JP2024516843A - 抗ｔｉｇｉｔ抗体、抗ｃｄ９６抗体、及びそれらの使用の方法 - Google Patents

抗ｔｉｇｉｔ抗体、抗ｃｄ９６抗体、及びそれらの使用の方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する多特異性分子ならびにＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。また、提供されるのは、これらの多特異性分子及び抗体を含む医薬組成物、これらの多特異性分子及び抗体をコードする核酸、これらの多特異性分子及び抗体を作製するための発現ベクター及び宿主細胞、ならびにこれらの多特異性分子及び抗体を使用して対象を治療する方法である。

Description

１．関連出願
本出願は、２０２１年５月４日に出願された米国仮出願第６３／２０１，５３７号に優先的に利益を与えるものであり、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
２．配列表
ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：１９０４４８＿ＳＬ、サイズ２９３，５８７バイト、作成日：２０２２年４月２６日）中で電子的に提出された配列表の内容は、参照によりその全体において本明細書中に組み入れられる。
３．技術分野
本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する多特異性分子、抗ＴＩＧＩＴ抗体、ならびに同を使用する方法に関する。
４．背景技術
ＴＡＣＴＩＬＥ（Ｔ細胞活性化、増加された後期発現）としても知られるＣＤ９６（表面抗原分類（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）９６）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーにおけるＩ型膜貫通タンパク質である。それは、単一のＩｇドメイン、Ｉ型膜貫通ドメイン、単一の細胞内免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）、及び単一のＹＸＸＭリン酸化モチーフを有し、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に発現される。
ＣＤ９６は、免疫細胞（例、ＮＫ細胞及びＴ細胞）及び腫瘍転移の制御において役割を果たすと考えられる。特に、ＣＤ９６機能の遮断は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞依存性様式で、いくつかのマウス腫瘍モデルにおいて原発性腫瘍の成長を抑制したことが示されている。
ＶＳＩＧ９又はＶＳＴＭ３としても公知である、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）を伴うタンパク質Ｔ細胞免疫受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーにおけるＩ型膜貫通タンパク質である。それは、単一のＩｇドメイン、Ｉ型膜貫通ドメイン、単一の細胞内免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）、及び単一の免疫グロブリンテールチロシン（ＩＴＴ）様リン酸化モチーフを有し、活性化ＣＤ４陽性／ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、メモリーＣＤ４５ＲＯ陽性Ｔ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現されるが、しかし、ナイーブＴ細胞上では発現されない。
ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）としても公知である）は、単球及び樹状細胞上で高度に発現され、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞を活性化し、ならびに、その二つの受容体ＣＤ２２６及びＣＤ９６への結合を通じてＴｒｅｇの活性を減弱することが可能である。ＴＩＧＩＴはＣＤ１５５に結合し、ＣＤ１５５とＣＤ２２６及びＣＤ９６との相互作用に拮抗し、それにより、Ｔ細胞及びＮＫ細胞媒介性の免疫活性を抑制することが示されている。
免疫応答を調節する際でのヒトＣＤ９６及びヒトＴＩＧＩＴの役割を考えると、ＣＤ９６リガンドの相互作用及び／又はＴＩＧＩＴリガンドの相互作用を遮断するように設計された治療剤は、免疫抑制を含む疾患の治療のために大いに有望である。
５．発明の概要
本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する多特異性分子ならびにＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する抗体を提供する。また、提供されるのは、これらの多特異性分子及び抗体を含む医薬組成物、これらの多特異性分子及び抗体をコードする核酸、これらの多特異性分子及び抗体を作製するための発現ベクター及び宿主細胞、ならびにこれらの多特異性分子及び抗体を使用して対象を治療する方法である。
一態様では、本開示は、以下を含む多特異性分子を提供する：
（ａ）ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、第一の抗原結合領域が、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む第一のＶＨ、ならびにＣＤＲ ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む第一のＶＬを含み、
（ｉ）第一のＶＨが、配列番号３４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに第一のＶＬが、配列番号３５のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）第一のＶＨが、配列番号３６のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに第一のＶＬが、配列番号３７のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、又は
（ｉｉｉ）第一のＶＨが、配列番号３８のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに第一のＶＬが、配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、第一の抗原結合領域、及び
（ｂ）ヒトＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、第二の抗原結合領域が、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む第二のＶＨ、ならびにＣＤＲ ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む第二のＶＬを含む、第二の抗原結合領域。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１、又は２２、２３、２４、２５、２６、及び２７のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する。特定の実施形態では、第二のＶＨは、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに第二のＶＬは、配列番号４１のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第二の抗原結合領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、以下を含む多特異性分子を提供する：
（ａ）ヒトＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、第一の抗原結合領域が、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む第一のＶＨ、ならびにＣＤＲ ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む第一のＶＬを含む、第一の抗原結合領域、及び
（ｂ）ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、第二の抗原結合領域が、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む第二のＶＨ、ならびに配列番号４１のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む、第二の抗原結合領域。
特定の実施形態では、第二の抗原結合領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する。特定の実施形態では、第一のＶＨは、配列番号３４、３６、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３４、３６、又は３８のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、第一のＶＬは、配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、第二のＶＨは、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第二のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４０のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、第二のＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第二のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号４１のアミノ酸配列からなる。
別の態様では、本開示は、以下を含む多特異性分子を提供する：
（ａ）ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、抗原結合領域が第一のＶＨ及び第一のＶＬを含み、第一のＶＨが、配列番号３４、３６、もしくは３８のアミノ酸配列を含み、及び／又は第一のＶＬが、配列番号３５、３７、もしくは３９のアミノ酸配列含む、第一の抗原結合領域、ならびに
（ｂ）ヒトＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、第二の抗原結合領域が第二のＶＨ及び第二のＶＬを含む、第二の抗原結合領域。
特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する。
別の態様では、本開示は、以下を含む多特異性分子を提供する：
（ａ）ヒトＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、第一の抗原結合領域が第一のＶＨ及び第一のＶＬを含む、第一の抗原結合領域、ならびに
（ｂ）ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、抗原結合領域が第二のＶＨ及び第二のＶＬを含み、第二のＶＨが、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、及び／又は第二のＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、第二の抗原結合領域。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する。特定の実施形態では、第一のＶＨは、配列番号３４、３６、又は３８のアミノ酸配列を含み、及び第一のＶＬは、配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３４、３６、又は３８からなり、及び第一のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３５、３７、又は３９からなる。別の実施形態では、第一のＶＨ及び第一のＶＬは、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一のＶＨ及び第一のＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、第二のＶＨは、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、及び第二のＶＬは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第二のＶＨ及び第二のＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、第一のＶＨ及び第一のＶＬは、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列を含み、ならびに第二のＶＨ及び第二のＶＬは、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一のＶＨ及び第一のＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列からなり、ならびに第二のＶＨ及び第二のＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、第一及び／又は第二の抗原結合領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域である。別の実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号４９～６０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａ変異を含む。
特定の実施形態では、第一及び／又は第二の抗原結合領域は、野生型重鎖定常領域のバリアントである重鎖定常領域を含み、バリアント重鎖定常領域は、野生型重鎖定常領域がＦｃγＲに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲに結合する。特定の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＩＡである。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ変異を含む。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異からなる群から選択される少なくとも一つの変異を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
第二の抗原結合領域は、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まない第二の重鎖定常領域を含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号５８及び５７、５９及び５７、又は６０及び５７を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸を含む第二の重鎖定常領域を含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖及び定常領域は、それぞれ配列番号５９及び５８、又は６０及び５８を含む。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域は、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含み、ならびに
第二の重鎖定常領域が、アミノ酸３３２位にグルタミン酸をさらに含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号６０及び５９を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まない第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む第二の重鎖定常領域を含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号５７及び６０、５７及び５９、又は５７及び５８を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸を含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
第二の抗原結合領域は、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む第二の重鎖定常領域を含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号５８及び６０、又は５８及び５９を含む。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域は、アミノ酸３３２位にグルタミン酸をさらに含み、ならびに
第二の重鎖定常領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号５９及び６０を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、アミノ酸３６６位にトリプトファンを含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
第二の抗原結合領域は、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含む第二の重鎖定常領域を含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域は、配列番号５３、５４、５５、又は５６を含み、ならびに第二の重鎖定常領域は、配列番号４９、５０、５１、又は５２を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
第二の抗原結合領域は、アミノ酸３６６位にトリプトファンを含む第二の重鎖定常領域を含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の重鎖定常領域は、配列番号４９、５０、５１、又は５２を含み、ならびに第二の重鎖定常領域は、配列番号５３、５４、５５、又は５６を含む。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号１、３、５、又は６７～９９のアミノ酸配列を含む第一の重鎖を含む。特定の実施形態では、第一の重鎖は、配列番号１、３、５、又は６７～９９のアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、配列番号７又は１００～１１０のアミノ酸配列を含む第二の重鎖を含む。特定の実施形態では、第二の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７又は１００～１１０のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、多特異性分子は、配列番号４２、４３、又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号２、４、又は６のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖を含む。別の実施形態では、第一の軽鎖は、配列番号２、４、又は６のアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、配列番号８又は９のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む。別の実施形態では、第二の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８又は９のアミノ酸配列からなる。
別の態様では、本開示は、以下を含む多特異性分子を提供する：
（ａ）ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、第一の抗原結合領域が、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、及び／又は配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖を含む、第一の抗原結合領域、ならびに
（ｂ）ヒトＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、第二の抗原結合領域が第二の重鎖及び第二の軽鎖を含む、第二の抗原結合領域。
特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する。
別の態様では、本開示は、以下を含む多特異性分子を提供する：
（ａ）ヒトＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、第一の抗原結合領域が第一の重鎖及び第一の軽鎖を含む、第一の抗原結合領域、ならびに
（ｂ）ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、第二の抗原結合領域が、配列番号７もしくは１００～１１０のアミノ酸配列を含む第二の重鎖、及び／又は配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む、第二の抗原結合領域。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する。特定の実施形態では、第一の重鎖は、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９のアミノ酸配列を含み、及び／又は第一の軽鎖は、配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一の重鎖は、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９のアミノ酸配列を含み、及び第一の軽鎖は、配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９からなり、及び第一の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、第二の重鎖は、配列番号７もしくは１００～１１０のアミノ酸配列を含み、及び／又は第二の軽鎖は、配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第二の重鎖は、配列番号７又は１００～１１０のアミノ酸配列を含み、及び第二の軽鎖は、配列番号８又は９のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第二の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７からなり、及び第二の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８もしくは９のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、第一の重鎖及び第一の軽鎖は、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６のアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは第二の重鎖及び第二の軽鎖は、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第一の重鎖及び第一の軽鎖が、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６のアミノ酸配列を含み、あるいは第二の重鎖及び第二の軽鎖が、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第一の重鎖及び第一の軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６からなり、ならびに第二の重鎖及び第二の軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列からなる。
別の態様では、本開示は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて：
（ａ）第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、ならびに
（ｂ）第二の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
一部の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号７３、８４、９５、又は５６を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号１０３又は４９を含む。
別の態様では、本開示は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて：
（ａ）第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、ならびに
（ｂ）第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれアスパラギン酸、セリン、アラニン、及びバリンを含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号７３、８４、９５、又は５６を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号１０４又は５０を含む。
別の態様では、本開示は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて：
（ａ）第一の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、ならびに
（ｂ）第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号６７、７８、８９、又は４９を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号７又は５６を含む。
別の態様では、本開示は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて：
（ａ）第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれアスパラギン酸、セリン、アラニン、及びバリン、ならびに
（ｂ）第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号１、３、５、又は５０を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号７又は５６を含む。
別の態様では、本開示は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて：
（ａ）第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、ならびに
（ｂ）第二の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号７２、８３、９４、又は５５を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号１０３又は４９を含む。
別の態様では、本開示は、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて：
（ａ）第一の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、ならびに
（ｂ）第二の抗原結合領域が、それぞれアミノ酸２３９位、３３２位、及び３６６位にアスパラギン酸、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、
アミノ酸位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、配列番号６７、７８、８９、又は４９を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号１０２又は５５を含む。
別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体が、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４１のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＶＬは、配列番号４０のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、抗体は、配列番号４１のＶＬアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４１のアミノ酸配列からなる。
別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、配列番号４０及び４１のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ及びＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列からなる。
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号５７、５８、５９、又は６０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａ変異を含む。
特定の実施形態では、抗体は、野生型重鎖定常領域のバリアントである重鎖定常領域を含み、バリアント重鎖定常領域は、野生型重鎖定常領域がＦｃγＲに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲに結合する。特定の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＩＡである。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ変異を含む。
特定の実施形態では、ＩｇＧ１重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異からなる群から選択される少なくとも一つの変異を含む。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、抗体は、配列番号４３又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号８又は９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８又は９のアミノ酸配列からなる。
別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８又は９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０のアミノ酸配列からなり、及び軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８又は９のアミノ酸配列からなる。別の実施形態では、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１０７及び８、１０７、及び９、１０８及び８、１０８及び９、１０９及び８、１０９及び９、１１０及び８、又は１１０及び９のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０７及び８、１０７、及び９、１０８及び８、１０８及び９、１０９及び８、１０９及び９、１１０及び８、又は１１０及び９のアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、抗体は、多特異性である。
特定の実施形態では、多特異性分子又は単離抗体は、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、毒素、放射性核種、又は検出可能な標識にコンジュゲートされている。特定の実施形態では、多特異性分子又は単離抗体は、抗体にコンジュゲートされている。
別の態様では、本開示は、以下をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）本明細書中に開示される多特異性分子のＶＨ、ＶＬ、重鎖、及び／又は軽鎖、
（ｂ）本明細書中に開示される多特異性分子の第一のＶＨ及び第一のＶＬ、
（ｃ）本明細書中に開示される多特異性分子の第二のＶＨ及び第二のＶＬ、
（ｄ）本明細書中に開示される多特異性分子の第一の重鎖及び第一の軽鎖、又は
（ｅ）本明細書中に開示される多特異性分子の第二の重鎖及び第二の軽鎖。
別の態様では、本開示は、本明細書中に開示される単離抗体のＶＨ及び／又はＶＬ、あるいは重鎖及び／又は軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、以下を含む組換え宿主細胞を提供する：
（ａ）本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、
（ｂ）本明細書中に開示されるベクター、
（ｃ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、
（ｄ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、ならびに本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、
（ｅ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチド、
（ｆ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチドを含む第三のベクター、及び本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを含む第四のベクター、
（ｇ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、
（ｈ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、ならびに本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、
（ｉ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチド、又は
（ｊ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチドを含む第三のベクター、及び本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の軽鎖をコードする第四のポリヌクレオチドを含む第四のベクター。
別の態様では、本開示は、以下を含む組換え宿主細胞を提供する：
（ａ）本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、
（ｂ）本明細書中に開示されるベクター、
（ｃ）本明細書中に開示される単離抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）本明細書中に開示される単離抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクター、
（ｅ）本明細書中に開示される単離抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に開示される単離抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、
（ｆ）本明細書中に開示される単離抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、及び本明細書中に開示される単離抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター。
別の態様では、本開示は、本開示は、本明細書中に開示される多特異性分子、本明細書中に開示される単離抗体、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、本明細書中に開示されるベクター、又は本明細書中に開示される宿主細胞、及び医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、多特異性分子又は単離抗体を産生する方法を提供し、この方法は、ポリヌクレオチドが発現され、多特異性分子又は単離抗体が産生されるように、適切な条件下で本明細書中に開示される宿主細胞を培養することを含む。
別の態様では、本開示は、多特異性分子を産生する方法を提供し、方法は、細胞中で：
（ａ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、又は
（ｂ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを、
ポリヌクレオチドが発現され、多特異性分子が産生されるように、適切な条件下で発現させることを含む。
別の態様では、本開示は、多特異性分子を産生する方法を提供し、方法は、細胞中で：
（ａ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチド、又は
（ｂ）本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に開示される第二の抗原結合領域の軽鎖をコードする第四のポリヌクレオチドを、
ポリヌクレオチドが発現され、多特異性分子が産生されるように、適切な条件下で発現させることを含む。
別の態様では、本開示は、多特異性分子を産生する方法を提供し、方法は：
（ａ）第一の細胞において、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチドを、第一の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、
（ｂ）第二の細胞において、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを、第二の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において産生される第一の及び第二の抗原結合領域を、多特異性分子が産生されるように適切な条件下で接触させること、を含む。
別の態様では、本開示は、多特異性分子を産生する方法を提供し、方法は：
（ａ）第一の細胞において、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド及び本明細書中に開示される第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを、第一の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、
（ｂ）第二の細胞において、本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド及び本明細書中に開示される第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを、第二の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において産生される第一の及び第二の抗原結合領域を、多特異性分子が産生されるような条件下で接触させることを含む。
別の態様では、本開示は、多特異性分子を産生する方法を提供し、方法は、多特異性分子が産生されるような条件下で、本明細書中に開示される第一の抗原結合領域及び第二の抗原結合領域を接触させることを含む。
別の態様では、本開示は、単離抗体を産生する方法を提供し、方法は、細胞中で、
（ａ）本明細書中に開示される抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチド、又は
（ｂ）本明細書中に開示される抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、
ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるような、適切な条件下で発現させることを含む。
別の態様では、本開示は、単離抗体を産生する方法を提供し、方法は、細胞中で、
（ａ）本明細書中に開示される抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に開示される抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、又は
（ｂ）本明細書中に開示される抗体の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に開示される抗体の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを、
ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるような、適切な条件下で発現させることを含む。
別の態様では、本開示は、対象において免疫応答を増強させる方法を提供し、方法は、本明細書中に開示される多特異性分子、本明細書中に開示される単離抗体、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、本明細書中に開示されるベクター、本明細書中に開示される宿主細胞、又は本明細書中に開示される医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、対象において癌を治療する方法を提供し、方法は、本明細書中に開示される多特異性分子、本明細書中に開示される単離抗体、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、本明細書中に開示されるベクター、本明細書中に開示される宿主細胞、又は本明細書中に開示される医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、多特異性分子、単離抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は医薬組成物は、全身的に、静脈内に、皮下に、腫瘍内に投与される、又は腫瘍排出リンパ節に送達される。
特定の実施形態では、方法は、追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤である。特定の実施形態では、追加の治療剤は、チェックポイント標的化剤である。別の実施形態では、チェックポイント標的化剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ－３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ－３抗体、アンタゴニスト抗ＶＩＳＴＡ抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ９６抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、及びアゴニスト抗ＯＸ４０抗体からなる群から選択される。別の実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体であり、場合により、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ又はニボルマブである。特定の実施形態では、追加の治療剤は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である。別の実施形態では、阻害剤は、エパカドスタット、Ｆ００１２８７、インドキシモド、及びＮＬＧ９１９からなる群から選択される。特定の実施形態では、追加の治療剤は、ワクチンである。別の実施形態では、ワクチンは、抗原ペプチドと複合体化された熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む。別の実施形態では、熱ショックタンパク質は、ｈｓｃ７０であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体化されている。別の実施形態では、熱ショックタンパク質は、ｇｐ９６タンパク質であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体化されており、場合により、それにおいて、ＨＳＰＰＣは、対象から得られた腫瘍から由来する。
別の態様では、本開示は、対象において感染性疾患を治療する方法を提供し、方法は、本明細書中に開示される多特異性分子、本明細書中に開示される単離抗体、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、本明細書中に開示されるベクター、本明細書中に開示される宿主細胞、又は本明細書中に開示される医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
６．図面の簡単な説明
図１Ａ～図１Ｃは、多特異性分子ＢＡ１２３（図１Ａ）、ＢＡ１２５（図１Ｂ）、及びＢＡ１２７（図１Ｃ）へのヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６の細胞外ドメインの同時結合を示す一連のセンサーグラムである。 同上。 同上。
図２Ａ～図２Ｂは、対照多特異性分子ＢＡ１２８、ＢＡ１３１、及びＢＡ１３３と比較した、ヒトＴＩＧＩＴ又はヒトＣＤ９６を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７の同時結合を示すグラフである。細胞発現ヒトＴＩＧＩＴ及び可溶性Ｈｉｓタグ付きヒトＣＤ９６（図２Ａ）又は細胞発現ヒトＣＤ９６及び可溶性Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴ（図２Ｂ）の二重結合を、蛍光色素コンジュゲート（Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ４８８）抗Ｈｉｓ抗体を使用したフローサイトメトリーにより検出した。 同上。
図３Ａ～図３Ｉは、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）と比較した、ヒトＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図３Ａ）、ＢＡ１２５（図３Ｂ）、又はＢＡ１２７（図３Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図３Ｄ）、ＢＡ１３０（図３Ｅ）、ＢＡ１３１（図３Ｆ）、ＢＡ１３３（図３Ｇ）、ＢＡ１３４（図３Ｈ）、又はＢＡ１３６（図３Ｉ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、ＢＡ１２８のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図４Ａ～図４Ｉは、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）と比較した、ヒトＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム１を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図４Ａ）、ＢＡ１２７（図４Ｂ）、又はＢＡ１２５（図４Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図４Ｄ）、ＢＡ１３０（図４Ｅ）、ＢＡ１３１（図４Ｆ）、ＢＡ１３３（図４Ｇ）、ＢＡ１３４（図４Ｈ）、又はＢＡ１３６（図４Ｉ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、ＢＡ１２８のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図５Ａ～図５Ｉは、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）と比較した、カニクイザルＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図５Ａ）、ＢＡ１２５（図５Ｂ）、又はＢＡ１２７（図５Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図５Ｄ）、ＢＡ１３０（図５Ｅ）、ＢＡ１３１（図５Ｆ）、ＢＡ１３３（図５Ｇ）、ＢＡ１３４（図５Ｈ）、又はＢＡ１３６（図５Ｉ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、ＢＡ１２８のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされる。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図６Ａ～図６Ｉは、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図６Ａ）、ＢＡ１２５（図６Ｂ）、又はＢＡ１２７（図６Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図６Ｄ）、ＢＡ１３０（図６Ｅ）、ＢＡ１３１（図６Ｆ）、ＢＡ１３３（図６Ｇ）、ＢＡ１３４（図６Ｈ）、又はＢＡ１３６（図６Ｉ）による、ヒトＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示す一連のグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）による遮断との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図７Ａ～図７Ｉは、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図７Ａ）、ＢＡ１２５（図７Ｂ）、又はＢＡ１２７（図７Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図７Ｄ）、ＢＡ１３０（図７Ｅ）、ＢＡ１３１（図７Ｆ）、ＢＡ１３３（図７Ｇ）、ＢＡ１３４（図７Ｈ）、又はＢＡ１３６（図７Ｉ）による、カニクイザルＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示す一連のグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）による遮断との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの多特異性分子の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図８Ａ～図８Ｉは、高レベルの細胞表面ヒトＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図８Ａ）、ＢＡ１２５（図８Ｂ）、又はＢＡ１２７（図８Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図８Ｄ）、ＢＡ１３０（図８Ｅ）、ＢＡ１３１（図８Ｆ）、ＢＡ１３３（図８Ｇ）、ＢＡ１３４（図８Ｈ）、又はＢＡ１３６（図８Ｉ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図９Ａ～図９Ｉは、高レベルの細胞表面カニクイザルＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図９Ａ）、ＢＡ１２５（図９Ｂ）、又はＢＡ１２７（図９Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図９Ｄ）、ＢＡ１３０（図９Ｅ）、ＢＡ１３１（図９Ｆ）、ＢＡ１３３（図９Ｇ）、ＢＡ１３４（図９Ｈ）、又はＢＡ１３６（図９Ｉ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）の結合と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１０Ａ～図１０Ｉは、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図１０Ａ）、ＢＡ１２５（図１０Ｂ）、又はＢＡ１２７（図１０Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図１０Ｄ）、ＢＡ１３４（図１０Ｅ）、ＢＡ１３１（図１０Ｆ）、ＢＡ１３３（図１０Ｇ）、ＢＡ１３０（図１０Ｈ）、又はＢＡ１３６（図１０Ｉ）による、高レベルの細胞表面ヒトＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示す一連のグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）による遮断と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１１Ａ～図１１Ｉは、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図１１Ａ）、ＢＡ１２５（図１１Ｂ）、又はＢＡ１２７（図１１Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図１１Ｄ）、ＢＡ１３０（図１１Ｅ）、ＢＡ１３１（図１１Ｆ）、ＢＡ１３３（図１１Ｇ）、ＢＡ１３４（図１１Ｈ）、又はＢＡ１３６（図１１Ｉ）による、高レベルの細胞表面カニクイザルＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示す一連のグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）による遮断と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１２Ａ～図１２Ｉは、高レベルの細胞表面ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６のアイソフォーム２を共発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図１２Ａ）、ＢＡ１２５（図１２Ｂ）、又はＢＡ１２７（図１２Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図１２Ｄ）、ＢＡ１３０（図１２Ｅ）、ＢＡ１３１（図１２Ｆ）、ＢＡ１３３（図１２Ｇ）、ＢＡ１３４（図１２Ｈ）、又はＢＡ１３６（図１２Ｉ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）の結合と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１３Ａ～図１３Ｉは、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図１３Ａ）、ＢＡ１２５（図１３Ｂ）、又はＢＡ１２７（図１３Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図１３Ｄ）、ＢＡ１３０（図１３Ｅ）、ＢＡ１３１（図１３Ｆ）、ＢＡ１３３（図１３Ｇ）、ＢＡ１３４（図１３Ｈ）、又はＢＡ１３６（図１３Ｉ）による、高レベルの細胞表面ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６のアイソフォーム２を共発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示す一連のグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照多特異性分子（ＢＡ１２８）による遮断と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１４Ａ～図１４Ｆは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの高レベルの細胞表面バリアントＶ／Ｖを発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図１４Ａ）、ＢＡ１２５（図１４Ｂ）、又はＢＡ１２７（図１４Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図１４Ｄ）、ＢＡ１３０（図１４Ｅ）、及びＢＡ１３１（図１４Ｆ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１５Ａ～図１５Ｆは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの高レベルの細胞表面バリアントＦ／Ｆを発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３（図１５Ａ）、ＢＡ１２５（図１５Ｂ）、又はＢＡ１２７（図１５Ｃ）、あるいは対照多特異性分子ＢＡ１２９（図１５Ｄ）、ＢＡ１３０（図１５Ｅ）、及びＢＡ１３１（図１５Ｆ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１６Ａ～図１６Ｃは、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４６）と比較した、ヒトＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３（図１６Ａ）、ＢＡ１４４（図１６Ｂ）、ＢＡ１４５（図１６Ｃ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、ＢＡ１４６のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。
図１７Ａ～図１７Ｃは、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４６）と比較した、カニクイザルＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３（図１７Ａ）、ＢＡ１４４（図１７Ｂ）、ＢＡ１４５（図１７Ｃ）の結合を示す一連のグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、ＢＡ１４６のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。
図１８Ａ～図１８Ｃは、抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３（図１８Ａ）、ＢＡ１４４（図１８Ｂ）、及びＢＡ１４５（図１８Ｃ）による、ヒトＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示す一連のグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４６）による遮断と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。 同上。 同上。
図１９Ａ～図１９Ｃは、抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３（図１９Ａ）、ＢＡ１４４（図１９Ｂ）、及びＢＡ１４５（図１９Ｃ）による、カニクイザルＣＤ９６の高レベルの細胞表面アイソフォーム２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示す一連のグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４６）による遮断と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。 同上。 同上。
図２０は、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４９）と比較した、高レベルの細胞表面ヒトＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞への抗ＴＩＧＩＴ ＩｇＧ１抗体ＢＡ１４８の結合を示すグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、ＢＡ１４９のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。
図２１は、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４９）と比較した、高レベルの細胞表面カニクイザルＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞への抗ＴＩＧＩＴ抗体ＢＡ１４８の結合を示すグラフである。結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、各場合において、ＢＡ１４９のＣＨＯ細胞結合との比較において、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。
図２２は、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＢＡ１４８による、高レベルのヒトＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示すグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４９）による遮断と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。
図２３は、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＢＡ１４８による、高レベルのカニクイザルＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞へのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ結合の遮断を示すグラフである。ＣＤ１５５－Ｆｃの結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、アイソタイプ対照抗体（ＢＡ１４９）による遮断と比較して、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対して、最大応答パーセントとしてプロットされた。
図２４Ａ～図２４Ｄは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのバリアントＶ／Ｖの高レベルの細胞表面を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への抗ＴＩＧＩＴ抗体ＢＡ１４８、及び抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５の結合を示す一連のグラフである。ＢＡ１４３（図２４Ａ）、ＢＡ１４４（図２４Ｂ）、ＢＡ１４５（図２４Ｃ）、及びＢＡ１４８（図２４Ｄ）の結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。
図２５Ａ～図２５Ｄは、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのバリアントＦ／Ｆの高レベルの細胞表面を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への抗ＴＩＧＩＴ ＩｇＧ１抗体ＢＡ１４８、及び抗ＣＤ９６ ＩｇＧ１ ＷＴ抗体ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５の結合を示す一連のグラフである。ＢＡ１４３（図２５Ａ）、ＢＡ１４４（図２５Ｂ）、ＢＡ１４５（図２５Ｃ）、及びＢＡ１４８（図２５Ｄ）の結合のレベルは、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）により評価され、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。
図２６Ａ～図２６Ｆは、三つの異なるドナーにおいて活性化ヒトＴ細胞に結合するＢＡ１２７、ＢＡ１４３、ＢＡ１４８、又はＢＡ１２８の能力を示す一連のグラフである。ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｄ、図２６Ｅ、及び図２６Ｆ）への結合は、中央蛍光強度（ＭＦＩ）により評価され、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２７Ａ～図２７Ｆは、三つの異なるドナーにおいて活性化ヒトＴ細胞に結合するＢＡ１２７又はＢＡ１２８の能力を示す一連のグラフである。ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２７Ａ、図２７Ｂ、及び図２７Ｃ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図２７Ｄ、図２７Ｅ、及び図２７Ｆ）への結合は、中央蛍光強度（ＭＦＩ）により評価され、細胞とインキュベートされたそれぞれの抗体の濃度に対してプロットされた。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２８Ａ～図２８Ｃは、広範な多特異性分子濃度にわたって単一ドナーからのＳＥＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を促進する、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２８、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、及びＢＡ１３１多特異性分子の能力を示す一連のグラフである。各パネルは、同じドナーを使用した独立した実験を表す。 同上。 同上。
図２９は、広範な多特異性分子濃度にわたって単一ドナーからのＳＥＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を促進する、ＢＡ１２７及びＢＡ１２８多特異性分子ならびにＢＡ１４３及びＢＡ１４８抗体の能力を示すグラフである。
図３０Ａ～図３０Ｆは、広範な抗体濃度にわたって六つの異なるドナーからのＳＥＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を促進する、ＢＡ１２７及びＢＡ１２８の能力を示す一連のグラフである。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図３１Ａ～図３１Ｂは、ＣＨＯ細胞上で発現されるＣＤ１５５への、Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現される ＴＩＧＩＴの結合を遮断する、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２８、及びＢＡ１３３（図３１Ａ）、ならびにＢＡ１２７、ＢＡ１４３、ＢＡ１４６、抗ＴＩＧＩＴ単一特異性参照抗体１、及び抗ＴＩＧＩＴ単一特異性参照抗体２（図３１Ｂ）の能力を示すグラフである。図３１Ｃは、ＣＨＯ細胞上で発現されるＣＤ１５５への、Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現されるＴＩＧＩＴの結合を遮断する、ＢＡ１２７、ＢＡ１３１、ＢＡ１２８、及び抗ＴＩＧＩＴ参照抗体３の能力を示すグラフである。遮断は、広範な抗体濃度にわたるＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナルの倍率変化として表される。 同上。 同上。
図３２Ａ～図３２Ｂは、広範な濃度にわたる、二人のドナーからの最適濃度以下のＳＥＡスーパー抗原で刺激された初代健常ドナーヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ－２サイトカイン分泌を誘発する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７、参照抗ＴＩＧＩＴ抗体、及びアイソタイプ対照抗体の能力を示すグラフである。 同上。
図３３Ａ～図３３Ｅは、マウス結腸直腸癌モデルにおける経時的な腫瘍容積を示す一連のグラフであり、ここでマウスには、二特異性アイソタイプ対照（図３３Ａ）、抗ＴＩＧＩＴマウス代替単一特異性抗体（図３３Ｂ）、抗ＣＤ９６マウス代替単一特異性抗体（図３３Ｃ）、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ９６の両方のマウス代替単一特異性抗体（図３３Ｄ）、又は抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６マウス代替多特異性分子（図３３Ｅ）が投与された。 同上。 同上。 同上。 同上。
図３４Ａは、マウス結腸直腸癌モデルにおける経時的な平均腫瘍容積を示すグラフであり、ここでマウスには、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ９６の両方のマウス代替単一特異性抗体、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６マウス代替多特異性分子、Ｆｃサイレント抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６マウス代替多特異性分子、又はアイソタイプ対照が投与された。図３４Ｂ～図３４Ｅは、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ９６の両方のマウス代替単一特異性抗体（図３４Ｃ）、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６マウス代替多特異性分子（図３４Ｄ）、Ｆｃサイレント抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６マウス代替多特異性分子（図３４Ｅ）、又はアイソタイプ対照（図３４Ｂ）が投与された個々の各マウスについての経時的な個々の腫瘍容積を示す一連のグラフである。 同上。 同上。 同上。 同上。
７．発明を実施するための形態
本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）ならびに単離抗ＴＩＧＩＴ抗体に特異的に結合する多特異性分子を提供する。また、提供されるのは、これらの多特異性分子及び抗体を含む医薬組成物、これらの多特異性分子及び抗体をコードする核酸、これらの多特異性分子及び抗体を作製するための発現ベクター及び宿主細胞、ならびにこれらの多特異性分子及び抗体を使用して対象を治療する方法である。本明細書中で開示される多特異性分子及び抗体は、免疫細胞活性化を増加させるために特に有用であり、それ故に、対象において癌を治療する、又は対象において感染性疾患を治療もしくは予防する際に有用である。
７．１ 定義
本明細書で使用される場合、「ＣＤ９６」という用語は、ＴＡＣＴＩＬＥ（Ｔ細胞活性化、増加された後期発現）としても知られる、ヒトにおいてＣＤ９６遺伝子によってコードされる表面抗原分類９６を指す。本明細書で使用される場合、「ヒトＣＤ９６」という用語は、野生型ヒトＣＤ９６遺伝子（例、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＭ＿００５８１６．５）、断片、又はそのバリアントによってコードされるＣＤ９６タンパク質を指す。ヒトＣＤ９６の例示的な細胞外部分を、配列番号６１～６５として本明細書中に提供する。カニクイザルＣＤ９６の例示的な細胞外部分を、配列番号６６、１１１、及び１１２として本明細書中に提供する。
本明細書中で使用されるように、用語「ＴＩＧＩＴ」は、ヒトにおいてＴＩＧＩＴ遺伝子によりコードされるＩｇドメイン及びＩＴＩＭドメイン（また、ＶＳＩＧ９又はＶＳＴＭ３として公知である）を伴うＴ細胞免疫受容体を指す。本明細書中で使用されるように、用語「ヒトＴＩＧＩＴ」は、野生型ヒトＴＩＧＩＴ遺伝子（例、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＭ＿１７３７９９．３）によりコードされるＴＩＧＩＴタンパク質又はそのようなタンパク質の細胞外ドメインを指す。成熟ヒトＴＩＧＩＴタンパク質及びカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質の細胞外ドメインの例示的なアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１３及び１１４として提供される。
本明細書中で使用されるように、「多特異性分子」は、異なる抗原に特異的に結合する二つ又はそれ以上の抗原結合領域を含む分子である。
本明細書中で使用されるように、「抗原結合領域」は、多特異性分子又は抗原に対して、抗原についてのその特異性を付与するアミノ酸残基を含む多特異性分子又は抗体の部分を指す。抗原結合領域の例は、抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖、軽鎖、及びそれらの任意の断片を含む。抗原結合領域は、げっ歯類（例、マウス、ラット、又はハムスター）及びヒトのような、任意の動物種に由来し得る。
本明細書中で使用されるように、用語「抗体」は、全長抗体、全長抗体の抗原結合断片、ならびに抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域、及び／又はＶＬ領域を含む分子を含む。抗体の例は、限定されないが、モノクローナル抗体、組換えで産生された抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体（二特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、二つの重鎖及び二つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖対、細胞内抗体、ヘテロ複合体抗体、抗体－薬物コンジュゲート、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかの抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、もしくはＩｇＡ２）、又は任意のサブクラス（例、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ）のものであり得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、ＩｇＧ抗体、あるいはそのクラス（例、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４）又はサブクラスである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
「多特異性抗体」は、二つ又はそれ以上の異なる抗原、あるいは同じ抗原の二つ又はそれ以上の異なる領域に特異的に結合する抗体（例、二特異性抗体）である。多特異性抗体は、二つの異なる抗原結合部位（Ｆｃ領域を除く）を含む二特異性抗体を含む。多特異性抗体は、例えば、組換えで製造された抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、表面再処理された抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、二つの重鎖及び二つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖一量体、ヘテロ接合抗体、結合単鎖抗体又は結合単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、結合Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、化学結合Ｆｖｓ、及びジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）を含み得る。多特異性抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、もしくはＩｇＡ２）、又は任意のサブクラス（例、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ）のものであり得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性抗体は、ＩｇＧ抗体、あるいはそのクラス（例、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４）又はサブクラスである。
本明細書中で使用されるように、用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２、６６０９－６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）により、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）により、ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）により記載されており、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書中に組み入れられ、ここで、定義は、互いに対して比較された場合に、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３は、重鎖ＣＤＲを表示し、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、軽鎖ＣＤＲを表示する。
本明細書中で使用されるように、用語「可変領域」及び「可変ドメイン」は、互換的に使用され、当技術分野において一般的である。可変領域は、典型的には、抗体の部分、一般的には、軽鎖又は重鎖の部分、典型的には、成熟重鎖におけるアミノ末端の約１１０～１２０のアミノ酸もしくは１１０～１２５のアミノ酸及び成熟軽鎖における約９０～１１５のアミノ酸を指し、それは、抗体の間で配列において広範に異なり、特定の抗体の、その特定の抗原についての結合及び特異性において使用される。配列中の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるそれらの領域中に集中している一方で、可変領域中のより高度に保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。任意の特定の機構又は理論により拘束されることを望まないが、軽鎖及び重鎖のＣＤＲが、抗体の抗原との相互作用及び特異性に主に関与していると考えられている。特定の実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。特定の実施形態では、可変領域は、げっ歯類又はマウスＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態では、可変領域は、霊長類（例、非ヒト霊長類）可変領域である。特定の実施形態では、可変領域は、げっ歯類又はマウスＣＤＲ及び霊長類（例、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
本明細書中で使用されるように、用語「ＶＨ」及び「ＶＬ」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）において記載されるように、それぞれ抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を指し、それは、その全体において参照により本明細書中に組み入れられる。
本明細書中で使用されるように、用語「定常領域」は、当技術分野において一般的である。定常領域は、抗体部分、例えば、抗体の抗原との結合に直接的には関与しないが、しかし、様々なエフェクター機能、例えばＦｃ受容体（例、Ｆｃガンマ受容体）との相互作用などを示し得る、軽鎖及び／又は重鎖のカルボキシル末端部分である。
本明細書中で使用されるように、用語「重鎖」は、抗体への参照において使用される場合、定常領域のアミノ酸配列に基づき、任意の異なる型、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）を指すことができ、それは、それぞれＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭクラスを生じる。
本明細書中で使用されるように、用語「軽鎖」は、抗体への参照において使用される場合、定常領域のアミノ酸配列に基づき、任意の異なる型、例えば、カッパ（κ）又はラムダ（λ）を指すことができる。軽鎖アミノ酸配列は、当技術分野において周知である。具体的な実施形態では、軽鎖はヒト軽鎖である。
本明細書中で使用されるように、用語「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、「免疫特異的に結合する」、及び「免疫特異的に認識する」は、抗体の文脈において類似の用語であり、そのような結合が当業者により理解されるとおり、抗原（例、エピトープ又は免疫複合体）に結合する分子を指す。例えば、抗原に特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ ３０００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ボイシ、アイダホ州）、又は当技術分野において公知の他のアッセイにより決定されるとおり、一般的により低い親和性で他のペプチド又はポリペプチドに結合し得る。特定の実施形態では、抗原に特異的に結合する分子は、分子が別の抗原に非特異的に結合する場合、ＫＡより少なくとも２ｌｏｇ（例、１０倍）、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ又はそれより大きいＫＡで抗原に結合する。
本明細書中で使用されるように、用語「ＥＵ番号付けシステム」は、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５（１９６９）及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１において記載されるように、抗体の定常領域についてのＥＵ番号付け慣例を指し、それらの各々が、その全体において参照により本明細書中に組み入れられる。
本明細書中で使用されるように、用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、本明細書中に記載される治療的又は予防的な措置を指す。「治療」の方法は、疾患もしくは障害又は再発性の疾患もしくは障害の一つ又は複数の症状を予防する、治癒する、遅延させる、その重症度の低下させる、又は改善するために、あるいはそのような治療の非存在下で予期される以上に対象の寿命を延ばすために、疾患もしくは障害を有する、又はそのような疾患もしくは障害を有する傾向がある対象への抗体の投与を用いる。
本明細書中で使用されるように、対象への治療の投与に関連する用語「有効量」は、所望の予防又は治療効果を達成する治療の量を指す。
本明細書中で使用されるように、用語「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。特定の実施形態では、対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
抗体又はポリヌクレオチドに関して本明細書中で使用されるように、用語「単離」は、抗体又はポリヌクレオチドの天然供給源において存在している一つ又は複数の混入物（例、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、又は炭水化物など）から分離される抗体又はポリヌクレオチドを指す。本明細書中に記載される「単離抗体」の全ての例は、単離されていてもよいが、単離される必要はない抗体として追加的に企図される。本明細書中に記載される「単離されたポリヌクレオチド」の全ての例は、単離されていてもよいが、単離される必要はないポリヌクレオチドとして追加的に企図される。本明細書中に記載される「抗体」の全ての例は、単離されていてもよいが、単離される必要はない抗体として追加的に企図される。本明細書中に記載される「ポリヌクレオチド」の全ての例は、単離されていてもよいが、単離される必要はないポリヌクレオチドとして追加的に企図される。
二つの配列（例、アミノ酸配列又は核酸配列）間の「同一性パーセント」の決定は、数学的アルゴリズムを使用して成し遂げられ得る。二つの配列の比較のため利用される数学的アルゴリズムの特定の非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：５８７３－５８７７において改変されたＫａｒｌｉｎ Ｓ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムであり、その各々は、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み入れられ、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書中に記載される核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためのＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝１００についてワード長＝１２で行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書中に記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るためのＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝５０に対して、ワード長＝３で行われ得る。比較目的でギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９－３４０２において記載されるとおり、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用されてもよく、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。あるいは、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムの（例、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）デフォルトパラメーターが使用され得る（例、ワールドワイドウェブ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ上の全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を参照）。配列の比較のため利用される数学的アルゴリズムの別の特定の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムであり、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウエアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み入れられる。アミノ酸配列を比較するためＡＬＩＧＮプログラムを利用するとき、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４が使用され得る。
二つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容して、又は許容しないで、上で記載されたものと同様の技術を使用して決定され得る。パーセント同一性を算出する際、通常、完全一致のみがカウントされる。
７．２ ＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴならびに抗ＴＩＧＩＴ抗体に結合する多特異性分子
一態様では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する多特異性分子を提供する。例えば、本明細書中で提供される多特異性分子は、ＣＤ９６に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に結合する第二の抗原結合領域を含み得る。本明細書中で提供される多特異性分子はまた、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴに結合する第二の抗原結合領域を含み得る。また、本明細書中で提供されるのは、ＣＤ９６に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴに結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子である。例示的な抗ＣＤ９６抗原結合領域及び抗ＴＩＧＩＴ抗原結合領域のアミノ酸配列が、それぞれ表１及び表２中に示されている。
別の態様では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する抗体を提供する。例示的な抗体のアミノ酸配列が、表２中に示されている。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＨを含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲＨ１を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲＨ２を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲＨ３を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、表１中に開示されるＶＬのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＬのＣＤＲＬ１を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＬのＣＤＲＬ２を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＬのＣＤＲＬ３を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＨを含む。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲＨ１を含む。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲＨ２を含む。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲＨ３を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲＨ１を含む。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲＨ２を含む。特定の実施形態では、第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲＨ３を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＨを含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＨを含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲＨ１を含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲＨ１を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲＨ２を含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲＨ２を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＨのＣＤＲＨ３を含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＨのＣＤＲＨ３を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＬのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＬを含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＬを含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＬのＣＤＲＨ１を含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲＨ１を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＬのＣＤＲＨ２を含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲＨ２を含む。特定の実施形態では、第一の抗原結合領域は、表１中に示されるＶＬのＣＤＲＨ３を含み、及び第二の抗原結合領域は、表２中に示されるＶＬのＣＤＲＨ３を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、表２中に示されるＶＨドメインのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、抗体は、表２中に示されるＶＨドメインのＣＤＲＨ１を含む。特定の実施形態では、抗体は、表２中に示されるＶＨドメインのＣＤＲＨ２を含む。特定の実施形態では、抗体は、表２中に示されるＶＨドメインのＣＤＲＨ３を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、表２中に開示されるＶＬドメインのＣＤＲの一つ、二つ、又は三つ全てを含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、抗体は、表２中に示されるＶＬドメインのＣＤＲＬ１を含む。特定の実施形態では、抗体は、表２中に示されるＶＬドメインのＣＤＲＬ２を含む。特定の実施形態では、抗体は、表２中に示されるＶＬドメインのＣＤＲＬ３を含む。
本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体の個々のＣＤＲは、当技術分野において公知の任意のＣＤＲ番号付けスキームに従って決定することができる。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体のＣＤＲの一つ又は複数は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）に従って決定することができ、その各々は、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームにより決定される、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、Ｋａｂａｔ番号付けスキームにより決定される、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、Ｋａｂａｔ番号付けスキームにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含み、及び第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、Ｋａｂａｔ 番号付けスキームにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体のＣＤＲの一つ又は複数が、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って決定され得るが、それは、免疫グロブリン構造ループの位置を指す（例、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ ＡＭ，（１９８７），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：７９９－８１７；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（１）：１７５－８２；及び米国特許第７，７０９，２２６号を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより決定されるように、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含み、及び第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体のＣＤＲの一つ又は複数は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２－７４５に従って決定することができ、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。また、例えば、Ｍａｒｔｉｎ Ａ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ，” ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ３１，ｐｐ．４２２－４３９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）を参照のこと。その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ番号付けシステムにより決定されるように、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ番号付けシステムにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＭａｃＣａｌｌｕｍ番号付けシステムにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含み、及び第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、ＭａｃＣａｌｌｕｍ番号付けスキームにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体のＣＤＲは、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ，（１９９９）Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ７：１３２－１３６；Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：２０９－２１２、その各々が、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる；及びＬｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７：Ｄ１００６－Ｄ１０１２において記載されるＩＭＧＴ番号付けシステムに従って決定することができる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＩＭＧＴ番号付けシステムにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＩＭＧＴ番号付けシステムにより決定されるように、第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＩＭＧＴ番号付けシステムにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含み、及び第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、ＩＭＧＴ番号付けスキームにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体のＣＤＲは、ＡｂＭ番号付けスキームに従って決定することができ、それは、ＡｂＭ高頻度可変領域を指し、それは、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の妥協点を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）により使用され、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＡｂＭ番号付けスキームにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＡｂＭ番号付けスキームにより決定されるように、第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＡｂＭ番号付けスキームにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含み、及び第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、ＡｂＭ番号付けスキームにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗体のＣＤＲは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７－６７０（２００１）において記載されているように、ＡＨｏ番号付けシステムに従って決定することができ、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＡＨｏ番号付けシステムにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＡＨｏ番号付けシステムにより決定されるように、第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、ＡＨｏ番号付けシステムにより決定されるように、第一の抗原結合領域は、本明細書中の表１中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含み、及び第二の抗原結合領域は、本明細書中の表２中に開示される抗原結合領域のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、ＡＨｏ番号付けシステムにより決定されるように、本明細書中の表２中に開示される抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体の個々のＣＤＲは、各々が独立して、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡＨｏ、又はＡｂＭ番号付けスキームの一つに従って、又は多特異性分子の構造分析により決定され、それにおいて、構造分析は、ＣＤ９６又はＴＩＧＩＴのエピトープ領域と接触すると予測される可変領域中の残基を同定する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３５、３７、又は３９において示されるＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列を含むＶＬを含み、それにおいて、各ＣＤＲが独立して、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡＨｏ、又はＡｂＭの番号付けスキームの一つに従って、又は多特異性分子の構造分析により決定され、それにおいて、構造分析は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）のエピトープ領域と接触すると予測される可変領域中の残基を同定する。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４１において示されるＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列を含むＶＬを含み、それにおいて、各ＣＤＲは独立して、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡＨｏ、又はＡｂＭの番号付けスキームの一つに従って、又は多特異性分子の構造分析により決定され、それにおいて、構造分析は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）のエピトープ領域と接触すると予測される可変領域中の残基を同定する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３５、３７、又は３９において示されるＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列を含むＶＬを含み、第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４１において示されるＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列を含むＶＬを含み、それにおいて、各ＣＤＲは独立して、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、ＩＭＧＴ、ＡＨｏ、又はＡｂＭの番号付けスキームの一つに従って、又は多特異性分子の構造分析により決定され、それにおいて、構造分析は、それぞれＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）のエピトープ領域と接触すると予測される可変領域中の残基を同定する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号１０、１１、及び１２、１６、１７、及び１８、又は２２、２３、及び２４においてそれぞれ示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号１３、１４、及び１５、１９、２０、及び２１、又は２５、２６、及び２７においてそれぞれ示されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む ＶＬを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域を含むＶＨ、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域を含むＶＬを含み、それにおいて、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１、又は２２、２３、２４、２５、２６、及び２７において示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３４、３６、及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３５、３７、又は３９において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３５、３７、又は３９において示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３５、３７、又は３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３５、３７、又は３９において示されるアミノ酸配列と少なくとも ７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも ８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３４において示されるアミノ酸配列からなり、及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３５において示されるアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３６において示されるアミノ酸配列からなり、及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３７において示されるアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３８において示されるアミノ酸配列からなり、及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３９において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、ならびに３８及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）への結合について、配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と交差競合する多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される多特異性分子、例えば、配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と同じ又は重複するＣＤ９６のエピトープ（例、ヒトＣＤ９６のエピトープ又はカニクイザルＣＤ９６のエピトープ）に結合する多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号２８、２９、及び３０においてそれぞれ示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号３１、３２、及び３３においてそれぞれ示されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域を含むＶＨ、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域を含むＶＬを含み、それにおいて、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３において示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＬのアミノ酸配列は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列からなり、及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第二の抗原結合領域は、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨアミノ酸配列及びＶＬアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０及び４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）への結合について、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と交差競合する多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される多特異性分子、例えば、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と同じ又は重複するＴＩＧＩＴのエピトープ（例、ヒトＴＩＧＩＴのエピトープ又はカニクイザルＴＩＧＩＴのエピトープ）に結合する多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合分子は、配列番号１０、１１、及び１２、１６、１７、及び１８、又は２２、２３、及び２４においてそれぞれ示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む第一のＶＨを含み、ならびに第二の抗原結合領域は、配列番号２８、２９、及び３０においてそれぞれ示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合分子は、配列番号１３、１４、及び１５、１９、２０、及び２１、又は２５、２６、及び２７においてそれぞれ示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む第一のＶＬを含み、ならびに第二の抗原結合領域は、配列番号３１、３２、及び３３においてそれぞれ示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合分子は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域を含む第一のＶＨ、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域を含む第一のＶＬを含み、それにおいて、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１、又は２２、２３、２４、２５、２６、及び２７において示されるアミノ酸配列を含み、及び第二の抗原結合領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域を含む第二のＶＨ、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域を含む第二のＶＬを含み、それにおいて、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３において示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第一のＶＨを含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるアミノ酸配列を含む第一のＶＨを含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列を含む第二のＶＨを含む。特定の実施形態では、第一のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３４、３６、及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、ならびに第二のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３５、３７、又は３９において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第一のＶＬを含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３５、３７、又は３９において示されるアミノ酸配列を含む第一のＶＬを含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む。特定の実施形態では、第一のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３５、３７、及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、及び第二のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号３５、３７、又は３９において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第一のＶＬを含み、ならびに第二の抗原結合領域は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第二のＶＨ、及び配列番号４１において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４、３６、又は３８のアミノ酸配列を含む第一のＶＨ、及び配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列を含む第一のＶＬを含み、第二の抗原結合領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第二のＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む。特定の実施形態では、第一のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号３４、３６、及び３８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、第一のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号３５、３７、及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、第二のＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列からなり、ならびに第二のＶＬのアミノ酸配列は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９においてそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む第一のＶＨ及び第一のＶＬを含み、ならびに第二の抗原結合領域は、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む第二のＶＨ及び第二のＶＬを含む。特定の実施形態では、第一のＶＨ及び第一のＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、ならびに３８及び３９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、及び第二のＶＨ及び第二のＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０及び４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）への結合について、配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と交差競合する第一の抗原結合領域、ならびにＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）への結合について、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と交差競合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される多特異性分子、例えば、配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と同じ又は重複するＣＤ９６のエピトープ（例、ヒトＣＤ９６のエピトープ又はカニクイザルＣＤ９６のエピトープ）に結合する第一の抗原結合領域、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子、例えば、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む多特異性分子と同じ又は重複するＴＩＧＩＴのエピトープ（例、ヒトＴＩＧＩＴのエピトープ又はカニクイザルＴＩＧＩＴのエピトープ）に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、それにおいて、単離抗体 は、配列番号２８、２９、及び３０においてそれぞれ示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、それにおいて、単離抗体 は、配列番号３１、３２、及び３３においてそれぞれ示されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、それにおいて、単離抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３領域を含むＶＨ、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域を含むＶＬを含み、それにおいて、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３領域は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３においてそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、ＶＬのアミノ酸配列は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４１において示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（例、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４０において示されるアミノ酸配列からなり、及びＶＬのアミノ酸配列は、配列番号４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０及び４１において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）への結合について、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体と交差競合する単離抗体を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される抗体と同じ又は重複するＴＩＧＩＴのエピトープ（例、ヒトＴＩＧＩＴのエピトープ又はカニクイザルＴＩＧＩＴのエピトープ）に結合する単離抗体、例えば、配列番号４０及び４１においてそれぞれ示されるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体を提供する。
特定の実施形態では、多特異性分子又は抗体のエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））、Ｘ線回折結晶解析試験、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析と共役された水素／ジュウテリウム交換（例、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴ－ペプチドスキャニングアッセイ、及び／又は変異誘発マッピング（例、部位特異的変異誘発マッピング）により決定され得る。Ｘ線結晶解析のために、結晶化は、当技術分野における公知の方法のいずれかを使用して達成され得る（例、Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３；Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。多特異性分子：抗原又は抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して試験されてもよく、コンピューターソフトウェア、例えばＸ－ＰＬＯＲなどを使用して精密化され得る（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布；例、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ １１４ ＆ １１５，ｅｄｓ．Ｗｙｃｋｏｆｆ ＨＷ ｅｔ ａｌ．；米国特許出願第２００４／００１４１９４号）、及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ １）：３７－６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ．Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。変異誘発マッピング試験は、当業者に公知の任意の方法を使用して達成され得る。アラニンスキャニング変異誘発技術を含む、変異誘発技術の説明については、例えば、上記のＣｈａｍｐｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）及び上記のＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＣ＆Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９８９）を参照のこと。特定の実施形態では、多特異性分子又は抗体のエピトープは、アラニンスキャニング変異誘発試験を使用して決定される。また、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）の同じ又は重複するエピトープを認識し、結合する多特異性分子又は抗体は、例えば、一つの多特異性分子又は抗体が、標的抗原への別の多特異性分子又は抗体の結合を遮断する能力を示すこと、即ち、競合結合アッセイによる、ルーチン的技術、例えばイムノアッセイなどを使用して同定され得る。競合結合アッセイをまた使用して、二つの多特異性分子又は抗体が、エピトープについて同様の結合特異性を有するか否かを決定することができる。競合結合は、免疫グロブリンが、テスト下で、共通抗原、例えばＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）などへの参照多特異性分子又は抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定され得る。多数の型の競合結合アッセイが公知である：例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ９：２４２－２５３を参照のこと）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ＴＮ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３６１４－９を参照のこと）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）；Ｉ－１２５標識を使用した固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５（１）：７－１５を参照のこと）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５２を参照のこと）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：７７－８２を参照のこと）。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。典型的には、そのようなアッセイは、これら、未標識テスト免疫グロブリン及び標識参照免疫グロブリンのいずれかを持つ固体表面又は細胞に結合された精製抗原（例、ＣＤ９６、例えばヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６など、あるいはＴＩＧＩＴ、例えばヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴなど）の使用を含む。競合阻害は、テスト免疫グロブリンの存在において固体表面又は細胞に結合された標識の量を決定することにより測定され得る。通常、テスト免疫グロブリンは、過剰に存在する。通常、競合する多特異性分子又は抗体が過剰に存在する場合、それは、共通の抗原への参照多特異性分子又は抗体の特異的結合を、少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％又はそれ以上阻害するであろう。競合結合アッセイは、標識抗原あるいは標識多特異性分子又抗体のいずれかを使用して、多数の異なるフォーマットにおいて設計され得る。一般的なバージョンのこのアッセイにおいて、抗原は、９６ウェルプレート上に固定される。抗原への標識抗体の結合を遮断する、未標識多特異性分子又は抗体の能力が次に、放射性標識又は酵素標識を使用して測定される。さらなる詳細については、例えば、Ｗａｇｅｎｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３０：２３０８－２３１５；Ｗａｇｅｎｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６８：２６９－２７４；Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０：４８７２－４８７９；Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ ２１：５２３－５３８；Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １１：３９１－４０７ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ ｅｄｉｔｏｒｓ（上記），ｐｐ．３８６－３８９を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ヒトＣＤ１５５（また、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）として公知である）へのヒトＣＤ９６の結合を阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５へのヒトＣＤ９６の結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５へのヒトＣＤ９６の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ヒトＣＤ９６の可溶性断片が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片への、ヒトＣＤ９６の可溶性断片の結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのヒトＣＤ９６の可溶性断片の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、抗体は、ＣＤ９６発現細胞が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのＣＤ９６発現細胞の結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのＣＤ９６発現細胞の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６発現細胞が、ヒトＣＤ１５５を発現する細胞に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ＣＤ１５５発現細胞へのＣＤ９６発現細胞の結合は、多特異性分子の非存在におけるＣＤ１５５発現細胞へのＣＤ９６発現細胞の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号１、３、５、又は６７～９９において示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１、３、５、及び６７～９９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号２、４、又は６において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は重鎖及び軽鎖を含み、それにおいて、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、ならびに５及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ヒトＣＤ１５５（また、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）として公知である）へのヒトＴＩＧＩＴの結合を阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５へのヒトＴＩＧＩＴの結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５へのヒトＴＩＧＩＴの結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片への、ヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片の結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ＴＩＧＩＴ発現細胞が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ＴＩＧＩＴ発現細胞が、ヒトＣＤ１５５を発現する細胞に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ＣＤ１５５発現細胞へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合は、多特異性分子の非存在におけるＣＤ１５５発現細胞へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、配列番号７又は１００～１１０において示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７及び１００～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、配列番号８又は９において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は重鎖及び軽鎖を含み、それにおいて、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７及び８、ならびに７及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ヒトＣＤ１５５（また、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）として公知である）へのヒトＣＤ９６及びヒトＴＩＧＩＴの結合を阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５へのヒトＣＤ９６及びヒトＴＩＧＩＴの結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５へのヒトＣＤ９６及びヒトＴＩＧＩＴの結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ヒトＣＤ９６の可溶性断片及びヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片への、ヒトＣＤ９６の可溶性分子及びヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片の結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片への、ヒトＣＤ９６の可溶性分子及びヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、又はＣＤ９６及びＴＩＧＩＴを発現する細胞が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片への、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、又はＣＤ９６及びＴＩＧＩＴを発現する細胞の結合は、多特異性分子の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片への、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、又はＣＤ９６及びＴＩＧＩＴを発現する細胞の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、又はＣＤ９６及びＴＩＧＩＴを発現する細胞が、ヒトＣＤ１５５を発現する細胞に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ＣＤ１５５発現細胞への、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、又はＣＤ９６及びＴＩＧＩＴを発現する細胞の結合は、多特異性分子の非存在におけるＣＤ１５５発現細胞への、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、又はＣＤ９６及びＴＩＧＩＴを発現する細胞の結合に比べて、多特異性分子の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号１、２、３、又は６７～９９において示されるアミノ酸配列を含む第一の重鎖を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号７又は１００～１１０において示されるアミノ酸配列を含む第二の重鎖を含む。特定の実施形態では、第一の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１、２、３、及び６７～９９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、ならびに第二の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号７及び１００～１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号２、４、又は６において示されるアミノ酸配列を含む第一の軽鎖を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号８又は９において示されるアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む。特定の実施形態では、第一の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２、４、及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、ならびに第二の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は第一の重鎖及び第一の軽鎖を含み、それにおいて、第一の重鎖及び第一の軽鎖は、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６のアミノ酸配列を含み、ならびに第二の抗原結合領域は第二の重鎖及び第二の軽鎖を含み、それにおいて第二の重鎖及び第二の軽鎖は、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第一の重鎖及び第一の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、ならびに５及び６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、及び第二の重鎖及び第二の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７及び８、ならびに７及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）としても公知である）へのヒトＴＩＧＩＴの結合を阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５ へのヒトＴＩＧＩＴの結合は、抗体の非存在におけるヒトＣＤ１５５へのヒトＴＩＧＩＴの結合に比べて、抗体の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片への、ヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片の結合は、抗体の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのヒトＴＩＧＩＴの可溶性断片の結合に比べて、抗体の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、抗体は、ＴＩＧＩＴ発現細胞が、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合は、抗体の非存在におけるヒトＣＤ１５５の可溶性断片へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合に比べて、抗体の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、抗体は、ＴＩＧＩＴ発現細胞が、ヒトＣＤ１５５を発現する細胞に結合するのを阻害する。特定の実施形態では、ＣＤ１５５発現細胞へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合は、抗体の非存在におけるＣＤ１５５発現細胞へのＴＩＧＩＴ発現細胞の結合に比べて、抗体の存在において５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超だけ低下される。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０において示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０において示されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、配列番号８又は９において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本開示は、重鎖及び軽鎖を含む、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、それにおいて、重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号１０７及び８、１０７、及び９、１０８及び８、１０８及び９、１０９及び８、１０９及び９、１１０及び８、又は１１０及び９のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０７及び８、１０７、及び９、１０８及び８、１０８及び９、１０９及び８、１０９及び９、１１０及び８、又は１１０及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体は、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、毒素、放射性核種、又は検出可能な標識にコンジュゲートされている。特定の実施形態では、細胞傷害性剤は、それと接触する細胞の死又は破壊を誘導することができる。特定の実施形態では、細胞増殖抑制剤は、増殖を防止もしくは実質的に低下させ、及び／又はそれと接触する細胞の活性もしくは機能を阻害することができる。特定の実施形態では、細胞傷害性剤又は細胞増殖抑制剤は、化学療法剤である。特定の実施形態では、放射性核種は、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１７Ｌｕ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、及び１８６Ｒｅからなる群から選択される。特定の実施形態では、検出可能な標識は、蛍光部分又はクリックケミストリーハンドルを含む。
任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域を、本明細書中に開示される多特異性分子又は抗体において使用することができる。特定の実施形態では、Ｉｇ領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又は任意のサブクラス（例、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）である。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号４９～６０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第二の抗原結合領域は、配列番号４９～６０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号４３又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含み、第一の抗原結合領域は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、第一の抗原結合領域は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、及び第二の抗原結合領域は、配列番号４３又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、配列番号５７、５８、５９、又は６０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する単離抗体を提供し、抗体は、配列番号４３又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、一つ、二つ、又はそれ以上の変異（例、アミノ酸置換）が、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられたＦｃ領域（例、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）及び／又はＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１～４４７））ならびに／あるいはヒンジ領域（残基２１６～２３０、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付け）中に導入され、多特異性分子又は抗体の一つ又は複数の機能特性、例えば血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害性などを変化させる。
特定の実施形態では、一つ、二つ、又はそれ以上の変異（例、アミノ酸置換）が、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例えば、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる米国特許第５，６７７，４２５号において記載されるように変化（例、増加又は減少）されるように、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のヒンジ領域中に導入される。ヒンジ領域中のシステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖及び重鎖の会合が促進され得る、あるいは多特異性分子又は抗体の安定性が変化（例、増加又は減少）され得る。
特定の実施形態では、一つ、二つ、又はそれ以上アミノ酸変異（例、置換、挿入、又は欠失）が、ＩｇＧ定常領域、又はそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくは、Ｆｃ又はヒンジ－Ｆｃ断片）中に導入され、インビボでの多特異性分子又は抗体の半減期を変化（例、減少又は増加）させる。例えば、インビボでの多特異性分子又は抗体の半減期を変化（例、減少又は増加）させる変異の例については、国際公開ＷＯ０２／０６０９１９、ＷＯ９８／２３２８９、及びＷＯ９７／３４６３１、ならびに米国特許第５，８６９，０４６号、第６，１２１，０２２号、第６，２７７，３７５号、及び第６，１６５，７４５号を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、一つ、二つ、又はそれ以上アミノ酸変異（例、置換、挿入、又は欠失）が、ＩｇＧ定常領域、又はそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくは、Ｆｃ又はヒンジ－Ｆｃ断片）中に導入され、インビボでの多特異性分子又は抗体の半減期を減少させる。他の実施形態では、一つ、二つ、又はそれ以上のアミノ酸変異（例、置換、挿入、又は欠失）が、ＩｇＧ定常領域、又はそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくは、Ｆｃ又はヒンジ－Ｆｃ断片）中に導入され、インビボでの多特異性分子又は抗体の半減期を増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子又は抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、第二の定常（ＣＨ２）ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）及び／又は第三の定常（ＣＨ３）ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１～４４７）における一つ又は複数のアミノ酸変異（例、置換）を有し得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のＩｇＧ１の定常領域は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、位置２５２におけるメチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換、位置２５４におけるセリン（Ｓ）からスレオニン（Ｔ）への置換、及び位置２５６におけるスレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への置換を含む。米国特許第７，６５８，９２１号を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。この型の変異体ＩｇＧは、「ＹＴＥ変異体」として言及され、同じ多特異性分子又は抗体の野生型バージョンと比較して、四倍増加した半減期を呈示することが示されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４－２４を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。特定の実施形態では、多特異性分子又は抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、位置２５１～２５７、２８５～２９０、３０８～３１４、３８５～３８９、及び４２８～４３６でのアミノ酸残基の一つ、二つ、三つ、又はそれ以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ定常領域を含む。
特定の実施形態では、一つ、二つ、又はそれ以上の変異（例、アミノ酸置換）を、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のＦｃ領域（例、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）及び／又はＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１～４４７））ならびに／あるいはヒンジ領域（残基２１６～２３０、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付け）中に導入して、例えば、エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（例、活性化Ｆｃ受容体）についての多特異性分子又は抗体の親和性を増加又は減少させる。Ｆｃ受容体についての多特異性分子又は抗体の親和性を減少又は増加させる、多特異性分子又は抗体のＦｃ領域中の変異、及びそのような変異をＦｃ受容体又はその断片中に導入するための技術は、当業者に公知である。Ｆｃ受容体についての抗体の親和性を変化させるために作製され得る、多特異性分子又は抗体のＦｃ受容体における変異の例は、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＰＮＡＳ １０９：６１８１－６１８６、米国特許第６，７３７，０５６号、ならびに国際公開第ＷＯ０２／０６０９１９号、第ＷＯ９８／２３２８９号、及び第ＷＯ９７／３４６３１号において記載されており、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、多特異性分子又は抗体は、野生型重鎖定常領域のバリアントである重鎖定常領域を含み、それにおいて、バリアント重鎖定常領域は、野生型重鎖定常領域がＦｃγＲＩＩＢに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。特定の実施形態では、バリアント重鎖定常領域は、バリアントヒト重鎖定常領域、例えば、バリアントヒトＩｇＧ１、バリアントヒトＩｇＧ２、又はバリアントヒトＩｇＧ４重鎖定常領域である。特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けシステムに従って、以下のアミノ酸変異：Ｇ２３６Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、及びＬ３２８Ｅの一つ又は複数を含む。特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＥＵ番号付けシステムに従った、Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ及びＬ３２８Ｅ、Ｐ２３８ＤとＥ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒからなる群から選択される一つ又は複数の置換、Ｐ２３８Ｄ、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒ、Ｇ２３６Ｄ及びＳ２６７Ｅ、Ｓ２３９Ｄ及びＳ２６７Ｅ、Ｖ２６２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、及びＬ３２８Ｆ、ならびにＶ２６４Ｅ、Ｓ２６７Ｅ、及びＬ３２８Ｆからなる群から選択されるアミノ酸変異のセットを含む。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢは、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、樹状細胞、内皮細胞、及び活性化Ｔ細胞からなる群から選択される細胞上に発現される。
さらなる実施形態では、一つ、二つ、又はそれ以上のアミノ酸置換が、ＩｇＧ定常領域Ｆｃ領域中に導入され、多特異性分子又は抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２４３、２６７、２９２、２９７、３００、３１８、３２０、３２２、３２８、３３０、３３２、及び３９６から選択される一つ又は複数のアミノ酸が、多特異性分子又は抗体が、エフェクターリガンドについての変化した親和性を有するが、しかし、親多特異性分子又は抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。親和性が変化したエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号においてさらに詳細に記載されており、その各々が、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、定常領域ドメインの欠失又は不活性化（点変異もしくは他の手段を通じて）によって、循環多特異性分子又は抗体のＦｃ受容体結合が低下し、それにより、腫瘍局在化が増加し得る。定常領域を欠失又は不活性化させ、それにより、腫瘍局在化を増加させる変異の説明については、例えば、米国特許第５，５８５，０９７号及び第８，５９１，８８６号を参照のこと。特定の実施形態では、一つ又は複数のアミノ酸置換が、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のＦｃ領域中に導入され、Ｆｃ領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去することができ、それによって、Ｆｃ受容体結合が低下し得る（例、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６０４を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。様々な実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中の以下の変異の一つ又は複数が作製されてもよい：Ｎ２９７Ａ置換、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｌ２３４Ａ置換、Ｌ２３４Ｆ置換、Ｌ２３５Ａ置換、Ｌ２３５Ｆ置換、Ｌ２３５Ｖ置換、Ｌ２３７Ａ置換、Ｓ２３９Ｄ置換、Ｅ２３３Ｐ置換、Ｌ２３４Ｖ置換、Ｌ２３５Ａ置換、Ｃ２３６欠失、Ｐ２３８Ａ置換、Ｓ２３９Ｄ置換、Ｆ２４３Ｌ置換、Ｄ２６５Ａ置換、Ｓ２６７Ｅ置換、Ｌ３２８Ｆ置換、Ｒ２９２Ｐ置換、Ｙ３００Ｌ置換、Ａ３２７Ｑ置換、Ｐ３２９Ａ置換、Ａ３３０Ｌ置換、Ｉ３３２Ｅ置換、又はＰ３９６Ｌ置換。
特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異は、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中に作製されてもよい。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３７Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異は、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中に作製されてもよい。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異は、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中に作製されてもよい。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、場合によりＡ３３０Ｌ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異は、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中に作製されてもよい。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｐ３９６Ｌ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中に作製されてもよい。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異は、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中に作製されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｎ２９７Ｑ又はＮ２９７Ａアミノ酸置換を伴うＩｇＧ１の定常領域を含む。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異を伴うＩｇＧ１の定常領域を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異を伴うＩｇＧ１の定常領域を含む。別の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｆ、Ｎ２９７Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異を伴うＩｇＧ１の定常領域を含む。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、ヒトＩｇＧ１重鎖中の位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５に対応する位置における、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中のアミノ酸残基は、それぞれＬ、Ｌ、及びＤではない。このアプローチは、国際公開ＷＯ１４／１０８４８３において詳細に記載されており、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、ヒトＩｇＧ１重鎖における位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５に対応するアミノ酸は、それぞれＦ、Ｅ、及びＡ、又はＡ、Ａ、及びＡである。
特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の定常領域中のアミノ酸残基３２９、３３１、及び３２２から選択される一つ又は複数のアミノ酸が、多特異性分子又は抗体が、変化したＣ１ｑ結合及び／又は低下もしくは無効にされた補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．）においてさらに詳細に記載されており、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のＣＨ２ドメインのＮ末端領域中のアミノ酸位置２３１～２３８内の一つ又は複数のアミノ酸残基が変化され、それにより、補体を固定する多特異性分子又は抗体の能力が変化される。このアプローチは、国際公開ＷＯ９４／２９３５１においてさらに記載されており、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のＦｃ領域を修飾して、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する多特異性分子又は抗体の能力が増加させる、ならびに／あるいはＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、もしくは４３９で一つ又は複数のアミノ酸を変異させること（例、アミノ酸置換を導入すること）により、Ｆｃγ受容体についての抗体の親和性を増加させる。このアプローチは、国際公開ＷＯ００／４２０７２においてさらに記載されており、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、ＩｇＧ１の修飾された定常領域を含み、それにおいて、修飾によって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する多特異性分子又は抗体の能力が増加する。特定の実施形態では、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬの多特異性分子又は抗体は、本明細書中に記載され、及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、１、２、又は３時間以内にＣＤ９６発現細胞及び／又はＴＩＧＩＴ発現細胞の少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％の細胞死を誘導することが可能である。特定の実施形態では、ＩｇＧ１の修飾された定常領域は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ置換を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ１の修飾された定常領域は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ置換を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ１の修飾された定常領域は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌ置換を含む。特定の実施形態では、抗体は、エフェクターＴ細胞及びＴｒｅｇにおいて細胞死を誘導することが可能であり、それにおいて、細胞死を受けるＴｒｅｇのパーセンテージは、細胞死を受けるエフェクターＴ細胞のパーセンテージよりも、少なくとも１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、又は５倍高い。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子は、第一及び第二の重鎖定常領域を含み、それにおいて、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域は、異なるアミノ酸置換を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、ＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴに結合する多特異性分子は、「ノブイントゥホール」変異を含み、ここで、多特異性分子は、「ノブ鎖」中のＴ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、ならびに、場合により、ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋を、例えば、「ノブ鎖」中にＹ３４９Ｃ変異を、「ホール鎖」中にＥ３５６Ｃ変異又はＳ３５４Ｃ変異を導入することにより、「ノブ鎖」中のＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」中のＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異、「ノブ鎖」中のＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」中のＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異、「ノブ鎖」中のＴ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、「ノブ鎖」中のＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」中のＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異、鎖の一つ中のＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び対応鎖中のＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、一つの鎖中のＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び対応鎖中のＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、ならびに一つの鎖中のＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び対応鎖中のＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、ならびに一つの鎖中のＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び対応鎖中のＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異（ＥＵ番号付けシステムに従った番号付け）を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例えばヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子は、第一及び第二の重鎖定常領域を含み、それにおいて、第一の重鎖定常領域及び第二の重鎖定常領域は、ノブイントゥホール置換を含み、第一の抗原結合領域及び第二の抗原結合領域において異なる追加のアミノ酸置換をさらに含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＣＤ９６以外の抗原（例、ＴＩＧＩＴ、例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅを含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅを含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅを含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、及びＴ３６６Ｗ変異を含む重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ以外の抗原（例、ＣＤ９６、例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子を提供し、それにおいて、第一の抗原結合領域は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むが、しかし、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異を含まない重鎖定常領域を含み、ならびに第二の抗原結合領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、ＩｇＧ４抗体の定常領域を含み、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、重鎖のアミノ酸残基２２８のセリンは、プロリンに置換される。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する多特異性分子を提供し、多特異性分子は、配列番号４９～６０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される定常領域変異又は修飾のいずれかが、二つの重鎖定常領域を有する、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の重鎖定常領域の一方又は両方の中に導入され得る。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、アンタゴニストとして機能する（例、ＣＤ９６活性を減少させる又は阻害する）多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）活性に比べて、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）活性を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）活性に比べて、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍 倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれ以上だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）活性の非限定的な例は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）シグナル伝達、そのリガンド（例、ＣＤ１５５）又はその断片及び／又は融合タンパク質へのＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）結合、Ｔ細胞（例、ヒトＣＤ９６を発現するＴ細胞）の活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、Ｔｒｅｇの減少又は阻害、サイトカイン（例、ＩＬ－２）産生の増加、ＣＤ１５５（例、ヒトＣＤ１５５）の活性の増加を含み得る。特定の実施形態では、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）活性の増加は、実施例に記載されるように評価される。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴う、このリガンドへのＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）結合に比べて、そのリガンド（例、ＣＤ１５５）又は断片及び／又は融合タンパク質へのＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない抗体）を伴う、このリガンドへのＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６）結合に比べて、そのリガンド（例、ＣＤ１５５（例、ヒト又はカニクイザルＣＤ１５５）又はその断片及び／又は融合タンパク質）へのＣＤ９６（例、ヒト ＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）結合を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍 倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、Ｔ細胞（例、ヒトＣＤ９６を発現するＴ細胞）を活性化する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、初代ＣＤ３発現Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ９６発現Ｊｕｒｋａｔ細胞である。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、ＮＦＡＴの活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６のリガンド（例、ＣＤ１５５）又はその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＣＤ９６のリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在において、ＮＦＡＴ活性を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関連の多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６のリガンド（例、ＣＤ１５５）又はその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＣＤ９６のリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在において、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関連の多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない抗体）を伴うＩＬ－２産生に比べて、ＩＬ－２の産生を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、単独又は抗ＰＤ－１抗体（例、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）との組み合わせにおいて、スタフィロコッカスエンテロトキシン Ａ（ＳＥＡ）刺激への応答におけるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する、本明細書中に記載される多特異性分子の存在においてスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）で刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関連の多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴う、ＳＥＡのみで刺激されたＰＢＭＣからのＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、ＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させた。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、メモリーＴ細胞のメモリーリコールを増加又は促進する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子の非存在において、又は無関連の多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）の存在において、メモリーＴ細胞がそれらの同種抗原と接触した際に増殖するメモリーＴ細胞の数に比べて、メモリーＴ細胞がそれらの同種抗原と接触した際に増殖するメモリーＴ細胞の数を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子の非存在において、又は無関連の多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）の存在において、メモリーＴ細胞がその同種抗原と接触した際でのメモリーＴ細胞からのサイトカインの産生に比べて、メモリーＴ細胞がその同種抗原と接触した際でのメモリーＴ細胞からのサイトカイン（例、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合し、ＮＫ細胞を活性化する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、単離される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＰＢＭＣの混合培養物中にある。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、アンタゴニストとして機能する（例、ＴＩＧＩＴ活性を減少させる又は阻害する）多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザル ＴＩＧＩＴ）活性に比べて、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザル ＴＩＧＩＴ）活性に比べて、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、又はそれ以上だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性の非限定的な例は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）シグナル伝達、そのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質へのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合、Ｔ細胞（例、ヒトＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞）の活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、Ｔｒｅｇの減少又は阻害、サイトカイン（例、ＩＬ－２）産生の増加、ＣＤ１５５（例、ヒトＣＤ１５５）の活性の増加を含み得る。特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性における増加が、実施例において記載されるように評価される。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴う、このリガンドへのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザル ＴＩＧＩＴ）結合に比べて、そのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質へのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴う、このリガンドへのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）結合に比べて、そのリガンド（例、ＣＤ１５５（例、ヒト又はカニクイザルＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質）へのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、Ｔ細胞（例、ヒトＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞）を活性化する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、初代ＣＤ３発現Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＩＧＩＴ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞である。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、ＮＦＡＴの活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、ＴＩＧＩＴのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＴＩＧＩＴのリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在においてＮＦＡＴ活性を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（ＩＬ－２）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、多特異性分子は、ＴＩＧＩＴのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＴＩＧＩＴのリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在においてサイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＩＬ－２産生に比べて、ＩＬ－２の産生を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、単独又は抗ＰＤ－１抗体（例、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）との組み合わせにおいて、スタフィロコッカスエンテロトキシン Ａ（ＳＥＡ）刺激への応答におけるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍増加させる多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する、本明細書中に記載される多特異性分子の存在においてスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）で刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＳＥＡで刺激されたのみのＰＢＭＣからのＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、ＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させた。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、メモリーＴ細胞のメモリーリコールを増加又は促進する分子を提供する。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子の非存在において、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）の存在においてメモリーＴ細胞がそれらの同族抗原と接触した場合での増殖するメモリーＴ細胞の数に比べて、メモリーＴ細胞がそれらの同族抗原と接触した場合での増殖するメモリーＴ細胞の数を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子の非存在において、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）の存在においてメモリーＴ細胞がその同族抗原と接触した場合でのメモリーＴ細胞からのサイトカインの産生に比べて、メモリーＴ細胞がその同族抗原と接触した場合でのメモリーＴ細胞からのサイトカイン（例、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、ＮＫ細胞を活性化する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、単離される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＰＢＭＣの混合培養物中にある。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、アンタゴニストとして機能する（例、ＣＤ９６及びＴＩＧＩＴ活性を減少させる又は阻害する）多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性に比べて、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性に比べて、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍又はそれ以上だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性の非限定的な例は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）シグナル伝達、そのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質へのＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合、Ｔ細胞（例、ヒトＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞）の活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、Ｔｒｅｇの減少又は阻害、サイトカイン（例、ＩＬ－２）産生の増加、ＣＤ１５５（例、ヒトＣＤ１５５）の活性の増加を含み得る。特定の実施形態では、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性における増加が、実施例において記載されるように評価される。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴う、そのリガンドへのＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合に比べて、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）のそのリガンド（例、ＣＤ１５５）または断片および／またはその融合タンパク質への結合を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少させる又は阻害する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴う、そのリガンドへのＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）結合に比べて、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）のそのリガンド（例、ＣＤ１５５（例えばヒトまたはカニクイザルＣＤ１５５）または断片および／またはその融合タンパク質）への結合を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、Ｔ細胞（例、ヒトＣＤ９６及び／又はヒトＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞）を活性化する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、初代ＣＤ３発現Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ９６発現及び／又はＴＩＧＩＴ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞である。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、ＮＦＡＴの活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴのリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在においてＮＦＡＴ活性を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、多特異性分子は、ＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴのリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在において、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関連の多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＩＬ－２産生に比べて、ＩＬ－２の産生を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、単独又は抗ＰＤ－１抗体（例、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）との組み合わせにおいて、スタフィロコッカスエンテロトキシン Ａ（ＳＥＡ）刺激への応答におけるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる多特異性分子を提供する。
特定の実施形態では、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する、本明細書中に記載される多特異性分子の存在においてスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）で刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＳＥＡで刺激されたのみのＰＢＭＣからのＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、ＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させた。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、メモリーＴ細胞のメモリーリコールを増加又は促進する分子を提供する。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子の非存在において、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）の存在においてメモリーＴ細胞がそれらの同族抗原と接触した場合での増殖するメモリーＴ細胞の数に比べて、メモリーＴ細胞がそれらの同族抗原と接触した場合での増殖するメモリーＴ細胞の数を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子の非存在において、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）の存在においてメモリーＴ細胞がその同族抗原と接触した場合でのメモリーＴ細胞からのサイトカインの産生に比べて、メモリーＴ細胞がその同族抗原と接触した場合でのメモリーＴ細胞からのサイトカイン（例、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）及びＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、ＮＫ細胞を活性化する多特異性分子を提供する。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、単離される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＰＢＭＣの混合培養物中にある。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される多特異性分子は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の多特異性分子を伴わない、又は無関係な多特異性分子（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない多特異性分子）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、アンタゴニストとして機能する（例、ＴＩＧＩＴ活性を減少又は阻害させる）単離抗体を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザル ＴＩＧＩＴ）活性に比べて、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少又は阻害する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法及び／又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザル ＴＩＧＩＴ）活性に比べて、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍又はそれ以上だけ減少又は阻害する単離抗体を提供する。ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性の非限定的な例は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）シグナル伝達、そのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質へのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合、Ｔ細胞（例、ヒトＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞）の活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、Ｔｒｅｇの減少又は阻害、サイトカイン（例、ＩＬ－２）産生の増加、ＣＤ１５５（例、ヒトＣＤ１５５）の活性の増加を含み得る。特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性における増加が、実施例において記載されるように評価される。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴う、このリガンドへのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザル ＴＩＧＩＴ）結合に比べて、そのリガンド（（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質）へのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ減少させる又は阻害する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴う、このリガンドへのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ）結合に比べて、そのリガンド（例、ＣＤ１５５（例、ヒト又はカニクイザルＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質）へのＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）結合を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる単離抗体を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、Ｔ細胞（例、ヒトＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞）を活性化する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、初代ＣＤ３発現Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＩＧＩＴ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞である。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＦＡＴ活性に比べて、ＮＦＡＴの活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、抗体は、ＴＩＧＩＴのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＴＩＧＩＴのリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在においてＮＦＡＴ活性を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うサイトカイン産生に比べて、サイトカイン産生（ＩＬ－２）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる単離抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、ＴＩＧＩＴのリガンド（例、ＣＤ１５５）あるいはその断片及び／又は融合タンパク質、ならびに／あるいはＴＩＧＩＴのリガンドを発現する細胞（例、単球又は樹状細胞）の存在においてサイトカイン産生（例、ＩＬ－２）を増加させる。特定の実施形態では、抗体は、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＩＬ－２産生に比べて、ＩＬ－２の産生を増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、単独又は抗ＰＤ－１抗体（例、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）との組み合わせにおいて、スタフィロコッカスエンテロトキシン Ａ（ＳＥＡ）刺激への応答におけるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる単離抗体を提供する。
特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する、本明細書中に記載される抗体の存在においてスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）で刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＳＥＡで刺激されたのみのＰＢＭＣからのＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生に比べて、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、ＩＦＮγ及び／又はＩＬ－２産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させた。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、メモリーＴ細胞のメモリーリコールを増加又は促進する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ４エフェクターメモリーＴ細胞である。特定の実施形態では、抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体の非存在において、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）の存在においてメモリーＴ細胞がそれらの同族抗原と接触した場合での増殖するメモリーＴ細胞の数に比べて、メモリーＴ細胞がそれらの同族抗原と接触した場合での増殖するメモリーＴ細胞の数を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。特定の実施形態では、抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体の非存在において、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）の存在においてメモリーＴ細胞がその同族抗原と接触した場合でのメモリーＴ細胞からのサイトカインの産生に比べて、メモリーＴ細胞がその同族抗原と接触した場合でのメモリーＴ細胞からのサイトカイン（例、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍だけ増加させる。
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合し、ＮＫ細胞を活性化する単離抗体を提供する。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、単離される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＰＢＭＣの混合培養物中にある。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルに比べて、ＮＫ細胞中でのＣＤ１０７ａの発現レベルを少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％ 、９０％、９５％、９８％、又は９９％だけ増加させる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗体は、本明細書中に記載される方法又は当業者に公知の方法により評価されるように、任意の抗体を伴わない、又は無関係な抗体（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合しない抗体）を伴うＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）に比べて、ＮＫ細胞からのサイトカイン産生（例、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα）を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍、又はそれ以上だけ増加させる。
７．３ 医薬組成物
本明細書中で提供されるのは、所望の程度の純度を有する、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体を、生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤中に含む組成物である（例、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、ペンシルバニア州イーストンを参照のこと）。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、リン酸などの緩衝剤、クエン酸塩、及び他の有機酸、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例、Ｚｎ－タンパク質複合体）、ならびに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、ならびに、場合により、一つ又は複数の追加の予防剤又は治療剤を医薬的に許容可能な担体中に含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、有効量の本明細書中の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、ならびに、場合により、一つ又は複数の追加の予防剤又は治療剤を医薬的に許容可能な担体中に含む。特定の実施形態では、多特異性分子又は抗体は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。本明細書中に記載される医薬組成物は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザル ＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）活性を増加又は促進させ、状態、例えば癌又は感染性疾患などを治療する際に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明は、薬物としての使用のための、本発明の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む、本発明の医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、癌又は感染症の治療のための方法における使用のための本発明の医薬組成物に関する。
非経口調製物中で使用される医薬的に許容可能な担体は、水性溶剤、非水性溶剤、抗微生物剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤、又はキレート剤、ならびに他の医薬的に許容可能な物質を含む。水性溶剤の例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース及び乳酸リンゲル注射液を含む。非水性非経口溶剤には、植物起源の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、及びラッカセイ油が含まれる。静菌濃度又は静真菌濃度の抗微生物剤は、フェノール又はクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む複数回用量容器中にパッケージングされた非経口調製物に加えられ得る。等張剤は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。緩衝剤は、リン酸塩及びクエン酸塩を含む。抗酸化剤は、二硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤には、プロカイン塩酸塩が含まれる。懸濁剤及び分散剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤には、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が含まれる。封鎖剤又はキレート剤は、ＥＤＴＡを含む。医薬担体はまた、水混和性溶剤用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、又は乳酸を含む。
医薬組成物は、対象への任意の投与の経路について製剤化され得る。投与の経路の具体的な例は、鼻腔内、経口、肺、経皮、皮内、及び非経口を含む。非経口投与は、皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射のいずれかにより特徴付けられ、また、本明細書中で企図される。注射剤は、液体溶液又は懸濁剤として、注射前の液体中の溶液又は懸濁剤のために適切な固体形態として、又はエマルションとしてのいずれかで、従来形態において調製され得る。注射剤、溶液、及びエマルションはまた、一つ又は複数の賦形剤を含む。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールである。また、所望される場合、投与される医薬組成物はまた、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性エンハンサー、ならびに他のそのような薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、及びシクロデキストリンなどを含み得る。
多特異性分子又は抗体の非経口投与のための調製物は、注射のための準備ができた滅菌溶液、滅菌乾燥可溶性産物、例えば、皮下注射用錠剤を含む、使用直前に溶媒と組み合わされる準備ができた凍結乾燥粉末など、注射のための準備ができた滅菌懸濁剤、使用直前に溶剤と組み合わされる準備ができた滅菌乾燥不溶性産物、及び滅菌エマルションを含む。溶液は、水性又は非水性のいずれであり得る。
静脈内に投与される場合、適切な担体は、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤及び可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールなど、ならびにそれらの混合物を含む溶液を含む。
抗体を含む局所混合物は、局所及び全身投与について記載されるように調製される。結果として得られた混合物は、溶液、懸濁剤、エマルション又は同様のものであってもよく、クリーム、ゲル、軟膏、エマルション、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、発泡体、エアロゾル、灌注剤、スプレー、坐剤、包帯、皮膚パッチ、又は局所投与のために適切な任意の他の製剤として製剤化され得る。
本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、局所適用のための、例えば吸入などによるエアロゾルとして製剤化され得る（例、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号、及び第４，３６４，９２３号を参照のこと。それらは、炎症性疾患、特に喘息の治療のために有用なステロイドの送達のためのエアロゾルを記載し、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。気道への投与のためのこれらの製剤は、ネブライザー用のエアロゾルもしくは溶液の形態で、又は吹送用の微細粉末として、単独で又はラクトースなどの不活性担体と組み合わせてもよい。そのような場合では、製剤の粒子は、特定の実施形態では、５０ミクロン未満、特定の実施形態では、１０ミクロン未満の直径を有する。
本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、局所又は外用適用のために、例えば皮膚及び粘膜、例えば眼中などへの外用適用などのために、ジェル、クリーム、及びローションの形態において、ならびに眼への適用のために、又は大槽内もしくは脊髄内の適用のために製剤化され得る。局所投与は、経皮送達のために、ならびに、また、眼もしくは粘膜への投与のために、又は吸入治療のために企図される。抗体の鼻腔溶液を、単独で又は他の医薬的に許容可能な賦形剤との組み合わせにおいて投与することもできる。
経皮パッチは、イオン泳動及び電気泳動装置を含み、当業者に周知であり、抗体を投与するために使用することができる。例えば、そのようなパッチは、米国特許第６，２６７，９８３号、第６，２６１，５９５号、第６，２５６，５３３号、第６，１６７，３０１号、第６，０２４，９７５号、第６，０１０７１５号、第５，９８５，３１７号、第５，９８３，１３４号、第５，９４８，４３３号、及び第５，８６０，９５７号において開示されており、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体を含む医薬組成物は、凍結乾燥粉末であり、それは、溶液、エマルション、及び他の混合物としての投与のために再構成され得る。また、これは固形分又はゲルとして再構成及び製剤化されてもよい。凍結乾燥粉末は、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体、あるいはその医薬的に許容可能な誘導体を、適切な溶媒中に溶解することにより調製される。特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、滅菌である。溶媒は、粉末又は粉末から調製された再構成溶液の安定性又は他の薬理学的成分を改善する賦形剤を含んでもよい。使用してもよい賦形剤は、限定されないが、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、又は他の適切な薬剤を含む。溶媒はまた、一実施形態では、ほぼ中性ｐＨで、緩衝剤、例えばクエン酸塩、ナトリウム、もしくはリン酸カリウムなど、又は当業者に公知の他のそのような緩衝剤を含み得る。溶液のその後の滅菌濾過、それに続く当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥によって、所望の製剤が提供される。特定の実施形態では、結果として得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアル中に分配される。各バイアルは、化合物の単回用量又は複数回用量を含む。凍結乾燥粉末は、約４℃～室温などの適切な条件下で保存することができる。この凍結乾燥粉末を注射用水で再構成することによって、非経口投与における使用のための製剤が提供される。再構成のためには、凍結乾燥粉末を滅菌水又は他の適切な担体に加える。正確な量は、選択される化合物に依存する。そのような量は、経験的に決定することができる。
本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子及び単離抗ＴＩＧＩＴ抗体ならびに本明細書中に提供される他の組成物はまた、治療される対象の特定の組織、受容体、又は身体の他の領域を標的化するように製剤化され得る。多くのそのような標的化方法は、当業者に周知である。全てのそのような標的化方法が、本組成物における使用のために本明細書中で企図される。標的化方法の非限定的な例については、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、第６，２７４，５５２号、第６，２７１，３５９号、第６，２５３，８７２号、第６，１３９，８６５号、第６，１３１，５７０号、第６，１２０，７５１号、第６，０７１，４９５号、第６，０６０，０８２号、第６，０４８，７３６号、第６，０３９，９７５号、第６，００４，５３４号、第５，９８５，３０７号、第５，９７２，３６６号、第５，９００，２５２号、第５，８４０，６７４号、第５，７５９，５４２号、及び第５，７０９，８７４号を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、腫瘍に対して標的化される。
インビボ投与のため使用される組成物は、滅菌であり得る。これは、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
７．４ 使用の方法及び使用
別の態様では、本開示は、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子及び単離抗ＴＩＧＩＴ抗体を使用して対象を治療する方法を提供する。ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）機能の減少から利益を得るであろう対象における任意の疾患又は障害は、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子及び単離抗ＴＩＧＩＴ抗体を使用して治療され得る。特定の実施形態では、疾患又は障害は、チェックポイント標的化剤（例、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、又はアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体）に対して耐性である。特定の実施形態では、疾患又は障害は、チェックポイント標的化剤（例、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、又はアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体）での治療後に再発する。
本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子及び単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、腫瘍に対する免疫系の耐性を阻害するために特に有用であり、したがって、癌を伴う対象のための免疫療法として使用することができる。例えば、特定の実施形態では、本開示は、対象における抗原への応答において、Ｔ細胞（例、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、エフェクターＴ細胞、又はメモリーＴ細胞）活性化を増加させる方法を提供し、方法は、有効量の、本明細書に開示される、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子及び単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、又はその医薬組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、本開示は、対象において癌を治療する方法を提供し、方法は、本明細書中に開示されるように、抗体又は医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む。
本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又は医薬組成物で治療され得る癌は、限定されないが、固形腫瘍、血液癌（例、白血病、リンパ腫、骨髄腫、例、多発性骨髄腫）、及び転移性病変を含む。特定の実施形態では、癌は、固形腫瘍である。固形腫瘍の例は、悪性腫瘍、例えば、肉腫及び癌腫、例えば、肺、***、卵巣、リンパ、消化管（例、結腸）、肛門、生殖器及び尿生殖路（例、腎臓、尿路上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（例、脳、神経又はグリア細胞）、頭頸部、皮膚（例、黒色腫）、及び膵臓に影響を及ぼすものなど、様々な器官系の腺癌、ならびに結腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺癌（例、非小細胞肺癌又は小細胞肺癌）、小腸癌、及び食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。癌は、早期、中期、後期の段階、又は転移性の癌であり得る。特定の実施形態では、癌は、チェックポイント標的化剤（例、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、又はアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体）に対して耐性である。特定の実施形態では、癌は、チェックポイント標的化剤（例、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、又はアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体）による治療後に再発する。
特定の実施形態では、癌は、肺癌（例、肺腺癌又は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（例、扁平上皮及び／又は非扁平上皮の組織型を伴うＮＳＣＬＣ、又はＮＳＣＬＣ腺癌））、黒色腫（例、進行性黒色腫）、腎臓癌（例、腎細胞癌）、肝臓癌（例、肝細胞癌）、骨髄腫（例、多発性骨髄腫）、前立腺癌、乳癌（例、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、又はＨｅｒ２／ｎｅｕの一つ、二つ、又は全てを発現しない乳癌、例、トリプルネガティブ乳癌）、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌（例、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ））、肛門癌、胃食道癌（例、食道扁平上皮細胞癌）、中皮腫、鼻咽腔癌、甲状腺癌、子宮頸癌、上皮癌、腹膜癌、又はリンパ増殖性疾患（例、移植後リンパ増殖性疾患）から選択される。特定の実施形態では、癌は、子宮頸癌である。
特定の実施形態では、癌は、血液癌、例えば、白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である。特定の実施形態では、癌は、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＣＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、又は有毛細胞白血病である。特定の実施形態では、癌は、リンパ腫であり、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、再発性非ホジキンリンパ腫、難治性非ホジキンリンパ腫、再発性濾胞性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、又は節外性辺縁帯リンパ腫である。特定の実施形態では、癌は、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫である。
別の実施形態では、癌は、癌腫（例、進行性癌又は転移性癌）、黒色腫、又は肺癌、例えば、非小細胞肺癌から選択される。
特定の実施形態では、癌は、肺癌、例えば、肺腺癌、非小細胞肺癌、又は小細胞肺癌である。
特定の実施形態では、癌は、黒色腫、例えば、進行性黒色腫である。特定の実施形態では、癌は、他の治療に応答しない進行性又は切除不能な黒色腫である。他の実施形態では、癌は、ＢＲＡＦ変異（例、ＢＲＡＦ Ｖ６００変異）を伴う黒色腫である。さらに他の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、又は医薬組成物は、ＢＲＡＦ阻害剤（例、ベムラフェニブ又はダブラフェニブ）を伴う又は伴わない、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例、イピリムマブ）を用いた治療後に投与される。
別の実施形態では、癌は、ウイルス感染、例えば、慢性ウイルス性肝炎を伴う又は伴わない肝細胞癌、例えば、進行性肝細胞癌である。
別の実施形態では、癌は、前立腺癌、例えば、進行性前立腺癌である。
一実施形態では、癌は、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫である。
さらに別の実施形態では、癌は、腎臓癌、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例、転移性ＲＣＣ、明細胞腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、又は乳頭状腎細胞癌）である。
さらに別の実施形態では、癌は、肺癌、黒色腫、腎癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、又は癌の転移性病変から選択される。
特定の実施形態では、本開示は、対象における感染性疾患を予防又は治療する方法を提供し、方法は、本明細書中に開示されるように、有効量の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、又はその医薬組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、本明細書中で提供されるのは、感染（例、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、原虫感染、又は寄生虫感染）を予防及び／又は治療するための方法である。この方法に従って予防及び／又は治療される感染は、本明細書中で特定される感染性因子により起こされ得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体あるいはその組成物は、対象に投与される唯一の活性剤である。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその組成物は、感染性疾患の治療のための抗感染介入（例、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、又は抗ヘルミン薬）との組み合わせにおいて使用される。従って、一実施形態では、本発明は、感染性疾患を予防及び／又は治療する方法における使用のための、本発明の多特異性分子又は抗体及び／又は医薬組成物に関し、場合により、それにおいて、抗体又は医薬組成物は、対象に投与される唯一の活性薬剤である、あるいは、それにおいて、抗体又は医薬組成物は、抗感染介入との組み合わせにおいて使用される。
本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、あるいは医薬組成物により治療及び／又は予防され得る感染性疾患は、限定されないが、細菌、寄生虫、真菌、原虫、及びウイルスを含む感染性病原体により起こされる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、あるいは医薬組成物により治療及び／又は予防され得る感染性疾患は、ウイルスにより起こされる。本明細書中に記載される方法に従って予防及び／又は治療され得るウイルス性疾患又はウイルス感染症は、限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ（例、インフルエンザＡ又はインフルエンザＢ）、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ－Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ－ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エチノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ－Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ－ＩＩ）、及びウイルス性疾患、例えばウイルス性髄膜炎、脳炎、デング、又は天然痘などの病原体を含む。
予防及び／又は治療され得る細菌感染症は、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス、プロテウス・ブルガリス、スタフィロコッカス・ビリダンス、及び緑膿菌により起こされる感染症を含む。本明細書中に記載される方法に従って予防及び／又は治療され得る細菌（例、エシェリキア・コリ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス、プロテウス・ブルガリス、スタフィロコッカス・ビリダンス、及びシュードモナス・エルギノーサ）により起こされる細菌性疾患は、限定されないが、マイコバクテリア・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、Ｓ．ニューモニエ、ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病）、バチルス・アントラシス（炭疽）、破傷風、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリア、百日咳、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、Ｓ．アウレウス、及びレジオネラ症を含む。
本明細書中に記載される方法に従って予防及び／又は治療され得る、原虫により起こされる原虫性疾患又は原虫性感染症は、限定されないが、リーシュマニア、コクシジウム症、トリパノソーマ、住血吸虫、又はマラリアを含む。本明細書中に記載される方法に従って予防及び／又は治療され得る寄生虫により起こされる寄生虫性疾患又は寄生虫感染症は、限定されないが、クラミジア及びリケッチアを含む。
本明細書中に記載される方法に従って予防及び／又は治療され得る真菌性疾患又は真菌感染症は、限定されないが、カンジダ感染症、接合真菌症、カンジダ***炎、潜在性トリコスポロン血症を伴う進行性播種性トリコスポロン症、播種性カンジダ症、肺パラコクシジオイデス症、肺アスペルギルス症、ニューモシスチス・カリニ肺炎、クリプトコッカス性髄膜炎、コクシジオイド性髄膜脳炎及び脳脊髄血管炎、アスペルギルス・ニガー感染症、フザリウム角膜炎、副鼻腔真菌症、アスペルギルス・フミガタス心内膜炎、脛骨軟骨形成不全症、カンジダ・グラブラタ膣炎、中咽頭カンジダ症、Ｘ関連慢性肉芽腫症、足白癬、皮膚カンジダ症、真菌性胎盤炎、播種性トリコスポロン症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、真菌性角膜炎、クリプトコッカス・ネオフォルマンス感染症、真菌性腹膜炎、クルブラリア・ゲニクラタ感染症、ブドウ球菌性眼内炎、スポロトリコ症、及び皮膚糸状菌症により起こされるものを含む。
特定の実施形態では、これらの方法は、追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤、放射線療法剤、又はチェックポイント標的化剤である。特定の実施形態では、化学療法剤は、低メチル化剤（例、アザシチジン）である。特定の実施形態では、化学療法剤は、ＤＮＡ損傷誘発剤（例、ゲムシタビン）である。特定の実施形態では、チェックポイント標的化剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ－３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ－３抗体、アンタゴニスト抗ＶＩＳＴＡ抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ９６抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、及びアゴニスト抗ＯＸ４０抗体からなる群から選択される。特定の実施形態では、チェックポイント標的化剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、及びアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体からなる群から選択され、本明細書に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗体又は医薬組成物は、チェックポイント標的化剤と相乗効果を示す。
特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法における使用のための本発明の多特異性分子、抗体、及び／又は医薬組成物に関し、それにおいて、この方法は、追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の多特異性分子、抗体、及び／又は医薬組成物、ならびに（ｂ）薬物としての使用のための追加の治療剤に関する。特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の多特異性分子、抗体、及び／又は医薬組成物、ならびに（ｂ）癌の治療のための方法における使用のための追加の治療剤に関する。さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の多特異性分子、又は抗体、及び／又は医薬組成物、ならびに（ｂ）追加の治療剤を含む、医薬組成物、キット、又はキットオブパーツ（ｋｉｔ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）に関する。特定の実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤、放射線療法剤、又はチェックポイント標的化剤である。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、本明細書中に開示される方法において使用される。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開発された、ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６としても公知であるニボルマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はペムブロリズマブであり、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏにより開発されたランブロリズマブ又はＭＫ－３４７５としても公知である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体はピジリズマブであり、ＣｕｒｅＴｅｃｈにより開発されたＣＴ－０１１としても公知である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発されたＡＭＰ－５１４としても公知であるＭＥＤＩ０６８０である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたＰＤＲ００１である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたＲＥＧＮ２８１０である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｐｆｉｚｅｒによって開発されたＰＦ－０６８０１５９１である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＢｅｉＧｅｎｅによって開発されたＢＧＢ－Ａ３１７である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ及びＴｅｓａｒｏによって開発されたＴＳＲ－０４２である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｈｅｎｇｒｕｉによって開発されたＳＨＲ－１２１０である。
本明細書中に開示される治療方法において使用され得る抗ＰＤ－１抗体のさらなる非限定的な例は、以下の特許及び特許出願において開示されており、それらの全てが、それらの全体において、参照により、全ての目的のために本明細書中に組み入れられる：米国特許第６，８０８，７１０号、米国特許第７，３３２，５８２号、米国特許第７，４８８，８０２号、米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，１１４，８４５号、米国特許第８，１６８，７５７号、米国特許第８，３５４，５０９号、米国特許第８，６８６，１１９号、米国特許第８，７３５，５５３号、米国特許第８，７４７，８４７号、米国特許第８，７７９，１０５号、米国特許第８，９２７，６９７号、米国特許第８，９９３，７３１号、米国特許第９，１０２，７２７号、米国特許第９，２０５，１４８号、米国公開第ＵＳ２０１３／０２０２６２３Ａ１号、米国公開第ＵＳ２０１３／０２９１１３６Ａ１号、米国公開第ＵＳ２０１４／００４４７３８Ａ１号、米国公開第ＵＳ２０１４／０３５６３６３Ａ１号、米国公開第ＵＳ２０１６／００７５７８３Ａ１号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３３０９１Ａ１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０３６３９４Ａ１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１７９６６４Ａ２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／２０９８０４Ａ１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／２０６１０７Ａ１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０５８５７３Ａ１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０８５８４７Ａ１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／２００１１９Ａ１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０１５６８５Ａ１号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０２０８５６Ａ１号。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書中に開示される方法において使用される。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されたアテゾリズマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｃｅｌｇｅｎｅ、及びＭｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発されたデュルバルマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ及びＰｆｉｚｅｒによって開発されたＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても公知であるアベルマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたＭＤＸ－１１０５である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ及びＧＳＫによって開発されたＡＭＰ－２２４である。
本明細書中に開示される治療方法において使用され得る抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非限定的な例が、以下の特許及び特許出願中に開示されており、これらの全てが、全ての目的のために、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる：米国特許第７，９４３，７４３号、米国特許第８，１６８，１７９号、米国特許第８，２１７，１４９号、米国特許第８，５５２，１５４号、米国特許第８，７７９，１０８号、米国特許第８，９８１，０６３号、米国特許第９，１７５，０８２号、米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６（Ａ１）号、米国特許出願公開第２００３／０２３２３２３（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１３／０３２３２４９（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１４／０３４１９１７（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１４／００４４７３８（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１５／０２２５４８３（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１５／０３４６２０８（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１５／０３５５１８４（Ａ１）号、及びＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４／１０００７９（Ａ１）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４／０２２７５８（Ａ１）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４／０５５８９７（Ａ２）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１５／０６１６６８（Ａ１）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１５／１０９１２４（Ａ１）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１５／１９５１６３（Ａ１）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１６／０００６１９（Ａ１）、ならびにＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１６／０３０３５０（Ａ１）。
特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書中に開示される方法において使用される。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたイピリムマブである。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、免疫調節酵素、例えばＩＤＯ（インドールアミン－（２，３）－ジオキシゲナーゼ）及び／又はＴＤＯ（トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ）などを標的化する化合物との組み合わせにおいて対象に投与される。従って、特定の実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節酵素、例えばインドールアミン－（２，３）－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤などを標的化する化合物である。特定の実施形態では、そのような化合物は、エパカドスタット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｏｒｐ；例えば、ＷＯ２０１０／００５９５８を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及びＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、化合物はエパカドスタットである。別の実施形態では、化合物はＦ００１２８７である。別の実施形態では、化合物はインドキシモドである。別の実施形態では、化合物はＮＬＧ９１９である。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、癌を治療するためのＩＤＯ阻害剤との組み合わせにおいて対象に投与される。癌を治療する際での使用のための本明細書中に記載されるＩＤＯ阻害剤は、医薬組成物の固形投薬形態、例えば錠剤、ピル、又はカプセルなどの中に存在しており、それにおいて、医薬組成物は、ＩＤＯ阻害剤及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む。そのようなものとして、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体及び本明細書中に記載されるＩＤＯ阻害剤は、別々の投薬形態として、別々に、連続的に、又は同時に投与することができる。特定の実施形態では、多特異性分子又は抗体は非経口的に投与され、ＩＤＯ阻害剤は経口的に投与される。特定の実施形態では、阻害剤は、エパカドスタット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及びＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からなる群から選択される。エパカドスタットは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００５９５８において記載されており、それは、その全体において、全ての目的のために、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、阻害剤はエパカドスタットである。別の実施形態では、阻害剤はＦ００１２８７である。別の実施形態では、阻害剤はインドキシモドである。別の実施形態では、阻害剤はＮＬＧ９１９である。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ワクチンとの組み合わせにおいて対象に投与される。ワクチンは、例えば、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、又はＲＮＡワクチンであり得る。特定の実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質ベースの腫瘍ワクチン又は熱ショックタンパク質ベースの病原体ワクチンである。特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、熱ショックタンパク質ベースの腫瘍ワクチンとの組み合わせにおいて対象に投与される。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、すべての種にわたって一様に見出される高度に保存されたタンパク質のファミリーである。それらの発現は、熱ショック、又は毒素への曝露、酸化ストレスもしくはグルコース欠乏を含む他の形態のストレスの結果として、はるかに高いレベルまで強力に誘導され得る。五つのファミリーが、分子量に従って、ＨＳＰ－１１０、－９０、－７０、－６０、及び－２８に分類されている。ＨＳＰは、Ｔ細胞活性化を導く、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）における交差提示経路を通じて免疫原性ペプチドを送達する。ＨＳＰは、腫瘍特異的免疫を誘導することができる複合体を形成する、腫瘍関連抗原性ペプチドのシャペロン担体として機能する。瀕死の腫瘍細胞からの放出の際、ＨＳＰ－抗原複合体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により持ち上げられ、ここで、抗原は、抗腫瘍ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を導く、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子に結合するペプチドに処理される。腫瘍調製物から由来するＨＳＰ複合体により引き出された免疫は、それぞれの対象の癌により発現される固有の抗原性ペプチドレパートリーに対して特異的に指向される。従って、特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の多特異性分子、抗体、及び／又は医薬組成物ならびに（ｂ）薬物としての使用のための、例えば、癌の治療のための方法における使用のためのワクチンに関する。特定の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の多特異性分子、抗体、及び／又は医薬組成物ならびに（ｂ）ワクチンを含む、医薬組成物、キット、又はキットオブパーツに関する。特定の実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質ベースの腫瘍ワクチンである。特定の実施形態では、ワクチンは、熱ショックタンパク質ベースの病原体ワクチンである。特定の実施形態では、ワクチンは、ＷＯ２０１６／１８３４８６に記載されるとおりであり、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）は、抗原性ペプチドと非共有結合で複合体化された熱ショックタンパク質からなるタンパク質ペプチド複合体である。ＨＳＰＰＣは、自然及び適応免疫応答の両方を誘発する。特定の実施形態では、抗原性ペプチドは、治療されている癌に対する抗原性を提示する。ＨＳＰＰＣは、膜受容体（主に、ＣＤ９１）を介してＡＰＣにより、又はＴｏｌｌ様受容体への結合により、効率的にサイズ分類される。ＨＳＰＰＣ内在化は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、単球、ならびにＴｈ１及びＴｈ－２介在性免疫応答の活性化を導く、ケモカイン及びサイトカイン産生を伴うＡＰＣの機能的成熟をもたらす。特定の実施形態では、本明細書中に開示される方法において使用されるＨＳＰＰＣは、抗原性ペプチドと複合体化されたストレスタンパク質のｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、又はｈｓｐ９０ファミリー由来の一つ又は複数の熱ショックタンパク質を含む。特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣは、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、又はその二つもしくはそれ以上の組み合わせを含む。
特定の実施形態では、熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）は、組換え抗原性ペプチドと複合体化された組換え熱ショックタンパク質（例、ｈｓｐ７０又はｈｓｃ７０）又はそのペプチド結合領域を含む。組換え熱ショックタンパク質は、例えば、Ｄｗｏｒｎｉｃｚａｋ ａｎｄ Ｍｉｒａｕｌｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５１８１－５１９７（１９８７）ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号 Ｐ１１１４２及び／又はＹ００３７１において記載されるように、ヒトｈｓｃ７０配列を使用して、組換えＤＮＡ技術により産生され得るが、それらの各々が、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、Ｈｓｐ７０配列は、Ｈｕｎｔ ａｎｄ Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２（１９），６４５５－６４５９（１９８５）ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号 Ｐ０ＤＭＶ８及び／又はＭ１１７１７に記載されるとおりであり、その各々が、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。抗原性ペプチドはまた、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ方法により調製することができる。
特定の実施形態では、抗原性ペプチドは、修飾アミノ酸を含む。特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、翻訳後修飾の模倣物を含む。特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、側鎖ヒドロキシル又はアミン上でリン酸化されたＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又はＨｉｓである。特定の実施形態では、修飾アミノ酸は、側鎖ヒドロキシル又はアミン上でリン酸化されたＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又はＨｉｓアミノ酸の模倣物である。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）、例えば、熱ショックタンパク質ペプチド複合体９６（ＨＳＰＰＣ－９６）との組み合わせにおいて対象に投与され、癌を治療する。ＨＳＰＰＣ－９６は、抗原性ペプチドと複合体化された９６ｋＤａ熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）、ｇｐ９６を含む。ＨＳＰＰＣ－９６は、対象の腫瘍から製造された癌免疫療法であり、癌の抗原性「フィンガープリント」を含む。特定の実施形態では、このフィンガープリントは、特定の対象の特定の癌細胞においてのみ存在する固有の抗原を含み、ワクチンの注射は、特定の癌フィンガープリントで任意の細胞を認識し、攻撃するように、対象の免疫系を刺激することが意図される。従って、特定の実施形態では、本発明は、薬物としての使用のため及び／又は癌の治療のための方法における使用のための熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）との組み合わせにおける、本発明の抗体及び／又は医薬組成物に関する。
特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ－９６は、対象の腫瘍組織から産生される。特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ（例、ＨＳＰＰＣ－９６）は、治療されている癌又はその転移のタイプの腫瘍から産生される。別の特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ（例、ＨＳＰＰＣ－９６）は、治療されている対象にとって自己由来である。特定の実施形態では、腫瘍組織は、非壊死性腫瘍組織である。特定の実施形態では、非壊死性腫瘍組織の少なくとも１グラム（例、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０グラム）を使用して、ワクチン投与計画が生み出される。特定の実施形態では、外科的切除後、非壊死性腫瘍組織は、ワクチン調製における使用の前に凍結される。特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ－９６は、精製技術により、腫瘍組織から単離され、濾過され、注射可能なワクチン用に調製される。特定の実施形態では、対象は、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＣＣ－９６の６～１２回の用量を投与される。そのような実施形態では、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ－９６用量は、最初の４回の用量を毎週、次に、２～８回の追加用量を隔週で投与されてもよい。
本明細書中に記載される方法に従って使用され得るＨＳＰＰＣのさらなる例は、以下の特許及び特許出願において開示されており、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる：米国特許第６，３９１，３０６号、第６，３８３，４９２号、第６，４０３，０９５号、第６，４１０，０２６号、第６，４３６，４０４号、第６，４４７，７８０号、第６，４４７，７８１号、及び第６，６１０，６５９号。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、アジュバントとの組み合わせにおいて対象に投与される。様々なアジュバントを、治療状況に依存して使用することができる。適したアジュバントの非限定的な例は、限定されないが、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、モンタニドＩＳＡ（不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント）、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ、ムラミルペプチド、Ｓｙｎｔｅｘアジュバント製剤（ＳＡＦ）、ミョウバン（水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム）、アルミニウム塩アジュバント、Ｇｅｒｂｕ（登録商標）アジュバント、ニトロセルロース吸収抗原、封入又は捕捉抗原、３脱Ｏ－アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ－ＭＰＬ）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）リガンド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、免疫刺激複合体、例えばサポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ－２１、ＱＳ－７、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ及び他などを含む。他のアジュバントには、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびにポリ（Ａ）及びポリ（Ｕ）などの二本鎖ＲＮＡ分子が含まれる。上記のアジュバントの組み合わせも使用され得る。例えば、米国特許第６，６４５，４９５号、第７，０２９，６７８号、及び第７，８５８，５８９号を参照されたく、そのすべては、それらの全体が参照により本明細書中に組み入れられる。特定の実施形態では、本明細書中で使用されるアジュバントは、ＱＳ－２１ ＳＴＩＭＵＬＯＮである。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＣＲを含む追加の治療剤との組み合わせにおいて対象に投与される。特定の実施形態では、追加の治療剤は、可溶性ＴＣＲである。特定の実施形態では、追加の治療剤は、ＴＣＲを発現する細胞である。従って、特定の実施形態では、本発明は、薬物としての使用のための及び／又は癌の治療のための方法における使用のための、ＴＣＲを含む追加の治療剤との組み合わせにおける、本発明の多特異性分子、抗体、及び／又は医薬組成物に関する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞との組み合わせにおいて対象に投与される。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＣＲ模倣抗体との組み合わせにおいて対象に投与される。特定の実施形態では、ＴＣＲ模倣抗体は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体である。ＴＣＲ模倣抗体の非限定的な例については、例えば、米国特許第９，０７４，０００号ならびに米国公開第ＵＳ２００９／０３０４６７９Ａ１号及び第ＵＳ２０１４／０１３４１９１Ａ１を参照されたく、そのすべては、それらの全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、二特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）（例、ＷＯ２００５０６１５４７Ａ２中に記載され、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）及び／又は二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）（例、ＷＯ２０１２１６２０６７Ａ２中に記載され、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）との組み合わせにおいて対象に投与される。特定の実施形態では、ＢｉＴＥ及び／又はＤＡＲＴは、腫瘍関連抗原（例、腫瘍において過剰発現されるポリペプチド、オンコウイルスから由来するポリペプチド、腫瘍に特異的な翻訳後修飾を含むポリペプチド、腫瘍において特異的に変異されたポリペプチド）、及びエフェクター細胞上の分子（例、ＣＤ３又はＣＤ１６）に特異的に結合する。特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＥＧＦＲ（例、ヒトＥＧＦＲ）であり、場合により、ＢｉＴＥ及び／又はＤＡＲＴは、セツキシマブのＶＨ及びＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、Ｈｅｒ２（例、ヒトＨｅｒ２）であり、場合により、ＢｉＴＥ及び／又はＤＡＲＴは、トラスツズマブのＶＨ及びＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ２０（例、ヒトＣＤ２０）である。
抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体ならびに追加の治療剤（例、化学療法剤、放射線療法剤、チェックポイント標的化剤、ＩＤＯ阻害剤、ワクチン、アジュバント、可溶性ＴＣＲ、ＴＣＲを発現する細胞、キメラ抗原受容体を発現する細胞、及び／又はＴＣＲ模倣抗体）は、別々の投与形態として、別々に、連続的に、又は同時に投与され得る。特定の実施形態では、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、非経口的に投与され、ＩＤＯ阻害剤は、経口投与される。
本明細書中に記載される抗体又は医薬組成物は、様々な経路によって対象に送達され得る。これらには、これらに限定されないが、非経口、鼻腔内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、腫瘍内、結膜、動脈内、及び皮下経路が含まれる。肺投与はまた、例えば、吸入器又はネブライザーの使用、及びスプレーとして使用するためのエアロゾル化剤との製剤化によって用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子、抗体、又は医薬組成物は、皮下又は静脈内に送達される。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子、抗体、又は医薬組成物は、動脈内に送達される。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子、抗体、又は医薬組成物は、腫瘍内に送達される。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子、抗体、又は医薬組成物は、腫瘍排出リンパ節中に送達される。
状態の治療及び／又は予防において有効であるであろう多特異性分子、抗体、又は組成物の量は、疾患の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定され得る。
組成物において用いられるべき正確な用量はまた、投与の経路、及びそれにより起こされる感染又は疾患の重症度に依存し、開業医の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。例えば、有効な用量はまた、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態（年齢、体重、及び健康を含む）、患者がヒトもしくは動物であるかどうか、投与される他の医薬品、又は治療が予防的もしくは治療的であるかどうかに応じて変動してもよい。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物もまた治療され得る。治療投与量を、最適に滴定して、安全性及び有効性が最適化される。
本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体を使用して、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）など、免疫沈降、又はウエスタンブロッティングを含む、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して、生物学的サンプルにおいてＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）タンパク質レベルをアッセイすることもできる。好適な抗体アッセイ標識は、当該技術分野において既知であり、グルコース酸化酵素などの酵素標識、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）などのラジオアイソトープ、ルミノールなどの発光標識、ならびにフルオレセイン及びローダミン、ならびにビオチンなどの蛍光標識を含む。そのような標識を使用して、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体を標識することができる。あるいは、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体を標識する第二の多特異性分子又は抗体を標識して、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗 ＴＩＧＩＴ抗体との組み合わせにおいて使用し、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）タンパク質レベルを検出することができる。従って、特定の実施形態では、本発明は、生物学的サンプル中の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）タンパク質のインビトロ検出のための、本発明の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用に関する。さらなる実施形態では、本発明は、生物学的サンプル中のＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）タンパク質レベルをインビトロでアッセイ及び／又は検出するための、本発明の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用に関し、場合により、それにおいて、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、放射性核種又は検出可能な標識にコンジュゲートされており、及び／又は本明細書中に記載される標識を担持し、ならびに／あるいは、それにおいて免疫組織学的方法が使用される。
ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）タンパク質の発現レベルについてアッセイすることは、第一の生物学的サンプル中のＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）タンパク質のレベルを、直接的に（例、絶対タンパク質レベルを測定又は測定することにより）又は相対的に（例、第二の生物学的サンプル中の疾患関連タンパク質レベルと比較することにより）定性的又は定量的に測定又は推定することを含むことを意図する。第一の生物学的サンプル中のＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）ポリペプチド発現レベルを測定又は推定し、標準的なＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）タンパク質レベルと比較することができ、標準は、例えば、障害を有さない個人から得られた第二の生物学的サンプルから取られる、又は障害を有さない個人の集団からのレベルを平均化することにより決定される。当技術分野において理解されるとおり、一度、「標準的な」ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）ポリペプチドレベルが公知であると、それは、比較用の標準として繰り返し使用することができる。従って、さらなる実施形態では、本発明は、生物学的サンプル中のＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴタンパク質レベル、例えば、ヒトＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴタンパク質レベルをアッセイ及び／又は検出するためのインビトロ方法に関し、免疫組織学的方法により、生物学的サンプル中のＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴタンパク質、例えば、ヒトＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴタンパク質のレベルを定性的又は定量的に測定又は推定することを含む。
本明細書中で使用されるように、用語「生物学的サンプル」は、対象、細胞株、組織、あるいはＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）を潜在的に発現する細胞の他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルを指す。動物（例、ヒト又はカニクイザル）から組織生検及び体液を得るための方法は、当技術分野において周知である。生物学的サンプルは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、予後、診断、モニタリング、及びスクリーニングの適用のために使用することができ、当業者に周知であり、標準的であり、本明細書の記載に基づくインビトロ及びインビボ適用を含む。免疫系の状態及び／又は免疫応答のインビトロ判断及び評価のための、予後アッセイ、診断アッセイ、モニタリングアッセイ、及びスクリーニングアッセイならびにキットは、免疫系障害を有することが公知である、もしくは有することが疑われるもの、あるいは予想されるもしくは所望の免疫系応答、抗原応答、又はワクチン応答に関するものを含む患者サンプルを評価するために予想し、診断し、モニタリングするために利用されてもよい。免疫系状態及び／又は免疫応答の判断ならびに評価はまた、異なる薬剤又は抗体に対する、薬物の臨床試験について、又は特定の化学療法剤、放射線療法剤、もしくは抗体（それらの組み合わせを含む）の投与について、患者の適合性を決定する際に有用である。この種の予後及び診断のモニタリングならびに判断は、アッセイが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を使用する抗体療法について患者を評価するためにも使用される、乳癌においてＨＥＲ２タンパク質に対する抗体を利用して、既に実施中である（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）、Ｄａｋｏ）。インビボ適用は、指向された細胞療法、及び免疫系調整、及び免疫応答の放射線画像化を含む。従って、特定の実施形態では、本発明は、診断としての使用のための本発明の抗ＣＤ９６抗体及び／又は医薬組成物に関する。特定の実施形態では、本発明は、免疫系機能不全を有する、もしくは有すると疑われる対象の、及び／又は予想されるもしくは所望の免疫系応答、抗原応答、もしくはワクチン応答に関する、予測、診断、及び／又はモニタリングのための方法における使用のための、本発明の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体、及び／又は医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、対象の生物学的サンプル中のヒトＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴタンパク質レベルをインビトロでアッセイ及び／又は検出することにより、免疫系機能不全を有する、又は有すると疑われる対象の、及び／又は予想されるもしくは所望の免疫系応答、抗原応答、もしくはワクチン応答に関する、予測、診断、及び／又はモニタリングのための、本発明の抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用に関する。
特定の実施形態では、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、生検サンプルの免疫組織化学において使用され得る。特定の実施形態では、方法は、インビトロ方法である。別の実施形態では、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６ 又はカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）のレベル、あるいは膜表面上にＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）を含む細胞のレベルを検出するために使用することができ、そのレベルは次に、特定の疾患症状に関連付けられ得る。本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子及び単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、検出可能な、もしくは機能的な標識を担持してもよく、及び／又は放射性核種もしくは検出可能な標識にコンジュゲートされてもよい。蛍光標識が使用される場合、当技術分野において公知の、現在利用可能な顕微鏡及び蛍光活性化細胞選別解析（ＦＡＣＳ）又は両方の方法手順の組み合わせを利用して、特定の結合メンバーを同定し、定量化してもよい。本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子及び単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、蛍光標識を担持してもよく、又はコンジュゲートされてもよい。例示的な蛍光標識は、例えば、反応性及びコンジュゲートされたプローブ、例えば、アミノクマリン、フルオレセイン及びテキサスレッド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃｙ色素、ならびにＤｙＬｉｇｈｔ色素を含む。抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体は、放射性標識又は放射性核種、例えば同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１７Ｌｕ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、及び１８６Ｒｅなどを担持してもよく、又はコンジュゲートされてもよい。放射性標識が使用される場合、当技術分野において公知の現在利用可能な計数手順を利用して、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）への抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子の、あるいはＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）への単離抗ＴＩＧＩＴ抗体への特異的結合を同定及び定量化してもよい。標識が酵素である場合において、検出は、当技術分野において公知の、現在利用される比色分析技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流測定技術、又は気体定量技術のいずれかにより達成されてもよい。これは、サンプル又は対照サンプルを、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体と、抗ＣＤ９６及び／又は抗ＴＩＧＩＴ多特異性分子とＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）、あるいは抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）の間で複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより達成することができる。抗ＣＤ９６及び／又は抗ＴＩＧＩＴ多特異性分子とＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）、あるいは抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）の間に形成される任意の複合体を、サンプル及び対照において検出し、比較する。ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）についての本明細書中に記載される多特異性分子、ならびにＴＩＧＩＴについての本明細書中に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）の特異的結合に照らして、多特異性分子は、細胞の表面上のＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）発現を特異的に検出するために使用することができ、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）を特異的に検出するために使用することができる。本明細書中に記載される抗ＣＤ９６及び／又は抗ＴＩＧＩＴ多特異性分子は、免疫親和性精製を介してＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）を精製するために使用することもできる。本明細書中に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体はまた、免疫親和性精製を介してＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）を精製するために使用することができる。また、本明細書中に含まれるのは、例えば、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）、又はＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）／ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）リガンド複合体及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）／ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）リガンド複合体の存在の程度の定量的な分析のためのテストキット、キット、又はキットオブパーツの形態で調製できるアッセイシステムである。システム、テストキット、キット、又はキットオブパーツは、標識成分、例えば、標識抗体、及び一つ又は複数の追加の免疫化学試薬を含み得る。
７．５ ポリヌクレオチド、ベクター、ならびに多特異性分子及び抗体を産生する方法
別の態様では、本明細書中で提供されるのは、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原に特異的に結合する、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体、あるいはその一部、又はその断片（例、ＶＬ及び／又はＶＨ、ならびに軽鎖及び／又は重鎖）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びベクター、例えば、宿主細胞（例、大腸菌及び哺乳動物細胞）中での組換え発現のためのそのようなポリヌクレオチドを含むベクターである。本明細書中で提供される抗体のいずれかの重鎖及び／又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞におけるそれらの効率的発現のための発現ベクターが本明細書中で提供される。
本明細書中で使用されるように、「単離された」ポリヌクレオチド又は核酸分子は、核酸分子の天然の供給源に（例、マウス又はヒトに）存在する他の核酸分子から分離されるものである。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術により産生されるとき、他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まない可能性があるか、又は化学的に合成されるとき、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。例えば、専門用語「実質的に含まない」は、他の材料、例えば、細胞材料、培地、他の核酸分子、化学前駆体及び／もしくは他の化学物質の約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、又は０．１％未満（特に、約１０％未満）を有するポリヌクレオチドあるいは核酸分子の調製を含む。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体をコードする核酸分子は、単離又は精製される。
特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、多特異性分子及び抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、それらは、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）ポリペプチドに特異的に結合し、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を含み、ならびにＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）ポリペプチドへの結合について、そのような多特異性分子及び抗体と（例、用量 依存的な様式において）競合する、あるいは、そのような多特異性分子及び抗体のエピトープと同じエピトープに結合する多特異性分子及び抗体である。
特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体の軽鎖又は重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のＶＬ ＦＲ及びＣＤＲを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列（例、表１及び表２を参照のこと）あるいは本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体のＶＨ ＦＲ及びＣＤＲを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列（例、表１及び表２を参照のこと）を含み得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される多特異性分子のＶＨ、ＶＬ、重鎖、及び／又は軽鎖をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される多特異性分子の第一のＶＨ及び第一のＶＬをコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される多特異性分子の第二のＶＨ及び第二のＶＬをコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の重鎖及び第一の軽鎖をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の重鎖及び第二の軽鎖をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨ及び／又はＶＬ、あるいは重鎖及び／又は軽鎖をコードする。
また、本明細書中で提供されるのは、例えば、コドン／ＲＮＡ最適化、異種シグナル配列での置換、及びｍＲＮＡ不安定性エレメントの除去により最適化された、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は単離抗ＴＩＧＩＴ抗体をコードするポリヌクレオチドである。コドン変化を導入すること及び／又はｍＲＮＡ中の阻害領域を除去することによる組換え発現のために抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片（例、軽鎖、重鎖、ＶＨドメイン、又はＶＬドメイン）をコードする最適化核酸を生成するための方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号、第６，１７４，６６６号、第６，２９１，６６４号、第６，４１４，１３２号、及び第６，７９４，４９８号において記載されている最適化方法を適応させることにより行うことができ、したがって、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。例えば、ＲＮＡ内の可能性のあるスプライス部位及び不安定性エレメント（例、Ａ／Ｔ又はＡ／Ｕリッチエレメント）は、組換え発現のためのＲＮＡの安定性を増加させるために核酸配列によりコードされるアミノ酸を変更することなく、変異され得る。変更は、例えば、同一のアミノ酸の代替コドンを使用する、遺伝子コードの縮重を利用する。特定の実施形態では、保存的変異、例えば、元々のアミノ酸と同様の化学構造ならびに特性及び／又は機能を有する同様のアミノ酸をコードする一つ以上のコドンを変更させることが所望であり得る。そのような方法によって、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片の発現が、最適化されていないポリヌクレオチドによりコードされる抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体の発現に比べて、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくは１００倍又はそれ以上だけ増加させることができる。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片（例、ＶＬドメイン及び／又はＶＨドメイン）をコードする最適化ポリヌクレオチド配列は、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片（例、ＶＬドメイン及び／又はＶＨドメイン）をコードする最適化ポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例、相補的）ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又は断片をコードする最適化ヌクレオチド配列は、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片をコードする非最適化ポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドに高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片をコードする最適化ヌクレオチド配列は、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片をコードする非最適化ヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドに高ストリンジェンシー、中又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報が記載されており、例えば、米国特許出願公開第２００５／００４８５４９（例、段落７２～７３）を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の方法により得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書中に記載される多特異性分子及び抗体、例えば、表１及び表２中に記載される多特異性分子及び抗体、ならびにこれらの多特異性分子及び抗体の修飾バージョンをコードするヌクレオチド配列を、当技術分野において周知の方法を使用して決定することができ、即ち、特定のアミノ酸をコードすることが公知のヌクレオチドコドンを、多特異性分子又は抗体をコードする核酸を生成するような方法において組み立てられる。多特異性分子又は抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができ（例、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２－６において記載されているとおりで、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）、それは、簡単には、多特異性分子又は抗体をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、ならびに次に、ＰＣＲによる、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
あるいは、本明細書中に記載される多特異性分子又は本明細書中に記載される抗体の抗原結合領域をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法（例、ＰＣＲ及び他の分子クローニング方法）を使用して、適切な供給源（例、ハイブリドーマ）からの核酸から生成することができる。例えば、既知の配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅は、目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られたゲノムＤＮＡを使用して実施することができる。そのようなＰＣＲ増幅方法を使用して、多特異性分子又は抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする配列を含む核酸を得ることができる。そのようなＰＣＲ増幅方法を使用して、多特異性分子又は抗体の可変軽鎖領域及び／又は可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅された核酸は、宿主細胞における発現のため、及びさらなるクローニングのために、ベクターにクローニングすることができる。
特定の抗原結合領域又は抗体をコードする核酸を含むクローンは利用可能ではないが、しかし、抗原結合領域又は抗体分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅により、又は、特定の遺伝子配列について特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングし、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定することにより、化学的に合成する、又は適切な情報源から得ることができる（例、抗体を発現する任意の組織又は細胞、例えば、本明細書中に記載される抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などから生成された抗体ｃＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー、あるいはそれから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ ＲＮＡ）。ＰＣＲによって生成された増幅された核酸を次に、当技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合断片、あるいは単離抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原結合領域、抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原結合領域、又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源として作用し得る。一度、単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され、それらは次に、宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例、ＣＨＯ ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞）、又はそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの中にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞において抗ＣＤ９６及び／又は抗ＴＩＧＩＴ多特異性分子あるいは抗ＴＩＧＩＴ抗体の合成を得ることができる。
全抗体を生成するために、ＶＨ又はＶＬヌクレオチド配列、制限部位、及び制限部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンにおいてＶＨ又はＶＬ配列を増幅することができる。当業者に公知のクローニング技術を使用して、ＰＣＲにより増幅されたＶＨドメインは、重鎖定常領域、例えば、ヒトガンマ１又はヒトガンマ４定常領域を発現するベクターにクローニングされ得るが、ＰＣＲにより増幅されたＶＬドメインは、軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ又はラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングされ得る。特定の実施形態では、ＶＨ又はＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ－１αプロモーター、分泌シグナル、可変領域用のクローニング部位、定常領域、及び選択マーカー、例えばネオマイシンなどを含む。ＶＨ及びＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する一つのベクターにクローニングされ得る。次に、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを、細胞株に共トランスフェクトして、当業者に公知の技術を使用して、完全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定した又は一過性細胞株を生成する。
ＤＮＡはまた、例えば、マウス配列の代わりに、ヒト重及び軽鎖定常領域についてのコード配列を置換することにより、又は免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てもしくは一部を共有結合的に連結させることにより、修飾することができる。
高度に厳密、中程度又はより低度に厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書中に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、高度に厳密、中程度又はより低度に厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に提供されるＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において記載されており、当業者に既知である。例えば、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、フィルター結合したＤＮＡへの、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での、約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での、約５０～６５℃での一回又は複数回の洗浄を含み得る、高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、フィルター結合した核酸への、６×ＳＳＣ中での、約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での、約６８℃での一回又は複数回の洗浄を含み得る。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者に公知であり、記載されており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ならびにＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｔ ｐａｇｅｓ ６．３．１－６．３．６及び２．１０．３を参照のこと、それらは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される多特異性分子、又はその抗原結合領域を（例、組換えにより）発現する細胞（例、宿主細胞）であって、それは、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）、本明細書中に記載される抗体を（例、組換えにより）発現する細胞（例、宿主細胞）に特異的に結合し、それは、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）、ならびに関連するポリヌクレオチド及び発現ベクターに特異的に結合する。本明細書中で提供されるのは、宿主細胞における、好ましくは哺乳動物細胞（例、ＣＨＯ細胞）における組換え発現のための抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、あるいはそれらの抗原結合領域、ならびに抗ＴＩＧＩＴ抗体又は断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例、発現ベクター）である。また、本明細書中で提供されるのは、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、ならびに本明細書中に記載される抗ＴＩＧＩＴ抗体（例、ヒト又はヒト化抗体）を組換え発現するためのそのようなベクターを含む宿主細胞である。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、宿主細胞から多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗体を発現させることを含む、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体を産生するための方法である。
ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する、本明細書中に記載される多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は抗体（例、本明細書中に記載される完全長抗原結合領域又は抗体あるいは抗体の重鎖及び／又は軽鎖）の組換え発現は、一般的に、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を含む。一度、本明細書中に記載される多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は抗体分子、多特異性分子又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖、あるいはその断片（例、重鎖及び／又は軽鎖可変領域）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は抗体分子の産生のためのベクターを、当技術分野において周知の技術を使用した組換えＤＮＡ技術により産生することができる。このように、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は抗体もしくは抗体断片（例、軽鎖もしくは重鎖）コードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製するための方法が、本明細書中に記載されている。当業者に周知である方法を使用して、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は抗体もしくは抗体断片（例、軽鎖もしくは重鎖）コード配列ならびに適した転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えを含む。また、提供されるのは、プロモーターに作動可能に連結された、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変領域又はその断片、又は重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターである。そのようなベクターは、例えば、多特異性分子又は抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例、国際公開ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと。それらは、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）、多特異性分子又は抗体の可変領域は、重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖全体の両方の発現のためのそのようなベクター中にクローニングされ得る。
特定の実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載される多特異性分子のＶＨ、ＶＬ、重鎖、及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載される多特異性分子の第一のＶＨ及び第一のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載される多特異性分子の第二のＶＨ及び第二のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の重鎖及び第一の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の重鎖及び第二の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ベクターは、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨ及び／又はＶＬ、あるいは重鎖及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
発現ベクターは、従来の技術により細胞（例、宿主細胞）に移すことができ、結果として得られた細胞が次に、従来の技術により培養され、本明細書中に記載される多特異性分子もしくはその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗体もしくはその断片を含み、産生することができる。このように、本明細書中で提供されるのは、宿主細胞中でのそのような配列の発現のためにプロモーターに作動可能に連結された、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、あるいは本明細書中に記載される抗体もしくはその断片、又はその重鎖もしくは軽鎖、又はその断片、あるいは本明細書中に記載される単一鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子のＶＨ、ＶＬ、重鎖、及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一のＶＨ及び第一のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第二のＶＨ及び第二のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の重鎖及び第一の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の重鎖及び第二の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨ及び／又はＶＬ、あるいは重鎖及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子のＶＨ、ＶＬ、重鎖、及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一のＶＨ及び第一のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第二のＶＨ及び第二のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の重鎖及び第一の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の重鎖及び第二の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨ及び／又はＶＬ、あるいは重鎖及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチドを含む第三のベクター、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを含む第四のベクターを含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の軽鎖をコードする第四のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞が、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチドを含む第三のベクター、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の軽鎖をコードする第四のポリヌクレオチドを含む第四のベクターを含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される単離抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書中に記載される単離抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、及び本明細書中に記載される単離抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む。
特定の実施形態では、第二の細胞の軽鎖／軽鎖可変領域に関連付けられた第一の細胞により発現されて、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体を形成する重鎖／重鎖可変領域。特定の実施形態では、本明細書中で提供されるのは、そのような第一の宿主細胞及びそのような第二の宿主細胞を含む宿主細胞の集団である。
特定の実施形態では、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、あるいは本明細書中に記載される抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体の軽鎖／軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクター、ならびに本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、あるいは本明細書中に記載される抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体の重鎖／重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含むベクターの集団である。
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書中に記載される多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗体分子を発現させることができる（例、米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、その後に精製され得る溶剤を表すが、しかし、また、適したヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクトされる場合に、本明細書中に記載される多特異性分子、もしくはその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗体分子をインサイツで発現し得る細胞を表す。これらは、限定されないが、例えば、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域のコード配列、又は抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌（例、大腸菌及び枯草菌）など、例えば、抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例、サッカロミセス及びピキア）、例えば、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域のコード配列、又は抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、例えば、組換えウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、あるいは、例えば、多特異性分子、もしくはその抗原結合領域のコード配列、又は抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、あるいは、例えば、哺乳動物細胞のゲノムから由来する（例、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来するプロモーター（例、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス ７．５Ｋ プロモーター）を持つ哺乳動物細胞系（例、ＣＯＳ（例、ＣＯＳ１又はＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、及びＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、及びＢＭＴ１０細胞）を含む。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体を発現する細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＣＨＯ ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞により産生される多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗体の重鎖及び／又は軽鎖は、ピログルタメートにより置換されたＮ末端グルタミン又はグルタミン酸残基を有し得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体を発現するための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）又はｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、特に、組換え抗体分子全体の発現のための、細菌細胞、例えば大腸菌など、又は真核生物細胞（例、哺乳動物細胞）が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞などが、ベクター、例えばヒトサイトメガロウイルスからの主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどとの併用において、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ＭＫ ＆ Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ Ｈ（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：１０１－５；ａｎｄ Ｃｏｃｋｅｔｔ ＭＩ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（７）：６６２－７、それらの各々が、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗体は、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞により産生される。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合領域、又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する、本明細書中に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターにより調節される。
細菌系において、多数の発現ベクターを、発現されている多特異性分子又は抗体分子について意図される使用に依存して、有利に選択することができる。例えば、大量のそのような多特異性分子又は抗体を産生する場合、多特異性分子又は抗体分子の医薬組成物の生成のために、容易に精製できる高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいであろう。そのようなベクターは、限定されないが、融合タンパク質が産生されるように、コード配列が、ｌａｃ Ｚコード領域を伴うフレームにおけるベクター中に個別にライゲーションされ得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ Ｕ ＆ Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｌｌ Ｂ（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ ２：１７９１－１７９４）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ Ｓ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ Ｍ（１９８５）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １３：３１０１－３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ Ｇ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ＳＭ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４：５５０３－５５０９）、及び同様のものを含み、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。例えば、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、吸着及びマトリックスグルタチオンアガロースビーズへの結合により溶解細胞から容易に精製され、その後、遊離グルタチオンの存在下で溶出され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
昆虫系では、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するベクターとして使用することができる。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞において成長する。コード配列は、ウイルスの非必須領域（例、ポリヘドリン遺伝子）中に個別にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれてもよい。
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合では、目的のコード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションされ得る。このキメラ遺伝子は、次に、インビトロ又はインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例、領域Ｅｌ又はＥ３）中での挿入によって、感染した宿主において生存可能で、分子を発現することが可能な組換えウイルスがもたらされる（例、Ｌｏｇａｎ Ｊ ＆ Ｓｈｅｎｋ Ｔ（１９８４）ＰＮＡＳ ８１（１２）：３６５５－９を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。特定の開始シグナルがまた、挿入されたコード配列の効率的な翻訳のために要求され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調している必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって強化され得る（例、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｔｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４を参照されたい）。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物のそのような修飾（例、グリコシル化）及び処理（例、切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後処理ならびに修飾の特徴的かつ特異的な機序を有する。適した細胞株又は宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的で、遺伝子産物の最初の転写、グリコシル化、及びリン酸化の適当なプロセシングのための細胞機構を保有する真核生物宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞は、限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ、及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（任意の免疫グロブリン鎖を内因性に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例、ＣＯＳ１又はＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０、及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞などにおいて産生される。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子又は抗体は、低下されたフコース含量を有する又はフコース含量を有さない。そのような多特異性分子は、当業者に公知の技術を使用して産生され得る。例えば、多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗体は、フコシル化する能力を欠損している又は欠く細胞において発現され得る。特定の例では、α１，６－フコシルトランスフェラーゼの対立遺伝子の両方のノックアウトを伴う細胞株を使用して、低下されたフコース含量を伴う、多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗体を産生することができる。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、低下されたフコース含量を有する抗体を産生するために使用され得る、そのようなシステムの例である。
組換えタンパク質の長期間の高収率の産生のため、安定した発現細胞が生成され得る。例えば、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体を安定的に発現する細胞株が、操作され得る。特定の実施形態では、本明細書中で提供される細胞は、軽鎖／軽鎖可変領域及び重鎖／重鎖可変領域を安定的に発現し、それらは、本明細書中に記載される抗原結合領域又は抗体を形成するように会合する。
特定の態様では、複製のウイルス起源を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞を、適した発現制御エレメント（例、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、及び選択マーカーにより制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞を富化培地中で１～２日間増殖させた後、選択培地に切り換え得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、増殖して病巣を形成することを可能にし、それによりクローン化されて細胞株に拡大される。この方法は、有利には、本明細書中に記載される抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）もしくはその断片を発現する細胞株を操作するために使用され得る。そのような操作された細胞株は、多特異性分子又は抗体分子と直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価において特に有用であり得る。
多数の選択系を使用することができ、限定されないが、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、又はａｐｒｔ－細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃｅｌｌ １１（１）：２２３－３２）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＥＨ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ Ｗ（１９６２）ＰＮＡＳ ４８（１２）：２０２６－２０３４）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ Ｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２（３）：８１７－２３）の遺伝子を含み、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。また 抗代謝剤耐性は、以下の遺伝子についての選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、それは、メトトレキサートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）ＰＮＡＳ ７７（６）：３５６７－７０；Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）ＰＮＡＳ ７８：１５２７－３１）；ｇｐｔ、それは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ ＆ Ｂｅｒｇ Ｐ（１９８１）ＰＮＡＳ ７８（４）：２０７２－６）；ｎｅｏ、それは、アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与する（Ｗｕ ＧＹ ＆ Ｗｕ ＣＨ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ Ｐ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３２：５７３－５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２；及びＭｏｒｇａｎ ＲＡ ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１９１－２１７；Ｎａｂｅｌ ＧＪ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１（５）：２１１－５）；及びｈｙｇｒｏ、それは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ＲＦ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｇｅｎｅ ３０（１－３）：１４７～５６）。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。組換えＤＮＡ技術の当技術分野において一般的に公知である方法は、所望の組換えクローンを選択するためにルーチン的に適用することができ、そのような方法が、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）において；ならびに第１２章及び第１３章，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ＮＣ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１－１４において記載されており、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増加され得る（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ＣＲ ＆ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ ＣＣＧ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。ベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルにおける増加によって、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域は目的の遺伝子と関連付けられるため、タンパク質の産生がまた、増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ＧＦ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２５７－６６、それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。
宿主細胞は、本明細書中に記載される二つ又はそれ以上の発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクター、及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクターでトランスフェクトすることができる。二つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含み得る。宿主細胞は、異なる量の二つ又はそれ以上の発現ベクターで共トランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞は、第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターの以下の比率のいずれか一つでトランスフェクトされ得る：約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、又は１：５０。
あるいは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、それらを発現することができる単一ベクターを使用することができる。そのような状況では、軽鎖は、過剰の毒性のない遊離重鎖を避けるために重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ＮＪ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５６２－５６５、及びＫｏｈｌｅｒ Ｇ（１９８０）ＰＮＡＳ ７７：２１９７－２１９９、それらの各々は、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。重鎖及び軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含み得る。発現ベクターは、モノシストロニック又はマルチシストロニックであり得る。マルチシストロニック核酸構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれ以上の遺伝子／ヌクレオチド配列、又は２～５、５～１０、もしくは１０～２０の範囲の遺伝子／ヌクレオチド配列をコードし得る。例えば、バイシストロニック核酸構築物は、以下の順序で、プロモーター、第一の遺伝子（例、本明細書中に記載される抗体の重鎖）、及び第二の遺伝子（例、本明細書中に記載される抗体の軽鎖）を含み得る。そのような発現ベクターでは、両方の遺伝子の転写は、プロモーターにより駆動され得るが、第一の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性スキャニング機構により行うことができ、第二の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、例えば、ＩＲＥＳによるキャップ非依存性機構により行うことができる。
一度、本明細書中に記載される多特異性分子、その抗原結合領域、又は抗体分子が、組換え発現により産生されると、それは、免疫グロブリン分子の精製について当技術分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例、イオン交換、親和性、具体的には、プロテインＡ後の特異的な抗原についての親和性、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーにより）、遠心分離、示差溶解度により、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製され得る。さらに、本明細書中に記載される多特異性分子及び抗体を、本明細書中に記載される、又はそうでなければ当技術分野において公知の異種ポリペプチド配列に融合して、精製を促進させることができる。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗体は、単離又は精製される。特定の実施形態では、単離抗体は、単離抗体とは異なる抗原特異性を伴う他の抗体を実質的に含まないものである。例えば、特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体の調製物は、細胞材料及び／又は化学前駆体を実質的に含まない。専門用語「細胞材料を実質的に含まない」は、抗体が、それが単離されるか、又は組換え産生される細胞の細胞成分から分離される、抗体の調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まない抗体は、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％（乾燥重量で）未満の、異種性タンパク質（本明細書において「混在タンパク質」としても称される）を有する抗体、及び／又は抗体のバリアント、例えば、抗体の異なる翻訳後修飾形態もしくは抗体の他の異なるバージョン（例、抗体断片）の調製物を含む。抗体が組換え産生されるとき、それはまた、一般的に、培養培地を実質的に含まず、即ち、培養培地は、タンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、又は０．１％未満を表す。抗体が化学合成により産生されるとき、それは、一般的に、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まず、即ち、それは、タンパク質の合成に関与する化学前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、抗体のそのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量で）未満の、目的の抗体以外の化学前駆体又は化合物を有する。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、単離されるか、又は精製される。
抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体又はその断片は、タンパク質又は抗体の合成について当技術分野において公知の任意の方法により、例えば、化学合成により、又は組換え発現技術により産生され得る。本明細書中に記載される方法は、別段に示されない限り、分子生物学、マイクロ生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当該技術の内にある関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、例えば、本明細書において引用される参考文献中で記載され、文献中で十分に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと、それらの全てが、参照により、それらの全体において本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は本明細書中に記載される抗体は、例えば、ＤＮＡ配列の合成、遺伝子操作を介した作製を含む任意の手段により調製され、発現され、作製され、又は単離される。特定の実施形態では、そのような多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗体は、インビボで動物又は哺乳動物（例、ヒト）の抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在しない配列（例、ＤＮＡ配列又はアミノ酸配列）を含む。
一態様では、本明細書中に提供されるのは、本明細書中に記載される細胞又は宿主細胞を培養することを含む、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合領域、又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体を作製する方法である。一実施形態では、方法は、インビトロで実施される。特定の態様では、本明細書中で提供されるのは、抗ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）及び／又は抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）多特異性分子、又はその抗原結合領域、あるいは多特異性分子又はその抗原結合領域を発現する（例、組換え発現する）ことを含む抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体、あるいは本明細書中に記載される細胞又は宿主細胞（例、本明細書中に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞又は宿主細胞）を使用する抗体を作製する方法である。特定の実施形態では、細胞は、単離細胞である。特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞中に導入されている。特定の実施形態では、方法は、細胞又は宿主細胞から得られた多特異性分子、又はその抗原結合領域、又はその抗体を精製する工程をさらに含む。
特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが発現され、多特異性分子が産生される適切な条件下で、細胞において発現させることにより産生される。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが発現され、多特異性分子が産生される適切な条件下で、細胞において発現させることにより産生される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが発現され、多特異性分子が産生される適切な条件下で、細胞において発現させることにより産生される。特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域の軽鎖をコードする第四のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが発現され、多特異性分子が産生される適切な条件下で細胞において発現させることにより産生される。
特定の実施形態では、多特異性分子は、多特異性分子が産生されるような条件下で、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域及び第二の抗原結合領域を接触させることにより産生される。例えば 特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチドを第一の細胞において、第一の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを第二の細胞において、第二の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに多特異性分子が産生されるように、第一及び第二の抗原結合領域を適切な条件下で接触させることにより産生される。別の方法として、特定の実施形態では、多特異性分子は、本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを第一の細胞において、第一の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される多特異性分子の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを第二の細胞において、第二の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに多特異性分子が産生されるように、適切な条件下で第一及び第二の抗原結合領域を接触させることにより産生される。第一及び第二の抗原結合領域を接触させて多特異性分子を生成するための適切な方法論及び条件は、限定されないが、ＷＯ ２０１１／１３１７４６、ＷＯ ２０１１／１４７９８６、ＷＯ ２００８／１１９３５３、及びＷＯ ２０１３／０６０８６７において、ならびにＬａｂｒｉｊｎ ＡＦ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＰＮＡＳ １１０（１３）：５１４５－５１５０において記載されている方法論及び条件を含み、それらの各々が、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、単離抗体は、ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように、適切な条件下で、本明細書中に記載される抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを細胞中で発現させることにより産生される。別の実施形態では、単離抗体は、ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように、適切な条件下で、本明細書中に記載される抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを細胞中で発現させることにより産生される。特定の実施形態では、単離抗体は、ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように、適切な条件下で、本明細書中に記載される抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを細胞中で発現させることにより産生される。特定の実施形態では、単離抗体は、ポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように、適切な条件下で、本明細書中に記載される抗体の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、及び本明細書中に記載される抗体の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを細胞中で発現させることにより産生される。
ポリクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野において公知である（例、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第１１章を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる）。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む当該技術分野で既知の多種多様な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３ ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）において教示されるものを含む、ハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、それらの各々が、その全体において参照により本明細書中に組み入れられる。本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書に記載される抗体又はその断片、例えば、かかる抗体の軽鎖及び／又は重鎖を外因的に発現する宿主細胞から組換えで産生され得る。
特定の実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、単一の細胞（例、組換え抗体を産生するハイブリドーマ又は宿主細胞）によって産生される抗体であり、抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、又は当該技術分野もしくは本明細書に提供される実施例で既知の他の抗原結合もしくは競合結合アッセイによって決定された場合、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）に特異的に結合する。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であり得る。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、一価抗体又は多価（例、二価）抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、単一特異性抗体又は多特異性抗体（例、二特異性抗体）であり得る。本明細書中に記載されるモノクローナル抗体は、例えば、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５において記載されるハイブリドーマ方法により作製され得る、又は例えば、本明細書中に記載される技術を使用して、例えば、ファージライブラリーから単離され得る。クローン細胞株の及びそれにより発現されるモノクローナル抗体の他の調製のための他の方法は、当技術分野において周知である（例、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，（上記）の第１１章を参照のこと）。
本明細書中で使用されるように、抗体は、抗体が、少なくとも二つ（例、二つ又はそれ以上）の一価結合領域を含む場合、多価（例、二価）で抗原に結合し、各一価結合領域は、抗原上のエピトープに結合することが可能である。各一価結合領域は、抗原上の同じ又は異なるエピトープに結合し得る。
ハイブリドーマ技術を使用して特異性抗体を産生及びスクリーニングする方法は、当技術分野で習慣的であり周知である。例えば、ハイブリドーマ方法では、マウス又は他の適した宿主動物、例えばヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、又はマカクサルなどが免疫化されて、免疫化のために使用されるタンパク質（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６））に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することが可能であるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化されてもよい。リンパ球は次に、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールなどを使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ ＪＷ（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６、その全体において参照により本明細書中に組み入れられる）。さらに、ＲＩＭＭＳ（反復免疫多重部位）技術を使用して、動物を免疫化することができる（その全体が参照により本明細書中に組み入れられる、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ＫＥ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３８１－９）。
特定の実施形態では、マウス（又はラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、もしくはイヌなどの他の動物）は、抗原（例、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６））で免疫化することができ、免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中に検出され、マウス脾臓が採取され、脾臓細胞が単離される。脾臓細胞は次に、周知の技術により、任意の好適な骨髄腫細胞、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞に融合され、ハイブリドーマを形成する。ハイブリドーマは、限定された希釈によって選択及びクローニングされる。特定の実施形態では、免疫化マウスのリンパ節が採取され、ＮＳ０骨髄腫細胞と融合される。
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一つ又は複数の物質を好ましくは含む、適切な培養培地中に播種され、増殖される。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
特定の実施形態は、効率的に融合し、かつ選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生をサポートし、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性である、骨髄腫細胞を用いる。これらの骨髄腫細胞株は、ＮＳ０細胞株、又はＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手可能なＳＰ－２又はＸ６３－Ａｇ８．６５３細胞から由来するものなどのマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されており（Ｋｏｚｂｏｒ Ｄ（１９８４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３００１－５；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、それら各々が、参照により、その全体において本明細書中に組み入れられる）。
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に対して指向されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、当該技術分野で既知の方法、例えば、免疫沈降によって、又は放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって決定される。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ ＪＷ（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（上記））により成長され得る。この目的のための適切な培養培地には、例えば、Ｄ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ １６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで成長され得る。
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、タンパク質Ａ－セファロース、ヒドロキシラパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどにより、培養培地、腹水液、又は血清から適切に分離される。
本明細書中に記載される抗体は、例えば、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）を認識し、当業者に公知の任意の技術により生成され得る抗体断片を含む。例えば、本明細書中に記載されるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などの酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断により産生され得る。Ｆａｂ断片は、抗体分子の二つの同一のアームの一つに対応し、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対合した完全な軽鎖を含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合により連結された抗体分子の二つの抗原結合アームを含む。
さらに、本明細書中に記載される抗体はまた、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ方法を使用して生成され得る。ファージディスプレイ方法において、機能性抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（例、冒された組織のヒト又はマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーと一緒に組換えられ、ファージミドベクター中にクローニングされる。ベクターは、大腸菌中にエレクトロポレーションされ、大腸菌は、ヘルパーファージで感染される。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄ及びＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨ及びＶＬドメインは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合される。特定の抗原に結合する抗原結合領域を発現するファージは、例えば、標識抗原、あるいは固体表面もしくはビーズに結合又は捕捉された抗原を使用して、抗原で選択又は同定され得る。本明細書中に記載される抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ方法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；Ａｍｅｓ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：９５２－９５８；Ｐｅｒｓｉｃ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ ＆ Ｂａｒｂａｓ ＣＦ（１９９４）Ａｄｖａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５７：１９１－２８０；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４；国際公開ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ ９１／１０７３７、ＷＯ ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、及びＷＯ９７／１３８４４；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、及び第５，９６９，１０８号において開示されるものを含み、それらの全てが、参照により、それらの全てにおいて本明細書中に組み入れられる。
上記参考文献において記載されるとおり、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域が単離され、それを使用して、ヒト抗体を含む全抗体、又は任意の他の所望の抗原結合断片を生成し、例えば、以下に記載されるとおり、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片などを組み換え的に産生する技術がまた、当技術分野において公知の方法、例えばＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４－９、Ｓａｗａｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：２６－３４、及びＢｅｔｔｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３において開示されるものなどを使用して用いられることができ、それらの全てが、参照により、それらの全体において本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、全抗体を生成するために、ＶＨ又はＶＬヌクレオチド配列、制限酵素部位、及び制限酵素部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、テンプレート、例えば、ｓｃＦｖクローンからＶＨ又はＶＬ配列を増幅することができる。当業者に公知のクローニング技術を使用して、ＰＣＲにより増幅されたＶＨドメインは、ＶＨ定常領域を発現するベクター中にクローニングされ得る、ＰＣＲにより増幅されたＶＬドメインは、ＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパ又はラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングされ得る。ＶＨ及びＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する一つのベクターにクローニングされ得る。次に、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを、細胞株に共トランスフェクトして、当業者に公知の技術を使用して、完全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定した又は一過性細胞株を生成する。
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子から由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合されたマウス又はラットモノクローナル抗体の可変領域を含み得る。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－７；Ｏｉ ＶＴ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、及び第６，３３１，４１５号を参照のこと。それらの全てが、参照により、それらの全体において本明細書中に組み入れられる。
ヒト化抗体は、予め決定された抗原と結合することができ、それは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域、及び非ヒト免疫グロブリン（例、マウス免疫グロブリン）のアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものを含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４領域を含み得る。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体は、限定されないが、ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７；及び米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は再表面処理（欧州特許 ＥＰ ５９２１０６及びＥＰ ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｎｉｃｋａ ＧＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４；及びＲｏｇｕｓｋａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３）、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開ＷＯ９３／１７１０５；Ｔａｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：１１１９－２５；Ｃａｌｄａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０；Ｍｏｒｅａ Ｖ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７－７９；Ｂａｃａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２（１６）：１０６７８－８４；Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９（１０）：８９５ ９０４；Ｃｏｕｔｏ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ；Ｃｏｕｔｏ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（８）：１７１７－２２；Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ（１９９４）Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０；及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３５（３）：９５９－７３を含む、当技術分野において公知の多様な技術を使用して産生することができ、それらの全てが、参照により、それらの全体において本明細書中に組み入れられる。また、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４Ａ１号（２００５年２月２４日）を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
多特異性分子及び多特異性抗体（例、二特異性抗体）を作製するための方法が記載されており、例えば、米国特許第７，９５１，９１７号、第７，１８３，０７６号、第８，２２７，５７７号、第５，８３７，２４２号、第５，９８９，８３０号、第５，８６９，６２０号、第６，１３２，９９２号、及び第８，５８６，７１３号を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
多特異性二価抗体、及びそれらを作製する方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号、ならびに米国出願公開公開第２００３／０２０７３４号及び第２００２／０１５５５３７号において記載されている；それらの各々が、その全体において、参照により組み入れられる。二特異性四価抗体、及びそれらを作製する方法は、例えば、国際出願公開ＷＯ０２／０９６９４８及びＷＯ００／４４７８８において記載されており、それらの両方の開示が、その全体において参照により本明細書中に組み入れられる。一般的に、国際出願公開ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、及びＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号；及び第５，６０１，８１９号；ならびにＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３（１９９２）を参照のこと；それらの各々が、その全体において参照により本明細書中に組み入れられる。
本明細書中に記載される多特異性分子又は二特異性抗体は、例えば、国際公開ＷＯ２０１１／１３１７４６、ＷＯ２０１１／１４７９８６、ＷＯ２００８／１１９３５３、及びＷＯ２０１３／０６０８６７において、ならびにＬａｂｒｉｊｎ ＡＦ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＰＮＡＳ １１０（１３）：５１４５－５１５０において記載されているように、ＤｕｏＢｏｄｙ技術プラットフォーム（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）に従って生成することができる。ＤｕｏＢｏｄｙ技術を使用して、二つの重鎖及び二つの軽鎖を含む、第一の単一特異性抗体、又は第一の抗原結合領域の一つ半分を、二つの重及び二つの軽鎖を含む、第二の単一特異性抗体、又は第二の抗原結合領域の一つの半分と組み合わせることができる。結果として得られたヘテロ二量体は、第二の抗体、又は第二の抗原結合領域からの一つの重鎖及び一つの軽鎖と対形成された、第一の抗体、又は第一の抗原結合領域からの一つの重鎖及び一つの軽鎖を含む。単一特異性抗体、又は抗原結合領域の両方が、異なる抗原上の異なるエピトープを認識する場合、結果としてのヘテロ二量体は多特異性分子又は二特異性抗体である。
ＤｕｏＢｏｄｙ技術は、単一特異性抗体、又は抗原結合領域の各々が、ＣＨ３ドメインにおける単一点変異を伴う重鎖定常領域を含むことを要求する。点変異によって、単一特異性抗体、又は抗原結合領域のいずれかにおけるＣＨ３ドメイン間よりも、結果として得られた二特異性抗体におけるＣＨ３ドメイン間でのより強い相互作用が可能になる。各単一特異性抗体、又は抗原結合領域における単一点変異が、例えば、国際公開第２０１１／１３１７４６号において記載されるとおり、重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、残基３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、又は４０９にある。さらに、単一の点変異は、一つの単一特異性抗体、又は抗原結合領域中で、他の単一特異性抗体、又は抗原結合領域と比較して、異なる残基に位置する。例えば、一つの単一特異性抗体、又は抗原結合領域は、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられた、変異Ｆ４０５Ｌ（即ち、残基４０５でのフェニルアラニンからロイシンへの変異）を含み得る一方で、他の単一特異性抗体、又は抗原結合領域は、変異Ｋ４０９Ｒ（即ち、残基４０９でのリジンからアルギニンへの変異）を含み得る。単一特異性抗体の重鎖定常領域、又は抗原結合領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプ（例、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）であり得るが、二特異性抗体、又は多特異性分子は、ＤｕｏＢｏｄｙ技術により産生され、Ｆｃ媒介性エフェクター機能を保持し得る。
多特異性分子又は二特異性抗体を生成するための別の方法は、「ノブイントゥホール」戦略（例、国際公開ＷＯ２００６／０２８９３６を参照のこと）と呼ばれている。Ｉｇ重鎖の誤対合は、ＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸を変異誘発することにより、この技術において低下される。二つの重鎖が直接相互作用するＣＨ３ドメイン内の位置において、短い側鎖（ホール）を有するアミノ酸が、一方の重鎖の配列に導入され、長い側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が、他の重鎖上の残基位置と相互作用する対応物に導入される。一部の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＨ３ドメインが、二特異性抗体を優先的に形成するように、二つのポリペプチド間の界面にて相互作用する、選択されたアミノ酸を変異誘発することにより修飾された免疫グロブリン鎖を有する。二特異性抗体、又は多特異性分子は、同じサブクラス（例、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３）又は異なるサブクラス（例、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ３及びＩｇＧ４）の免疫グロブリン鎖で構成され得る。
ＣＤ９６及び／又はＴＩＧＩＴに結合する多特異性分子は、一部の場合では、ＩｇＧ４及びＩｇＧ１、ＩｇＧ４及びＩｇＧ２、ＩｇＧ４及びＩｇＧ２、ＩｇＧ４及びＩｇＧ３、又はＩｇＧ１及びＩｇＧ３鎖ヘテロ二量体を含み得る。そのようなヘテロ二量体重鎖抗体は、例えば、ヘテロ二量体重鎖形成を支持するように、ヒトＩｇＧ４及びＩｇＧ１又はＩｇＧ３におけるＣＨ３ドメインの界面を形成する、選択されたアミノ酸を修飾することにより、ルーチン的に操作することができる。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、本明細書中に記載される抗ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗体と同じＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）のエピトープに結合し、ヒト抗体である。特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）への結合から、本明細書中に記載される抗体のいずれか一つを（例、用量依存的な様式において）競合的に遮断し、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して産生され得る。例えば、機能的内因性免疫グロブリンを発現する能力はないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得る遺伝子導入マウスが使用され得る。特に、ヒト重及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、無作為に、又はマウス胚性幹細胞への相同組換えにより、導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入され得る。マウス重及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と非機能的に別々に又は同時に与えられ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合欠失は、内因性抗体産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を拡大し、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスが産生される。キメラマウスを次に、繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫が産生される。遺伝子導入マウスは、通常の様式において、選択された抗原、例えば、抗原（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ））の全て又は一部で免疫化される。抗原に対して指向されたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化された遺伝子導入マウスから得ることができる。遺伝子導入マウスが宿すヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再構成し、クラススイッチ及び体細胞変異を実質的に経験する。このように、そのような技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するこの技術の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ＆Ｈｕｓｚａｒ Ｄ（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５－９３を参照のこと。それは、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、国際公開ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９６／３４０９６、及びＷＯ ９６／３３７３５、ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、及び第５，９３９，５９８号を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。ヒト抗体を産生することが可能なマウスの例は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ Ｐｈａｒｍ、米国特許第５，５４５，８０６号及び第５，５６９，８２５号）、Ｔｒａｎｓ－Ｃｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｉｒｉｎ）、及びＫＭ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）を含み、それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）に特異的に結合するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から由来する抗体ライブラリーを使用する、上に記載されるファージディスプレイ方法を含む、当技術分野において公知の様々な方法により作製することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、及び第５，８８５，７９３号、ならびに国際公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、及びＷＯ９１／１０７４１を参照のこと。それらの全てが、それらの全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
特定の実施形態では、ヒト抗体は、マウス－ヒトハイブリドーマを使用して産生することができる。例えば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたヒト末梢血リンパ球を、マウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス－ヒトハイブリドーマを産生することができ、これらのマウス－ヒトハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原（例、ＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ））に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを決定することができる。そのような方法は、当技術分野において公知であり、記載されており、例えば、Ｓｈｉｎｍｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４６：１９－２３；Ｎａｇａｎａｗａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １４：２７－３１を参照のこと。それら各々が、その全体において、参照により本明細書中に組み入れられる。
７．６ キット
また、本明細書中で提供されるのは、本明細書中に記載される一つ又は複数の多特異性分子又は抗体、あるいはその医薬組成物又はコンジュゲートを含むキットである。特定の実施形態では、本明細書中に提供されるのは、本明細書中に記載される医薬組成物の成分の一つ又は複数、例えば、本明細書中に提供される一つ又は複数の多特異性分子又は抗体などを充填した一つ又は複数の容器を含む医薬パック又はキットである。特定の実施形態では、キットは、本明細書中に記載される医薬組成物、及び本明細書中に記載されるものなどの任意の予防又は治療剤を含む。特定の実施形態では、キットは、例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及び／もしくはホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）などのＴ細胞マイトジェン、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体などのＴＣＲ複合体刺激抗体を含み得る。場合により、そのような容器に関連付けられるのは、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の機関による承認を反映する、医薬もしくは生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により規定された形態の通知であり得る。
また、本明細書中で提供されるのは、上記の方法において使用することができるキットである。特定の実施形態では、キットは、一つ又は複数の容器中に、本明細書中に記載される抗体、好ましくは、多特異性分子又は精製抗体を含む。特定の実施形態では、本明細書中に記載されるキットは、対照としての実質的に単離されたＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原を含む。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されるキットは、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原と反応しない対照抗体をさらに含む。別の特定の実施形態では、本明細書中に記載されるキットは、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原に対する多特異性分子又は抗体の結合を検出するための一つ又は複数のエレメントを含む（例、多特異性分子又は抗体は、検出可能な基質、例えば蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物などに結合することができる、あるいは、一次抗体を認識する二次抗体を、検出可能な基質に結合することができる）。特定の実施形態では、本明細書中に提供されるキットは、組換え産生された、又は化学的に合成されたＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴ又はカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原を含み得る。キット中で提供されるＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原はまた、固体支持体に付着され得る。より特定の実施形態では、上に記載されるキットの検出手段は、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原が付着される固体支持体を含む。そのようなキットはまた、非付着レポーター標識抗ヒト抗体又は抗マウス／ラット抗体を含み得る。この実施形態では、ＣＤ９６（例、ヒトＣＤ９６もしくはカニクイザルＣＤ９６）抗原及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）抗原への多特異性分子又は抗体の結合は、当該レポーター標識抗体の結合により検出され得る。特定の実施形態では、本発明は、生物学的サンプル中のＣＤ９６抗原（例、ヒトＣＤ９６又はカニクイザルＣＤ９６）及び／又はＴＩＧＩＴ（例、ヒトＴＩＧＩＴもしくはカニクイザルＴＩＧＩＴ）をインビトロアッセイ及び／又は検出するための本発明のキットの使用に関する。
８．実施例
この節（すなわち、節６）における実施例は、説明の目的であるが、制限の目的ではなく、提示される。
表５は、以下の実施例において使用される様々な多特異性分子及び単一特異性抗体の詳細を提供する。
８．１ 実施例１：抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の特徴付け
８．１．１ 精製ヒト及びカニクイザルＣＤ９６タンパク質に対して結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子
Ｃ８９Ｓ変異を伴うヒトＣＤ９６のＨｉｓタグ付きアイソフォーム２への結合
Ｃ８９Ｓ変異を含むＣＤ９６のヒトアイソフォーム２の完全長細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のバリアント（配列番号６３）に対する多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約２μｇ／ｍｌのＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。多特異性分子を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約３５０共鳴単位（ＲＵ）に達した。Ｃ８９Ｓ変異を伴うヒトＣＤ９６の完全長アイソフォーム２ＥＣＤ（配列番号６３）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈し、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表６中に示す。
カニクイザルＣＤ９６のＨｉｓタグ付きアイソフォーム２への結合
ＣＤ９６のカニクイザルアイソフォーム２の完全長ＥＣＤ（配列番号１１１）に対する多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約２μｇ／ｍｌのＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。多特異性分子を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約３５０共鳴単位（ＲＵ）に達した。カニクイザルＣＤ９６の完全長アイソフォーム２ＥＣＤ（配列番号１１１）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈し、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表７中に示す。
８．１．２ 精製ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子
Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴへの結合
ヒトＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１３）に対する多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約４μｇ／ｍｌのＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。多特異性分子を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約１０００共鳴単位（ＲＵ）に達した。ヒトＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１３）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈し、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ 、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表８中に示す。
Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＴＩＧＩＴへの結合
カニクイザルＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１４）に対する多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約４μｇ／ｍｌのＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。多特異性分子を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約３５０共鳴単位（ＲＵ）に達した。カニクイザルＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１４）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈し、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ 、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表９中に示す。
８．２ 実施例２：精製ヒト及びカニクイザルＣＤ９６タンパク質に結合する抗ＣＤ９６抗体。
Ｃ８９Ｓ変異を伴うヒトＣＤ９６のＨｉｓタグ付きアイソフォーム２への結合
Ｃ８９Ｓ変異を伴うＣＤ９６のヒトアイソフォーム２の完全長ＥＣＤ（配列番号６３）に対する単一特異性抗体ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約１μｇ／ｍｌのＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。抗体を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約１７５共鳴単位（ＲＵ）に達した。Ｃ８９Ｓ変異を伴うヒトＣＥＤ９６の完全長アイソフォーム２ＥＣＤ（配列番号６３）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈し、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表１０中に示す。
カニクイザルＣＤ９６のＨｉｓタグ付きアイソフォーム２への結合
ＣＤ９６のカニクイザルアイソフォーム２の完全長ＥＣＤ（配列番号１１１）に対する単一特異性抗体ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約１μｇ／ｍｌのＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。抗体を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約１７５共鳴単位（ＲＵ）に達した。カニクイザルＣＤ９６の完全長アイソフォーム２ＥＣＤ（配列番号１１１）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈し、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ 、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表１１中に示す。
８．３ 実施例３：精製ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体
Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴへの結合
ヒトＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１３）に対する単一特異性抗体ＢＡ１４８の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約２μｇ／ｍｌのＢＡ１４８を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。抗体を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約５００共鳴単位（ＲＵ）に達した。ヒトＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１３）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈し、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表１２中に示す。
Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＴＩＧＩＴへの結合
カニクイザルＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１４）に対する単一特異性抗体ＢＡ１４８の結合親和性を、表面プラズモン共鳴により評価した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いた１：１の結合モデルを使用して各実験から算出した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約４μｇ／ｍｌのＢＡ１４８を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。抗体を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約５００共鳴単位（ＲＵ）に達した。カニクイザルＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１４）を０、０．４１、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭの濃度に希釈、３分間の会合相及び１０分間の解離相を伴って、流速３０μｌ／分でチップ表面上に流した。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを評価し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０ソフトウェアのグローバルデータ解析オプションを使用して、単純なＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用モデルに適合させた。データ品質は、偏差及び曲線適合を視覚的に検査することにより、ならびにＲｍａｘ、Ｃｈｉ２、及びＴｃのパラメータを評価することにより検証した。結合動態（ｋａ、ｋｄ、及びＫＤ）をセンサーグラム分析から決定し、表１３中に示す。
８．４ 実施例４：抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子への精製ヒトＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６タンパク質の同時二重結合。
表面プラズモン共鳴結合アッセイ
ヒトＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１３）及びＣ８９Ｓ変異を伴うＣＤ９６のヒトアイソフォーム２の完全長ＥＣＤ（配列番号６３）に同時に結合する多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７の能力を、表面プラズモン共鳴を使用して確認した。
簡単には、表面プラズモン共鳴実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して実施し、センサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して視覚的に検査した。
泳動緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中で希釈された約４μｇ／ｍｌのＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７を、基準として単一フローセルを保持するＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ、カタログ番号２９－１２７５－５６）の個々のフローセル上に捕捉させた。多特異性分子を、１０μｌ／分の流量で３０秒間の注入を使用して捕捉し、約１０００共鳴単位（ＲＵ）に達した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００の二重注入プロトコルを次に、異なるＴＩＧＩＴ及び／又はＣＤ９６サンプルの二つの別々の注射のために使用し、一つは他の直後であった。一回目の注入は、３分間の会合相についての１００ｎＭのヒトＴＩＧＩＴ（配列番号１１３）の完全長ＥＣＤを用いており、その直後に、緩衝液、１００ｎＭのヒトＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１３）、１００ｎＭのヒトＴＩＧＩＴの完全長ＥＣＤ（配列番号１１３）及び１００ｎＭのＣ８９Ｓ変異を伴うＣＤ９６のヒトアイソフォーム２の完全長ＥＣＤ（配列番号６３）の混合物、又は１００ｎＭのＣ８９Ｓ変異を伴うＣＤ９６のヒトアイソフォーム２の完全長ＥＣＤ（配列番号６３）のいずれかの二回目の３分間の注入が続いた。二回目の注入には、１０分間の解離相が続いた。センサーチップを、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの二回の３０秒間注入を伴うサイクル間で再生成した。センサーグラムを、ＢＩＡＮＢＣ ３．０ソフトウェアを使用して評価した。
図１Ａ－１Ｃ中に示されるように、ＢＡ１２３（図１Ａ）、ＢＡ１２５（図１Ｂ）、及びＢＡ１２７（図１Ｃ）は、ＴＩＧＩＴ結合多特異性分子が、その後にその上に流れたＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６の混合物を有する場合に生じるシグナル（ＲＵ）における増加により実証されるように、ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６タンパク質に同時に結合することができ、多特異性分子の他の抗原結合領域へのＣＤ９６の結合を示している。
細胞結合アッセイ
この実施例では、対照多特異性分子ＢＡ１２８、ＢＡ１３１、及びＢＡ１３３と比較した、ヒトＴＩＧＩＴ又はヒトＣＤ９６を発現するように操作されたＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７の同時結合。
ヒトＴＩＧＩＴ又はヒトＣＤ９６を発現するＣＨＯ細胞株を、振盪フラスコ中の１μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で３７℃で培養した。抗体結合アッセイについては、ヒトＴＩＧＩＴ細胞又はＣＤ９６－ＣＨＯ細胞をインキュベーターから取り出し、細胞培養物を含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清を伴う冷ＰＢＳサプリメント）中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中の１ウェル当たり１×１０５個細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレート中に播種した。
抗体を別々のマイクロプレート中で調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対３に連続希釈した。ＣＨＯ－ヒトＴＩＧＩＴへの結合については９０μｇ／ｍＬ～０．０００５μｇ／ｍＬ又はＣＨＯ－ヒトＣＤ９６への結合については３０μｇ／ｍＬ～０．０００２μｇ／ｍＬの範囲の合計１２個の作業希釈物を調製した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を５０μｌの抗体混合物中に再懸濁した。細胞を４℃で４５分間にわたりインキュベートした。４５分後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２×洗浄し、上清を廃棄した。
図２Ａ及び図２Ｂ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７は、対照多特異性分子ＢＡ１２８、ＢＡ１３１、及びＢＡ１３３と比較して、ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６への同時結合が可能であった。細胞発現ヒトＴＩＧＩＴ及び可溶性Ｈｉｓタグ付きヒトＣＤ９６（図２Ａ）又は細胞発現ヒトＣＤ９６及び可溶性Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＧＩＴ（図２Ｂ）の二重結合を、蛍光色素コンジュゲート（Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ４８８）抗Ｈｉｓ抗体を使用したフローサイトメトリーにより検出した。
８．５ 実施例５：抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子のリードパネルの特徴付け。
８．５．１ 抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、ヒト及びカニクイザルＣＤ９６を発現する細胞に結合する
この実施例では、様々な細胞型の表面上での野生型ヒトＣＤ９６又は野生型カニクイザルＣＤ９６に結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＣＤ９６発現ＣＨＯ細胞への結合
ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトＣＤ９６に結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を評価した。簡単には、ＣＨＯ細胞に、野生型完全長ヒトＣＤ９６（ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ）アイソフォーム１又はアイソフォーム２をコードするベクターをトランスフェクトし、野生型ＣＤ９６アイソフォーム１又はアイソフォーム２を安定的に発現するクローンを選択した。安定な細胞株を、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬの１×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。
抗体結合アッセイについて、ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞（アイソフォーム１又はアイソフォーム２）の凍結アリコートを、３７℃で解凍し、次に、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加したＤＰＢＳを含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中１ウェル当たり２×１０５細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。別々のマイクロプレート中で、各抗体の２×濃縮中間ストックを調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対３に連続希釈した。６０μｇ／ｍＬ～０．００１μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。５０マイクロリットルの各希釈物を次に、ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞を含むマイクロプレートに移した。細胞を次に、４℃で４５分間にわたりインキュベートした。抗体染色のために、細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、Ｆｃγ断片特異的である、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に、１：８００の最終希釈で再懸濁した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａを連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。ソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式を使用して、曲線適合により、５０％の最大結合をもたらす多特異性分子の濃度（有効濃度５０、［ＥＣ５０］）を決定した。
図３Ａ－３Ｉ（アイソフォーム２）及び図４Ａ－４Ｉ（アイソフォーム１）中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、ＢＡ１３１、ＢＡ１３４、及びＢＡ１３６は、用量依存的な様式においてヒトＣＤ９６発現ＣＨＯ細胞に結合した。平均ＥＣ５０値を各抗体について算出し、表１４及び１６（それぞれアイソフォーム２及びアイソフォーム１について）中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表１５及び１７（それぞれアイソフォーム２及びアイソフォーム１について）中に報告している。
カニクイザルCD96発現CHO細胞への結合
同様の実験では、細胞表面上に野生型カニクイザルＣＤ９６（アイソフォーム２）を発現するように操作されたＣＨＯ細胞（カニクイザルＣＤ９６－ＣＨＯ細胞）に結合する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力をテストした。簡単には、ＣＨＯ細胞を、野生型完全長カニクイザルＣＤ９６アイソフォーム２をコードするベクターでトランスフェクトし、ＣＤ９６を安定的に発現するクローンを選択した。この安定的な細胞株を、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ １×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。カニクイザルＣＤ９６－ＣＨＯに結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、上のヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞について記載されるように決定した。
図５Ａ－５Ｉ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３１、ＢＡ１３４、及びＢＡ１３６は、用量依存的な様式においてカニクイザルＣＤ９６を発現するＣＨＯ細胞に結合した。カニクイザルＣＤ９６－ＣＨＯ細胞への、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の結合についてのＥＣ５０値を、各抗体について算出し、表１８中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、表１９中に報告している。
８．５．２ 抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、ヒトＣＤ９６へのリガンド結合を遮断する
野生型ヒトＣＤ９６（アイソフォーム２）又は野生型カニクイザルＣＤ９６（アイソフォーム２）とそのリガンドＣＤ１５５の間の結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞の遮断
抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子を、ＣＨＯ細胞上で過剰発現された野生型ヒトＣＤ９６（アイソフォーム２）と可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合をインビトロで遮断するそれらの能力について、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
簡単には、Ｒ－フィコエリスリンにコンジュゲートされた２μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ）を含む溶液を、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。５０マイクロリットルのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥのこの作業ストックを次に、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに加えた。各多特異性分子の４×濃縮中間ストックをマイクロプレート中で調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対３に連続希釈した。１２０μｇ／ｍＬ～０．００２μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。各希釈物の２５マイクロリットルを、ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥを含むマイクロプレートに移した。最後に、２５μＬの野生型ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞（アイソフォーム ２）が、上に記載されるように調製され、各ウェルに加えられた。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ上で連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、上に記載されるように分析した。各抗体濃度について、実験データを、方程式１に従った、多特異性分子の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされたヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞について得られたＭＦＩ値及びヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞の自己蛍光（バックグラウンド）についてのＭＦＩ値を使用して標準化した。
方程式１
最大シグナル％＝
（ＭＦＩ「多特異性分子」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）／（ＭＦＩ「合計」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）
（式中、
「多特異性分子」は、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、ＢＡ１３１、ＢＡ１３３、ＢＡ１３４、又はＢＡ１３６である。
「バックグラウンド」は、細胞単独（抗体又はＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥなし）である。
「合計」は、抗体の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされた細胞である。
ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合の５０％（ＩＣ５０）を阻害する多特異性分子の濃度を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図６Ａ－６Ｉ中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、ＢＡ１３１、ＢＡ１３４、及びＢＡ１３６は、ＣＤ１５５へのヒトＣＤ９６結合を遮断した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表２０中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表２１中に報告している。
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するカニクイザルＣＤ９６ ＣＨＯ細胞の遮断
同様の実験では、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子を、上のヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞について記載されるように、フローサイトメトリーにより、ＣＨＯ細胞上に過剰発現された野生型カニクイザルＣＤ９６（アイソフォーム２）と可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合をインビトロで遮断するそれらの能力についてインビトロでテストした。
ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合の５０％を阻害する抗体の濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図７Ａ－７Ｉ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２９、ＢＡ１３１、ＢＡ１３４、及びＢＡ１３６は、野生型カニクイザルＣＤ９６とヒトＣＤ１５５の間での相互作用を部分的に遮断する。ＩＣ５０値は算出できなかった。なぜなら、多特異性分子が部分的遮断薬であるためである。曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、表２２中に報告されている。
８．５．３ 抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴを発現する細胞に結合する
様々な細胞型の表面上での野生型ヒトＴＩＧＩＴ又は野生型カニクイザルＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ細胞への結合
ＣＨＯ細胞の表面上に発現された野生型ヒトＴＩＧＩＴ又は野生型カニクイザルＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を評価した。簡単には、ＣＨＯ細胞を、野生型完全長ヒトＴＩＧＩＴ（ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ）をコードするベクターでトランスフェクトし、ＴＩＧＩＴを安定的に発現するクローンを選択した。安定な細胞株を、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬの１×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。
抗体結合アッセイについて、ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞の凍結アリコートを、３７℃で解凍し、次に、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加したＤＰＢＳを含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中１ウェル当たり２×１０５細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。別々のマイクロプレート中で、各抗体の２×濃縮中間ストックを調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。６０μｇ／ｍＬ～０．００００５７μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。５０マイクロリットルの各希釈物を次に、ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞を含むマイクロプレートに移した。細胞を次に４℃で４５分間にわたりインキュベートした。抗体染色のために、細胞を、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、Ｆｃγ断片特異的である、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に、１：８００の最終希釈で再懸濁した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａを連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。ソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式を使用して、曲線適合により、５０％の最大結合をもたらす多特異性分子の濃度（有効濃度５０、［ＥＣ５０］）を決定した。
図８Ａ－８Ｉ中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１３３、及びＢＡ１３６は、用量依存的な様式においてヒトＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ細胞に結合した。平均ＥＣ５０値を各多特異性分子について算出し、表２３中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表２４中に報告している。
カニクイザルＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ細胞への結合
同様の実験では、細胞表面上に野生型カニクイザルＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＣＨＯ細胞（カニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞）に結合する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力をテストした。簡単には、ＣＨＯ細胞に、野生型完全長カニクイザルＴＩＧＩＴをコードするベクターをトランスフェクトし、ＴＩＧＩＴを安定的に発現するクローンを選択した。この安定的な細胞株を、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ １×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。カニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯに結合する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、上のヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞について記載されるように決定した。
図９Ａ－９Ｉ中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１３３、及びＢＡ１３６は、用量依存的な様式においてカニクイザルＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ細胞に結合した。カニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞への抗体の結合についての平均ＥＣ５０値を、各抗体について算出し、表２５中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表２６中に報告している。
８．５．４ 抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、ＴＩＧＩＴへのリガンド結合を遮断する。
野生型ヒトＴＩＧＩＴ又は野生型カニクイザルＴＩＧＩＴとそのリガンドヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞の遮断
本実施例では、野生型ヒトＴＩＧＩＴとそのリガンドであるヒトＣＤ１５５（また、ＰＶＲとして言及される）の間での結合を遮断する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力をテストした。具体的には、抗体を、フローサイトメトリーにより、ＣＨＯ細胞上で過剰発現されたヒトＴＩＧＩＴと可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断するそれらの能力についてインビトロでテストした。
簡単には、Ｒ－フィコエリスリンにコンジュゲートされた２μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ）を含む溶液を、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。５０マイクロリットルのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥのこの作業ストックを次に、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに加えた。各多特異性分子の４×濃縮中間ストックをマイクロプレート中で調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対３に連続希釈した。１２０μｇ／ｍＬ～０．００２μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。各希釈物の２５マイクロリットルを、ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥを含むマイクロプレートに移した。最後に、２５μＬのヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞が、上に記載されるように調製され、各ウェルに加えられた。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ上で連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、上に記載されるように分析した。各抗体濃度について、実験データを、方程式２に従った、多特異性分子の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされたヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞について得られたＭＦＩ値及びヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞自家蛍光（バックグラウンド）についてのＭＦＩ値を使用して標準化した。
方程式２
最大シグナル％＝
（ＭＦＩ「多特異性分子」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）／（ＭＦＩ「合計」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）
（式中、
「多特異性分子」は、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、ＢＡ１３１、ＢＡ１３３、ＢＡ１３４、又はＢＡ１３６である。
「バックグラウンド」は、細胞単独（抗体又はＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥなし）である。
「合計」は、抗体の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされた細胞である。
ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合を５０％阻害する多特異性分子の濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図１０Ａ－１０Ｉ中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１３３、及びＢＡ１３６は、ＣＤ１５５へのヒトＴＩＧＩＴ結合を遮断した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表２７中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表２８中に報告している。
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するカニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞の遮断
同様の実験では、野生型カニクイザルＴＩＧＩＴとそのリガンドであるヒトＣＤ１５５（また、ＰＶＲとして言及される）の間での結合を遮断する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力をテストした。簡単には、抗体を、上のヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞について記載されるように、フローサイトメトリーにより、ＣＨＯ細胞上に過剰発現された野生型カニクイザルＴＩＧＩＴと可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断する能力についてインビトロでテストした。
ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合の５０％を阻害する抗体の濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図１１Ａ－１１Ｉ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１３３、及びＢＡ１３６は、カニクイザルＣＤ９６とＣＤ１５５の間での相互作用を遮断する。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表２９中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表３０中に報告している。
８．５．５ 抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６を共発現する細胞に結合する。
様々な細胞型の表面上でヒトＴＩＧＩＴ又はヒトＣＤ９６に結合する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６を共発現するＣＨＯ細胞への結合
ＣＨＯ細胞の表面上に共発現された野生型ヒトＴＩＧＩＴ及び野生型ヒトＣＤ９６に結合する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を評価した。簡単には、ＣＨＯ細胞を、野生型ヒトＴＩＧＩＴをコードするベクターでトランスフェクトし（ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ）、ＴＩＧＩＴを安定的に発現するクローンを選択した。これらの細胞を次に、野生型ヒトＣＤ９６（アイソフォーム２）をコードするベクターでトランスフェクトし、ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６の両方を発現する細胞株（ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＤ９６－ＣＨＯ）を産生した。これらの安定的な細胞株を、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ １×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。発現を、フローサイトメトリーにより確認した。細胞は高レベルＴＩＧＩＴ発現についてクローン性であったが、しかし、広範なＣＤ９６発現を有した。
抗体結合アッセイについて、ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＤ９６ ＣＨＯ細胞の凍結アリコートを、３７℃で解凍し、次に、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加したＤＰＢＳを含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中１ウェル当たり２×１０５細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。別々のマイクロプレート中で、各抗体の２×濃縮中間ストックを調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対３に連続希釈した。６０μｇ／ｍＬ～０．００１μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。５０μＬの各希釈物を次に、ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＤ９６－ＣＨＯ細胞を含むマイクロプレートに移した。細胞を次に４℃で４５分間にわたりインキュベートした。抗体染色のために、細胞を、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、Ｆｃγ断片特異的である、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に、１：８００の最終希釈で再懸濁した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａを連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。ソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式を使用して、曲線適合により、５０％の最大結合をもたらす多特異性分子の濃度（有効濃度５０、［ＥＣ５０］）を決定した。
図１２Ａ－１２Ｉ中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、ＢＡ１３１、ＢＡ１３３、ＢＡ１３４、及びＢＡ１３６は、用量依存的な様式においてＣＨＯ細胞を発現するヒトＴＩＧＩＴ－ＣＤ９６に結合した。平均ＥＣ５０値を各多特異性抗体について算出し、表３１中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表３２中に報告している。
８．５．６ 抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６を共発現する細胞へのリガンド結合を遮断する。
様々な細胞型の表面上でのヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６の結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６を発現するＣＨＯ細胞への可溶性ヒトＣＤ１５５結合の遮断
この実施例では、野生型ヒトＴＩＧＩＴ及び野生型ヒトＣＤ９６とそれらのリガンドヒトＣＤ１５５（また、ＰＶＲとして言及される）の間での結合を遮断する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力をテストした。具体的には、抗体を、フローサイトメトリーにより、ＣＨＯ細胞上に過剰発現されたヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＣＤ９６と可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断するそれらの能力についてインビトロでテストした。
簡単には、Ｒ－フィコエリスリンにコンジュゲートされた２μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ）を含む溶液を、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。５０マイクロリットルのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥのこの作業ストックを次に、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに加えた。各多特異性分子の４×濃縮中間ストックをマイクロプレート中で調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対３に連続希釈した。１２０μｇ／ｍＬ～０．００２μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。各希釈物の２５マイクロリットルを、ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥを含むマイクロプレートに移した。最後に、２５μＬのヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞が、上に記載されるように調製され、各ウェルに加えられた。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ上で連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、上に記載されるように分析した。各多特異性分子濃度について、実験データを、方程式３に従って、多特異性分子の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされたヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞について得られたＭＦＩ値及びヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞自家蛍光（バックグラウンド）についてのＭＦＩ値を使用して標準化した。
方程式３
最大シグナル％＝
（ＭＦＩ「多特異性分子」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）／（ＭＦＩ「合計」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）
（式中、
「多特異性分子」は、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、ＢＡ１３１、ＢＡ１３３、ＢＡ１３４、又はＢＡ１３６である。
「バックグラウンド」は、細胞単独（抗体又はＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥなし）である。
「合計」は、抗体の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされた細胞である。
ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＤ９６－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合を５０％阻害する多特異性分子の濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図１３Ａ－１３Ｉ中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１３３、及びＢＡ１３６は、ＣＤ１５５へのヒトＴＩＧＩＴ－ＣＤ９６結合を遮断した。ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、ＢＡ１３１、及びＢＡ１３４は、ＣＤ１５５に結合するヒトＴＩＧＩＴ－ＣＤ９６を部分的に遮断した。平均ＩＣ５０値を各多特異性分子について算出し、表３３中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表３４中に報告している。
８．６ 実施例６：抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現する細胞に結合する。
様々な細胞型の表面上でヒトＦｃγＲＩＩＩａのバリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆに結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞への結合
ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトＦｃγＲＩＩＩａのバリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆに結合する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を評価した。簡単には、ＣＨＯ細胞を、完全長ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－ＣＨＯ）バリアントＶ／Ｖ又はＦ／Ｆをコードするベクターでトランスフェクトし、ＦｃγＲＩＩＩａ（バリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆ）を安定的に発現するクローンを選択した。安定的な細胞株を、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ １００Ｕ／ｍＬ １×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。
抗体結合アッセイについて、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－ＣＨＯ（バリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆ）細胞の凍結アリコートを、３７℃で解凍し、次に、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加したＤＰＢＳを含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中１ウェル当たり２×１０５細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。別々のマイクロプレート中で、各多特異性分子の２×濃縮中間ストックを調製した。多特異性分子を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。６０μｇ／ｍＬ～０．００００５７μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。５０マイクロリットルの各希釈物を次に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－ＣＨＯ（バリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆ）細胞を含むマイクロプレートに移した。細胞を次に４℃で４５分間にわたりインキュベートした。抗体染色のために、細胞を、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、Ｆｃγ断片特異的である、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に、１：８００の最終希釈で再懸濁した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａを連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。ソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式を使用して、曲線適合により、５０％の最大結合をもたらす多特異性分子の濃度（有効濃度５０、［ＥＣ５０］）を決定した。
図１４Ａ－１４Ｆ（バリアントＶ／Ｖ）及び１５Ａ－１５Ｆ（バリアントＦ／Ｆ）中に示されるように、ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、ＢＡ１２７、ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、及びＢＡ１３１は、用量依存的な様式においてヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞に結合した。平均ＥＣ５０値を各多特異性分子について算出し、バリアントＶ／Ｖについて表３５中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表３６及び３７（それぞれバリアントＶ／Ｖ及びバリアントＦ／Ｆについて）中に報告している。
８．７ 実施例７：抗ＣＤ９６抗体の特徴付け
８．７．１ 抗ヒトＣＤ９６抗体は、ヒト及びカニクイザルＣＤ９６（アイソフォーム２）を発現する細胞に結合する
様々な細胞型の表面上での野生型ヒトＣＤ９６又は野生型カニクイザルＣＤ９６に結合する抗ＣＤ９６抗体の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＣＤ９６発現ＣＨＯ細胞への結合
ＣＨＯ細胞の表面上に発現された野生型ヒトＣＤ９６に結合する抗ＣＤ９６抗体の能力を評価した。簡単には、ＣＨＯ細胞を、ヒトＣＤ９６（ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ）アイソフォーム２をコードするベクターでトランスフェクトし、ＣＤ９６アイソフォーム２を安定的に発現するクローンを選択した。安定な細胞株を、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬの１×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。
抗体結合アッセイについて、ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞（アイソフォーム２）の凍結アリコートを、３７℃で解凍し、次に、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加したＤＰＢＳを含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中１ウェル当たり２×１０５細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。別々のマイクロプレート中で、各抗体の２×濃縮中間ストックを調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。６０μｇ／ｍＬ～０．００００５７μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。５０マイクロリットルの各希釈物を次に、ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞を含むマイクロプレートに移した。細胞を次に４℃で４５分間にわたりインキュベートした。抗体染色のために、細胞を、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、Ｆｃγ断片特異的である、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に、１：８００の最終希釈で再懸濁した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａを連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。ソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式を使用して、曲線適合により、５０％の最大結合をもたらす抗体の濃度（有効濃度５０、［ＥＣ５０］）を決定した。
図１６Ａ－１６Ｃ中に示されるように、抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５は、用量依存的な様式においてヒトＣＤ９６発現ＣＨＯ細胞（アイソフォーム２）に結合した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表３８中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表３９中に報告している。
カニクイザルＣＤ９６発現ＣＨＯ細胞への結合
同様の実験では、細胞表面上に野生型カニクイザルＣＤ９６（アイソフォーム２）を発現するように操作されたＣＨＯ細胞（カニクイザルＣＤ９６－ＣＨＯ細胞）に結合する、抗ＣＤ９６抗体の能力をテストした。簡単には、ＣＨＯ細胞を、野生型カニクイザルＣＤ９６アイソフォーム２をコードするベクターでトランスフェクトし、カニクイザルＣＤ９６を安定的に発現するクローンを選択した。この安定的な細胞株を、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ １×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。カニクイザルＣＤ９６－ＣＨＯに結合する抗ＣＤ９６抗体の能力を、上のヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞について記載されるように決定した。
図１７Ａ－１７Ｃ中に示されるように、抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３及びＢＡ１４５は、用量依存的な様式においてカニクイザルＣＤ９６を発現するＣＨＯ細胞に結合した。カニクイザルＣＤ９６－ＣＨＯ細胞への抗ＣＤ９６抗体の結合についての平均ＥＣ５０値を、各抗体について算出し、表４０中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表４１中に報告している。
８．７．２ 抗ヒトＣＤ９６抗体は、ヒトＣＤ９６へのリガンド結合を遮断する
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞の遮断
この実施例では、野生型ヒトＣＤ９６とそのリガンドヒトＣＤ１５５（また、ＰＶＲとして言及される）の間での結合を遮断する抗ＣＤ９６抗体の能力をテストした。具体的には、抗体を、フローサイトメトリーにより、ＣＨＯ細胞上に過剰発現されたヒトＣＤ９６（アイソフォーム２）と可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断するそれらの能力についてインビトロでテストした。
簡単には、Ｒ－フィコエリスリンにコンジュゲートされた２μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ）を含む溶液を、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。５０マイクロリットルのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥのこの作業ストックを次に、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに加えた。各抗体の４×濃縮中間ストックをマイクロプレート中で調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。１２０μｇ／ｍＬ～０．０００１μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。各希釈物の２５マイクロリットルを、ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥを含むマイクロプレートに移した。最後に、２５μＬのヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞（アイソフォーム２）が、上に記載されるように調製され、各ウェルに加えられた。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ上で連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、上に記載されるように分析した。
各抗体濃度について、実験データを、方程式４に従って、抗体の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされたヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞について得られたＭＦＩ値及びヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞自家蛍光（バックグラウンド）についてのＭＦＩ値を使用して標準化した。
方程式４
最大シグナル％＝
（ＭＦＩ「抗体」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）／（ＭＦＩ「合計」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）
（式中、
「抗体」はＢＡ１４３、ＢＡ１４４、又はＢＡ１４５である。
「バックグラウンド」は、細胞単独（抗体又はＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥなし）である。
「合計」は、抗体の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされた細胞である。
ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合の５０％を阻害する抗体の濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図１８Ａ－１８Ｃ中に示されるように、ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４５は、ＣＤ１５５へのヒトＣＤ９６－ＣＨＯ結合を遮断した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表４２中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表４３中に報告している。
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するカニクイザルＣＤ９６ ＣＨＯ細胞の遮断
同様の実験では、野生型カニクイザルＣＤ９６及びそのリガンドであるヒトＣＤ１５５（また、ＰＶＲとして言及される）の間での結合を遮断する抗ＣＤ９６抗体の能力をテストした。簡単には、抗体を、上のヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞について記載されるように、ＣＨＯ細胞上で過剰発現された野生型カニクイザルＣＤ９６（アイソフォーム２）と可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断する、それらの能力について、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＣＤ９６－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合の５０％を阻害する抗体の濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図１９Ａ－１９Ｃ中に示されるように、抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４５は、カニクイザルＣＤ９６とＣＤ１５５の間での相互作用を遮断し、ＢＡ１４３は部分的に遮断する。平均ＩＣ５０値をＢＡ１４５について算出し、表４４中に報告している。ＩＣ５０値は、部分的遮断に起因して、ＢＡ１４３について算出することができなかった。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表４５中に報告している。
８．８ 実施例８：抗ＴＩＧＩＴ抗体の特徴付け
８．８．１ 抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体は、ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴを発現する細胞に結合する
様々な細胞型の表面上で野生型ヒトＴＩＧＩＴ又は野生型カニクイザルＴＩＧＩＴに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ細胞への結合
ＣＨＯ細胞の表面上に発現された野生型ヒトＴＩＧＩＴに結合する、抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力を評価した。簡単には、ＣＨＯ細胞を、野生型ヒトＴＩＧＩＴをコードするベクターでトランスフェクトし（ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ）、ＴＩＧＩＴを安定的に発現するクローンを選択した。安定な細胞株を、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬの１×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。
抗体結合アッセイについて、ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞の凍結アリコートを、３７℃で解凍し、次に、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加したＤＰＢＳを含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中１ウェル当たり２×１０５細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。別々のマイクロプレート中で、各抗体の２×濃縮中間ストックを調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。６０μｇ／ｍＬ～０．００００５７μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。５０マイクロリットルの各希釈物を次に、ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞を含むマイクロプレートに移した。細胞を次に４℃で４５分間にわたりインキュベートした。抗体染色のために、細胞を、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、Ｆｃγ断片特異的である、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に、１：８００の最終希釈で再懸濁した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａを連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。ソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式を使用して、曲線適合により、５０％の最大結合をもたらす抗体の濃度（有効濃度５０、［ＥＣ５０］）を決定した。
図２０中に示されるように、ＢＡ１４８は、用量依存的な様式においてヒトＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ細胞に結合した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表４６中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表４７中に報告している。
カニクイザルＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ細胞への結合
同様の実験では、野生型カニクイザルＴＩＧＩＴをそれらの細胞表面上に発現するように操作されたＣＨＯ細胞（カニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞）に結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力をテストした。簡単には、ＣＨＯ細胞を、野生型カニクイザルＴＩＧＩＴをコードするベクターでトランスフェクトし、ＴＩＧＩＴを安定的に発現するクローンを選択した。この安定的な細胞株を、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ １×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。カニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力を、上のヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞について記載されるように決定した。
図２１中に示されるように、ＢＡ１４８は、用量依存的な様式においてカニクイザルＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ細胞に結合した。カニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞へのＢＡ１４８の結合についての平均ＥＣ５０値を、各抗体について算出し、表４８中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表４９中に報告している。
８．８．２ 抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴへのリガンド結合を遮断する
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞の遮断
この実施例では、野生型ヒトＴＩＧＩＴとそのリガンドであるヒトＣＤ１５５（また、ＰＶＲ として言及される）の間での結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力をテストした。具体的には、抗体を、フローサイトメトリーにより、ＣＨＯ細胞上に過剰発現された野生型ヒトＴＩＧＩＴと可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断するそれらの能力についてインビトロでテストした。
簡単には、Ｒ－フィコエリスリンにコンジュゲートされた２μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ）を含む溶液を、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。５０マイクロリットルのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥのこの作業ストックを次に、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに加えた。各抗体の４×濃縮中間ストックをマイクロプレート中で調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。１２０μｇ／ｍＬ～０．０００１μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。各希釈物の２５マイクロリットルを、ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥを含むマイクロプレートに移した。最後に、２５μＬのヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞が、上に記載されるように調製され、各ウェルに加えられた。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ上で連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、上に記載されるように分析した。
各抗体濃度について、実験データを、方程式５に従って、抗体の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされたヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞について得られたＭＦＩ値及びヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞自家蛍光（バックグラウンド）についてのＭＦＩ値を使用して標準化した。
方程式５
最大シグナル％＝
（ＭＦＩ「抗体」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）／（ＭＦＩ「合計」－ＭＦＩ「バックグラウンド」）
（式中、
「抗体」はＢＡ１４８である。
「バックグラウンド」は、細胞単独（抗体又はＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥなし）である。
「合計」は、抗体の非存在においてＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥとインキュベートされた細胞である。
野生型ヒトＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞へのＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ結合の５０％を阻害する抗体の濃度（ＩＣ５０）を決定した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティック方程式を使用して曲線フィッティングによって算出した。
図２２中に示されるように、ＢＡ１４８は、ＣＤ１５５への野生型ヒトＴＩＧＩＴ結合を遮断した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表５０中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表５１中に報告している。
可溶性ヒトＣＤ１５５に結合するカニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞の遮断
この実施例では、野生型カニクイザルＴＩＧＩＴとそのリガンドであるヒトＣＤ１５５（また、ＰＶＲとして言及される）の間での結合を遮断する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力をテストした。具体的には、抗体を、フローサイトメトリーにより、ＣＨＯ細胞上に過剰発現された野生型カニクイザルＴＩＧＩＴと可溶性ヒトＣＤ１５５の間での結合を遮断するそれらの能力についてインビトロでテストした。
簡単には、Ｒ－フィコエリスリンにコンジュゲートされた２μｇ／ｍＬのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ（ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥ）を含む溶液を、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製した。５０マイクロリットルのヒトＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥのこの作業ストックを次に、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに加えた。各多特異性分子の４×濃縮中間ストックをマイクロプレート中で調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。１２０μｇ／ｍＬ～０．０００１μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。各希釈物の２５マイクロリットルを、ＣＤ１５５－Ｆｃ－ＰＥを含むマイクロプレートに移した。最後に、上に記載されるように調製されたカニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ細胞の２５μＬを各ウェルに加えた。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ上で連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットし、上に記載されるように分析した。
図２３中に示されるように、ＢＡ１４８は、ＣＤ１５５へのカニクイザルＴＩＧＩＴ－ＣＨＯ結合を遮断した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表５２中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表５３中に報告している。
８．９ 実施例９：抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体及び抗ヒトＣＤ９６抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａバリアントＶ／Ｖ及びＦ／Ｆを発現する細胞に結合する。
様々な細胞型の表面上でヒトＦｃγＲＩＩＩａ（バリアントＶ／Ｖ及びバリアントＦ／Ｆ）に結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＣＤ９６抗体の能力を、フローサイトメトリーによりインビトロでテストした。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞への結合
ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトＦｃγＲＩＩＩａに結合する抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＣＤ９６ 抗体の能力を評価した。簡単には、ＣＨＯ細胞を、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－ＣＨＯ）バリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆをコードするベクターでトランスフェクトし、ＦｃγＲＩＩＩａバリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆを安定的に発現するクローンを選択した。安定な細胞株を、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬの１×ＨＴ－サプリメント、及び２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含むＰｏｗｅｒ ＣＨＯ－２培地中で培養した。
抗体結合アッセイについて、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－ＣＨＯ細胞（バリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆ）の凍結アリコートを、３７℃で解凍し、次に、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．０５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加したＤＰＢＳを含むチューブに移した。細胞を３００ｇで五分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した細胞を、５０μＬ中１ウェル当たり２×１０５細胞の密度で、９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。別々のマイクロプレート中で、各抗体の２×濃縮中間ストックを調製した。抗体を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１対４に連続希釈した。６０μｇ／ｍＬ～０．００００５７μｇ／ｍＬの範囲の合計１１の作業希釈物を調製した。５０マイクロリットルの各希釈物を次に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－ＣＨＯ（バリアントＶ／Ｖ又はバリアントＦ／Ｆ）細胞を含むマイクロプレートに移した。細胞を次に４℃で４５分間にわたりインキュベートした。抗体染色のために、細胞を、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、Ｆｃγ断片特異的である、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に、１：８００の最終希釈で再懸濁した。氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を冷たいＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、及びＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａを連続的にゲーティングすることにより、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＰＥについての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を算出し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりプロットした。ソフトウェアを使用し、４パラメータロジスティック方程式を使用して、曲線適合により、５０％の最大結合をもたらす抗体の濃度（有効濃度５０、［ＥＣ５０］）を決定した。
図２４Ａ－２４Ｄ中に示されるように、ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、ＢＡ１４５、及びＢＡ１４８は、用量依存的な様式においてヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞のバリアントＶ／Ｖに結合した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表５４中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を代表的な実験について算出し、表５５中に報告している。
図２５Ａ－２５Ｅ中に示されるように、ＢＡ１４３、ＢＡ１４４、及びＢＡ１４８は、用量依存的な様式においてヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞のバリアントＦ／Ｆに結合した。平均ＩＣ５０値を各抗体について算出し、表５６中に報告している。曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、表５７中に報告している。
８．１０ 実施例１０：初代ヒトＴ細胞への抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の結合。
この実施例では、活性化ヒトＴ細胞に結合する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７、ならびに抗ＣＤ９６単一特異性対照抗体ＢＡ１４３、抗ＴＩＧＩＴ単一特異性抗体ＢＡ１４８、又は二特異性アイソタイプ対照抗体ＢＡ１２８の能力をテストした。活性化Ｔ細胞について、四人の異なる健常ドナーからのヒトＰＢＭＣの凍結アリコートを、液体窒素から回収し、流氷が観察されるまで３７℃の水中で直ちに解凍した。細胞を次に、１０ｍＬの予め加温されたＲ１０培地に移した。２０μＬを除去し、３８０μＬの生存性色素に加えて、細胞をカウントし、Ｍｕｓｅ装置を使用して生存率を確認した。サンプルを１２００ｒｐｍで五分間にわたり遠心分離し、次に、Ｒ１０培地を用いて１×１０６個細胞／ｍＬの最終濃度まで懸濁した。細胞を、１×１０６個細胞当たり２５ｕｌでｉｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞アクチベーターで刺激し、１００μＬの刺激細胞を、９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェル中にピペットで移し、５％ＣＯ２中で、３７℃で四日間にわたりインキュベートした。
多特異性分子又は抗体の用量範囲を、９６ウェル丸底プレート中に入れた。最初に、２００μＬの５０μｇ／ｍＬの各抗体を、緩衝液中で調製した。多特異性分子及び抗体を、２０μＬの以前の希釈物を１８０μＬのサンプル緩衝液中にピペッティングすることにより、１対１０に連続希釈した。５０μｇ／ｍＬ～０．０００００５μｇ／ｍＬの範囲の合計８つの希釈物を調製した。四日後、サンプルプレートを２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。サンプルを、１００μＬ当たり５μＬのＦＡＣｓ緩衝液中で調製されたＦｃγＲブロックで１０分間にわたり遮断した。サンプルプレートを次に、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を次に、図２６Ａ－２６Ｆ中に示される濃度で、１００μＬの抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子又は関連するアイソタイプ対照中に再懸濁した。サンプルプレートを、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、冷サンプル緩衝液の添加により洗浄し、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。この洗浄を一回繰り返した。
細胞を次に、蛍光標識抗体のカクテル中に再懸濁した。全てのサンプルについて十分な蛍光標識抗体のカクテルを、ＦＡＣｓ緩衝液中で調製した。１ウェル当たり１００μＬの抗体を次に、丸底９６ウェルプレートに加えた。サンプルプレートを、氷上で２０分間にわたりインキュベートした。細胞を、冷サンプル緩衝液の添加により洗浄し、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。この洗浄を一回繰り返した。ＰＥ標識二次抗ヒトＩｇＧ抗体の最終カクテルを、１１ｍＬのＦＡＣｓ緩衝液中で調製した。１ウェル当たり１００μＬの二次抗体を、丸底９６ウェルプレートに加えた。サンプルプレートを、氷上で５分間にわたりインキュベートした。細胞を、冷サンプル緩衝液の添加により洗浄し、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。この洗浄を一回繰り返した。
抗体結合を、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーにより測定した。未染色対照細胞を使用して、単一細胞の選択のための前方散乱光面積（ＦＳＣ－Ａ）に対する側方散乱光面積（ＳＳＣ－Ａ）のプロット、及びＦＳＣ－Ａに対するＦＳＣの高さ（ＦＳＣ－Ｈ）の別のプロットを使用して、リンパ球集団でゲーティングした。各個々の抗体で染色された細胞のチューブを使用して、実験において使用される様々な色の補正を算出した。１００，０００の事象を各サンプルについて記録した。サンプルを、以下の集団で連続的にゲーティングすることにより分析した：ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ対ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ、ＣＤ４対ＣＤ８、及びＳＳＣ対ＣＤ２５。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。
図２６Ａ－２６Ｆ中に示されるように、ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７は、三人の独立したドナーにわたって、活性化初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ａ，２６Ｂ、及び２６Ｃ）及び活性化初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｄ、２５６、及び２６Ｆ）への強力な結合を示した。注目すべきことに、ＢＡ１２７は、対応する抗ＣＤ９６単一特異性対照抗体ＢＡ１４３及び抗ＴＩＧＩＴ単一特異性抗体ＢＡ１４８と比較して、ドナー１及び２からの活性化ＣＤ４＋（図２６Ａ及び２６Ｂ）及びＣＤ８＋（図２６Ｄ及び２６Ｅ）Ｔ細胞に対して優れた最大結合を示した。ＢＡ１２７は、ＢＡ１４３と比較して、ドナー３からの活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞と同等の結合を示した（図２６Ｃ及び２６Ｆ）。
８．１１ 実施例１１：初代ヒトＴ細胞への抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の結合。
この実験では、活性化ヒトＴ細胞に結合する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７の能力をテストした。活性化Ｔ細胞について、四人の異なる健常ドナーからのヒトＰＢＭＣの凍結アリコートを、液体窒素から回収し、流氷が観察されるまで３７℃の水中で直ちに解凍した。細胞を次に、１０ｍＬの予め加温されたＲ１０培地に移した。２０μＬを除去し、３８０μＬの生存性色素に加えて、細胞をカウントし、Ｍｕｓｅ装置を使用して生存率を確認した。サンプルを１２００ｒｐｍで五分間にわたり遠心分離し、次に、Ｒ１０培地を用いて１×１０６個細胞／ｍＬの最終濃度まで懸濁した。細胞を、１×１０６個細胞当たり２５ｕｌでｉｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞アクチベーターで刺激し、１００μＬの刺激細胞を、９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェル中にピペットで移し、５％ＣＯ２中で、３７℃で四日間にわたりインキュベートした。
多特異性分子又は抗体（ＢＡ１２７又は二特異性アイソタイプ対照抗体ＢＡ１２８）の用量範囲を、９６ウェル丸底プレートに入れた。最初に、２００μＬの２５μｇ／ｍＬの各抗体を、緩衝液中で調製した。多特異性分子及び抗体を次に、５０μＬの以前の希釈物を１５０μＬのサンプル緩衝液中にピペッティングすることにより、１対４に連続希釈した。５０μｇ／ｍＬ～０．０００００５μｇ／ｍＬの範囲の合計８つの希釈物を調製した。四日後、サンプルプレートを２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。サンプルを、１００μＬ当たり５μＬのＦＡＣｓ緩衝液中で調製されたＦｃγＲブロックで１０分間にわたり遮断した。サンプルプレートを次に、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を次に、図２７Ａ－２７Ｆ中に示される濃度で、１００μＬの抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子（ＢＡ１２７）又は関連するアイソタイプ対照（ＢＡ１２８）中に再懸濁した。サンプルプレートを、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、冷サンプル緩衝液の添加により洗浄し、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。この洗浄を一回繰り返した。
細胞を次に、蛍光標識抗体のカクテル中に再懸濁した。全てのサンプルについて十分な蛍光標識抗体のカクテルを、ＦＡＣｓ緩衝液中で調製した。１ウェル当たり１００μＬの抗体を次に、丸底９６ウェルプレートに加えた。サンプルプレートを、氷上で２０分間にわたりインキュベートした。細胞を、冷サンプル緩衝液の添加により洗浄し、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。この洗浄を一回繰り返した。ＰＥ標識二次抗ヒトＩｇＧ抗体の最終カクテルを、１１ｍＬのＦＡＣｓ緩衝液中で調製した。１ウェル当たり１００μｌの二次抗体を、丸底９６ウェルプレートに加えた。サンプルプレートを、氷上で５分間にわたりインキュベートした。細胞を、冷サンプル緩衝液の添加により洗浄し、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。この洗浄を一回繰り返した。
抗体結合を、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーにより測定した。未染色対照細胞を使用して、単一細胞の選択のための前方散乱光面積（ＦＳＣ－Ａ）に対する側方散乱光面積（ＳＳＣ－Ａ）のプロット、及びＦＳＣ－Ａに対するＦＳＣの高さ（ＦＳＣ－Ｈ）の別のプロットを使用して、リンパ球集団でゲーティングした。各個々の抗体で染色された細胞のチューブを使用して、実験において使用される様々な色の補正を算出した。１００，０００の事象を各サンプルについて記録した。サンプルを、以下の集団で連続的にゲーティングすることにより分析した：ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ａ対ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ、ＣＤ４対ＣＤ８、及びＳＳＣ対ＣＤ２５。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。
図２７Ａ－２７Ｆ中に示されるように、ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７は、用量依存的な様式において、三人の独立したドナーからの活性化初代ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞（図２７Ａ、２７Ｂ、及び図２７Ｃ）及び活性化初代ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２７Ｄ、２７Ｅ、及び図２７Ｆ）に結合した。
８．１２ 実施例１２：ＳＥＡ刺激アッセイ
本実施例では、ＳＥＡで刺激されたＰＢＭＣによりサイトカインインターロイキン－２（ＩＬ－２）の分泌を促進する、対照多特異性分子と比較した、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力をテストした。
抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７、アイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１２８、ならびに抗ＣＤ９６×アイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、及びＢＡ１３１の各々の用量範囲を、１．２ｍＬのバレットチューブ中の５×濃縮中間ストックで調製した。最初に、２５０μｇ／ｍｌの中間ストックをＲ１０培地中で調製し、抗体を、合計８の希釈のための段階希釈により１～１０まで段階希釈した。２０μＬの抗体を、５０μｇ／ｍＬ～０．０００００５μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度のために、丸底９６ウェルプレートに１ウェル当たり加えた。
ヒトＰＢＭＣの凍結アリコートを、液体窒素から取り出し、流氷が観察されるまで３７℃の水中で直ちに解凍した。細胞を、１０ｍＬの予め加温されたＲ１０培地に移し、１５００ｒｐｍで五分間にわたり直ちに遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を新鮮なＲ１０培地中に再懸濁した。細胞をカウントし、生存率を確認するために、２０μＬのサンプルを取り出し、３８０μＬの生存性色素に加えて、混合し、Ｍｕｓｅ装置を使用して読み取った。
中間濃度まで再懸濁した細胞。ＳＥＡの中間ストック濃縮を、１０μＬの１０μｇ／ｍＬのＳＥＡを９０μＬのＲ１０に加えて、１μｇ／ｍＬの中間濃縮を作製することにより作製した。細胞を最初にＳＥＡペプチド及び８０μＬの細胞で刺激し、ＳＥＡ混合物を、対応するウェル中に加えて、加湿チャンバー内の５％ＣＯ２で、３７℃で四日間にわたり、組織培養インキュベーター中でインキュベートした。合計１００，０００個細胞／ウェル及び最終濃度１ｎｇ／ｍＬのＳＥＡを使用した。
四日間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出した。プレートを次に、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離した。５μＬの上清を、サイトカイン分析のために、３８４ウェルＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートに移した。ＩＬ－２分泌の測定には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した。簡潔に述べると、アッセイ緩衝液を、２．５ｍＬの１０倍ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイ緩衝液を２２．５ｍＬの水にピペッティングすることによって調製した。ヒトＩＬ－２分析物を使用して、標準希釈物を調製した。１．６×ＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＩＬ－２アクセプタービーズ及びビオチン化抗ＩＬ－２抗体の混合物を、アッセイ緩衝液中で調製した。８μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。２．３×ストレプトアビジンドナービーズ中間体ストックを、アッセイ緩衝液中で調製した。１０μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。相対光単位（ＲＬＵ）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー上でＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロトコルを使用して測定した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、曲線を、非線形回帰を使用して適合させた。
図２８Ａ－２８Ｃ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２３、ＢＡ１２５、及びＢＡ１２７（図２８Ａ）ならびにＢＡ１２５及びＢＡ１２７（図２８Ｂ）は、アイソタイプ対照ＢＡ１２８と比較して、インターロイキン－２（ＩＬ－２）サイトカイン分泌により決定されるＴ細胞応答性を強力に増強した。さらに、ＢＡ１２７は、多特異性分子ＢＡ１２９、ＢＡ１３０、及びＢＡ１３１又はアイソタイプ対照抗体ＢＡ１２８のみに結合するＣＤ９６と比較して、優れた機能活性を示した（図２８Ｃ）。
８．１３ 実施例１３：ＳＥＡ刺激アッセイ
抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７、アイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１２８、抗ＣＤ９６単一特異性抗体対照ＢＡ１４３、及び抗ＴＩＧＩＴ単一特異性抗体対照ＢＡ１４８の各々の用量範囲を、１．２ｍＬのバレットチューブ中の５×濃縮中間ストックで調製した。最初に、２５０μｇ／ｍｌの中間ストックをＲ１０培地中で調製し、抗体を、合計８の希釈のための段階希釈により１～１０まで段階希釈した。２０μＬの抗体を、５０μｇ／ｍＬ～０．０００００５μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度のために、丸底９６ウェルプレートに１ウェル当たり加えた。
ヒトＰＢＭＣの凍結アリコートを、液体窒素から取り出し、流氷が観察されるまで３７℃の水中で直ちに解凍した。細胞を、１０ｍＬの予め加温されたＲ１０培地に移し、１５００ｒｐｍで五分間にわたり直ちに遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を新鮮なＲ１０培地中に再懸濁した。細胞をカウントし、生存率を確認するために、２０μＬのサンプルを取り出し、３８０μＬの生存性色素に加えて、混合し、Ｍｕｓｅ装置を使用して読み取った。
中間濃度まで再懸濁した細胞。ＳＥＡの中間ストック濃縮を、１０μＬの１０μｇ／ｍＬのＳＥＡを９０μＬのＲ１０に加えて、１μｇ／ｍＬの中間濃縮を作製することにより作製した。細胞を最初にＳＥＡペプチド及び８０μＬの細胞で刺激し、ＳＥＡ混合物を、対応するウェル中に加えて、加湿チャンバー内の５％ＣＯ２で、３７℃で四日間にわたり、組織培養インキュベーター中でインキュベートした。合計１００，０００個細胞／ウェル及び最終濃度１ｎｇ／ｍＬのＳＥＡを使用した。
四日間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出した。プレートを次に、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離した。５μＬの上清を、サイトカイン分析のために、３８４ウェルＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートに移した。ＩＬ－２分泌の測定には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した。簡潔に述べると、アッセイ緩衝液を、２．５ｍＬの１０倍ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイ緩衝液を２２．５ｍＬの水にピペッティングすることによって調製した。ヒトＩＬ－２分析物を使用して、標準希釈物を調製した。１．６×ＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＩＬ－２アクセプタービーズ及びビオチン化抗ＩＬ－２抗体の混合物を、アッセイ緩衝液中で調製した。８μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。２．３×ストレプトアビジンドナービーズ中間体ストックを、アッセイ緩衝液中で調製した。１０μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。相対光単位（ＲＬＵ）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー上でＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロトコルを使用して測定した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、曲線を、非線形回帰を使用して適合させた。
図２９中に示されるように、ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７は、アイソタイプ対照ＢＡ１２８と比較して、インターロイキン－２（ＩＬ－２）サイトカイン分泌により決定されるＴ細胞応答性を強力に増強した。さらに、ＢＡ１２７は、単一特異性抗ＴＩＧＩＴ抗体ＢＡ１４８又は単一特異性抗ＣＤ９６抗体ＢＡ１４３と比較して、優れた機能活性を示した。
８．１４ 実施例１４：ＳＥＡ刺激アッセイ
抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７及びアイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１２８の各々の用量範囲を、１．２ｍＬのバレットチューブ中の５×濃縮中間ストックで調製した。ドナー１及び２については、２５０μｇ／ｍｌの中間ストックをＲ１０培地中で調製し、抗体を、合計８回の希釈のために段階希釈により１～１０まで連続希釈した。１ウェル当たり２０μＬの抗体を、５０μｇ／ｍＬ～０．０００００５μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度のために、丸底９６ウェルプレートに加えた。
ドナー３、４、５、及び６について、１０μｇ／ｍＬの中間ストックをＲ１０培地中で調製し、抗体を連続希釈により１～５に連続希釈した。１０μｇ／ｍＬ～０．０００１２８μｇ／ｍＬの範囲の合計８つの希釈物を、Ｒ１０培地中で調製した。２０μＬの抗体を、１ウェル当たりで、丸底９６ウェルプレートに加えた。
ヒトＰＢＭＣの凍結アリコートを、液体窒素から取り出し、流氷が観察されるまで３７℃の水中で直ちに解凍した。細胞を、１０ｍＬの予め加温されたＲ１０培地に移し、１５００ｒｐｍで五分間にわたり直ちに遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を新鮮なＲ１０培地中に再懸濁した。細胞をカウントし、生存率を確認するために、２０μＬのサンプルを取り出し、３８０μＬの生存性色素に加えて、混合し、Ｍｕｓｅ装置を使用して読み取った。
中間濃度まで再懸濁した細胞。ＳＥＡの中間ストック濃縮を、１０μＬの１０μｇ／ｍＬのＳＥＡを９０μＬのＲ１０に加えて、１μｇ／ｍＬの中間濃縮を作製することにより作製した。細胞を最初にＳＥＡペプチド及び８０μＬの細胞で刺激し、ＳＥＡ混合物を、対応するウェル中に加えて、加湿チャンバー内の５％ＣＯ２で、３７℃で四日間にわたり、組織培養インキュベーター中でインキュベートした。合計１００，０００個細胞／ウェル及び最終濃度１ｎｇ／ｍＬのＳＥＡを使用した。
四日間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出した。プレートを次に、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離した。５μＬの上清を、サイトカイン分析のために、３８４ウェルＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートに移した。ＩＬ－２分泌の測定には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した。簡潔に述べると、アッセイ緩衝液を、２．５ｍＬの１０倍ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイ緩衝液を２２．５ｍＬの水にピペッティングすることによって調製した。ヒトＩＬ－２分析物を使用して、標準希釈物を調製した。１．６×ＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＩＬ－２アクセプタービーズ及びビオチン化抗ＩＬ－２抗体の混合物を、アッセイ緩衝液中で調製した。８μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。２．３×ストレプトアビジンドナービーズ中間体ストックを、アッセイ緩衝液中で調製した。１０μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。相対光単位（ＲＬＵ）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー上でＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロトコルを使用して測定した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、曲線を、非線形回帰を使用して適合させた。
図３０Ａ－３０９Ｆ中に示されるように、ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７は、アイソタイプ対照ＢＡ１２８と比較して、用量依存的な様式において、六人の別々のドナーからのＳＥＡ刺激ＰＢＭＣにおけるインターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌により決定されるＴ細胞応答性を強力に増強した。図３０中の各ドナーについてのＥＣ１０、ＥＣ５０、及びＥＣ９０値を、表５８中に列挙する。
８．１５ 実施例１５：ＴＩＧＩＴ遮断レポーターアッセイ。
この実施例は、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５阻害性シグナル伝達を遮断する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を実証する。
ＴＩＧＩＴ遮断レポーターアッセイを、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルに従って実施した。最初に、ＴＣＲ活性化及びＣＤ２２６共刺激の両方に応答することができる天然プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを用いてヒトＴＩＧＩＴを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔエフェクターＴ細胞を、液体窒素から取り出し、浮遊氷が観察されるまで３７℃の水中で直ちに解凍した。細胞を次に、円錐チューブ中の１２ｍＬの予め加温された（３７℃）アッセイ緩衝液（９０％ＲＰＭＩ １６４０／１０％ＦＢＳ）に移した。細胞懸濁液を穏やかに混合し、滅菌リザーバーに移し、８０μＬの細胞懸濁液を、９６ウェル白色平底アッセイプレートの内側６０ウェルに移した。１２０μＬの予め加温された（３７℃）アッセイ緩衝液を、アッセイプレートの外側ウェルの各々に加えた。細胞を次に、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で、１６～２０時間にわたりインキュベートした。
抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２５及びＢＡ１２７、アイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１２８、抗ＴＩＧＩＴ×アイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１３３、抗ＣＤ９６単一特異性抗体対照ＢＡ１４３、抗ＣＤ９６×アイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１３１、単一特異性アイソタイプ対照ＢＡ１４６、抗ＴＩＧＩＴ参照抗体１、抗ＴＩＧＩＴ参照抗体２、及び抗ＴＩＧＩＴ参照抗体３の用量範囲を、１．２ｍＬのバレットチューブ中の６×濃縮中間ストックで調製した。最初に、５０μｇ／ｍＬの中間ストックをアッセイ緩衝液中で調製し、抗体を連続希釈により１～２．５に連続的に希釈した。５０μｇ／ｍＬ～０．０１３１μｇ／ｍＬ（図３１Ａ及び３１Ｂ）又は４０μｇ／ｍＬ～０．０２６２μｇ／ｍＬ（図３１Ｃ）の範囲の合計１０の希釈物を、アッセイ緩衝液中で調製した。１ウェル当たり２０μＬの抗体を、予め播種したＴＩＧＩＴエフェクター細胞に加えた。
抗原非依存的な様式においてＴＣＲ複合体を活性化するように設計された、操作された細胞表面タンパク質（ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞）を用いてヒトＣＤ１５５を発現するように操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞を、液体窒素から回収し、浮遊氷が観察されるまで直ちに３７℃の水中で解凍した。細胞を次に、３ｍｌのアッセイ緩衝液を含む１５ｍｌの円錐チューブに移した。細胞懸濁液を穏やかに混合し、滅菌リザーバーに移し、２０μＬの細胞懸濁液を、予め播種したＴＩＧＩＴエフェクター細胞及び抗体の混合物に移した。最終アッセイ容量は１２０μＬであった。
細胞を次に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、６時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、周囲温度まで１０分間にわたり平衡化した。１２０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を次に、事前に播種された細胞及び多特異性分子又は抗体混合物に加えて、室温で５分間にわたりインキュベートする。相対光単位（ＲＬＵ）を、発光ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して測定した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、曲線を、非線形回帰を使用して適合させた。
図３１Ａ、３１Ｂ、及び３１Ｃ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２５及びＢＡ１２７は、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５リガンド遮断の結果として、用量依存的な様式において、ルシフェラーゼ遺伝子発現、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化及びＣＤ２２６共刺激経路活性化のための代替物を強力に増強した。予想とおり、抗ＴＩＧＩＴ×アイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１３３はまた、ルシフェラーゼ遺伝子発現を増強したが、しかし、抗ＣＤ９６単一特異性抗体対照ＢＡ１４３はしなかった。参照抗ＴＩＧＩＴ×アイソタイプ対照との比較において、多特異性分子ＢＡ１２５及びＢＡ１２７は、レポーター活性を増強する同等の能力を示した。
８．１６ 実施例１６：抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、Ｔ細胞刺激アッセイにおいてＩＬ－２分泌を誘発する。
この実施例では、最適以下の濃度のＳＥＡ超抗原で刺激された初代健常ドナーヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ－２サイトカイン分泌を誘発する、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７の能力を評価した。
ＢＡ１２７、参照抗ＴＩＧＩＴモノクローナル参照抗体１、又はアイソタイプ対照多特異性分子ＢＡ１２８の用量範囲を、１．２ｍＬのバレットチューブ中の５×濃縮中間ストックで調製した。最初に、５０μｇ／ｍＬの中間ストックをＲ１０培地中で調製し、抗体を、合計８回の希釈のために１～５まで段階希釈した。２０μＬの抗体を、１ウェル当たりに、１０μｇ／ｍＬ～０．０００１２８μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度について丸底９６ウェルプレートに加えた。
ヒトＰＢＭＣの凍結アリコートを、液体窒素から取り出し、流氷が観察されるまで３７℃の水中で直ちに解凍した。細胞を、１０ｍＬの予め加温されたＲ１０培地に移し、１５００ｒｐｍで五分間にわたり直ちに遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を新鮮なＲ１０培地中に再懸濁した。細胞をカウントし、生存率を確認するために、２０μＬのサンプルを取り出し、３８０μＬの生存性色素に加えて、混合し、Ｍｕｓｅ装置を使用して読み取った。
細胞を中間濃度まで再懸濁した。ＳＥＡの中間ストック濃縮を、１０μＬの１０μｇ／ｍＬのＳＥＡを９０μＬのＲ１０に加えて、１μｇ／ｍＬの中間濃縮を作製することにより作製した。細胞を最初にＳＥＡペプチド及び８０μＬの細胞で刺激し、ＳＥＡ混合物を、対応するウェル中に加えて、加湿チャンバー内の５％ＣＯ２で、３７℃で四日間にわたり、組織培養インキュベーター中でインキュベートした。合計１００，０００個細胞／ウェル及び最終濃度１ｎｇ／ｍＬのＳＥＡを使用した。
四日間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出した。プレートを次に、２０００ｒｐｍで二分間にわたり遠心分離した。５μＬの上清を、サイトカイン分析のために、３８４ウェルＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートに移した。ＩＬ－２分泌の測定には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した。簡潔に述べると、アッセイ緩衝液を、２．５ｍＬの１０倍ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイ緩衝液を２２．５ｍＬの水にピペッティングすることによって調製した。ヒトＩＬ－２分析物を使用して、標準希釈物を調製した。１．６×ＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＩＬ－２アクセプタービーズ及びビオチン化抗ＩＬ－２抗体の混合物を、アッセイ緩衝液中で調製した。８μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。２．３×ストレプトアビジンドナービーズ中間体ストックを、アッセイ緩衝液中で調製した。１０μＬを各ウェルに加えて、暗所において、室温でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。相対光単位（ＲＬＵ）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー上でＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロトコルを使用して測定した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットし、曲線を、非線形回帰を使用して適合させた。
図３２Ａ及び図３２Ｂ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子ＢＡ１２７は、参照抗ＴＩＧＩＴ抗体、及びアイソタイプ対照抗体と比較して、広範な濃度にわたって、二人のドナーにおいてより高いレベルのＩＬ－２サイトカイン分泌をもたらした。
８．１７ 実施例１７：抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子は、前臨床マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害した。
本実施例は、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子を用いた遮断が、マウスモデルにおける対応する単一特異性抗体及び単一特異性抗体の組み合わせと比較して、優れた腫瘍制御を促進することを実証した。
マウス代替抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ９６単一特異性抗体ならびに抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子を、マウス結腸直腸癌モデルにおいてテストした。具体的には、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ ＃０００６５１）を、最初に二週間にわたり順応させ、剃毛し、タグ付けした。ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３８（商標））を、１０％熱不活化ＦＢＳ及びノルモシンを添加したＲＰＭＩ培地中の組織培養物中で１週間にわたり増殖させた。マウスに、１００のＰＢＳ中に懸濁された１×１０５個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。移植された腫瘍細胞を、約５０ｍｍ３のサイズに達するまで９～１０日間にわたり確立させた。マウスを次に無作為化し、２００μｇの抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａ代替抗体（クローン：１０Ａ７）、抗ＣＤ９６ ｍＩｇＧ２ａ代替抗体（クローン：６Ａ６）、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ９６代替ｍＡｂの組み合わせ、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６ ｍＩｇＧ２ａ代替多特異性分子、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６ ｍＩｇＧ２ａ．Ｎ２９７Ａ代替多特異性分子、アイソタイプ対照単一特異性抗体（ｍＩｇＧ２ａ）、又はアイソタイプ対照多特異性分子（ｍＩｇＧ２ａ）で、腹腔内投与を介して週に二回、２週間にわたり処置した。腫瘍容積をキャリパーにより隔週で測定し、０．５×長さ×幅２として算出した。
図３３Ａ－３３Ｅ中に示されるように，抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６代替多特異性分子ｍＩｇＧ２ａは、１５匹中１３匹のマウスにおいて完全応答に導いた。対照的に、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６代替多特異性ｍＩｇＧ２ａ－Ｎ２９７Ａは、腫瘍成長の制御に対する効果を有さなかった。抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６ ｍＩｇＧ２ａ多特異性分子は、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂもしくは抗ＣＤ９６ ｍＡｂ又は抗ＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６ ｍＡｂの組み合わせを用いた単剤療法と比較して、優れた腫瘍制御を示した。この結果によって、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子が、免疫エフェクター機能を増強するためにＦｃγＲ共会合に依存し、単一特異性抗体又は単一特異性抗体の組み合わせよりも機能的に優れているというインビトロ観察が裏付けられる。
８．１８ 実施例１８：ＦｃγＲ共会合は、抗腫瘍免疫のために不可欠である。
この実施例は、前臨床マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害する抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子の能力を実証した。
マウス代替抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ９６単一特異性抗体ならびに抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子を、マウス結腸直腸癌モデルにおいてテストした。具体的には、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ ＃０００６５１）を、最初に二週間にわたり順応させ、剃毛し、タグ付けした。ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３８（商標））を、１０％熱不活化ＦＢＳ及びノルモシンを添加したＲＰＭＩ培地中の組織培養物中で１週間にわたり増殖させた。マウスに、１００のＰＢＳ中に懸濁された１×１０５個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。移植された腫瘍細胞を、約５０ｍｍ３のサイズに達するまで９～１０日間にわたり確立させた。マウスを次に無作為化し、２００μｇの抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａ代替抗体（クローン：１０Ａ７）、抗ＣＤ９６ ｍＩｇＧ２ａ代替抗体（クローン：６Ａ６）、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ９６代替単一特異性抗体の組み合わせ、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６ ｍＩｇＧ２ａ代替抗体、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６二特異性ｍＩｇＧ２ａ．Ｎ２９７Ａ代替多特異性分子、アイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ２ａ）、又はアイソタイプ対照多特異性（ｍＩｇＧ２ａ）で、腹腔内投与を介して週に二回、２週間にわたり処置した。腫瘍容積をキャリパーにより隔週で測定し、０．５×長さ×幅２として算出した。
図３４Ａ－３４Ｅ中に示されるように、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６代替多特異性分子ｍＩｇＧ２ａは、１５匹中１３匹のマウスにおいて完全応答に導いた。対照的に、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６代替多特異性分子ｍＩｇＧ２ａ－Ｎ２９７Ａは、腫瘍成長の制御に対する効果を有さなかった。抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６ ｍＩｇＧ２ａ多特異性分子は、抗ＴＩＧＩＴ単一特異性抗体もしくは抗ＣＤ９６単一特異性抗体又は抗ＴＩＧＩＴ及びＣＤ９６単一特異性抗体の組み合わせを用いた単一薬剤治療と比較して、優れた腫瘍管理を示した。この結果によって、抗ＴＩＧＩＴｘＣＤ９６多特異性分子が、免疫エフェクター機能を増強するためにＦｃγＲ共会合に依存し、ｍＡｂ又はｍＡｂの組み合わせよりも機能的に優れているというインビトロ観察が裏付けられる。
＊ ＊ ＊
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態により、範囲において限定されるべきではない。実際に、記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
本明細書において引用されるすべての参考文献（例、出版物又は特許又は特許出願）は、それぞれ個々の参考文献（例、出版物又は特許又は特許出願）が、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されるのと同程度まで、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (144)

  1. 多特異性分子であって、
    （ａ）ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、前記第一の抗原結合領域が、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む第一のＶＨ、ならびにＣＤＲ ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む第一のＶＬを含み、
    （ｉ）前記第一のＶＨが、配列番号３４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに前記第一のＶＬが、配列番号３５のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、
    （ｉｉ）前記第一のＶＨが、配列番号３６のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに前記第一のＶＬが、配列番号３７のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）前記第一のＶＨが、配列番号３８のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに前記第一のＶＬが、配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、第一の抗原結合領域、及び
    （ｂ）ヒトＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、前記第二の抗原結合領域が、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む第二のＶＨ、ならびにＣＤＲ ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む第二のＶＬを含む、第二の抗原結合領域、を含む、多特異性分子。
  2. 前記第一の抗原結合領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号１０、１１、１２、１３、１４、及び１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１、又は２２、２３、２４、２５、２６、及び２７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の多特異性分子。
  3. 前記第二の抗原結合領域が、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する、請求項１又は２に記載の多特異性分子。
  4. 前記第二のＶＨが、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含み、ならびに前記第二のＶＬが、配列番号４１のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  5. 前記第二の抗原結合領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の多特異性分子。
  6. 多特異性分子であって、
    （ａ）ヒトＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、前記第一の抗原結合領域が、ＣＤＲ ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む第一のＶＨ、ならびにＣＤＲ ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む第一のＶＬを含む、第一の抗原結合領域、及び
    （ｂ）ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、前記第二の抗原結合領域が、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む第二のＶＨ、ならびに配列番号４１のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む第二のＶＬを含む、第二の抗原結合領域、を含む、多特異性分子。
  7. 前記第二の抗原結合領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の多特異性分子。
  8. 前記第一の抗原結合領域が、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する、請求項６又は７に記載の多特異性分子。
  9. 前記第一のＶＨが、配列番号３４、３６、又は３８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  10. 前記第一のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号３４、３６、又は３８のアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の多特異性分子。
  11. 前記第一のＶＬが、配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  12. 前記第一のＶＬのアミノ酸配列が、配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載の多特異性分子。
  13. 前記第二のＶＨが、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  14. 前記第二のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号４０のアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の多特異性分子。
  15. 前記第二のＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  16. 前記第二のＶＬのアミノ酸配列が、配列番号４１のアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載の多特異性分子。
  17. 多特異性分子であって、
    （ａ）ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、前記抗原結合領域が第一のＶＨ及び第一のＶＬを含み、前記第一のＶＨが、配列番号３４、３６、もしくは３８のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記第一のＶＬが、配列番号３５、３７、もしくは３９のアミノ酸配列を含む、第一の抗原結合領域、ならびに
    （ｂ）ヒトＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、前記第二の抗原結合領域が第二のＶＨ及び第二のＶＬを含む、第二の抗原結合領域、を含む、多特異性分子。
  18. 前記第二の抗原結合領域が、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する、請求項１７に記載の単離多特異性分子。
  19. 多特異性分子であって、
    （ａ）ヒトＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、前記第一の抗原結合領域が第一のＶＨ及び第一のＶＬを含む、第一の抗原結合領域、ならびに
    （ｂ）ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、前記抗原結合領域が第二のＶＨ及び第二のＶＬを含み、前記第二のＶＨが、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記第二のＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、第二の抗原結合領域、を含む、多特異性分子。
  20. 前記第一の抗原結合領域が、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する、請求項１９に記載の単離多特異性分子。
  21. 前記第一のＶＨが、配列番号３４、３６、又は３８のアミノ酸配列を含み、及び前記第一のＶＬが、配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列を含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  22. 前記第一のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号３４、３６、又は３８からなり、及び前記第一のＶＬのアミノ酸配列が、配列番号３５、３７、又は３９のアミノ酸配列からなる、請求項２１に記載の多特異性分子。
  23. 前記第一のＶＨ及び前記第一のＶＬが、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  24. 前記第一のＶＨ及び前記第一のＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列からなる、請求項２３に記載の多特異性分子。
  25. 前記第二のＶＨが、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、及び前記第二のＶＬが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  26. 前記第二のＶＨ及び前記第二のＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列からなる、請求項２５に記載の多特異性分子。
  27. 前記第一のＶＨ及び前記第一のＶＬが、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列を含み、ならびに前記第二のＶＨ及び前記第二のＶＬが、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列を含む、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  28. 前記第一のＶＨ及び前記第一のＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３４及び３５、３６及び３７、又は３８及び３９のアミノ酸配列からなり、ならびに前記第二のＶＨ及び前記第二のＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列からなる、請求項２７に記載の多特異性分子。
  29. 前記第一及び／又は第二の抗原結合領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２からなる群から選択される重鎖定常領域を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  30. 前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１重鎖定常領域である、請求項２９に記載の多特異性分子。
  31. 前記重鎖定常領域が、配列番号４９～６０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の多特異性分子。
  32. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａ変異を含む、請求項３０に記載の多特異性分子。
  33. 前記第一及び／又は第二の抗原結合領域が、野生型重鎖定常領域のバリアントである重鎖定常領域を含み、前記バリアント重鎖定常領域が、前記野生型重鎖定常領域がＦｃγＲに結合するよりも高い親和性で前記ＦｃγＲに結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  34. 前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＩＡである、請求項３３に記載の多特異性分子。
  35. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ変異を含む、請求項３０に記載の多特異性分子。
  36. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異からなる群から選択される少なくとも一つの変異を含む、請求項３０に記載の多特異性分子。
  37. （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まない第二の重鎖定常領域を含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  38. 前記第一の重鎖定常領域及び前記第二の重鎖定常領域が、それぞれ配列番号５８及び５７、５９及び５７、又は６０及び５７を含む、請求項３７に記載の多特異性分子。
  39. （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸を含む第二の重鎖定常領域を含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  40. 前記第一の重鎖定常領域ならびに前記第二の重鎖及び定常領域が、それぞれ配列番号５９及び５８、又は６０及び５８を含む、請求項３９に記載の多特異性分子。
  41. （ａ）前記第一の重鎖定常領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の重鎖定常領域が、アミノ酸位置３３２にグルタミン酸をさらに含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項３９に記載の多特異性分子。
  42. 前記第一の重鎖定常領域及び前記第二の重鎖定常領域が、それぞれ配列番号６０及び５９を含む、請求項４１に記載の多特異性分子。
  43. （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まない第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む第二の重鎖定常領域を含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  44. 前記第一の重鎖定常領域及び前記第二の重鎖定常領域が、それぞれ配列番号５７及び６０、５７及び５９、又は５７及び５８を含む、請求項４３に記載の多特異性分子。
  45. （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位にアスパラギン酸を含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸、又はアミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含む、第二の重鎖定常領域を含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  46. 前記第一の重鎖定常領域及び前記第二の重鎖定常領域が、それぞれ配列番号５８及び６０、又は５８及び５９を含む、請求項４５に記載の多特異性分子。
  47. （ａ）前記第一の重鎖定常領域が、アミノ酸３３２位にグルタミン酸をさらに含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の重鎖定常領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項４５に記載の多特異性分子。
  48. 前記第一の重鎖定常領域及び前記第二の重鎖定常領域が、それぞれ配列番号５９及び６０を含む、請求項４７に記載の多特異性分子。
  49. （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位にトリプトファンを含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含む第二の重鎖定常領域を含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項１～４８のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  50. 前記第一の重鎖定常領域が、配列番号５３、５４、５５、又は５６を含み、ならびに前記第二の重鎖定常領域が、配列番号４９、５０、５１、又は５２を含む、請求項４９に記載の多特異性分子。
  51. （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含む第一の重鎖定常領域を含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位にトリプトファンを含む第二の重鎖定常領域を含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、請求項１～４８のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  52. 前記第一の重鎖定常領域が、配列番号４９、５０、５１、又は５２を含み、及び前記第二の重鎖定常領域が、配列番号５３、５４、５５、又は５６を含む、請求項５１に記載の多特異性分子。
  53. 前記第一の抗原結合領域が、配列番号１、３、５、又は６７～９９のアミノ酸配列を含む第一の重鎖を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  54. 前記第一の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１、３、５、又は６７～９９のアミノ酸配列からなる、請求項５３に記載の多特異性分子。
  55. 前記第二の抗原結合領域が、配列番号７又は１００～１１０のアミノ酸配列を含む第二の重鎖を含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  56. 前記第二の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７又は１００～１１０のアミノ酸配列からなる、請求項５５に記載の多特異性分子。
  57. 前記多特異性分子が、配列番号４２、４３、又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  58. 前記第一の抗原結合領域が、配列番号２、４、又は６のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖を含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  59. 前記第一の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２、４、又は６のアミノ酸配列からなる、請求項５８に記載の多特異性分子。
  60. 前記第二の抗原結合領域が、配列番号８又は９のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  61. 前記第二の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号８又は９のアミノ酸配列からなる、請求項６０に記載の多特異性分子。
  62. 多特異性分子であって、
    （ａ）ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、前記第一の抗原結合領域が、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９のアミノ酸配列を含む第一の重鎖、及び／又は配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖を含む、第一の抗原結合領域、ならびに
    （ｂ）ヒトＣＤ９６以外の抗原に特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、前記第二の抗原結合領域が第二の重鎖及び第二の軽鎖を含む、第二の抗原結合領域、を含む、多特異性分子。
  63. 前記第二の抗原結合領域が、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する、請求項５８に記載の多特異性分子。
  64. 多特異性分子であって、
    （ａ）ヒトＴＩＧＩＴ以外の抗原に特異的に結合する第一の抗原結合領域であって、前記第一の抗原結合領域が第一の重鎖及び第一の軽鎖を含む、第一の抗原結合領域、ならびに
    （ｂ）ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域であって、前記第二の抗原結合領域が、配列番号７もしくは１００～１１０のアミノ酸配列を含む第二の重鎖、及び／又は配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖を含む、第二の抗原結合領域、を含む、多特異性分子。
  65. 前記第一の抗原結合領域が、ヒトＣＤ９６に特異的に結合する、請求項６４に記載の多特異性分子。
  66. 前記第一の重鎖が、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記第一の軽鎖が、配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列を含む、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  67. 前記第一の重鎖が、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９のアミノ酸配列を含み、及び前記第一の軽鎖が、配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列を含む、請求項６２～６６のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  68. 前記第一の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１、３、５、もしくは６７～９９からなり、及び前記第一の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２、４、もしくは６のアミノ酸配列からなる、請求項６７に記載の多特異性分子。
  69. 前記第二の重鎖が、配列番号７もしくは１００～１１０のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記第二の軽鎖が、配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を含む、請求項６２～６８のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  70. 前記第二の重鎖が、配列番号７もしくは１００～１１０のアミノ酸配列を含み、及び前記第二の軽鎖が、配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を含む、請求項６２～６９のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  71. 前記第二の重鎖のアミノ酸配列が、配列番号７からなり、及び前記第二の軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号８もしくは９のアミノ酸配列からなる、請求項７０に記載の多特異性分子。
  72. 前記第一の重鎖及び前記第一の軽鎖が、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６のアミノ酸配列を含み、ならびに／あるいは前記第二の重鎖及び前記第二の軽鎖が、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列を含む、請求項６２～７１のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  73. 前記第一の重鎖及び前記第一の軽鎖が、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６のアミノ酸配列を含み、ならびに前記第二の重鎖及び第二の軽鎖が、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列を含む、請求項６２～７２のいずれか一項に記載の多特異性分子。
  74. 前記第一の重鎖及び前記第一の軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１及び２、３及び４、又は５及び６からなり、ならびに前記第二の重鎖及び前記第二の軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号７及び８、又は７及び９のアミノ酸配列からなる、請求項７３に記載の多特異性分子。
  75. ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子であって：
    （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、多特異性分子。
  76. 前記第一の抗原結合領域が、配列番号７３、８４、９５、又は５６を含み、及び前記第二の抗原結合領域が、配列番号１０３又は４９を含む、請求項７５に記載の多特異性分子。
  77. ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子であって：
    （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれアスパラギン酸、セリン、アラニン、及びバリンを含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、多特異性分子。
  78. 前記第一の抗原結合領域が配列番号７３、８４、９５、又は５６を含み、及び前記第二の抗原結合領域が配列番号１０４又は５０を含む、請求項７７に記載の多特異性分子。
  79. ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子であって：
    （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、多特異性分子。
  80. 前記第一の抗原結合領域が配列番号６７、７８、８９、又は４９を含み、及び前記第二の抗原結合領域が配列番号７又は５６を含む、請求項７９に記載の多特異性分子。
  81. ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子であって：
    （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれアスパラギン酸、セリン、アラニン、及びバリン、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、多特異性分子。
  82. 前記第一の抗原結合領域が配列番号１、３、５、又は５０を含み、及び前記第二の抗原結合領域が、配列番号７又は５６を含む、請求項８１に記載の多特異性分子。
  83. ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子であって：
    （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、多特異性分子。
  84. 前記第一の抗原結合領域が配列番号７２、８３、９４、又は５５を含み、及び前記第二の抗原結合領域が配列番号１０３又は４９を含む、請求項８３に記載の多特異性分子。
  85. ヒトＣＤ９６に特異的に結合する第一の抗原結合領域、及びヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する第二の抗原結合領域を含む多特異性分子であって：
    （ａ）前記第一の抗原結合領域が、アミノ酸３６６位、３６８位、及び４０７位にそれぞれセリン、アラニン、及びバリンを含むが、しかし、アミノ酸２３９位、３３０位、及び３３２位にそれぞれアスパラギン酸、ロイシン、及びグルタミン酸を含まず、ならびに
    （ｂ）前記第二の抗原結合領域が、アミノ酸２３９位、３３２位、及び３６６位にそれぞれアスパラギン酸、グルタミン酸、及びトリプトファンを含み、
    前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる、多特異性分子。
  86. 前記第一の抗原結合領域が配列番号６７、７８、８９、又は４９を含み、及び前記第二の抗原結合領域が配列番号１０２又は５５を含む、請求項８５に記載の多特異性分子。
  87. ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号４１のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む、単離抗体。
  88. 前記抗体が、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、及び３３のそれぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、請求項８７に記載の単離抗体。
  89. 前記抗体が、配列番号４０のＶＨアミノ酸配列を含む、請求項８７又は８８に記載の単離抗体。
  90. 前記ＶＨのアミノ酸配列が、配列番号４０のアミノ酸配列からなる、請求項８９に記載の単離抗体。
  91. 前記抗体が、配列番号４１のＶＬアミノ酸配列を含む、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の単離抗体。
  92. 前記ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号４１のアミノ酸配列からなる、請求項９１に記載の単離抗体。
  93. ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号４０及び４１のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ及びＶＬを含む、単離抗体。
  94. 前記ＶＨ及び前記ＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４０及び４１のアミノ酸配列からなる、請求項８７に記載の単離抗体。
  95. 前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２からなる群から選択される重鎖定常領域を含む、請求項８７～９４のいずれか一項に記載の単離抗体。
  96. 前記抗体がＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項９５に記載の単離抗体。
  97. 前記抗体が、配列番号５７、５８、５９、又は６０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項９６に記載の単離抗体。
  98. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＮ２９７Ａ変異を含む、請求項９６に記載の単離抗体。
  99. 前記抗体が、野生型重鎖定常領域のバリアントである重鎖定常領域を含み、前記バリアント重鎖定常領域が、前記野生型重鎖定常領域がＦｃγＲに結合するよりも高い親和性で前記ＦｃγＲに結合する、請求項８７～９８のいずれか一項に記載の単離抗体。
  100. 前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＩＡである、請求項９９に記載の単離抗体。
  101. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆ変異を含む、請求項９６に記載の単離抗体。
  102. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ変異からなる群から選択される少なくとも一つの変異を含む、請求項９６に記載の単離抗体。
  103. 前記抗体が、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項８７～１０２のいずれか一項に記載の単離抗体。
  104. 前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０のアミノ酸配列からなる、請求項１０３に記載の単離抗体。
  105. 前記抗体が、配列番号４３又は４４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項８７～１０４のいずれか一項に記載の単離抗体。
  106. 前記抗体が、配列番号８又は９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項８７～１０４のいずれか一項に記載の単離抗体。
  107. 前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号８又は９のアミノ酸配列からなる、請求項１０６に記載の単離抗体。
  108. ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離抗体であって、前記抗体が、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８又は９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗体。
  109. 前記重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１０７、１０８、１０９、又は１１０のアミノ酸配列からなり、及び前記軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号８又は９のアミノ酸配列からなる、請求項１０８に記載の単離抗体。
  110. 前記重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号１０７及び８、１０７及び９、１０８及び８、１０８及び９、１０９及び８、１０９及び９、１１０及び８、又は１１０及び９のアミノ酸配列を含む、請求項１０８又は１０９に記載の単離抗体、
  111. 前記重鎖及び前記軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１０７及び８、１０７、及び９、１０８及び８、１０８及び９、１０９及び８、１０９及び９、１１０及び８、又は１１０及び９のアミノ酸配列からなる、請求項１１０に記載の単離抗体。
  112. 前記抗体が多特異性である、請求項８７～１１１のいずれか一項に記載の単離抗体。
  113. 前記多特異性分子又は単離抗体が、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、毒素、放射性核種、又は検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１～１１２のいずれか一項に記載の多特異性分子又は単離抗体。
  114. 前記多特異性分子又は単離抗体が、抗体にコンジュゲートされている、請求項１～１１３のいずれか一項に記載の多特異性分子又は単離抗体。
  115. 単離ポリヌクレオチドであって：
    （ａ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子のＶＨ、ＶＬ、重鎖、及び／又は軽鎖、
    （ｂ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子の前記第一のＶＨ及び前記第一のＶＬ、
    （ｃ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子の前記第二のＶＨ及び前記第二のＶＬ、
    （ｄ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子の前記第一の重鎖及び前記第一の軽鎖、
    （ｅ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子の前記第二の重鎖及び前記第二の軽鎖をコードする、単離ポリヌクレオチド。
  116. 請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体の前記ＶＨ及び／又は前記ＶＬ、あるいは前記重鎖及び／又は前記軽鎖をコードする、単離ポリヌクレオチド。
  117. 請求項１１５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  118. 請求項１１６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  119. 組換え宿主細胞であって：
    （ａ）請求項１１５に記載のポリヌクレオチド、
    （ｂ）請求項１１７に記載のベクター、
    （ｃ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、
    （ｄ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、ならびに請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、
    （ｅ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド、及び請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチド、
    （ｆ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチドを含む第三のベクター、及び請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを含む第四のベクター、
    （ｇ）請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、
    （ｈ）請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、ならびに請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、
    （ｉ）請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチド、及び請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチド、あるいは
    （ｊ）請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクター、請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチドを含む第三のベクター、及び請求項５３～５６又は５８～７４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の軽鎖をコードする第四のポリヌクレオチドを含む第四のベクターを含む、組換え宿主細胞。
  120. 組換え宿主細胞であって：
    （ａ）請求項１１６に記載のポリヌクレオチド、
    （ｂ）請求項１１８に記載のベクター、
    （ｃ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチド、
    （ｄ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体のＶＨ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む第一のベクター、
    （ｅ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、又は
    （ｆ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチドを含む第一のベクター、及び請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む、組換え宿主細胞。
  121. 請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子、請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体、請求項１１５又は１１６に記載のポリヌクレオチド、請求項１１７又は１１８に記載のベクター、あるいは請求項１１９又は１２０に記載の宿主細胞、及び医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
  122. 多特異性分子又は単離抗体を産生する方法であって、前記方法が、ポリヌクレオチドが発現され、前記多特異性分子又は単離抗体が産生されるように、請求項１１９又は１２０に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養することを含む、方法。
  123. 多特異性分子を産生する方法であって、前記方法が、細胞中で：
    （ａ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチド、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、あるいは
    （ｂ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、ならびに請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の重鎖及び軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを、
    前記ポリヌクレオチドが発現され、前記多特異性分子が産生されるように、適切な条件下で発現させることを含む、方法。
  124. 多特異性分子を産生する方法であって、前記方法が、細胞中で：
    （ａ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド、及び請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチド、あるいは
    （ｂ）請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチド、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の重鎖をコードする第三のポリヌクレオチド、及び請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域の軽鎖をコードする第四のポリヌクレオチドを、
    前記ポリヌクレオチドが発現され、前記多特異性分子が産生されるように、適切な条件下で発現させることを含む、方法。
  125. 多特異性分子を産生する方法であって、前記方法が：
    （ａ）第一の細胞において、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第一のポリヌクレオチドを、前記第一の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、
    （ｂ）第二の細胞において、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨ及びＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを、前記第二の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに
    （ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において産生される前記第一の及び前記第二の抗原結合領域を、前記多特異性分子が産生されるような、適切な条件下で接触させること、を含む、方法。
  126. 多特異性分子を産生する方法であって、前記方法が：
    （ａ）第一の細胞において、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド及び請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第一の抗原結合領域のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチドを、前記第一の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、
    （ｂ）第二の細胞において、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＨをコードする第三のポリヌクレオチド及び請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の第二の抗原結合領域のＶＬをコードする第四のポリヌクレオチドを、前記第二の抗原結合領域が産生される条件下で発現させること、ならびに
    （ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において産生される前記第一の及び前記第二の抗原結合領域を、前記多特異性分子が産生されるような条件下で接触させること、を含む、方法。
  127. 多特異性分子を産生する方法であって、前記方法が、前記多特異性分子が産生されるような条件下で、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の前記第一の抗原結合領域及び前記第二の抗原結合領域を接触させることを含む、方法。
  128. 単離抗体を産生する方法であって、前記方法が、細胞中で：
    （ａ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の抗体のＶＨ及び／又はＶＬをコードするポリヌクレオチド、あるいは
    （ｂ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、
    前記ポリヌクレオチドが発現され、前記抗体が産生されるような、適切な条件下で発現させることを含む、方法。
  129. 単離抗体を産生する方法であって、前記方法が、細胞中で：
    （ａ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の抗体のＶＨをコードする第一のポリヌクレオチド、及び請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の抗体のＶＬをコードする第二のポリヌクレオチド、又は
    （ｂ）請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の抗体の重鎖をコードする第一のポリヌクレオチド、及び請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖をコードする第二のポリヌクレオチドを、
    前記ポリヌクレオチドが発現され、前記抗体が産生されるような、適切な条件下で発現させることを含む、方法。
  130. 対象において免疫応答を増強する方法であって、前記方法が、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子、請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体、請求項１１５又は１１６に記載のポリヌクレオチド、請求項１１７又は１１８に記載のベクター、請求項１１９又は１２０に記載の宿主細胞、あるいは請求項１２１に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  131. 対象において癌を治療する方法であって、前記方法が、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子、請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体、請求項１１５又は１１６に記載のポリヌクレオチド、請求項１１７又は１１８に記載のベクター、請求項１１９又は１２０に記載の宿主細胞、あるいは請求項１２１に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  132. 前記多特異性分子、単離抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は医薬組成物が、全身的に、静脈内に、皮下に、もしくは腫瘍内に投与される、又は腫瘍排出リンパ節に送達される、請求項１３０又は１３１に記載の方法。
  133. 追加の治療剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１３０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記追加の治療剤が、化学療法剤である、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記追加の治療剤が、チェックポイント標的化剤である、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記チェックポイント標的化剤が、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ－３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ－３抗体、アンタゴニスト抗ＶＩＳＴＡ抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アンタゴニスト抗ＣＤ９６抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、及びアゴニスト抗ＯＸ４０抗体からなる群から選択される、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記追加の治療剤が、抗ＰＤ－１抗体であり、場合により、前記抗ＰＤ－１抗体が、ペムブロリズマブ又はニボルマブである、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記追加の治療剤が、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である、請求項１３３に記載の方法。
  139. 前記阻害剤が、エパカドスタット、Ｆ００１２８７、インドキシモド、及びＮＬＧ９１９からなる群から選択される、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記追加の治療剤が、ワクチンである、請求項１３３に記載の方法。
  141. 前記ワクチンが、抗原ペプチドと複合体化された熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記熱ショックタンパク質が、ｈｓｃ７０であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体化されている、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記熱ショックタンパク質が、ｇｐ９６タンパク質であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体化されており、場合により、前記ＨＳＰＰＣが、対象から得られた腫瘍から由来する、請求項１４１に記載の方法。
  144. 対象において感染性疾患を治療する方法であって、前記方法が、請求項１～８６、１１３、又は１１４のいずれか一項に記載の多特異性分子、請求項８７～１１４のいずれか一項に記載の単離抗体、請求項１１５又は１１６に記載のポリヌクレオチド、請求項１１７又は１１８に記載のベクター、請求項１１９又は１２０に記載の宿主細胞、あるいは請求項１２１に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
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