过流式细胞术在试管内测试抗体阻断CHO细胞上过度表达的野生型人TIGIT与可溶性人CD155之间结合的能力。
简单来说，在FACS缓冲液中制备含有2μg/mL与R-藻红蛋白缀合的人CD155-Fc(CD155-Fc-PE)的溶液。然后将五十微升这种人CD155-Fc-PE工作储备液添加到96孔U形底微孔板的孔中。在微孔板中制备各种抗体的4倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从120μg/mL至0.0001μg/mL。将二十五微升的各种稀释液添加到含有CD155-Fc-PE的微孔板中。最后，将如上文所述制备的25μL人TIGIT-CHO细胞添加到各孔中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPadPrism软件将数据作图且如上文所述加以分析。
对于各种抗体浓度来说，根据方程式5，使用在抗体不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的人TIGIT-CHO细胞所获得的MFI值和人TIGIT-CHO细胞自体荧光(背景)的MFI值将实验数据归一化。
方程式5
％最大信号＝
(“抗体”MFI-“背景”MFI)/(“总”MFI-“背景”MFI)
其中
“抗体”是BA148
“背景”是单独的细胞(无抗体或CD155-Fc-PE)
“总”是在抗体不存在下与CD155-Fc-PE一起温育的细胞
测定抑制50％CD155-Fc-PE结合至野生型人TIGIT-CHO细胞的抗体的浓度(IC50)。IC50值是使用GraphPad Prism软件通过曲线拟合使用四参数逻辑方程计算的。
如图22所示，BA148阻断野生型人TIGIT结合至CD155。计算各种抗体的平均IC50值且在表50中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)且在表51中报告。
表50.抗TIGIT抗体阻断人TIGIT-CHO结合至人CD155的IC50值。*
| 抗体 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA148 | 8.4 |
*由3个实验计算出。
表51.显示抗TIGIT抗体阻断人TIGIT-CHO结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
| 抗体 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA148 | 250.9 | 3.24 |
| BA149 | 563.7 | 3.60 |
阻断食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞对可溶性人CD155的结合
在此实例中，测试抗TIGIT抗体阻断野生型食蟹猕猴TIGIT与其配体人CD155(也称为PVR)之间结合的能力。具体地说，通过流式细胞术在试管内测试抗体阻断CHO细胞上过度表达的野生型食蟹猕猴TIGIT与可溶性人CD155之间结合的能力。
简单来说，在FACS缓冲液中制备含有2μg/mL与R-藻红蛋白缀合的人CD155-Fc(CD155-Fc-PE)的溶液。然后将五十微升这种人CD155-Fc-PE工作储备液添加到96孔U形底微孔板的孔中。在微孔板中制备各种多特异性分子的4倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从120μg/mL至0.0001μg/mL。将二十五微升的各种稀释液添加到含有CD155-Fc-PE的微孔板中。最后，将如上文所述制备的25μL食蟹猕猴TIGIT-CHO细胞添加到各孔中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图且如上文所述加以分析。
如图23所示，BA148阻断食蟹猕猴TIGIT-CHO结合至CD155。计算各种抗体的平均IC50值且在表52中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)，并在表53中报告。
表52.抗TIGIT抗体阻断食蟹猕猴TIGIT-CHO结合至人CD155的IC50值。
| 抗体 | IC50(几何平均值)，ng/mL |
| BA148 | 243.1 |
*由3个实验计算出。
表53.显示抗TIGIT抗体阻断食蟹猕猴TIGIT-CHO结合至人CD155的代表性实验的AUC值。
| 抗体 | 曲线下面积(AUC) | 标准误差 |
| BA148 | 359.9 | 3.18 |
| BA149 | 543.4 | 3.59 |
8.9实例9：抗人TIGIT和抗人CD96抗体结合至表达FcγRIIIa变体V/V和F/F的细胞
流式细胞术在试管内测试抗TIGIT和抗CD96抗体结合至各类型细胞的表面上的人FcγRIIIa(变体V/V和变体F/F)的能力。
对表达人FcγRIIIa的CHO细胞的结合
评估抗TIGIT和抗CD96抗体结合至CHO细胞表面上所表达的人FcγRIIIa的能力。简单来说，用编码人FcγRIIIa(人FcγRIIIa-CHO)变体V/V或F/F的载体转染CHO细胞，且选择稳定表达FcγRIIIa变体V/V或变体F/F的克隆系。在含有4mM L-谷氨酰胺、100U/mL 1xHT-补充剂和2.5μg/mL嘌呤霉素的Power CHO-2培养基中培养稳定细胞系。
对于抗体结合分析来说，将人FcγRIIIa-CHO细胞(变体V/V或变体F/F)的冷冻等分试样在37℃下解冻，然后转移到含有补充有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的DPBS(FACS缓冲液)的管中。将细胞以300g离心五分钟。弃去上清液，将再悬浮于FACS缓冲液中的细胞以每孔2×105个细胞/50μL的密度接种在96孔U型底组织培养板中。在单独的微孔板中制备各种抗体的2倍浓缩中间储备液。抗体在FACS缓冲液中按1比4连续稀释。制备总共11个工作稀释液，范围从60μg/mL至0.000057μg/mL。然后将五十微升的各种稀释液转移到含有人FcγRIIIa-CHO(变体V/V或变体F/F)细胞的微孔板中。然后将细胞在4℃下温育45分钟。对于抗体染色来说，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次且以1:800最终稀释度再悬浮于含有R-藻红蛋白(PE)AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson，目录号109-116-098)的FACS缓冲液中。在冰上温育30分钟后，用冷FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪)分析细胞。使用FlowJo软件，通过将FSC-A对SSC-A和SSC-H对SSC-A依序设门来分析数据。计算PE的平均荧光强度(MFI)值，且通过GraphPad Prism软件将数据作图。该软件用于通过使用四参数逻辑方程的曲线拟合来确定导产生50％最大结合的抗体浓度(有效浓度50，[EC50])。
如图24A-24D所示，BA143、BA144、BA145和BA148以剂量依赖性方式结合至表达人FcγRIIIa的CHO细胞的变体V/V。计算各种抗体的平均EC50值且在表54中报告。计算代表性实验的曲线下面积(AUC)且在表55中报告。
如图25A-25E所示，BA143、BA144和BA148以剂量依赖性方式结合至表达人FcγRIIIa的CHO细胞的变体F/F。计算各种抗体的EC50值且在表56中报告。计算曲线下面积(AUC)并在表57中报告。
表54.抗TIGIT和抗CD96抗体结合至人FcγRIIIa(V/V)CHO细胞的EC50值。*
| 抗体 | EC50，ng/mL |
| BA143 | 191.5 |
| BA144 | 271.7 |
| BA145 | 329.1 |
| BA148 | 45.5 |
*由2个实验计算出。
表55.显示抗TIGIT和抗CD96抗体结合至人FcγRIIIa(V/V)CHO细胞的代表性实验的AUC值。
| 抗体 | 曲线下面积(AUC) |
| BA143 | 28879 |
| BA144 | 38938 |
| BA145 | 29559 |
| BA148 | 50127 |
表56.抗TIGIT和抗CD96抗体结合至人FcγRIIIa(F/F)CHO细胞的EC50值。
| 抗体 | EC50，ng/mL |
| BA143 | 不拟合 |
| BA144 | 不拟合 |
| BA145 | 不拟合 |
| BA148 | 2.62 |
*由1个实验计算出。
表57.显示抗TIGIT和抗CD96抗体结合至人FcγRIIIa(F/F)CHO细胞的实验的AUC值
| 抗体 | 曲线下面积(AUC) |
| BA143 | 10043 |
| BA144 | 14171 |
| BA145 | 3333 |
| BA148 | 66622 |
8.10实例10：抗TIGITxCD96多特异性分子对人原代T细胞的结合
在此实例中，测试抗TIGITxCD96多特异性分子BA127以及抗CD96单特异性对照抗体BA143、抗TIGIT单特异性抗体BA148或双特异性同型对照抗体BA128结合至人活化T细胞的能力。对于活化的T细胞来说，从液氮中检取来自四位不同健康供体的人PBMC的冷冻等分试样且立即在37℃水中解冻，直至观察到浮冰为止。然后将细胞转移到10mL预温热的R10培养基中。取出20μL并且添加到380μL活力染料中以对细胞计数并且使用Muse仪器检查活力。将样品以1200rpm离心五分钟，然后用R10培养基悬浮至终浓度为1×106个细胞/mL。细胞用每1×106个细胞25μl的immunoCult CD3/CD28 T细胞活化剂刺激且将100μL经刺激的细胞吸移到96孔圆底组织培养板的各孔中且在37℃下、在5％CO2中温育四天。
将一定剂量范围的多特异性分子或抗体放入圆底96孔板中。首先，在缓冲液中制备200μL的50μg/mL各种抗体。然后，通过将20μL前述稀释液吸移到180μL样品缓冲液中、按1比10连续稀释多特异性分子和抗体。制备总共8种稀释液，范围从50μg/mL至0.000005μg/mL。四天之后，将样品板以2000rpm离心两分钟，且丢弃上清液。按照5μL/100μL测试物，用FACs缓冲液中制备的FcγR阻断剂将样品阻断10分钟。然后将样品板以2000rpm离心两分钟，弃去上清液。然后将细胞以图26A-26F中所示的浓度再悬浮于100μL抗TIGITxCD96多特异性分子或相关同型对照物中。将样品板在4℃下温育30分钟。通过添加冷样品缓冲液洗涤细胞且以2000rpm离心两分钟并且丢弃上清液。该洗涤重复一次。
然后将细胞再悬浮于荧光标记抗体的混合液中。在FACs缓冲液中制备足以供所有样品用的荧光标记抗体的混合液。然后向圆底96孔板中添加每孔100μL抗体。将样品板在冰上温育20分钟。通过添加冷样品缓冲液洗涤细胞，以2000rpm离心两分钟，且丢弃上清液。该洗涤重复一次。在11mL FACs缓冲液中制备经PE标记的二次抗人IgG抗体的最终混合液。向圆底96孔板中每孔添加100μL二次抗体。将样品板在冰上温育5分钟。通过添加冷样品缓冲液洗涤细胞，以2000rpm离心两分钟，且丢弃上清液。该洗涤重复一次。
使用BD LSR Fortessa流式细胞仪通过流式细胞术测量抗体结合。通过前向散射面积(FSC-A)与侧向散射面积(SSC-A)的图和另一个用于单细胞选择的FSC-A与FSC高度(FSC-H)的图，使用未染色的对照细胞对淋巴细胞群进行门控。经各种个别抗体染色的细胞的管用于计算实验中所用的各种颜色的补偿。每个样品记录100,000个事件。通过对以下群体依序设门来分析样品：FSC-A对SSC-A、FSC-H对FSC-A、SSC-A对活/死细胞、CD4对CD8，以及SSC对CD25。计算平均荧光强度(MFI)。
如图26A-26F所示，TIGITxCD96多特异性分子BA127对所有三位独立供体的人活化原代CD4+T细胞(图26A、26B和26C)和人活化原代CD8+T细胞(图26D、256和26F)展现强结合。值得注意的是，与对应的抗CD96单特异性对照抗体BA143和抗TIGIT单特异性抗体BA148相比，BA127对来自供体1和2的活化CD4+(图26A和26B)和CD8+(图26D和26E)T细胞展现优良的最大结合。BA127对来自供体3的活化CD4+和CD8+T细胞显示的结合类似于BA143(图26C和26F)。
8.11实例11：抗TIGITxCD96多特异性分子对人原代T细胞的结合
在此实验中，测试抗TIGITxCD96多特异性分子BA127结合至人活化T细胞的能力。对于活化的T细胞来说，从液氮中检取来自四位不同健康供体的人PBMC的冷冻等分试样且立即在37℃水中解冻，直至观察到浮冰为止。然后将细胞转移到10mL预温热的R10培养基中。取出20μL并且添加到380μL活力染料中以对细胞计数并且使用Muse仪器检查活力。将样品以1200rpm离心五分钟，然后用R10培养基悬浮至终浓度为1×106个细胞/mL。细胞用每1×106个细胞25μl的immunoCult CD3/CD28 T细胞活化剂刺激且将100μL经刺激的细胞吸移到96孔圆底组织培养板的各孔中且在37℃下、在5％CO2中温育四天。
将一定剂量范围的多特异性分子或抗体(BA127或双特异性同型对照抗体BA128)放入圆底96孔板中。首先，在缓冲液中制备200μL的25μg/mL各种抗体。然后，通过将50μL前述稀释液吸移到150μL样品缓冲液中、按1比4连续稀释多特异性分子和抗体。制备总共8种稀释液，范围从50μg/mL至0.000005μg/mL。四天之后，将样品板以2000rpm离心两分钟，且丢弃上清液。按照5μL/100μL测试物，用FACs缓冲液中制备的FcγR阻断剂将样品阻断10分钟。然后将样品板以2000rpm离心两分钟，弃去上清液。然后将细胞以图27A-27F中所示的浓度再悬浮于100μL抗TIGITxCD96多特异性分子(BA127)或相关同型对照物(BA128)中。将样品板在4℃下温育30分钟。通过添加冷样品缓冲液洗涤细胞且以2000rpm离心两分钟并且丢弃上清液。该洗涤重复一次。
然后将细胞再悬浮于荧光标记抗体的混合液中。在FACs缓冲液中制备足以供所有样品用的荧光标记抗体的混合液。然后向圆底96孔板中添加每孔100μL抗体。将样品板在冰上温育20分钟。通过添加冷样品缓冲液洗涤细胞，以2000rpm离心两分钟，且丢弃上清液。该洗涤重复一次。在11mL FACs缓冲液中制备经PE标记的二次抗人IgG抗体的最终混合液。向圆底96孔板中每孔添加100μl二次抗体。将样品板在冰上温育5分钟。通过添加冷样品缓冲液洗涤细胞，以2000rpm离心两分钟，且丢弃上清液。该洗涤重复一次。
使用BD LSR Fortessa流式细胞仪通过流式细胞术测量抗体结合。通过前向散射面积(FSC-A)与侧向散射面积(SSC-A)的图和另一个用于单细胞选择的FSC-A与FSC高度(FSC-H)的图，使用未染色的对照细胞对淋巴细胞群进行门控。经各种个别抗体染色的细胞的管用于计算实验中所用的各种颜色的补偿。每个样品记录100,000个事件。通过对以下群体依序设门来分析样品：FSC-A对SSC-A、FSC-H对FSC-A、SSC-A对活/死细胞、CD4对CD8，以及SSC对CD25。计算平均荧光强度(MFI)。
如图27A-27F所示，TIGITxCD96多特异性分子BA127以剂量依赖性方式结合至来自三位独立供体的人活化原代CD4+T细胞(图27A、27B和27C)和人活化原代CD8+T细胞(图27D、27E和27F)。
8.12实例12：SEA刺激分析
在此实例中，相较于对照多特异性分子，测试抗TIGITxCD96多特异性分子促进经SEA刺激的PBMC分泌细胞因子白介素-2(IL-2)的能力。
在1.2mL锥形管中，用5倍浓缩的中间储备液制备一定剂量范围的抗TIGITxCD96多特异性分子BA123、BA125和BA127、同型对照多特异性分子BA128以及抗CD96 x同型对照多特异性分子BA129、BA130和BA131中的每一种。首先，在R10培养基中制备250μg/ml中间储备液且通过连续稀释、按1比10连续稀释抗体，获得总共8种稀释液。向圆底96孔板中每孔添加20μL抗体，最终浓度在50μg/mL至0.000005μg/mL范围内。
从液氮中检取人PBMC的冷冻等分试样并且立即在37℃水中解冻，直至观察到浮冰为止。将细胞转移至10mL预热的R10培养基中并立即以1500rpm离心五分钟。丢弃上清液并使细胞再悬浮于新鲜的R10培养基中。为了将细胞计数和检查活力，取出20μL样品并添加到380μL活力染料中，混合并使用Muse仪器读数。
使细胞再悬浮达到中间浓度。通过将10μL的10μg/mL SEA添加至90μL R10中以得到1μg/mL的中间浓度来制备中间储备液浓度的SEA。首先用SEA肽刺激细胞并且将80μL细胞和SEA混合物添加至相应孔中，并且在潮湿室内，在组织培养恒温箱中、在37℃和5％CO2中温育四天。使用总共100,000个细胞/孔和1ng/mL最终浓度的SEA。
在温育四天后，将板从恒温箱中取出。然后将板以2000rpm离心两分钟。将5μL上清液转移至384孔AlphaLISA板进行细胞因子分析。AlphaLISA试剂盒(Perkin Elmer)用于测量IL-2分泌。简单来说，通过将2.5mL的10xAlphaLISA免疫分析缓冲液吸移到22.5mL水中来制备分析缓冲液。人IL-2分析物用于制备标准稀释液。在分析缓冲液中制备1.6xAlphaLISA抗IL-2受体珠粒和生物素化抗IL-2抗体的混合物。每孔添加8μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。在分析缓冲液中制备2.3x链霉亲和素供体珠粒中间储备液。每孔添加10μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。使用AlphaScreen方案在EnVision读板器上测量相对光单位(RLU)。在GraphPad Prism中对结果作图并使用非线性回归拟合曲线。
如图28A-28C所示，相较于同型对照物BA128，抗TIGITxCD96多特异性分子BA123、BA125和BA127(图28A)以及BA125和BA127(图28B)有力地增强T细胞反应，正如根据白介素-2(IL-2)细胞因子分泌所测定。另外，相较于仅结合CD96的多特异性分子BA129、BA130和BA131或同型对照抗体BA128，BA127展现优良的功能活性(图28C)。
8.13实例13：SEA刺激分析
在1.2mL锥形管中，用5倍浓缩的中间储备液制备一定剂量范围的抗TIGITxCD96多特异性分子BA127、同型对照多特异性分子BA128、抗CD96单特异性抗体对照BA143和抗TIGIT单特异性抗体对照BA148中的每一种。首先，在R10培养基中制备250μg/ml中间储备液且通过连续稀释、按1比10连续稀释抗体，获得总共8种稀释液。向圆底96孔板中每孔添加20μL抗体，最终浓度在50μg/mL至0.000005μg/mL范围内。
从液氮中检取人PBMC的冷冻等分试样并且立即在37℃水中解冻，直至观察到浮冰为止。将细胞转移至10mL预热的R10培养基中并立即以1500rpm离心五分钟。丢弃上清液并使细胞再悬浮于新鲜的R10培养基中。为了将细胞计数和检查活力，取出20μL样品并添加到380μL活力染料中，混合并使用Muse仪器读数。
使细胞再悬浮达到中间浓度。通过将10μL的10μg/mL SEA添加至90μL R10中以得到1μg/mL的中间浓度来制备中间储备液浓度的SEA。首先用SEA肽刺激细胞并且将80μL细胞和SEA混合物添加至相应孔中，并且在潮湿室内，在组织培养恒温箱中、在37℃和5％CO2中温育四天。使用总共100,000个细胞/孔和1ng/mL最终浓度的SEA。
在温育四天后，将板从恒温箱中取出。然后将板以2000rpm离心两分钟。将5μL上清液转移至384孔AlphaLISA板进行细胞因子分析。AlphaLISA试剂盒(Perkin Elmer)用于测量IL-2分泌。简单来说，通过将2.5mL的10xAlphaLISA免疫分析缓冲液吸移到22.5mL水中来制备分析缓冲液。人IL-2分析物用于制备标准稀释液。在分析缓冲液中制备1.6xAlphaLISA抗IL-2受体珠粒和生物素化抗IL-2抗体的混合物。每孔添加8μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。在分析缓冲液中制备2.3x链霉亲和素供体珠粒中间储备液。每孔添加10μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。使用AlphaScreen方案在EnVision读板器上测量相对光单位(RLU)。在GraphPad Prism中对结果作图并使用非线性回归拟合曲线。
如图29所示，相较于同型对照物BA128，TIGITxCD96多特异性分子BA127有力地增强T细胞反应，正如根据白介素-2(IL-2)细胞因子分泌所测定。另外，相较于单特异性抗TIGIT抗体BA148或单特异性抗CD96抗体BA143，BA127展现优良的功能活性。
8.14实例14：SEA刺激分析
在1.2mL锥形管中，用5倍浓缩的中间储备液制备一定剂量范围的抗TIGITxCD96多特异性分子BA127和同型对照多特异性分子BA128中的每一种。对于供体1和2来说，在R10培养基中制备250μg/ml中间储备液且通过连续稀释、按1比10连续稀释抗体，获得总共8种稀释液。向圆底96孔板中每孔添加20μL抗体，最终浓度在50μg/mL至0.000005μg/mL范围内。
对于供体3、4、5和6来说，在R10培养基中制备10μg/mL中间储备液并且通过连续稀释、按1比5连续稀释抗体。在R10培养基中制备总共8种稀释液，范围从10μg/mL至0.000128μg/mL。向圆底96孔板每孔添加20μL抗体。
从液氮中检取人PBMC的冷冻等分试样并且立即在37℃水中解冻，直至观察到浮冰为止。将细胞转移至10mL预热的R10培养基中并立即以1500rpm离心五分钟。丢弃上清液并使细胞再悬浮于新鲜的R10培养基中。为了将细胞计数和检查活力，取出20μL样品并添加到380μL活力染料中，混合并使用Muse仪器读数。
使细胞再悬浮达到中间浓度。通过将10μL的10μg/mL SEA添加至90μL R10中以得到1μg/mL的中间浓度来制备中间储备液浓度的SEA。首先用SEA肽刺激细胞并且将80μL细胞和SEA混合物添加至相应孔中，并且在潮湿室内，在组织培养恒温箱中、在37℃和5％CO2中温育四天。使用总共100,000个细胞/孔和1ng/mL最终浓度的SEA。
在温育四天后，将板从恒温箱中取出。然后将板以2000rpm离心两分钟。将5μL上清液转移至384孔AlphaLISA板进行细胞因子分析。AlphaLISA试剂盒(Perkin Elmer)用于测量IL-2分泌。简单来说，通过将2.5mL的10xAlphaLISA免疫分析缓冲液吸移到22.5mL水中来制备分析缓冲液。人IL-2分析物用于制备标准稀释液。在分析缓冲液中制备1.6xAlphaLISA抗IL-2受体珠粒和生物素化抗IL-2抗体的混合物。每孔添加8μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。在分析缓冲液中制备2.3x链霉亲和素供体珠粒中间储备液。每孔添加10μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。使用AlphaScreen方案在EnVision读板器上测量相对光单位(RLU)。在GraphPad Prism中对结果作图并使用非线性回归拟合曲线。
如图30A-309F所示，相较于同型对照物BA128，TIGITxCD96多特异性分子BA127以剂量依赖性方式有力地增强T细胞反应，正如根据来自六位各别供体的经SEA刺激的PBMC的白介素-2(IL-2)分泌所测定。图30中的各位供体的EC10、EC50和EC90值列于表58中。
表58：EC10、EC50和EC90值.
| 供体 | EC10 | EC50 | EC90 |
| 1 | 0.002519 | 0.02267 | 0.204 |
| 2 | 0.002114 | 0.01908 | 0.1713 |
| 3 | 0.0183 | 0.09746 | 0.8771 |
| 4 | 0.0003820 | 0.003438 | 0.03094 |
| 5 | 0.001937 | 0.01743 | 0.1569 |
| 6 | 0.001954 | 0.01758 | 0.1583 |
| 平均值 | 0.0045 | 0.0296 | 0.2664 |
8.15实例15：阻断TIGIT的报告基因分析
这个实例展现了抗TIGITxCD96多特异性分子阻断TIGIT/CD155抑制性信号传导的能力。
阻断TIGIT的报告基因分析是根据制造商的方案(Promega)进行。首先，从液氮中检取杰卡特效应T细胞且立即在37℃水中解冻直至观察到浮冰为止，所述效应T细胞经工程改造以经由荧光素酶报告基因表达人TIGIT，所述荧光素酶报告基因由响应于TCR活化和CD226共刺激的天然启动子驱动。然后，将细胞转移至锥形管中的12mL预热(37℃)的分析缓冲液(90％RPMI 1640/10％FBS)中。将细胞悬浮液轻柔地混合，转移至无菌储槽中，并且将80μL细胞悬浮液转移至96孔白色平底分析板的内部60个孔中。将120μl预热(37℃)的分析缓冲液添加至分析板的各个外部孔中。细胞然后在37℃、5％CO2恒温箱中温育16至20小时。
在1.2mL锥形管中，用6倍浓缩的中间储备液制备一定剂量范围的抗TIGITxCD96多特异性分子BA125和BA127、同型对照多特异性分子BA128、抗TIGIT x同型对照多特异性分子BA133、抗CD96单特异性抗体对照物BA143、抗CD96 x同型对照多特异性分子BA131、单特异性同型对照物BA146、抗TIGIT参考抗体1、抗TIGIT参考抗体2和抗TIGIT参考抗体3。首先，在分析缓冲液中制备50μg/mL中间储备液，然后按1比2.5通过连续稀释对抗体进行连续稀释。在分析缓冲液中制备总共10种稀释液，范围从50μg/mL至0.0131μg/mL(图31A和31B)或40μg/mL至0.0262μg/mL(图31C)。向预涂铺的TIGIT效应细胞中每孔添加20μL抗体。
从液氮中检取CHO-K1细胞且立即在37℃水中解冻，直至观察到浮冰为止，所述细胞经工程改造以表达人CD155和工程化细胞表面蛋白(CD155aAPC/CHO-K1细胞)，其设计成以抗原非依赖性方式活化TCR复合物。然后，将细胞转移至含有3ml分析缓冲液的15ml锥形管中。将细胞悬浮液轻柔地混合且转移至无菌储槽中，并且将20μL细胞悬浮液转移至预涂铺的TIGIT效应细胞和抗体混合物中。最终分析体积是120μL。
然后，将细胞在37℃、5％CO2恒温箱中温育6小时。温育之后，将分析板从恒温箱取出并且允许平衡至环境温度，保持10分钟。然后，将120μl的Bio-GloTM试剂添加到预涂铺的细胞和多特异性分子或抗体混合物中且在室温下温育5分钟。使用发光EnVision读板器测量相对光单位(RLU)。在GraphPad Prism中对结果作图并使用非线性回归拟合曲线。
如图31A、31B和31C所示，作为TIGIT-CD155配体阻断的结果，抗TIGITxCD96多特异性分子BA125和BA127以剂量依赖性方式有力地增强荧光素酶基因表达，T细胞受体(TCR)活化和CD226共刺激路径活化的替代指标。正如所预期的，抗TIGIT x同型对照多特异性分子BA133也增强荧光素酶基因表达，但抗CD96单特异性抗体对照物BA143则不能。相较于参考抗TIGIT x同型对照多特异性分子，BA125和BA127展现类似的增强报告基因活性的能力。
8.16实例16：抗TIGITxCD96多特异性分子在T细胞刺激分析中引起IL-2分泌
在此实例中，评估抗TIGITxCD96多特异性分子BA127引起健康人供体原代PBMC分泌IL-2细胞因子的能力，所述PBMC经次最佳浓度的SEA超抗原刺激。
在1.2mL锥形管中，用5倍浓缩的中间储备液制备一定剂量范围的BA127、参考抗TIGIT单克隆参考抗体1或同型对照多特异性分子BA128。首先，在R10培养基中制备50μg/mL中间储备液且通过连续稀释、按1比5连续稀释抗体，获得总共8种稀释液。向圆底96孔板中每孔添加20μL抗体，最终浓度在10μg/mL至0.000128μg/mL范围内。
从液氮中检取人PBMC的冷冻等分试样并且立即在37℃水中解冻，直至观察到浮冰为止。将细胞转移至10mL预热的R10培养基中并立即以1500rpm离心五分钟。丢弃上清液并使细胞再悬浮于新鲜的R10培养基中。为了将细胞计数和检查活力，取出20μL样品并添加到380μL活力染料中，混合并使用Muse仪器读数。
使细胞再悬浮达到中间浓度。通过将10μL的10μg/mL SEA添加至90μL R10中以得到1μg/mL的中间浓度来制备中间储备液浓度的SEA。首先用SEA肽刺激细胞并且将80μL细胞和SEA混合物添加至相应孔中，并在潮湿室内，在组织培养恒温箱中在37℃和5％CO2中温育四天。使用总共100,000个细胞/孔和1ng/mL最终浓度的SEA。
在温育四天后，将板从恒温箱中取出。然后将板以2000rpm离心两分钟。将5μL上清液转移至384孔AlphaLISA板进行细胞因子分析。AlphaLISA试剂盒(Perkin Elmer)用于测量IL-2分泌。简单来说，通过将2.5mL的10xAlphaLISA免疫分析缓冲液吸移到22.5mL水中来制备分析缓冲液。人IL-2分析物用于制备标准稀释液。在分析缓冲液中制备1.6xAlphaLISA抗IL-2受体珠粒和生物素化抗IL-2抗体的混合物。每孔添加8μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。在分析缓冲液中制备2.3x链霉亲和素供体珠粒中间储备液。每孔添加10μL且在室温下、在黑暗中温育。AlphaLISA板以2000rpm短暂离心。使用AlphaScreen方案在EnVision读板器上测量相对光单位(RLU)。在GraphPad Prism中对结果作图并使用非线性回归拟合曲线。
如图32A和32B所示，在两位供体中，在浓度范围内，相较于参考抗TIGIT抗体和同型对照抗体，抗TIGITxCD96多特异性分子BA127引起更高的IL-2细胞因子分泌水平。
8.17实例17：抗TIGITxCD96多特异性分子抑制临床前小鼠肿瘤模型的肿瘤生长
这个实例表明，在小鼠模型中，相较于对应的单特异性抗体和单特异性抗体组合，用抗TIGITxCD96多特异性分子阻断可促进优良的肿瘤控制。
在小鼠结肠直肠癌模型中测试小鼠替代物抗TIGIT和抗CD96单特异性抗体和抗TIGITxCD96多特异性分子。具体地说，首先将6-8周龄的Balb/c小鼠(Jackson Labs#000651)适应两周，并且剃毛并标记。CT26小鼠结肠直肠癌细胞(CRL-2638TM)在组织培养物中、在补充有10％热灭活FBS和诺霉素(normocin)的RPMI培养基中扩增1周。向小鼠皮下注射悬浮于100个PBS中的1×105个CT26细胞。使植入的肿瘤细胞建立9-10天以达到大约50mm3的大小。然后将小鼠随机分组且经由腹膜内施药2周、一周两次、用以下治疗：200μg抗TIGIT mIgG2a替代抗体(克隆系：10A7)、抗CD96 mIgG2a替代抗体(克隆系：6A6)、抗TIGIT和抗CD96替代mAb的组合、抗TIGITxCD96 mIgG2a替代多特异性分子、抗TIGITxCD96mIgG2a.N297A替代多特异性分子、同型对照单特异性抗体(mIgG2a)，或同型对照多特异性分子(mIgG2a)。两周一次用卡尺测量肿瘤体积且按照0.5×长度×宽度2计算。
如图33A-33E所示，抗TIGITxCD96替代多特异性分子mIgG2a在15只小鼠中的13只中引起完全反应。相比之下，抗TIGITxCD96替代多特异性mIgG2a-N297A对控制肿瘤生长不起作用。相较于抗TIGIT mAb或抗CD96mAb的单一药剂疗法或抗TIGIT和CD96 mAb的组合，抗TIGITxCD96mIgG2a多特异性分子显示优良的肿瘤控制。此结果证实如下试管内观测结果：抗TIGITxCD96多特异性分子依赖于FcγR共接合来增强免疫效应功能且在功能上优于单特异性抗体或单特异性抗体组合。
8.18实例18：FcγR共接合是抗肿瘤免疫的关键
这个实例展现抗TIGITxCD96多特异性分子抑制临床前小鼠肿瘤模型的肿瘤生长的能力。
在小鼠结肠直肠癌模型中测试小鼠替代物抗TIGIT和抗CD96单特异性抗体和抗TIGITxCD96多特异性分子。具体地说，首先将6-8周龄的Balb/c小鼠(Jackson Labs#000651)适应两周，并且剃毛并标记。CT26小鼠结肠直肠癌细胞(CRL-2638TM)在组织培养物中、在补充有10％热灭活FBS和诺霉素的RPMI培养基中扩增1周。向小鼠皮下注射悬浮于100个PBS中的1×105个CT26细胞。使植入的肿瘤细胞建立9-10天以达到大约50mm3的大小。然后将小鼠随机分组且经由腹膜内施药2周、一周两次、用以下治疗：200μg抗TIGITmIgG2a替代抗体(克隆系：10A7)、抗CD96 mIgG2a替代抗体(克隆系：6A6)、抗TIGIT和抗CD96替代单特异性抗体的组合、抗TIGITxCD96 mIgG2a替代抗体、抗TIGITxCD96双特异性mIgG2a.N297A替代多特异性分子、同型对照抗体(mIgG2a)，或同型对照多特异性抗体(mIgG2a)。两周一次用卡尺测量肿瘤体积且按照0.5×长度×宽度2计算。
如图34A-34E所示，抗TIGITxCD96替代多特异性分子mIgG2a在15只小鼠中的13只中引起完全反应。相比之下，抗TIGITxCD96替代多特异性分子mIgG2a-N297A对控制肿瘤生长不起作用。相较于抗TIGIT单特异性抗体或抗CD96单特异性抗体的单一药剂疗法或抗TIGIT和CD96单特异性抗体的组合，抗TIGITxCD96 mIgG2a多特异性分子显示优良的肿瘤控制。此结果证实如下试管内观测结果：抗TIGITxCD96多特异性分子依赖于FcγR共接合来增强免疫效应功能且在功能上优于mAb或mAb组合。
***
本发明在范围上不受本文所述的具体实施例的限制。实际上，根据上述说明和附图，除了所述的那些修改之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。此类修改旨在落在所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如出版物或专利或专利申请)以引用的方式整体并入本文并且用于所有目的，达到正如每个单独的参考文献(例如出版物或专利或专利申请)被具体和单独指出一样以引用的方式整体并入用于所有目的的相同程度。
其它实施例在以下权利要求范围内。
序列表
<110> 艾吉纳斯公司（Agenus Inc.）
<120> 抗TIGIT抗体、抗CD96抗体和其使用方法
<130> 404298-AGBW-146WO (190448)
<150> US 63/201,537
<151> 2021-05-04
<160> 114
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Gly Val Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ala Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Ser
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Gly Asn Ala Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Tyr Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Gly Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Lys
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 7
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
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Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro
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Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 8
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Pro Asp Val Gly Ser His
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Ala Tyr Arg Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Pro Pro Ser
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Ser Ala Thr Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
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Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
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Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
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Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
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Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Pro Asp Val Gly Ser His
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35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Pro Pro Ser
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Ser Ala Thr Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
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Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Ser Tyr Gly Ile Ser
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Ser Ala Gly Val Leu Gly Gly Met Asp Val
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<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ala Tyr Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
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<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Asn Tyr Ala Val His
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Trp Ile Asn Thr Gly Asn Ala Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Ser Leu Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Phe Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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Leu Gln Thr Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr
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<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Thr Tyr Ala Leu His
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<220>
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Gly
<210> 24
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<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Ser Leu Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
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<211> 7
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<220>
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<400> 26
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<220>
<223> 合成肽
<400> 27
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Ser Tyr Gly Ile Ser
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<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Thr Gly Thr Ser Pro Asp Val Gly Ser His Ala Tyr Arg Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Ser Ser Tyr Pro Pro Ser Ser Ala Thr Val
1 5 10
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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100 105 110
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115
<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ala Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
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85 90 95
Ala Arg Ser Leu Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Tyr Ser Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Gly Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Lys
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
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Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Pro Asp Val Gly Ser His
20 25 30
Ala Tyr Arg Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Pro Pro Ser
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Ser Ala Thr Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
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Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
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Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<211> 105
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
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Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
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Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys
100 105
<210> 45
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Ala Gly Val Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Ala Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Gly Asn Ala Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
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Ala Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Gly Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Leu Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
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290 295 300
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
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Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
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Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
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Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
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Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
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Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro
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Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Lys
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
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275 280 285
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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275 280 285
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<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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<223> 合成肽
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<213> 人工序列
<220>
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Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Val Ile Val Glu Asn
225 230 235 240
Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe Thr Cys Leu Leu Lys
245 250 255
Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe Ile Asp Gly Ser Phe
260 265 270
Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg Lys
275 280 285
Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val His
290 295 300
Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys Met Ala
305 310 315 320
Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser Glu Lys
325 330 335
Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser Thr Asp Pro Pro Leu
340 345 350
Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro Ala Ser Ser
355 360 365
Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr Leu Val Asp
370 375 380
Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Pro Ser Asn Ser Ser
385 390 395 400
Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Gly Thr Asp
405 410 415
Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu Thr Tyr Ser Ser Ser
420 425 430
Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe Thr Ser Thr
435 440 445
Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly Ser Thr Lys
450 455 460
Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Asn Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
Gly Met
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<211> 514
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr Ala Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val Gly Phe Phe
20 25 30
Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys Ile Asp Leu Ile Ala
35 40 45
Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly Arg Pro Cys
50 55 60
Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu Asn Gly Ser Lys Trp
65 70 75 80
Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Ser Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu
85 90 95
Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln Thr Lys Ile Tyr Asn
100 105 110
Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu Trp Asn Ser Asn His
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Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro Cys Phe Gln
130 135 140
Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala Trp Ser Val
145 150 155 160
Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser Gln Asn His Leu Ile
165 170 175
Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Leu Gly Thr Asp Tyr
180 185 190
Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly Arg Lys Phe
195 200 205
Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile Leu Arg Ser Ser Thr
210 215 220
Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Val Ile Val Glu Asn
225 230 235 240
Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe Thr Cys Leu Leu Lys
245 250 255
Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe Ile Asp Gly Ser Phe
260 265 270
Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg Lys
275 280 285
Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val His
290 295 300
Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys Met Ala
305 310 315 320
Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser Glu Lys
325 330 335
Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser Thr Asp Pro Pro Leu
340 345 350
Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro Ala Ser Ser
355 360 365
Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr Leu Val Asp
370 375 380
Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Pro Ser Asn Ser Ser
385 390 395 400
Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Gly Thr Asp
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly Ser Thr Lys
450 455 460
Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Asn Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
Gly Met Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Glu His His His His His
485 490 495
His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly Gly
500 505 510
Asp Arg
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr Ala Thr Leu
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20 25 30
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100 105 110
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115
<210> 65
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr Ala Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val Gly Phe Phe
20 25 30
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35 40 45
Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly Arg Pro Cys
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Ser Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu
85 90 95
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100 105 110
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115
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<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 66
Val Trp Gly Lys Pro Phe Asn Thr Glu Glu Asn Ile Tyr Ala Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Ala Lys Gly Phe Leu
20 25 30
Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asp Lys Ala Asp Leu Ile Ala
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro Cys Phe Gln
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Arg Tyr Asp Asn Gly Thr Gln Gln Thr Leu Ile Ser Gln Asp His Leu
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210 215 220
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275 280 285
Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg
290 295 300
Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val
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450 455 460
Thr Thr Arg Ala Leu Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly Ser Thr
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Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Ser Lys Pro Lys
485 490 495
Asp Gly Met
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<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
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275 280 285
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305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
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435 440 445
<210> 68
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 69
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys
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Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 70
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<210> 71
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Gly Val Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
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210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
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<211> 448
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<223> 合成肽
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<220>
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 105
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65 70 75 80
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195 200 205
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 106
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro
325 330 335
Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 107
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 108
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 109
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 110
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro
325 330 335
Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 111
<211> 514
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 111
Val Trp Gly Lys Pro Phe Asn Thr Glu Glu Asn Ile Tyr Ala Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Ala Lys Gly Phe Leu
20 25 30
Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asp Lys Ala Asp Leu Ile Ala
35 40 45
Leu Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe His Cys Ala Tyr Gly Ser Pro Cys
50 55 60
Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Gln Thr Pro Glu Asn Gly Ser Lys Trp
65 70 75 80
Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Ser Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu
85 90 95
Cys Met Leu Thr Leu Tyr Pro Glu Gly Met Gln Thr Lys Ile Tyr Asn
100 105 110
Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Pro Asp Glu Trp Lys Ser Asn His
115 120 125
Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro Cys Phe Gln
130 135 140
Asn Ser Ser Ser Glu Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala Trp Leu Val
145 150 155 160
Glu Asp Asn Gly Thr Gln Gln Thr Leu Ile Ser Gln Asp His Leu Ile
165 170 175
Ser Ser Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Val Gly Ile Asp Tyr
180 185 190
Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly Arg Lys Phe
195 200 205
Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asp Lys Ile Leu Arg Ser Ser Thr
210 215 220
Thr Ile Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Met Ile Val Glu Asn
225 230 235 240
Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Thr Phe Thr Cys Leu Leu Lys
245 250 255
Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Ile Trp Phe Ile Asp Gly Ser Phe
260 265 270
Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg Lys
275 280 285
Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val His
290 295 300
Ser Asp Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys Met Ala
305 310 315 320
Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser Glu Lys
325 330 335
Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Met Ser Thr Thr Asp Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro Ala Ser Ser
355 360 365
Val Ser Pro Thr Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr Leu Ala Asp
370 375 380
Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Ser Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Val Thr Thr Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Gly Thr Asp
405 410 415
Ala Lys Lys Ser Phe Ser Gln Ile Pro Ser Glu Thr Tyr Ser Ser Ser
420 425 430
Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe Thr Ser Thr
435 440 445
Thr Arg Ala Leu Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly Ser Thr Lys
450 455 460
Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Ser Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
Gly Met Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Glu His His His His His
485 490 495
His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly Gly
500 505 510
Asp Arg
<210> 112
<211> 119
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 112
Val Trp Gly Lys Pro Phe Asn Thr Glu Glu Asn Ile Tyr Ala Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Ala Lys Gly Phe Leu
20 25 30
Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asp Lys Ala Asp Leu Ile Ala
35 40 45
Leu Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe His Cys Ala Tyr Gly Ser Pro Cys
50 55 60
Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Gln Thr Pro Glu Asn Gly Ser Lys Trp
65 70 75 80
Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Ser Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu
85 90 95
Cys Met Leu Thr Leu Tyr Pro Glu Gly Met Gln Thr Lys Ile Tyr Asn
100 105 110
Leu Leu Ile Gln Thr His Val
115
<210> 113
<211> 150
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Glu His
115 120 125
His His His His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Gly Gly Asp Arg
145 150
<210> 114
<211> 151
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 114
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Lys Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Val Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Met Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln His Asp His Ser Leu Leu Ala Ile
35 40 45
Arg Asn Ala Glu Leu Gly Trp His Ile Tyr Pro Ala Phe Lys Asp Arg
50 55 60
Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Met
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly
85 90 95
Thr Tyr Arg Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala
100 105 110
Glu His Ser Ala Arg Phe Gln Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Glu
115 120 125
His His His His His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Gly Gly Asp Arg
145 150
Claims (144)
1.一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至人CD96的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有CDRCDRH1、CDRH2和CDRH3的第一VH以及含有CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3的第一VL，其中
(i)所述第一VH包含SEQ ID NO:34的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且所述第一VL包含SEQ ID NO:35的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，
(ii)所述第一VH包含SEQ ID NO:36的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且所述第一VL包含SEQ ID NO:37的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列，
(iii)所述第一VH包含SEQ ID NO:38的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且所述第一VL包含SEQ ID NO:39的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列；以及
(b)特异性结合至除人CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含含有CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3的第二VH以及含有CDRCDRL1、CDRL2和CDRL3的第二VL。
2.根据权利要求1所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区的所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15；16、17、18、19、20和21；或22、23、24、25、26和27的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的多特异性分子，其中所述第二抗原结合区特异性结合至人TIGIT。
4.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二VH包含SEQID NO:40的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；且所述第二VL包含SEQ IDNO:41的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的多特异性分子，其中所述第二抗原结合区的所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33的氨基酸序列。
6.一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至除人TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3的第一VH以及含有CDRCDRL1、CDRL2和CDRL3的第一VL；以及
(b)特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二VH，所述第二VH包含SEQ ID NO:40的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；以及第二VL，所述第二VL包含SEQ ID NO:41的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的多特异性分子，其中所述第二抗原结合区的所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33的氨基酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区特异性结合至人CD96。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一VH包含与SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的多特异性分子，其中所述第一VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列组成。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一VL包含与SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的多特异性分子，其中所述第一VL的氨基酸序列由SEQ IDNO:35、37或39的氨基酸序列组成。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二VH包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的多特异性分子，其中所述第二VH的氨基酸序列由SEQ IDNO:40的氨基酸序列组成。
15.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二VL包含与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％一致的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的多特异性分子，其中所述第二VL的氨基酸序列由SEQ IDNO:41的氨基酸序列组成。
17.一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至人CD96的第一抗原结合区，所述抗原结合区包含第一VH和第一VL，其中所述第一VH包含SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列，且/或所述第一VL包含SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列；以及
(b)特异性结合至除人CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二VH和第二VL。
18.根据权利要求17所述的经分离的多特异性分子，其中所述第二抗原结合区特异性结合至人TIGIT。
19.一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至除人TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一VH和第一VL；以及
(b)特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，所述抗原结合区包含第二VH和第二VL，其中所述第二VH包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；且/或所述第二VL包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的经分离的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区特异性结合至人CD96。
21.根据权利要求17至20中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一VH包含SEQ ID NO:34、36或38的氨基酸序列，且所述第一VL包含SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的多特异性分子，其中所述第一VH的氨基酸序列由SEQ IDNO:34、36或38组成且所述第一VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:35、37或39的氨基酸序列组成。
23.根据权利要求17至22中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一VH和所述第一VL分别包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列。
24.根据权利要求23所述的多特异性分子，其中所述第一VH和所述第一VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列组成。
25.根据权利要求17至24中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二VH包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，且所述第二VL包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的多特异性分子，其中所述第二VH和所述第二VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列组成。
27.根据权利要求17至26中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一VH和所述第一VL分别包含SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列；并且所述第二VH和所述第二VL分别包含SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的多特异性分子，其中所述第一VH和所述第一VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34和35；36和37；或38和39的氨基酸序列组成；并且所述第二VH和所述第二VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列组成。
29.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一和/或第二抗原结合区包含选自由人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2组成的组的重链恒定区。
30.根据权利要求29所述的多特异性分子，其中所述重链恒定区是IgG1重链恒定区。
31.根据权利要求30所述的多特异性分子，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:49-60中的任一个的氨基酸序列。
32.根据权利要求30所述的多特异性分子，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的N297A突变。
33.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一和/或第二抗原结合区包含重链恒定区，所述重链恒定区是野生型重链恒定区的变体，其中所述变体重链恒定区结合至FcγR的亲和力比所述野生型重链恒定区结合至所述FcγR的亲和力高。
34.根据权利要求33所述的多特异性分子，其中所述FcγR是FcγRIIB或FcγRIIIA。
35.根据权利要求30所述的多特异性分子，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的S267E和L328F突变。
36.根据权利要求30所述的多特异性分子，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含至少一个选自由根据EU编号***编号的S239D、A330L和I332E组成的组的突变。
37.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含位于氨基酸位置239的天冬氨酸；分别位于氨基酸位置239和332的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区不包含分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
38.根据权利要求37所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:58和57；59和57；或60和57。
39.根据权利要求1至36中任一权利要求所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239和332的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含位于氨基酸位置239的天冬氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
40.根据权利要求39所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链和恒定区分别包含SEQ ID NO:59和58；或60和58。
41.根据权利要求39所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二重链恒定区进一步包含位于氨基酸位置332的谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
42.根据权利要求41所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:60和59。
43.根据权利要求1至36中任一权利要求所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区不包含分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含位于氨基酸位置239的天冬氨酸；分别位于氨基酸位置239和332的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
44.根据权利要求43所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:57和60；57和59；或57和58。
45.根据权利要求1至36中任一权利要求所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含位于氨基酸位置239的天冬氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239和332的天冬氨酸和谷氨酸；或分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
46.根据权利要求45所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:58和60；或58和59。
47.根据权利要求45所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一重链恒定区进一步包含位于氨基酸位置332的谷氨酸；并且
(b)所述第二重链恒定区包含分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
48.根据权利要求47所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区分别包含SEQ ID NO:59和60。
49.根据权利要求1至48中任一权利要求所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含位于氨基酸位置366的色氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含分别位于氨基酸位置366、368和407的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
50.根据权利要求49所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区包含SEQ ID NO:53、54、55或56；并且所述第二重链恒定区包含SEQ ID NO:49、50、51或52。
51.根据权利要求1至48中任一权利要求所述的多特异性分子，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含第一重链恒定区，所述第一重链恒定区包含分别位于氨基酸位置366、368和407的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含第二重链恒定区，所述第二重链恒定区包含位于氨基酸位置366的色氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
52.根据权利要求51所述的多特异性分子，其中所述第一重链恒定区包含SEQ ID NO:49、50、51或52；并且所述第二重链恒定区包含SEQ ID NO:53、54、55或56。
53.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含第一重链，所述第一重链包含SEQ ID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列。
54.根据权利要求53所述的多特异性分子，其中所述第一重链的氨基酸序列由SEQ IDNO:1、3、5或67-99的氨基酸序列组成。
55.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二抗原结合区包含第二重链，所述第二重链包含SEQ ID NO:7或100-110的氨基酸序列。
56.根据权利要求55所述的多特异性分子，其中所述第二重链的氨基酸序列由SEQ IDNO:7或100-110的氨基酸序列组成。
57.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述多特异性分子包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:42、43或44的氨基酸序列。
58.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含第一轻链，所述第一轻链包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列。
59.根据权利要求58所述的多特异性分子，其中所述第一轻链的氨基酸序列由SEQ IDNO:2、4或6的氨基酸序列组成。
60.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二抗原结合区包含第二轻链，所述第二轻链包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列。
61.根据权利要求60所述的多特异性分子，其中所述第二轻链的氨基酸序列由SEQ IDNO:8或9的氨基酸序列组成。
62.一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至人CD96的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含含有SEQ IDNO:1、3、5或67-99的氨基酸序列的第一重链；和/或含有SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列的第一轻链；以及
(b)特异性结合至除人CD96之外的抗原的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二重链和第二轻链。
63.根据权利要求58所述的多特异性分子，其中所述第二抗原结合区特异性结合至人TIGIT。
64.一种多特异性分子，其包含：
(a)特异性结合至除人TIGIT之外的抗原的第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一重链和第一轻链；以及
(b)特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含含有SEQ IDNO:7或100-110的氨基酸序列的第二重链；和/或含有SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的第二轻链。
65.根据权利要求64所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区特异性结合至人CD96。
66.根据权利要求62至65中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列；且/或所述第一轻链包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列。
67.根据权利要求62至66中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一重链包含SEQ ID NO:1、3、5或67-99的氨基酸序列；并且所述第一轻链包含SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列。
68.根据权利要求67所述的多特异性分子，其中所述第一重链的氨基酸序列由SEQ IDNO:1、3、5或67-99组成；并且所述第一轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列组成。
69.根据权利要求62至68中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:7或100-110的氨基酸序列；且/或所述第二轻链包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列。
70.根据权利要求62至69中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第二重链包含SEQ ID NO:7或100-110的氨基酸序列；并且所述第二轻链包含SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列。
71.根据权利要求70所述的多特异性分子，其中所述第二重链的氨基酸序列由SEQ IDNO:7组成；并且所述第二轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列组成。
72.根据权利要求62至71中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一重链和所述第一轻链分别包含SEQ ID NO:1和2；3和4；或5和6的氨基酸序列；且/或所述第二重链和第二轻链分别包含SEQ ID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列。
73.根据权利要求62至72中任一权利要求所述的多特异性分子，其中所述第一重链和所述第一轻链分别包含SEQ ID NO:1和2；3和4；或5和6的氨基酸序列；并且所述第二重链和第二轻链分别包含SEQ ID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列。
74.根据权利要求73所述的多特异性分子，其中所述第一重链和所述第一轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1和2；3和4；或5和6组成；并且所述第二重链和所述第二轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7和8；或7和9的氨基酸序列组成。
75.一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区；和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
76.根据权利要求75所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:73、84、95或56；并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:103或49。
77.一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区；和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
78.根据权利要求77所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:73、84、95或56；并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:104或50。
79.一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区；和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
80.根据权利要求79所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:67、78、89或49；并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:7或56。
81.一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区；和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、366、368和407处的天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、330、332和366处的天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和色氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
82.根据权利要求81所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:1、3、5或50；并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:7或56。
83.一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区；和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
84.根据权利要求83所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:72、83、94或55；并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:103或49。
85.一种多特异性分子，其包含特异性结合至人CD96的第一抗原结合区；和特异性结合至人TIGIT的第二抗原结合区，其中：
(a)所述第一抗原结合区包含分别位于氨基酸位置366、368和407处的丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸，但不包含分别位于氨基酸位置239、330和332处的天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸；并且
(b)所述第二抗原结合区包含分别位于氨基酸位置239、332和366处的天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸，
其中所述氨基酸位置根据EU编号***编号。
86.根据权利要求85所述的多特异性分子，其中所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO:67、78、89或49；并且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO:102或55。
87.一种特异性结合至人TIGIT的经分离的抗体，所述抗体包含：VH，所述VH包含SEQ IDNO:40的VH氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列；以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:41的VL氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
88.根据权利要求87所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含分别为SEQ ID NO:28、29、30、31、32和33的所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
89.根据权利要求87或88所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:40的VH氨基酸序列。
90.根据权利要求89所述的经分离的抗体，其中所述VH的氨基酸序列由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成。
91.根据权利要求87至90中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含SEQID NO:41的VL氨基酸序列。
92.根据权利要求91所述的经分离的抗体，其中所述VL的氨基酸序列由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成。
93.一种特异性结合至人TIGIT的经分离的抗体，所述抗体包含分别含有SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列的VH和VL。
94.根据权利要求87所述的经分离的抗体，其中所述VH和所述VL的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列组成。
95.根据权利要求87至94中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含选自由以下组成的组的重链恒定区：人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
96.根据权利要求95所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含IgG1重链恒定区。
97.根据权利要求96所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:57、58、59或60的氨基酸序列的重链恒定区。
98.根据权利要求96所述的经分离的抗体，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的N297A突变。
99.根据权利要求87至98中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含重链恒定区，所述重链恒定区是野生型重链恒定区的变体，其中所述变体重链恒定区结合至FcγR的亲和力比所述野生型重链恒定区结合至所述FcγR的亲和力高。
100.根据权利要求99所述的经分离的抗体，其中所述FcγR是FcγRIIB或FcγRIIIA。
101.根据权利要求96所述的经分离的抗体，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含根据EU编号***编号的S267E和L328F突变。
102.根据权利要求96所述的经分离的抗体，其中所述IgG1重链恒定区的氨基酸序列包含至少一个选自由以下组成的组的突变：根据EU编号***编号的S239D、A330L和I332E突变。
103.根据权利要求87至102中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:107、108、109或110的氨基酸序列的重链。
104.根据权利要求103所述的经分离的抗体，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ IDNO:107、108、109或110的氨基酸序列组成。
105.根据权利要求87至104中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:43或44的氨基酸序列的轻链恒定区。
106.根据权利要求87至104中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的轻链。
107.根据权利要求106所述的经分离的抗体，其中所述轻链的氨基酸序列由SEQ IDNO:8或9的氨基酸序列组成。
108.一种特异性结合至人TIGIT的经分离的抗体，所述抗体包含含有SEQ ID NO:107、108、109或110的氨基酸序列的重链；和含有SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列的轻链。
109.根据权利要求108所述的经分离的抗体，其中所述重链的氨基酸序列由SEQ IDNO:107、108、109或110的氨基酸序列组成；并且所述轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO:8或9的氨基酸序列组成。
110.根据权利要求108或109所述的经分离的抗体，其中所述重链和轻链分别包含SEQID NO:107和8；107和9；108和8；108和9；109和8；109和9；110和8；或110和9的氨基酸序列。
111.根据权利要求110所述的经分离的抗体，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:107和8；107和9；108和8；108和9；109和8；109和9；110和8；或110和9的氨基酸序列组成。
112.根据权利要求87至111中任一权利要求所述的经分离的抗体，其中所述抗体是多特异性抗体。
113.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子或经分离的抗体，其中所述多特异性分子或经分离的抗体与细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、毒素、放射性核素或可检测标记缀合。
114.根据前述权利要求中任一权利要求所述的多特异性分子或经分离的抗体，其中所述多特异性分子或经分离的抗体与抗体缀合。
115.一种经分离的多核苷酸，其编码：
(a)根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子的VH、VL、重链和/或轻链；
(b)根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子的所述第一VH和所述第一VL；
(c)根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子的所述第二VH和所述第二VL；
(d)根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子的所述第一重链和所述第一轻链；
(e)根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子的所述第二重链和所述第二轻链。
116.一种经分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体的所述VH和/或所述VL，或所述重链和/或所述轻链。
117.一种载体，所述载体包含根据权利要求115所述的多核苷酸。
118.一种载体，所述载体包含根据权利要求116所述的多核苷酸。
119.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)根据权利要求115所述的多核苷酸；
(b)根据权利要求117所述的载体；
(c)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VH和VL，以及第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VH和VL；
(d)第一载体，所述第一载体包含编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VH和VL的第一多核苷酸，以及第二载体，所述第二载体包含编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VH和VL的第二多核苷酸；
(e)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VH；第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VL；第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VH；以及第四多核苷酸，所述第四多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VL；
(f)第一载体，所述第一载体包含编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VH的第一多核苷酸；第二载体，所述第二载体包含编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VL的第二多核苷酸；第三载体，所述第三载体包含编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VH的第三多核苷酸；以及第四载体，所述第四载体包含编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VL的第四多核苷酸；
(g)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述重链和轻链；以及第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述重链和轻链；
(h)第一载体，所述第一载体包含编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述重链和轻链的第一多核苷酸；以及第二载体，所述第二载体包含编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述重链和轻链的第二多核苷酸；
(i)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述重链；第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述轻链；第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述重链；以及第四多核苷酸，所述第四多核苷酸编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VL；或
(j)第一载体，所述第一载体包含编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述重链的第一多核苷酸；第二载体，所述第二载体包含编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述轻链的第二多核苷酸；第三载体，所述第三载体包含编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述重链的第三多核苷酸；以及第四载体，所述第四载体包含编码权利要求53至56或58至74中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述轻链的第四多核苷酸。
120.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)根据权利要求116所述的多核苷酸；
(b)根据权利要求118所述的载体；
(c)编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体的所述VH和VL的多核苷酸；
(d)第一载体，所述第一载体包含编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体的所述VH和VL的多核苷酸；
(e)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体的所述VH；和第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体的所述VL；或
(f)第一载体，所述第一载体包含编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体的所述VH的第一多核苷酸，和第二载体，所述第二载体包含编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体的所述VL的第二多核苷酸。
121.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子、根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体、根据权利要求115或116所述的多核苷酸、根据权利要求117或118所述的载体、或根据权利要求119或120所述的宿主细胞；和药学上可接受的载剂或赋形剂。
122.一种产生多特异性分子或经分离的抗体的方法，所述方法包括在表达多核苷酸和产生所述多特异性分子或经分离的抗体的适合条件下培养根据权利要求119或120所述的宿主细胞。
123.一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VH和VL，以及第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VH和VL；或
(b)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述重链和轻链；以及第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述重链和轻链；
所述方法是在表达所述多核苷酸和产生所述多特异性分子的适合条件下进行。
124.一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VH；第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述VL；第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VH；以及第四多核苷酸，所述第四多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述VL；或
(b)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述重链；第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的所述轻链；第三多核苷酸，所述第三多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述重链；以及第四多核苷酸，所述第四多核苷酸编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的所述轻链，
所述方法是在表达所述多核苷酸和产生所述多特异性分子的适合条件下进行。
125.一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括：
(a)在借以产生权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的条件下，在第一细胞中表达编码所述第一抗原结合区的VH和VL的第一多核苷酸；
(b)在借以产生权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的条件下，在第二细胞中表达编码所述第二抗原结合区的VH和VL的第二多核苷酸；以及
(c)使步骤(a)和(b)所产生的所述第一与第二抗原结合区在产生所述多特异性分子的适合条件下接触。
126.一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞中表达编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的VH的第一多核苷酸和编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区的VL的第二多核苷酸，所述表达是在借以产生所述第一抗原结合区的条件下进行；
(b)在第二细胞中表达编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的VH的第三多核苷酸和编码权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第二抗原结合区的VL的第四多核苷酸，所述表达是在借以产生所述第二抗原结合区的条件下进行；以及
(c)使步骤(a)和(b)所产生的所述第一与第二抗原结合区在产生所述多特异性分子的条件下接触。
127.一种产生多特异性分子的方法，所述方法包括使权利要求1至86、113或114中任一权利要求中的所述第一抗原结合区与所述第二抗原结合区在产生所述多特异性分子的条件下接触。
128.一种产生经分离的抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的抗体的VH和VL的多核苷酸；
(b)编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的抗体的重链和/或轻链的多核苷酸，
所述方法是在表达所述多核苷酸和产生所述抗体的适合条件下进行。
129.一种产生经分离的抗体的方法，所述方法包括在细胞中表达：
(a)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的抗体的VH；和第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的抗体的VL；或
(b)第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的抗体的重链；和第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码根据权利要求87至114中任一权利要求所述的抗体的轻链，
所述方法是在表达所述多核苷酸和产生所述抗体的适合条件下进行。
130.一种增强受试者的免疫反应的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子、根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体、根据权利要求115或116所述的多核苷酸、根据权利要求117或118所述的载体、根据权利要求119或120所述的宿主细胞或根据权利要求121所述的药物组合物施予所述受试者。
131.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子、根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体、根据权利要求115或116所述的多核苷酸、根据权利要求117或118所述的载体、根据权利要求119或120所述的宿主细胞、或根据权利要求121所述的药物组合物施予所述受试者。
132.根据权利要求130或131所述的方法，其中所述多特异性分子、经分离的抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物是通过全身、静脉内、皮下、肿瘤内施予，或递送到肿瘤引流***。
133.根据权利要求130至132中任一权利要求所述的方法，其进一步包括将额外治疗剂施予所述受试者。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述额外治疗剂是化学治疗剂。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述额外治疗剂是检查点靶向剂。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述检查点靶向剂选自由以下组成的组：拮抗剂抗PD-1抗体、拮抗剂抗PD-L1抗体、拮抗剂抗PD-L2抗体、拮抗剂抗CTLA-4抗体、拮抗剂抗TIM-3抗体、拮抗剂抗LAG-3抗体、拮抗剂抗VISTA抗体、拮抗剂抗TIGIT抗体、拮抗剂抗CEACAM1抗体、拮抗剂抗CD96抗体、促效剂抗GITR抗体和促效剂抗OX40抗体。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述额外治疗剂是抗PD-1抗体，任选地其中所述抗PD-1抗体是帕博利珠单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab)。
138.根据权利要求133所述的方法，其中所述额外治疗剂是吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的抑制剂。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述抑制剂选自由以下组成的组：艾卡哚司他(epacadostat)、F001287、吲哚莫德(indoximod)和NLG919。
140.根据权利要求133所述的方法，其中所述额外治疗剂是疫苗。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述疫苗包括热休克蛋白肽复合物(HSPPC)，所述热休克蛋白肽复合物包括与抗原肽复合的热休克蛋白。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述热休克蛋白是hsc70并且与肿瘤相关抗原肽复合。
143.根据权利要求141所述的方法，其中所述热休克蛋白是gp96蛋白并且与肿瘤相关抗原肽复合，任选地其中所述HSPPC来源于从受试者获得的肿瘤。
144.一种治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至86、113或114中任一权利要求所述的多特异性分子、根据权利要求87至114中任一权利要求所述的经分离的抗体、根据权利要求115或116所述的多核苷酸、根据权利要求117或118所述的载体、根据权利要求119或120所述的宿主细胞、或根据权利要求121所述的药物组合物施予所述受试者。
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